JP2002296275A - 少なくとも２種の異なる分子マーカーを同時に測定することによって腫瘍およびそれらの前駆体段階を検出する場合に臨床的特異性を増強する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 病理学的に変性した細胞の改良された診断の
ための自動化方法の提供。 【解決手段】 細胞または組織サンプルの構成領域にお
いて、疾病に関連する遺伝子発現における変化を示す少
なくとも２種の異なる分子マーカーを、抗体の組み合わ
せを使用し、そしてシグナル強度を認定する手段で、同
時に染色することによるがん細胞の自動化可能な診断方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、がん細胞の診断方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】がん疾患は、今なお、もっとも頻度の高
い世界的な死亡原因の１つを構成している。がんおよび
前がん段階の両早期認識および特異的検出に対する臨床
上の要望が存在する。さらに、腫瘍のより詳細な特徴
は、治療と予後に関して結論を下すために重要である。
異なるがん腫サブタイプは適用される治療上の測定に対
して異なって反応するので、このことは有用である。こ
れについて、例えば、乳がんが疑われる場合、頼みの綱
は、よりしばしば、分子マーカー、例えばサイトケラチ
ン、エストロゲン受容体、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７
もしくはｐ５３の免疫組織化学的染色に対してとられる
（例えば、Ｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６９，１３５−１３９；Ｍｏｋｂｅ
ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇｅｒ
ｙ１７８，６９−７２；Ｒｅｉｎｅｒｅｔ ａｌ．，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，７０５７−７０６１）。
この染色は、乳房生検においてもっとも高頻度に行われ
るけれども、それはまた、針穿刺（ＦＮＡ，ｆｉｎｅ
ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅｓ）においてますます
実施されつつある。また、分子マーカーは、腫瘍が、一
次腫瘍か、または転移であるかを決定することに関して
も使用される。例えば、罹病一次臓器に特異的であるマ
ーカーの発現は、この同定を容易にする。

【０００３】近年、変異の結果として変性形態における
それらのタンパク質を発現し、そして結果的にがんの生
成に役割を演じる多数の遺伝子が同定されている。対応
するタンパク質は、両血清中および細胞レベルにおいて
診断マーカーとして検出される。これらのタンパク質
は、細胞における生理学的調節過程、例えば成長制御
（増殖遺伝子。例えばＫｉ６７およびｍｃｍ−５；がん
遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子、例えばｐ１６，
ＥＧＦレセプター、ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびｍｄｍ−
２）、アポトーシス（自然細胞死、例えばｐ５３および
ｂｃｌ−２）、ＤＮＡ修復（ｍｓｈ−１）および細胞接
着（Ｅ−カドヘリン、β−カテニンおよびＡＰＣ）に関
与している。これらのタンパク質に対する特異抗体を使
用する免疫組織化学的および免疫細胞化学的検出方法
（ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ａｂｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，２６−
５３）は、例えば、検出のために適当である。

