DE19613691A1

DE19613691A1 - Arzneimittel für die Behandlung von Tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE19613691A1
Application number: DE19613691A
Authority: DE
Inventors: Martin Dr Oft; Ernst Dr Reichmann; Hartmut Dr Beug
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 1997-10-09
Also published as: CA2250839A1; AU2508597A; WO1997037678A1; US20020127542A1; US6383733B1; JP2000509024A; EP0896543A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Tumortherapie.

Mehr als 80% der im Menschen vorkommenden Tumoren sind epithelialen Ursprungs. Die Bildung epithelialer Tumoren (Karzinome) ist ein vielstufiger Prozeß, was am deutlichsten in der Progression des menschlichen Colonkarzinoms (Powell, et al., 1993) und des Hauttumors der Maus (Wright, et al., 1994) veranschaulicht wird. Von Karzinomen wird angenommen, daß sie von einzelnen oder kleinen Gruppen von Zellen ausgehen, in denen Mutationen stattgefunden haben. Diese Zellen entwickeln sich zu benignen, epithelialen hyper- oder dysplastische Bereichen. Die Progression dieser hyperplastischen Bereiche zu einem Karzinom in situ, die dann invasive und metastatische Eigenschaften erwerben kann, erfordert eine Anzahl weiterer Mutationen in der Tumorzelle. Charakteristischerweise erwerben diese Zellen die Fähigkeit, ihre Basalmembran proteolytisch abzubauen, sich von einer seßhaften, polarisierten Zelle zu einer nicht polarisierten, zur
Fortbewegung im Gewebe befähigten Zelle zu entwickeln, im Blutstrom zu überleben und an entfernten Stellen Metastasen zu bilden (Liotta, et al., 1991; Liotta und Stetler-Stevenson, 1991).

Obwohl an den vielfachen Veränderungen in Architektur und Verhalten von bösartig transformierten Zellen tiefgreifende Veränderungen der Genexpression beteiligt sind, kommt keine dieser neu erworbenen Eigenschaften nur bei invasiven Tumorzellen vor. Das Anheften an die Basalmembran, deren Proteolyse sowie die Migration durch die Basalmembran und das darunterliegende Mesenchym stellen wichtige Schritte bei normalen Vorgängen dar, wie z. B. bei der Implantation des Trophoblasten, bei Gestaltungsbewegungen während der Embryonalentwicklung, bei der Entwicklung der Brustdrüse und der Reorganisation von Epithelien während der Wundheilung (Aznavoorian, et al., 1993). Für ein besseres Verständnis der Entwicklung und Progression von Karzinomen ist es entscheidend zu verstehen, wie die Deregulierung dieser normalen Vorgänge bei der Zellinvasion und Metastasierung erfolgt.

Arbeiten der letzten Jahre haben zur Aufklärung von molekularen Mechanismen beigetragen, die an der Modulation des epithelialen Phänotyps unter normalen und pathologischen Situationen beteiligt sind (Reichmann, et al., 1992; Frisch, 1994). Außerdem spielen exogene Polypeptidfaktoren wie Scatter Factor (SF)/Hepatozytenwachtstumsfaktor (HGF) und Neu-Regulin/HER-Regulin wichtige Rollen bei der Veränderung der Migrations- und Differenzierungseigenschaften von epithelialen Zellen (Birchmeier, et al., 1993; Hartmann, et al., 1994; Soriano, et al., 1995). Erst kürzlich wurde der Transformierende Wachstumsfaktor 1 ("Transforming Growth Factorβ 1", TGFβ1) als ein weiterer potenter Modulator des Phänotyps von Brustepithelzellen identifiziert (Miettinen, et al., 1994; Zambruno, et al., 1995).