【０００４】単一のマーカーはある種の健全な細胞にお
いても存在するので、それは病理学的に変性した細胞を
認識することに関して十分な特異性を達成しないことが
度々例証された。これは、これらのマーカーが健全な細
胞において生理学的調節過程に関与しているタンパク質
であり、それが、病理学的に変性した細胞の指標である
過剰に高い発現において単に存在するという事実に基づ
いている。Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８，ＰＮＡＳ，
９５，１４９３２−１４９３７）は、頸部塗抹（ｎ＝５
８）において試験された病巣／腫瘍２８例を検出した
が、２８例の正常な塗抹標本のうち２例を誤った陽性型
に染色するＤＮＡ複製マーカーｍｃｍ−５を記述してい
る。Ｓａｎｏら（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｌ．，１
９９８，４８，５８０−５８５）は、マーカーｐ１６
が、１５例の正常な頸部生検のうち３例を非特異的に染
色することを報告している。ＨＰＶは、頸部のすべての
病巣および腫瘍の事実上１００％において検出できるけ
れども、それはまた、多くの正常な頸部上皮においても
検出できる；すなわち、ＨＰＶを検出する試験は高度の
感受性を示すけれども、それは低い度合いの特異性しか
示さない（例えば、Ｃｕｚｉｃｋ，２０００，ＪＡＭ
Ａ，２８３，１０８−１０９）．病理学において、生物
サンプルにおける数種のマーカーを検出することに関心
がますます高まっている。一方では、今では、より多く
の情報が病理学的に変性した細胞もしくは組織領域を検
出し、そして特徴付けるために利用可能であり；他方で
は、個々のマーカーの非特異的染色が何であるかを認識
し、その結果不正確な結論を回避することが可能であ
る。慣例的には、身体サンプルの得られた生検標本の連
続切片または複数標本（例えば固定剤中の頸部塗抹標
本）が、この目的のために調製され、各場合、特定のマ
ーカーに関して染色される。この方法はいくつかの欠
点、通常は限定される患者のサンプル材料および染色試
薬の高い消費、必要な大量の時間および高コスト、そし
てまた組織サンプルの細胞または特定領域において明瞭
に２種以上のマーカーの場所を同時に示すことが不可能
である：という欠点を有する。生物サンプルにおける２
種以上の異なる生物学的マーカーの同時検出は、文献
（ＤＡＫＯ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ
Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔ
ａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，１９９７．
４１，２５５−２５９）には既に記述されているけれど
も、その方法は、いかなる程度にも標準化されなかった
ので、それは、日常的診断においてはまだ使用されなか
った。Ｔｅｒｈａｖａｕｔａら（Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ，１９９４，５，２８２−２９３）は、頸部病巣
から採取された生検標本におけるｐ５３およびＫｉ６７
の２重染色を使用し、そしてＨＰＶ陽性およびＨＰＶ陰
性の病巣由来の基底および副基底細胞において、ある場
合は１つの細胞において両マーカーを検出できた。しか
しながら、同時に、著者らは、このサンプルにおける腫
瘍細胞の存在に関して確実な結論を引き出すべく、その
結果を組み合わせることによって情報を使用していな
い。腫瘍領域の検出を自動化する点で染色情報を使用す
るいかなる試みも完全に欠如している。さらにまた、こ
の１つの組み合わせとは別に、腫瘍領域の同定および特
徴付けを容易にすることができるいかなる他のマーカー
の組み合わせについての記述もない。

【０００５】肺の腫瘍生検標本において遂行されたさら
なる二重染色が、Ｋｒａｅｆｔら（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．２０００，６，４３４−４４２）および
Ｏｓｈｉｋａら（Ｍｏｄ Ｐａｔｈｌ，１９９８，１
１，１０５９−１０６３）により記述されている。これ
らの引用文献に記述されている抗体組み合わせは、本発
明が基づく組み合わせとは完全に異なる。さらにまた、
両上記出版物は、診断をするために、生検の染色を検査
する病理学者をさらに必要とする。このアプローチは、
方法を自動化することと概念的に合致せず、したがっ
て、全く考慮に入れられない。

【０００６】Ｒａｏら（１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐ
ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．７，１０２７−１０３３）は、
乳房から得られた針穿刺材料（ＦＮＡ，ｆｉｎｅ ｎｅ
ｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅｓ）における種々の腫瘍関
連マーカー（ＤＮＡ含量、Ｇアクチンおよびｐ５３）の
多重染色を記述している。彼らは、数種のマーカーの使
用が個々のマーカーを観察する場合に達成されるよりも
高い臨床的特異性を達成し、結果として、乳がんの早期
認識において重要な役割を演じることができるという効
果に対して彼らの結果を説明している。著者らによって
引用された多重染色は、乳房から得られた針穿刺材料に
限定され、そして種々の材料の性質のために、他の生物
材料（すなわち生検および頸部塗抹）に応用することが
できない。さらにまた、マーカーの組み合わせは、本発
明において記述される組み合わせとは異なる。腫瘍領域
の検出を自動化することに関して染色情報を使用する試
みはない。

【０００７】現在の臨床的腫瘍診断におけるさらなる改
良は、サンプルの調製および染色の自動化ならびに診断
の確立を含む自動画像解析の両方からなる。時間の節約
および必要なより少ない職員に加えて、このアプローチ
はまた、より客観的で、結果的に、より一様な診断をも
たらす。蛍光によるかまたは発色染料を用いる腫瘍細胞
またはそれらの前駆体における生物学的マーカーの染色
は、シグナルを定量し、そして結果的に自動方式でそれ
らを読み取ることを可能にする。染色操作を自動方式で
実施させる装置は既に存在している。しかしながら、画
像解析は、自動診断を達成するために使用されてない
（ＬｅＮｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ
Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２７８，１８５−１９２）。もっ
とも進歩した装置は、形態学的画像情報を使用する頸部
塗抹標本における腫瘍細胞とそれらの前駆体の自動検出
を伴う装置である（Ｓａｗａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９
９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｂｓｔｅｒｉｃｓ ａｎｄ
Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ，４２，９２２−９２８；Ｓ
ｔｏｌｅｒ，２０００ Ｍｏｄ，Ｐａｔｈｏｌ．，１
３，２７５−２８４）。