TGFβ1 gehört zu einer großen Superfamilie von multifunktionellen Polypeptidfaktoren. Die TGFβ-Familie selbst besteht aus drei Genen, TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3, die extrem hohe Homologie zueinander aufweisen. In Säugetieren gehören zur TGFβ-Superfamilie die verschiedenen TGFβ-Gene ebenso wie die embryonalen Morphogene, wie z. B. die Familie der Aktivine, "Müllerian Inhibitory Substance", und die bmp-Familie ("Bone Morphogenetic Protein"), die wichtige Rollen sowohl bei der Regulierung der Embryonalentwicklung wie bei der Re- oder Umorganisation von Epithelien spielen (Roberts und Sporn, 1992). TGFβ1 inhibiert das Wachstum vieler Zelltypen, einschließlich epithelialer Zellen, stimuliert jedoch die Proliferation verschiedener Arten von mesenchymalen Zellen. Darüberhinaus induzieren TGFβs die Synthese extrazellulärer Matrixproteine, modulieren die Expression von Matrixproteinasen und -proteninaseinhibitoren und verändern die Expression von Integrinen. Außerdem werden TGFβs in großer Menge in vielen Tumoren exprimiert (Derynck, et al., 1985; Keski-Oja, et al., 1987). Dieses starke Vorkommen in neoplastischen Geweben könnte darauf hinweisen, daß TGFβs strategische Wachstums-/Morphogenesefaktoren sind, die die malignen Eigenschaften beeinflussen, welche mit den verschiedenen Stufen der metastatischen Kaskade assoziiert sind. TGFβs inhibieren das Wachstum normaler epithelialer und relativ differenzierter Karzinomzellen, während dedifferenzierte Tumorzellen, denen viele epitheliale Eigenschaften fehlen, im allgemeinen gegen die Wachstumshemmung durch TGFβs resistent sind (Hoosein, et al., 1989; Murthy, et al., 1989). Darüberhinaus kann TGFβ1 das invasive und metastatische Potential einer Brustadenomzellinie verstärken (Welch, et al., 1990), was für die Rolle von TGFβ1 in der Tumorprogression spricht. Die molekularen Mechanismen, welche der Wirkung von TGFβs während der Tumorzellinvasion und der Metastasierung zugrunde liegen, bedürfen jedoch weiterhin der Aufklärung.

An der Entstehung von Brustkrebs (Mammakarzinom) des Menschen sind die Überexpression von (mutierten, oder häufiger, nicht-mutierten) ras-Genen und die Überexpression von Rezeptor-Tyrosinkinasen, die den Ras-Signalübertragungsweg aktivieren, beteiligt (De Bortoli, et al., 1985; Kern, et al., 1990; LeJeune, et al., 1993).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß Ha-Ras-transformierte Brustepithelzellen (EpRas-Zellen) bei der Entstehung von Tumoren in Mäusen einen Übergang (Konversion) vom epithelialen zum fibroblastoiden (bzw. mesenchymalen) Zustand durchmachen. Dieser Übergang wird im folgenden als EF-Übergang oder EF-Konversion ("Epithelial-Fibroblastoid Cell Conversion", EFC) bezeichnet. Solch eine EF-Konversion wurde auch in vitro nachgewiesen. Hierzu wurden EpRas-Zellen in Typ I-Kollagen-Gelen kultiviert. In Abwesenheit von Serum entwickelten sich diese Zellen zu dreidimensionalen, zystischen Hohlstrukturen, deren Wände aus einer einlagigen Schicht (Monolayers) polarisierter epithelialer Zellen bestanden. TGFβ1 führte dazu, daß dieselben Ras-transformierten Zellen sich zu ungeordneten Strängen entwickelten, die aus spindelförmigen Zellen mit fibroblastoiden Eigenschaften bestanden. In nicht-transformierten Epithelzellen war TGFβ1 nicht in der Lage, solche Änderungen herbeizuführen. Die konvertierten Zellen waren sowohl in Kollagengelen als auch im Hühnerherz- Invasionsassay stark invasiv. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die fibroblastoiden Zellen, wenn sie einmal die Konversion durchgemacht hatten, selbst große Mengen TGFβ1 produzierten. Wurde dieses selbst produzierte TGFβ1 durch einen TGFβ1 neutralisierenden Antikörper inaktiviert, entwickelten sich die Zellen zu einem polarisierten, epithelialen Phänotyp zurück. Dieses Zellverhalten deutet daraufhin, daß der konvertierte fibroblastoide Phänotyp durch TGFβ1 aufrechterhalten wird, wobei TGFβ1 über eine autokrine Schleife ("autocrine loop") wirkt.

Schließlich wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß der in vitro beobachtete Mechanismus auch in vivo gilt: Tumorzellen, die eine EF-Konversion durchgemacht hatten, produzierten selbst TGFβ1. Außerdem ist TGFβ1 in der Lage, den invasiven Phänotyp von Ha- Ras-transformierten Brustepithelzellen in experimentell induzierten Tumoren auszulösen und aufrechtzuerhalten.

Die vorliegenden Erfindung beruht somit auf folgenden Erkenntnissen:

An der Karzinogenese sind zahlreiche Mutationen in Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen beteiligt (Vogelstein und Kinzler, 1993). Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie bestimmte onkogene Mutationen mit definierten Veränderungen im Phänotyp der Zelle und in der Art, in der diese Veränderungen dann zur Tumorzellinvasion und Metastasierung beitragen, in Zusammenhang stehen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß das Ras-Onkoprotein sowohl in Kollagengelen als auch in sich entwickelnden Tumoren die zelluläre Reaktion von Brustepithelzellen auf TGFβ1 dramatisch verändert. Dieses modifizierte Reaktionsvermögen der Zellen führt dazu, daß TGFβ1 eine EFC induziert. Wenn sie einmal konvertiert sind, produzierten diese fibroblastoiden Zellen selbst hohe Konzentrationen an TGFβ1 und behalten auf diese Weise ihre eigenen mesenchymalen und invasiven Eigenschaften bei.

Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen wurde von der Beobachtung ausgegangen, daß Ras-transformierte Mausbrustepithelzellen während der Tumorbildung zu invasiven Spindelzellen konvertieren. Ähnliche Spindelzelltumoren wurden im Gehirn, in der Haut, im Kolon und in der Brust beschrieben, sowohl beim Menschen als auch in Tiermodellen (Buchmann, et al., 1991; Guldberg, 1923; Sandford, et al., 1961; Sonnenberg, et al. 1986; Stoler, et al. 1993). Die Herkunft dieser Spindelzellkarzinome bleibt noch immer unklar, obwohl einige Forscher glauben, daß diese oft hochinvasiven Tumoren eine eigene Tumorklasse fibroblastoiden Ursprungs darstellen, während andere Autoren von einem epithelialen Ursprung dieser Tumoren ausgehen.

In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Modellsystem stammten die Spindelzelltumoren eindeutig von den ins Tier injizierten epithelialen Donor-Zellen ab. Aus dem Tumor stammende Spindelzellen überlebten die Selektion in G418 und exprimierten noch zell- und gewebespezifische Zytokeratine, was ihre Donorzelleigenschaft und ihre epitheliale Herkunft bestätigt. Ferner ergaben die durchgeführten Untersuchungen, daß die injizierten Epithelzellen und die konvertierten fibroblastoiden Tumorzellen vom gleichen Zellklon abstammten und eine Re-Integration des retroviralen Vektors in andere Stellen des Genoms als mögliche Ursache der Veränderungen ausgeschlossen werden konnte. Beinahe noch wichtiger war, daß der fibroblastoide Phänotyp der konvertierten Zellen unter Standardkulturbedingungen absolut stabil war und daß sich die Zellen nach Neutralisierung der TGFβ1-Aktivität effizient zu polarisierten epithelialen Zellen rückverwandelten. Dies schließt aus, daß genetische oder epigenetische Veränderungen für die Zellkonversion verantwortlich sind. Die wahrscheinlichste Erklärung für die dramatische Veränderung des Phänotyps in vivo ist die, daß eine Wechselwirkung zwischen den Ras transformierten Zellen und mesenchymalen Zellen in ihrer Umgebung zu einer Umwandlung der epithelialen Zellen in fibroblastoide Zellen führt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde somit gezeigt, daß EFC in bestimmten Tumoren ein für die Karzinogenese relevanter Mechanismus ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde außerdem gezeigt, daß TGFβ1 sowohl in Kollagen-Gelen als auch während der Tumorentwicklung EFC induziert. Bemerkenswerterweise erforderte diese TGFβ1-induzierte Konversion die Mitwirkung eines aktivierten Ras- Proteins, da weder primäre Brustepithelzellen noch die parentalen EpH4-Zellen eine TGFβ1-induzierte EFC durchmachten. Daraus kann geschlossen werden, daß EFC durch eine Synergie verschiedener Signalübertragungswege ausgelöst wird, die entweder von TGFβ1 oder von Ha-Ras aktiviert werden. Diese Annahme wird durch andere Befunde gestützt, die zeigen, daß aktivierte Ras-Proteine ähnliche Wirkungen auf Zellen haben können wie Mitglieder der TGFβ-Familie. Dies trifft z. B. zu für die myogene Differenzierung (Payne, et al., 1987) und für die Bildung des Mesoderms (Whitman und Melton, 1992). Im Herzmuskel reguliert TGFβ Gene hoch, die mit dem durch hämodynamische Belastung regulierten Wachstum des embryonalen Herzes assoziiert sind. Diese Effekte werden zumindest teilweise durch aktiviertes Ras nachgeahmt (Parker, et al., 1990; Thorburn, et al., 1993), was vermuten läßt, daß, zumindest in bestimmten biologischen Systemen, Ras und TGFβ synergistisch wirken können.