【０００８】ＰＡＰＮＥＴシステムを用いる頸部塗抹標
本における異常細胞の自動形態学的検出に加えて、Ｂｏ
ｏｎら（１９９５，Ｄｉａｇｎ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏ
ｌ．，１３，４２３−４２８）は、さらに、Ｋｉ６７抗
体を用いる増殖細胞の免疫組織学的染色を使用してい
る。しかしながら、この１種の分子マーカーの使用は、
良性の増殖細胞とがん原性細胞の間のいかなる明瞭な差
異も可能にはさせない。しかしながら、これらの著者ら
は、異常細胞を同定するために少なくとも２種の分子マ
ーカーの同時検出を使用することを全く論じていない。

【０００９】Ｂｏｏｎらが著者である特許（米国特許第
５５４４６５０号）は、免疫組織化学的マーカーによる
染色がサンプル中の増殖（がん原性および非がん原性）
細胞の自動検出を容易にする方法、そして半自動方法に
おいて、制御している病理学者／細胞学者が、染色され
た細胞が真にがん原性細胞であるか否かを決定する方法
を記述している。しかしながら、異常または腫瘍細胞を
自動方式での検出を可能にするいかなる特異抗体の組み
合わせについての記述もない。

【００１０】著者がＭｃＧｌｙｎｎおよびＡｋｋａｐｅ
ｄｄｉである米国特許第６００５２５６号は、がん細胞
を同定する目的を含む、身体サンプルにおける数種の蛍
光標識マーカーを同時検出するための応用および方法を
詳細に記述しているが、がん診断におけるいかなる特定
の応用も論じていないし、また増強された特異性を保持
する適当なマーカーの組み合わせも記述していない。

【００１１】Ａｍｐｅｒｓａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｇｒｏｕｐ（ｗｗｗ．ａｍｐｅｒｓａｎ
ｄｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）が、会社自体の社内サンプ
ル調製に加えて、また不特定の生物学的マーカーを検出
する蛍光の使用も含む、頸部塗抹標本をスクリーニング
するための新しいシステム（ＩｎＰａｔｈ）を開発しつ
つあることは知られている。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、定め
られたマーカー組み合わせを使用することによって、病
理学的に変性した細胞、好ましくはがん細胞およびそれ
らの前駆体を決定するために使用できる自動化方法を提
供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、病理学的に変
性した細胞、好ましくはがん腫細胞およびそれらの前駆
体の検出の特異性が、細胞もしくは組織サンプルにおけ
る少なくとも２種の特定の分子マーカー、すなわち遺伝
子発現における疾病関連変化を同時に検出することによ
って増強され、そしてより特異的な検出およびその上自
動化できる検出が、数種のマーカーを検出し、そしてシ
グナルを組み合わせ、かつ、認定することに基づいて可
能にされるという本出願者らの発見に基づく。

【００１４】本発明は、分子マーカーが、病理学的に変
性されていないある種の生物材料において、類似または
異なる量においてまた存在するので、個々に検出される
場合には、病理学的に変性した細胞もしくは組織を認識
することに関して十分な特異性を達成しない分子マーカ
ーに関する。これは、これらのマーカーが、健全な細胞
においても同様に生理学的調節過程に関与しているタン
パク質であるという事実に基づく。これに加えて、非特
異的様式で交差反応する抗体のために、分子マーカーの
検出は明瞭にはできず、そして分子マーカーを含有しな
い生物材料の粒子の染色においても表される。本発明者
らは、細胞において、または生物材料の構成領域内で、
例えば組織切片の狭い定められた領域内で、少なくとも
２種のマーカーを同時に検出することによって、異常な
細胞もしくは組織切片を検出する場合に単一マーカーの
検出の不十分な特異性を補償して、より高度の特異性を
確定できることを観察した。かくして、生物サンプルを
診断する場合の数種のマーカーの組み合わせは、情報価
値を単一マーカーを使用するよりも一層高くすることが
できる。

【００１５】マーカー組み合わせは、例えば、分子マー
カー、ｈｅｒ２／ｎｅｕ，ｐ１６，ｐ５３，Ｋｉ６７，
ＭＮ，ｍｄｍ−２，ｂｃｌ−２およびＥＧＦレセプター
の組み合わせによって示されるように、次の種類：がん
遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝
子、増殖遺伝子、修復遺伝子およびウイルス遺伝子の少
なくとも１種に属する遺伝子の変化した発現の可視化を
含む。好ましくは、次の組み合わせ、ｈｅｒ２／ｎｅｕ
とＫｉ６７、ｈｅｒ２／ｎｅｕとｐ５３、ｈｅｒ２／ｎ
ｅｕとｂｃｌ−２、ｈｅｒ２／ｎｅｕとｐ１６、ｂｃｌ
−２とＫｉ６７、ｂｃｌ−２とｐ５３、ｂｃｌ−２とｐ
１６、ｐ１６とｐ５３、ｐ１６とＫｉ６７が意図され
る。

【００１６】本発明によれば、本出願者らの発見は、疾
病関連細胞もしくは組織切片の早期診断の方法のために
使用され、この方法は、自動方式においてがん腫および
それらの前駆体、そしてまた適当であれば転移の起源を
検出する目的による前記分子マーカーの組み合わせの検
出を含む。腫瘍細胞の自動化された特異的検出は、次の
方法、第１には、これらの２種のシグナルが、細胞また
は身体サンプルの限られた領域中に存在しなければなら
ず、そして第２には、２種のマーカーによって与えられ
るシグナルが、各場合、個々に定められた強度または閾
値を超えるかまたは以下でなければならない：方法によ
って達成することができる。これらの２つの基準が適用
される場合、例えば、設定閾値を超えるマーカーを発現
しているか、または各場合限られたシグナル強度以下で
ある両マーカーを示す健全な細胞を除外することが可能
である。

【００１７】表現「分子マーカー」は、細胞における分
子変化、特に遺伝子発現における変化を含み、これら
は、変性されているか、または病的である細胞構成と関
連して観察された。分子マーカーを検出する方法は、好
ましくはタンパク質レベルにおいて、マーカーの量また
は質を決定するいかなる方法も含む。

【００１８】後に、発色および／または蛍光検出を伴う
細胞化学的または組織化学的同定を可能にする抗体また
は他の特異的結合タンパク質（例えば、抗クリン（ａｎ
ｔｉ−ｃｕｌｌｉｎ））が、タンパク質レベルにおける
検出のために適する。

【００１９】表現「少なくとも２種の特異的分子マーカ
ーの同時検出」は、遺伝子発現が互いに関連して観察で
きるように、身体サンプル、特に同様の身体サンプルの
単一標本において、少なくとも２種の遺伝子の発現を可
視化する方法を含む。これに関連して、それは、少なく
とも２種のシグナルの存在下のみならず、また１種以上
のさらなるシグナルの存在または不在下にあり、可能な
組み合わせの情報価値をもつ。腫瘍特異性に加えて、こ
のさらなる情報は、転移の起源に関する結論を含む。こ
れに関連して、検出されたマーカーが比較的空間を空け
て接近して、特に１個の細胞またはサンプルの狭く定め
られた領域内で、例えば組織切片内で検出されることが
重要である。

【００２０】表現「シグナルを組み合わせることおよび
信認すること」は、身体サンプルにおける少なくとも２
種のマーカーの連結を含む。その上、健全細胞は、マー
カー強度に関する閾値を定めることによって罹病細胞か
ら特異的に区別できる。

【００２１】表現「細胞もしくは組織サンプル」は、身
体サンプル、例えば塗抹標本、唾液、臓器穿刺標本、生
検標本、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿
および糞、または臓器、例えば乳房、肺、腸、皮膚、頸
部、前立腺および胃から除去された組織から単離される
細胞を含む。

【００２２】表現「病理学的に変性された細胞」は、が
ん腫およびそれらの前駆体、好ましくは呼吸器、生殖器
および胃腸管のがん腫、そしてまた、皮膚、乳房および
血管系の腫瘍、特に乳がんおよび頸部がん腫およびその
前駆体、例えば頸部上皮内新生物（ＣＩＮ Ｉ−ＩＩ
Ｉ）およびまたインサイチューのがん腫を含む。

【００２３】表現「自動検出」は、完全に、または構成
段階においてのみ、人の手作業を置換し、そして特に、
検出方法の段階において、または続く文書もしくは情報
処理において使用される方法を含む。これは、サンプル
調製、サンプル染色、サンプル解析および情報処理の段
階を含む。これに関連して、検出は、吸光測定、反射測
定もしくは蛍光測定の手段によって実施できる。蛍光測
定の方法は、蛍光顕微鏡もしくはＦＡＣＳ（流動細胞
計）解析のようなすべての方法を含む。