In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, daß die Überexpression von normalem und mutiertem Ras in einer beträchtlichen Zahl humaner Karzinome, einschließlich solcher der Brust (De Bortoli, et al., 1985; Hand, et al., 1984; Slamon, et al., 1984), beobachtet wurde. Darüberhinaus sind autokrine Produktion von Liganden sowie Überexpression und/oder eine konstitutive Aktivierung von Rezeptor-Tyrosinkinasen, die am Anfang von c-Ras einschließenden Signalübertragungswegen stehen (z. B. HER-1, HER-2), häufige Änderungen in Brustkazinomen (Kern, et al., 1990; LeJeune, et al., 1993). Da TGFβ1 auch in vielen humanen Tumoren reichlich vorhanden ist (Derynck, et al., 1985; Keski-Oja, et al., 1987; Thompson, et al., 1991) kann aufgrund der im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse gefolgert werden, daß Ras- und TGFβ1-induzierte Signale auch in humanen Tumoren synergistisch wirken. Ein weiterer wesentlicher Befund im Rahmen der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, daß TGFβ und Ras bei der Regulation der Plastizität des polarisierten epithelialen Phänotyps kooperieren.

Nach serumfreier (und TGFβ-freier) Zellkultur in rekonstituierten Kollagen-Gelen zeigten EpRas-Zellen eine hohe Fähigkeit zur Organogenese und einen hohen Grad an epithelialer Polarisierung. Die Ep-Ras Zellen bildeten jedoch vorwiegend erweiterte Tubuli sowie alveoläre Hohlräume, im Gegensatz zu den engen, sich verzweigenden Tubuli, die von den parentalen EpH4-Zellen oder von primären Brustepithelzellen gebildet wurden. Dies zeigt, daß das Ras-Onkoprotein allein, in Abwesenheit von TGFβ, in der Lage ist, das morphogenetische Verhalten epithelialer Zellen bis zu einem gewissen Grad zu modulieren. In anderen Systemen wurden stärkere Wirkungen von aktiviertem Ras auf die epitheliale Polarität beschrieben (Eaton und Simons, 1995). Hier bewirkte die Transformation mit Ras eine Störung der polaren Expression apikaler Proteine, während die Expression basolateraler Markerproteine unbeeinflußt blieb. (Schoenenberger, et al., 1994). Da die vorbeschriebenen Experimente in Gegenwart von FCS (welches selbst TGFβ1 enthält) durchgeführt wurden, können sie jedoch nur schwer mit den im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen verglichen werden, in denen solche offensichtliche Polaritätsdefekte nicht beobachtet werden konnten. Da exogener TGFβ1 die Zellpolarität vollständig zerstörte, ist es möglich, daß die teilweise Zerstörung der Polarität in den oben erwähnten Ras-transformierten Zellsystemen auf die im Serum vorhandenen TGFβ1- Konzentrationen zurückzuführen ist. Nichtsdestoweniger ist das morphogenetische Verhalten in EpRas-Zellen leicht verändert, möglicherweise als Folge einer verstärkten Proteaseaktivität.

TGFβ zerstörte die Polarität epithelialer Zellen vollständig und bewirkte, daß die Zellen spindelförmig und invasiv wurden. Diese Veränderungen waren von der ständigen Gegenwart von TGFβ1 abhängig, da die Spindelzellen sich bei Zugabe von TGFβ1 neutralisierenden Antikörpern rasch in polarisierte epitheliale Zellen rückverwandelten. Die wesentlichste Schlußfolgerung aus diesen Ergebnissen ist die, daß Ras-transformierte Zellen durch TGFβ1 zwischen einem quasi-normalen und einem hochtumorigenen Phänotyp hin und her geschaltet werden können. Solch eine verstärkte phänotypische Plastizität könnte für invasiv wachsende Zellen im allgemeinen charakteristisch sein und dürfte erklären, warum invasive Tumorzellen oft die migratorischen Eigenschaften von Fibroblasten zeigen. Im Gegensatz dazu können sich dieselben Zellen, nach der Extravasation, am Ort der Metastasenbildung in gut differenzierte sekundäre Tumoren entwickeln. Eine erhöhte phänotypische Plastizität ist somit ein Kennzeichen von invasiven Tumorzellen.

Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnene wesentliche Erkenntnis ist die, daß EpRas- Zellen eine EFC durchmachen müssen, um signifikante Mengen von TGFβ1 sowohl in vitro als auch in vivo zu produzieren. Es konnte gezeigt werden, daß Tumorzellen ihren fibroblastoiden Phänotyp über die autokrine Produktion von TGFβ1 aufrechterhalten können und daß die autokrine TGFβ1-Produktion und Rückwirkung auf die produzierende Zelle (autocrine loop) unterbrochen werden muß, um die phänotypische Rück-Umwandlung der Zellen möglich zu machen. Die Fähigkeit von TGFβ1, EFC zu induzieren und dann effizient den invasiven Phänotyp aufrechtzuerhalten, kann auch erklären, warum die zunächst epithelialen Ras-transformierten Zellen sich während des Tumorwachstums progressiv und einheitlich in Spindelzellen umwandelten.

Kurz nach ihrer Injektion in Mäuse exprimierten polarisierte Ras-transformierte Epithelzellen weder signifikante Mengen an TGFβ1 noch setzten sie es frei. Wie mittels in situ Hybridisierung und Immunhistochemie festgestellt wurde, produzierten jedoch die den Mikrotumor umgebenden Stromazellen das Zytokin. Diese Stromazellen konnten als Fibrozyten und Endothelzellen identifiziert werden, es ist jedoch anzunehmen, daß andere Zelltypen, wie Makrophagen und Lymphozyten, wahrscheinlich ebenfalls vorhanden waren; von all diesen Zelltypen ist bekannt, daß sie TGFβ1 produzieren und freisetzen. Die wahrscheinlichste Schlußfolgerung daraus ist die, daß die Wirkungen von TGFβ1 vorwiegend auf der Ebene seiner proteolytischen Aktivierung reguliert werden. Die primäre Regulation von TGFβ erfolgt durch Faktoren, die die Prozessierung des latenten zum biologisch aktiven Molekül steuern. Über die TGFβ-Aktivierung in vivo ist jedoch fast nichts bekannt. Die Protease Plasmin kann in Ko-Kultursystemen zweier Zelltypen latentes TGFβ1 aktivieren, jedoch nur, wenn zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt stehen oder einander dicht angenähert sind (Antonelli- Orlidge, et al., 1989; Sato, et al., 1990). Dieser nahe Kontakt von verschiedenen Zelltypen dürfte in dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten System nach der Einkapselung des Tumors durch das Stroma stattfinden und, in einem sogar größeren Ausmaß, wenn Donor-Tumorzellen sich während der Tumorentwicklung mit Stromazellen des Empfängertieres vermischen (Fig. 2B). Darüberhinaus aktiviert Thrombospondin (TSP), ein extrazelluläres Matrixprotein, latenten TGFβ. In diesem Fall findet die Aktivierung in der löslichen Phase statt und erfordert keine proteolytische Aktivität (Schultz-Cherry, et al., 1994). Tatsächlich wurde über die die Krebsentstehung unterstützende Rolle von Thrombospondin und eine erhöhte Thrombospondinkonzentrationen in malignen Brustkrebsen kürzlich berichtet (Castle, et al. 1991; Wong, et al., 1992). Es wurde somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß die autokrine Produktion von TGFβ1, in Kooperation mit dem Onkoprotein Ha-Ras, den fibroblastoiden Phänotyp aufrecht erhält.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnenen Erkenntnisse und Schlußfolgerungen haben zu dem in Fig. 9 dargestellten hypothetischen Modell geführt. Es wird postuliert, daß der für die Tumorentstehung relevante TGFβ1 primär von infiltrierenden Zellen des Tumor-Stromas, wie Fibrozyten, Endothelzellen, Lymphozyten und Makrophagen, produziert wird. Die Wechselwirkung der Tumorzellen mit den verschiedenen Zelltypen des Tumor-Stromas dürfte die effiziente Produktion und/oder Aktivierung von TGFβ1 auslösen. Dies wiederum dürfte die epithelialen Tumorzellen dazu veranlassen, sich in den fibroblastoiden und invasiven Phänotyp zu verwandeln. Diese fibroblastoiden Zellen beginnen dann, selbst TGFβ1 zu produzieren, welches in einer autokrinen Schleife (autocrine loop) auf sie zurückwirkt und somit sowohl die Aufrechterhaltung des fibroblastoiden Phänotyps bewirkt als auch die Rekrutierung weiterer epithelialer Zellen zur EFC erleichtert. Weitere Mutationen oder selektive Mechanismen dürften einen Teil dieser invasiv wachsenden Zellen dazu veranlassen, in Blutgefäße hinein- und wieder herauszuwandern und schließlich an entfernten Stellen sekundäre Tumoren zu bilden. Dieses Modell steht im Einklang mit Befunden, die zeigen, daß eine verstärkte TGFβ1-Expression auch an der Progression zur Bösartigkeit in einem Prostatakrebs-Mausmodell beteiligt ist (Thompson, et al., 1992; 1993).