【００２４】表現「診断専門システム」は、画像情報を
提案される診断に変換するコンピューターソフトウエア
を含む。ソフトウエア中に存在するパラメーターか、ま
たはソフトウエアがアクセスできる外部情報に基づい
て、この専門システムは、利用しうる完全な情報または
その一部を、提案される診断に統合することができる。
さらなるパラメーターが、提案される診断を実証するた
めに必要であれば、ソフトウエアは、これらのパラメー
ターが収集されるか、あるいはレフレックス（ｒｅｆｌ
ｅｘ）アルゴリズムの意味における適当な解析装置と結
合させることによってこれを自動的に要求することを示
唆できる。

【００２５】表現「増幅システム」は、分子マーカーを
特異的に検出するために、より好ましいシグナル／ノイ
ズ比率を生み出すように、シグナル強度を増強する生化
学的方法を含む。これは、正常には、さらなる抗体およ
び／または酵素的検出反応を用いることによって達成さ
れる。

【００２６】本発明は、病理学的に変性した細胞、例え
ばがん腫およびそれらの前駆体を特異的に検出し、そし
て転移の起源を決定するために使用することができる。
また、本発明は、本発明による方法を実施するためのキ
ットであって、次の成分： （ａ）少なくとも２種の分子マーカーを検出するための
試薬、すなわちｈｅｒ２／ｎｅｕ，ｐ１６，ｐ５３，Ｋ
ｉ６７，ＭＮ，ｍｄｍ−２，ｂｃｌ−２およびＥＧＦレ
セプターに対する標識および／または非標識抗体、
（ｂ）慣用の補助剤、例えばバッファー、担体（ｓｕｐ
ｐｏｒｔｓ）、シグナル増幅物質、染色試薬など、
（ｃ）サンプルを調製および染色し、そしてシグナルを
検出するための自動化しうる方法、（ｄ）対照反応とし
て細胞系を染色するための方法および試薬、を含有する
キットに関する。

【００２７】上記説明は、キットの個々の成分に適合す
る。また、キットの個々の成分、または数種の成分は改
変形態で使用されてもよい。

【００２８】本発明は、病理学的に変性した細胞、例え
ばがん腫およびそれらの前駆体を、手動によるかまたは
部分的もしくは完全に自動化される方法において検出す
るために使用することができる。本発明により達成さ
れ、そして少なくとも２種の分子マーカーを同時に検出
することから得られる結果は、いかなる主観的検査も受
けず、反対に、生物材料における病理学的変化の客観的
な自動検出へと伝えられるので、形態学的発見は、また
「レフレックス試験（ｒｅｆｌｅｘ ｔｅｓｔｉｎ
ｇ）」の形式において客観的パラメーターによって補足
することができる。方法は急速に、そして自動方式にお
いて実施することができるので、それらは、費用および
人員に関して経済的である大規模なスクリーニング方法
に適している。これに加えて、２種以上のマーカーの組
み合わせ染色は、病理学的変化を区別して診断し、そし
て転移の起源を決定することを可能にする。

【００２９】その結果、本発明は、疾病の近代的診断に
とっての重要な貢献を構成する。

【００３０】

【実施例】上記本発明を実施するための方法は実施例に
よって以下に示される。これらの実施例は、本場合に
は、Ｖｅｎｔａｎａ自動ステナー（ｓｔａｉｎｅｒ）Ｎ
ＥＸＥＳを使用する結果として存在する正確な反応条件
を指定する。これは、種々のパラメーター、例えばイン
キュベーションおよび洗浄温度、インキュベーションお
よび洗浄時間、ならびに抗体および他の試薬の濃度は変
えることができること、すなわち他の機器に合致できる
という事実をいかなる点においても変えない。同様に、
本明細書に記述されている増幅システムは、それぞれ抗
体もしくはＤＮＡプローブに応じて、省略されるかまた
は新しいシステムが付加されてもよい。