Zusammenfassend weisen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Befunde daraufhin, daß die gesteigerte Empfindlichkeit und veränderte Reaktionsbereitschaft der Zellen gegenüber der Fähigkeit von TGFβ, den epithelialen Phänotyp zu modulieren, durch Ras-(Onko)Proteine hervorgerufen wird. Diese durch ein Onkogen induzierte, veränderte Reaktionsweise auf normale Umgebungssignale, wie z. B. die durch TGFβ1 induzierten, dürfte sowohl zu einer veränderten Genexpression in der Tumorzelle als auch zu inkorrekter Übertragung oder Interpretation von Signalen zwischen Tumor- und Stromazellen führen. Dieser abnormale "Crosstalk" zwischen Tumorzellen und ihrer unmittelbaren Umgebung dürfte die treibende Kraft für das sein, was man gemeinhin als Tumorprogression bezeichnet.

Ferner zeigen die Ergebnisse der Versuche, daß aktiviertes Ras (oder überexprimierte Rezeptor- Tyrosinkinasen, die den Ras-Signalübertragungsweg aktivieren) sowohl in der normalen Entwicklung als auch bei der Karzinogenese mit dem TGFβ1-Rezeptor kooperieren. Daran dürften Prozesse, wie die Induktion/Aktivierung von stromalem TGFβ1 durch Wechselwirkung von epithelialen und mesenchymalen Zellen sowie EF-Konversion, induziert und aufrechterhalten durch TGFβ1, beteiligt sein. Der Hauptunterschied zwischen normalen und Ras exprimierenden Tumorzellen dürfte daher darin gelegen sein, daß die normale, strikt regulierte Funktion von TGFβ1 bei der Morphogenese der normalen Zelle in der Tumorzelle durch die Expression des Ras-Onkogens zu einer konstitutiven und höchst abnormalen Funktion wird.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Arzneimittel für die Tumortherapie bereit zustellen.

Bei der Lösung der gestellten Aufgabe wurde von folgenden, aus den durchgeführten Versuchen gewonnenen Erkenntnissen ausgegangen: 1. Die Wirkung von TGFβ auf die Tumorzelle führt in Kooperation mit der Expression von oncogenem Ras bzw. mit der Überexpression von normalem Ras oder von Rezeptortyrosinkinasen, die den Ras- Signaltransduktionsweg aktivieren, zu einer Konversion epithelialen Zellen in fibroblastoide Zellen mit invasivem Potential. 2. Die autokrine Produktion von TGFβ durch die konvertierten Zellen führt zur Aufrechterhaltung des entarteten, invasiven Zellzustandes.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde außerdem, im Hinblick auf eine Abschätzung möglicher Nebenwirkungen von TGFβ1-Inhibitoren, die Rolle von TGFβ1 bei der normalen Brustdrüsenentwicklung untersucht.

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel für die Behandlung von Tumorerkrankungen, die durch einen Übergang von Zellen vom epithelialen in den fibroblastoiden Zustand (EF-Konversion) charakterisiert sind. Das Arzneimittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Substanz enthält, die die Wirkung von TGFβ auf die Zellen inhibiert, und/oder daß es eine Substanz enthält, die die Expression oder die Funktion von onkogenem Ras und/oder die Überexpression von normalem Ras in den Zellen inhibiert.

Die Substanz, die die Wirkung von TGFβ auf die Zellen inhibiert, wird im folgenden als "TGFβ-Inhibitor" bezeichnet.

TGFβs, wie auch die anderen Mitglieder der TGFβ- Superfamilie von multifunktionellen Polypeptidfaktoren, u. a. Aktivine, üben ihre Wirkung durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren aus. Die TGFβ- Rezeptoren vom Typ I und Typ II bilden nach Bindung des Liganden heterodimere Komplexe, wodurch die Signalübertragung eingeleitet wird. Die Typ II- Rezeptoren, die hinsichtlich ihrer Aktivität der Gruppe der Rezeptor-Serin/Threonin-Kinasen zugeordnet werden, binden den Liganden, benötigen jedoch, um das vom Liganden erhaltene Signal weiterleiten zu können, die Assoziierung mit den Typ I-Rezeptoren welche Serin- Threonin-Kinasen darstellen. Während die Typ II- Rezeptoren für die Ligandenspezifität verantwortlich sind, heterodimerisieren die funktionell unterschiedlichen Typ I-Rezeptoren mit mehreren Typ II- Rezeptoren. Das Zusammenwirken des Typ II-Rezeptors mit einem bestimmten Typ I-Rezeptor bewirkt die Aktivierung spezifischer Signalübertragungswege und als Folge davon eine transkriptionelle Antwort auf das durch den Liganden an die Zelle übermittelten Signals.