【００３１】特異的抗体を使用し、そしてＶｅｎｔａｎ
ａ製Ｎｅｘｅｓ自動イムノステナーを用いて生検標本に
おける２種の分子マーカーを同時に検出するための実験
の記述 厚さ４−５μｍのパラフィン切片（Ｌｅｉｃａ製ＲＭ２
１５５ミクロトーム）が、固定され、パラフィン中に包
埋された生検組織から最初に調製され、そして切片は３
７℃で一夜乾燥される。続く染色に伴い切片の浮いて離
れるのを避けるために、シランでコーティングされた顕
微鏡スライドが使用される。染色では、パラフィン切片
が、２ｘ１５分間キシロール中で脱パラフィンされ、続
いて、連続的に低下する濃度のアルコール（１００％，
９０％，７０％，各場合２ｘ５分間）を通過させて、キ
シロールを再度洗浄する。

【００３２】ホルマリンによる固定は、抗原をマスクす
るアルデヒド架橋の形成をもたらし、結果的にそれらを
抗体に対して無反応にする。その結果、さらなる前処理
が必要である。抗原は、１０ｍＭクエン酸バッファー、
ｐＨ６中でマイクロ波の６００Ｗにおいて３０分間脱マ
スクされる。

【００３３】マイクロ波前処理後、次に、Ｎｅｘｅｓ
（Ｖｅｎｔａｎａ ＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）自
動イムノステナーにおける免疫組織化学的染色が続く。
１次抗体および血清を除くすべての試薬は、Ｖｅｎｔａ
ｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓから、個々に、
またはキットの形で得られる。すべてのインキュベーシ
ョンは３７℃で実施される。自動ステナーは、下記の試
薬により各インキュベーション後に自動的に洗浄する。

【００３４】まず第１に、内因性ペルオキシダーゼが、
キットに含まれている「インヒビター」により４分間不
活性化される。次いで、すべて可能性のある非特異的結
合部位は、１．５％ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ製）を用い
て１０分間ブロックされる。次いで、切片が、主モノク
ローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｂ
ＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ（クローン３Ｂ５），Ｖ
ｅｎｔａｎａ抗体希釈バッファー中２．５μｇ／ｍｌ）
とともにインキュベートされる。

【００３５】続いて、より強い染色結果を得るために、
増強キットが使用される。このキットは、予め結合され
た主抗体と反応するウサギ抗マウス免疫グロブリン、お
よび順に、前のウサギ抗マウス免疫グロブリンと結合す
るマウス抗ウサギ免疫グロブリンからなる。インキュベ
ーション時間は各場合８分である。同様に８分間インキ
ュベートされる次の試薬は、両マウスおよびウサギに対
向され、そしてビオチンと共役される「ＭｕｌｔｉＬｉ
ｎｋ」抗体である。この抗体は、ここで、全３種の既に
インキュベートされた抗体に結合し、そして主抗体の反
応部位におけるビオチン量を大きく増加する。使用され
る次の試薬は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｈｏｒｓ
ｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）であり、こ
れが８分間添加され、そしてビオチンに結合する。検出
は、ペルオキシダーゼの基質としてＤＡＢ（ジアミノベ
ンジジン）およびＨ₂Ｏ₂を添加することによって実施さ
れるが、この基質は褐色沈殿に転化される。

【００３６】第２のマーカーの検出は、上記操作に正確
に対応し、１．５％ヤギ血清を用いるブロッキング、お
よび第２の特異的主抗体（ｐ５３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製クローンＤ０１，Ｖｅｎ
ｔａｎａ抗体希釈バッファー中３０μｇ／ｍｌ）のイン
キュベーションにより始まる。終了時点で、ストレプト
アビジン−ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）共役体が
ストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体の代わりに使用され
る。このインキュベーション後、内因性アルカリホスフ
ァターゼがレバミソール＋ＭｇＣｌ₂によりブロックさ
れる。ＡＬＰ基質（Ｆａｓｔ Ｒｅｄおよびナフトー
ル）がまた同時に添加される。続いて、核がヘマトキシ
リンにより２分間対比染色され、その後、切片は「藍色
剤（ｂｌｕｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）」中で２分間染色
される。最後に、顕微鏡スライドは、Ｍｏｖｉｏｌ
^TM（Ｈｏｅｃｈｓｔ）により被覆される。

【００３７】細胞が２種の分子マーカーを同時に検出す
ることによって染色された組織サンプルにおける異常細
胞を自動的に検出するための実験の記述 少なくとも２種の分子マーカーが上記方法にしたがって
抗体を用いて検出された生検標本は、顕微鏡スライド８
枚までの可動クロスステージを備えた蛍光顕微鏡（２０
００−３ ｍｕｌｔｉｃｏｎｔｒｏｌ−ｂｏｘおよび
「ＭｏｄｕｌｅＳｔａｇｅ^TM」ａｎａｌｙＳＩＳドライ
ブソフトウエアをもつＯｌｙｍｐｕｓＡＸ７０）および
Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ
（ＳＩＳ） ａｎａｌｙＳＩＳ ３．０ソフトウエアの
改訂版を使用して解析されるが、これは、ＳＩＳ「Ｇｒ
ａｂｂｉｔ Ｄｕａｌ Ｐｒｏ」パッケージとして、付
属モジュール、特にＦＦＴ（＝「Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉ
ｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）モジュール、
ＭＩＡ（＝「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｍａｇｅ Ａｌｉｇ
ｎｍｅｎｔ」）モジュールおよびＣモジュールを含有す
る。高分解能黒白（ＭＶ２ Ｓｌｏｗ Ｓｃａｎ Ｃａ
ｍｅｒａ，１２ｂｉｔ，ＳＩＳ製）およびカラー（ＤＸ
Ｃ−９５０Ｐ ３ＣＣＤ Ｃｈｉｐ，Ｓｏｎｙ製）カメ
ラが画像記録のために使用された。組み合わせにおい
て、これらのシステムは、１６−ｂｉｔ Ｇｒａｕｔｏ
ｎ画像解析ならびに２４−ｂｉｔ画像深度までのＲＧＢ
およびＨＩＳ色彩空間におけるカラー画像解析のために
適当である。

【００３８】可動クロスステージ（ａｎａｌｙＳＩＳ
ｍｏｄｕｌｅ ｓｔａｇｅ）を測定後、顕微鏡スライド
８枚までのすべての、論理的ゼロ点に比較した位置が、
「オートメーション」メニュー（ａｎａｌｙＳＩＳ ｍ
ｏｄｕｌｅ ｇｒａｉｎｓ）において８連続ステージパ
スを決定することによって記録される。生物サンプルの
全域は、サイズ１５８．７μｍｘ１１９．６μｍをもつ
個々の領域に総合的に再分割されるが、これは、顕微鏡
単位を用いて倍率４０倍の写真の画像分野に対応する。
各生物サンプルは、１ステージパスを通して解析され
る。各ステージパスは、それぞれの顕微鏡スライドの位
置の生物サンプルの各領域が、１ステージパス位置によ
って、隣接しているが重複しない方式で検出されるよう
に、一連のステージパス位置として、ゆっくり流れる方
式で水平に描写される。対応する行数および列数が定め
られる。「オートメーション」メニューにおける８ステ
ージパスの添加が、自動方式で解析されるべき作動ステ
ージ上にすべての標本を置くことを可能にする。

【００３９】各ステージパス位置が、透過光において写
真撮影され、そして画像情報が、「カラーマッチング」
下で「ｏｐｅｒ」メニューにおいて「ＲＧＢにマッチ」
される。これは、「オートメーション」メニューにおい
て行われる続いての「測定」を可能にする。測定では、
８種までの異なるカラー混合物についての閾値が、「カ
ラー閾値を設定」し、そして「ｐｉｘｅｌ ｖａｌｕｅ
ｓ／ｎｅｗ」を用いてｐｉｘｅｌ値を決定することによ
って「画像」メニューにおいて定められる。「測定」メ
ニューにおける「相解析（ｐｈａｓｅ ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）」によって、それぞれのステージパス位置の個々の
写真が、既に定められたカラー閾値を用いて測定され、
そして特定のカラー混合物の領域が、Ｅｘｅｌデータフ
ァイルにおいて面積として定量的に現わされる。２種の
マーカーが同時に検出される場合、検出反応のカラー、
すなわちサンプル領域における「褐色」（ＤＡＢ）およ
び「赤色」（ＦａｓｔＲｅｄ）、そしてまたそれらの中
間混合物（「赤色−褐色」）が特に関心がもたれる。そ
の結果、Ｅｘｅｌ表が、特定のカラー混合物についての
面積を表す各列とともに、各個々のステージパス（＝サ
ンプル）について得られる。Ｅｘｅｌ表の行は、単一サ
ンプル領域の個々の写真（＝ステージパス位置）に対応
する。

【００４０】ｍａｃｒｏを使用して、行（＝ステージパ
ス位置）における個々の値（＝カラー混合物の測定面
積）が、各場合、それぞれの列またはカラー混合物につ
いて前決定された一定の閾値と比較される。次いで、行
における１個以上の個々の値が、それぞれの列について
一定のカラー混合物閾値を越えていれば、サンプルが罹
病しているとして特徴付けられるように、ｍａｃｒｏは
個々の値を信認する。