Die Wirkung eines TGFβ-Inhibitors beruht darauf, daß er die durch die Rezeptoraktivierung ausgelöste zelluläre Antwort blockiert, d. h. er verhindert, daß das TGFβ- Rezeptorsystem aktiviert und damit der zelluläre Signalübertragungsweg ausgelöst wird.

Da es die Typ I-Rezeptoren sind, die nach Bindung des Liganden an den Typ II-Rezeptor, und an den Typ I- Rezeptor selbst, für die spezifische transkriptionelle Antwort, die letztlich den fibroblastoiden Phänotyp hervorruft, verantwortlich sind, stellt der Typ I- Rezeptor eines der Zielmoleküle für den TGFβ-Inhibitor dar.

Weitere Mechanismen für die Wirkung eines TGFβ- Inhibitors beruhen auf der Verhinderung der Interaktion zwischen dem Liganden TGFβ und dem Typ II-Rezeptor, der Verhinderung des vom Typ II-Rezeptor an den Typ I- Rezeptor übermittelten Signals, das die Aktivierung des Typ I-Rezeptors bewirkt, der Blockierung der Bindung von TGFβ an den Typ I-Rezeptor, der Inhibierung der Aktivität des Typ I-Rezeptors oder der Inhibierung eines Effektormoleküls des durch den Typ I-Rezeptor aktivierten Signalübertragungsweges.

Beispiele für TGFβ-Inhibitoren sind Antikörper, die TGFβ neutralisieren, insbesondere monoklonale Antikörper, TGFβ-Antisense-RNA-Moleküle oder dominant-negative TGFβ- Rezeptoren, insbesondere des Typs I.

Ein Weg, um weitere geeignete, insbesondere niedermolekululare, Inhibitoren zu finden, besteht darin, in einem ersten Schritt zu ermitteln, welcher der Typ I-Rezeptoren für den Übergang vom epithelialen zum fibroblastoiden Zustand der Zellen verantwortlich ist. Dazu wird zweckmäßig die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete EpRas-Zellinie (oder eine andere epitheliale Zellinie, die onkogenes Ras exprimiert oder normales Ras überexprimiert und in der Lage ist, die EF-Konversion herbeizuführen), daraufhin untersucht, welchen TGFβ-Typ I-Rezeptor sie exprimiert. Diese Untersuchung kann mittels RT-PCR ("Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction") vorgenommen werden, indem Oligonukleotide, abgleitet von bekannten TGFβ-Typ I-Rezeptoren, als PCR Primer benutzt werden, um aus EpRas-DNA die betreffende Rezeptor-DNA- herauszuamplifizieren und damit den bzw. die in diesen Zellen exprimierten TGFβ-Typ I-Rezeptor zu identifizieren. Nach Identifikation eines oder mehrerer in den Zellen exprimierter TGFβ-Typ I-Rezeptoren können dominant-negative Mutanten (bestehend aus extrazellulärer und Transmembrandomäne, verkürzt um mindestens einen Teil der zytoplasmatischen Domäne, wie z. B. von Miettinen et al., 1994, vorgeschlagen) des bzw. der Rezeptoren hergestellt und in der Zelle exprimiert werden. Wird durch die Expression der dominant-negativen Rezeptor-Mutante die EF-Konversion blockiert, ist dies eine Bestätigung dafür, daß dieser Rezeptor-Subtyp (als solcher) direkt oder indirekt für die die Signalübertragung, die die EF-Konversion zur Folge hat, notwendig ist. Dieser TGFβ-Typ I-Rezeptor- Subtyp stellt somit das Zielmolekül für den TGFβ- Inhibitor dar und bietet somit die Voraussetzung für die Etablierung eines zellulären Screening Assays, mittels dem gezielt nach Substanzen gescreent werden kann, die dieses Zielmolekül inhibieren.

Als nächstes wird in einer Zelle, die die EF-Konversion durchmacht, z. B. zweckmäßigerweise wiederum in der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten EpRas- Zelle, untersucht, welcher der biologischen Effekte, von denen angenommen werden kann, daß sie, nach Assoziation eines bestimmten TGFβ-Typ-I-Rezeptors mit dem Typ II-Subtyp, und Durchlaufen des Signalübertragungsweges, in der Zelle tatsächlich eintritt.