【００４１】対応する画像位置が保存でき、そしてそれ
らは続く肉眼的鑑定に利用することができる。「オート
メーション」メニューにおける「プロトコール」記録カ
ードを用いて、それぞれのステージパス位置に関する画
像および他のデータを自動的に保存することができる。

【００４２】これらの段階は手動で行われてもよいが、
また、それらは、「記録マクロス（ｒｅｃｏｒｄ ｍａ
ｃｒｏｓ）」下で「ｅｘｔｒａｓ」メニューにおいて生
成されるマクロスによって自動方式で実施することもで
きる。最後に、面積値（＝分子マーカーによる染色の結
果として正確に定められた２次カラーを表す生物サンプ
ルにおける面積）の形式における定量的検査が、特定の
カラー混合物について得られる。このようにして、生物
サンプルについての診断上の結論が、信認されたカラー
混合物を定量的に解析することによって達成される。

【００４３】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。

【００４４】１． 細胞もしくは組織サンプルにおける
少なくとも２種のマーカーが同時に検出され、そしてシ
グナル強度が組み合わされ、かつ認定されることを特徴
とする、がん細胞およびそれらの前駆体の自動化可能な
同定方法。

【００４５】２． 自動情報処理が、画像情報を提案さ
れる診断に統合する診断専門システムに連結されること
を特徴とする、第１項記載の方法。

【００４６】３． 分子マーカーが、単一染色に比較し
てさらなる情報を提供する少なくとも２種のマーカーを
使用する場合、２次カラーまたは空間を空けて接近する
個々のカラーによる、組織サンプルの構成領域における
発色反応もしくは蛍光シグナルを解析することによって
定量的に検出されることを特徴とする、第１〜２項記載
の方法。

【００４７】４． 次のマーカー組み合わせ、：ｈｅｒ
２／ｎｅｕとＫｉ６７、ｈｅｒ２／ｎｅｕとｐ５３、ｈ
ｅｒ２／ｎｅｕとｂｃｌ−２、ｈｅｒ２／ｎｅｕとＭ
Ｎ、ｈｅｒ２／ｎｅｕとｍｄｍ−２、ｈｅｒ２／ｎｅｕ
とＥＧＦレセプター、ｂｃｌ−２とＫｉ６７、ｂｃｌ−
２とＭＮ、ｂｃｌ−２とｍｄｍ−２、ｂｃｌ−２とＥＧ
Ｆレセプター、ｈｅｒ２／ｎｅｕとｂｃｌ−２、ｐ５３
とｂｃｌ−２、ｐ５３とＭＮ、ｐ５３とｍｄｍ−２、ｐ
５３とＥＧＦレセプター、ｐ１６とｐ５３、ｐ１６とＭ
Ｎ、ｐ１６とｍｄｍ−２、ｐ１６とＥＧＦレセプター、
ｐ１６とＫｉ６７、ｐ１６とｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｐ１６
とｂｃｌ−２、ＭＮとｍｄｍ−２、ＭＮとＥＧＦレセプ
ター、ｍｄｍ−２とＥＧＦレセプターが検出されること
を特徴とする、第１〜３項記載の方法。

【００４８】５． 乳腺、肺、頸部、結腸、皮膚および
前立腺の腫瘍が検出されることを特徴とする、第１〜４
項記載の方法。

【００４９】６． 方法がレフレックス試験を伴うこと
を特徴とする、第１〜５項記載の方法。

【００５０】７． すべての必要な試薬を含有する第１
〜６項記載の方法を実施するためのキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラルフ・ビルツ ドイツ50674ケルン・マイスター−ゲルハ ルト−シユトラーセ23 (72)発明者 ケルステイン・ボーマン ドイツ47798クレーフエルト・フランケン リング109 (72)発明者 ビルゲ・シエツパー ドイツ50259プルハイム・グスタフ−ハイ ネマン−シユトラーセ41 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 CB02 FA16 FA20 FB01 FB03 FB07 FB12

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞もしくは組織サンプルにおける少な
   くとも２種のマーカーが同時に検出され、そしてシグナ
   ル強度が組み合わされ、かつ確認されることを特徴とす
   る、がん細胞およびそれらの前駆体の自動化可能な同定
   方法。