Die zu erwartenden Effekte sind in zwei Gruppen zu unterteilen: Zu der ersten Gruppe gehören die in der Literatur beschriebenen Effekte von TGFβ auf normale mesenchymale und epitheliale Zellen, z. B. bei der Wundheilung. Die zweite Gruppe von Veränderungen sind diejenigen, die speziell bei der Wirkung von TGFβ auf transformierte Zellen auftreten (wie z. B. in dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Versuch). Während TGFβ-Wirkungen der ersten Gruppe für einen Primär-HTS-Screen ("High Throuput Screen", Screen mit hoher Durchsatzrate) herangezogen werden können, müssen gegebenenfalls gefundene Inhibitor-Kandidaten unbedingt auf ihre inhibierende Wirkung auf TGFβ Effekte der zweiten Gruppe getestet werden.

Zu TGFβ-Effekten des ersten Typs zählen i) die Induktion extrazellulärer Matrixproteine, wie Fibronektin, Laminin, Elastin; ii) die Induktion des Proteaseinhibitors PAI (Plasminogen Activator Inhibitor) und damit die Inhibierung der zellulären Proteaseaktivität, und iii) ein Wachstumsarrest bestimmter Zelltypen, vor allem von normalen Epithelzellen sowie von nur leicht entarteten, noch im wesentlichen epitheloiden Tumorzellinien. Einige dieser Effekte eignen sich zum Aufbau eines zellulären Assay- Systems zum Screenen von Substanzen, in dem der gewählte Effekt direkt als Nachweissystem für die inhibierende Wirkung der Substanz die EF-Konversion herangezogen wird.

Um festzustellen, ob die durch Aktivierung des TGFβ- Rezeptorsystems ausgelöste EF-Konversion in der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten EpRas- Zellinie über dieselben Typ I-Rezeptoren übermittelt wird wie die Induktion von PAI (bzw. eines anderen durch TGFβ regulierten Moleküls) in nicht transformierten Zellen, z. B. in der (ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung benutzten) normalen Ausgangszellinie EpH4, kann z. B. überprüft werden, ob die Induktion von PAI (bzw. eines anderen Moleküls) oder der in dieser Zellinie sehr gut ausgeprägten Wachstumshemmung, durch eine dominant-negative Mutante desselben Typ I- Rezeptors blockiert wird, die auch die EF-Konversion blockiert.

Nachdem dieser Zusammenhang bestätigt wurde, kann ein Screening Assay auf der Grundlage einer Testzelle etabliert werden, die mit einem Plasmid transformiert ist, in der ein Reportergen, z. B. das Luciferasegen, unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz des PAI-Gens (oder eines Gens, das für ein anderes von TGFβ reguliertes Molekül, z. B. für ein extrazelluläres Matrixproteins, kodiert) steht. Die Testzelle ist außerdem transformiert mit dem Typ I-Rezeptor, von dem sich erwiesen hat, daß er sowohl die EF-Konversion aus löst als auch die Induktion von PAI oder eines anderen durch TGFβ regulierten Moleküls.

Findet man in einem derartigen Screening Assay eine Substanz, welche die nach Bindung von TGFβ an den Typ I- Rezeptor und Aktivierung des Signalübertragungsweges ausgelöste Reportergenexpression ganz oder teilweise inhibiert, kann geschlossen werden, daß es der durch die Aktivierung des Typ I-Rezeptors aktivierte Signalübertragungsweg ist, den die Substanz blockiert. (Dieselbe Substanz sollte in einer Kontrollzelle, auf die kein TGFβ aufgebracht wurde, die geringe Reportergen-Expression nicht beeinflussen).

Unter der Voraussetzung, daß die EF-Konversion der EpRas-Zellen durch denselben Typ I-Rezeptor vermittelt wird wie der Wachstumsarrest der normalen epithelialen Ausgangszelle (EpH4), kann die Blockierung des TGFβ- Rezeptors durch Testsubstanzen sehr einfach durch die Aufhebung einer durch TGFβ bewirkten Wachstumshemmung gemessen werden. Da TGFβ in normalen EpH4 Zellen unter bestimmten Bedingungen effizient Apoptose bewirkt, sollten wirksame Inhibitoren des TGF-Rezeptors wie überlebens-/wachstumsstimulierende Faktoren wirken. Als Kontrollzelle bieten sich die EpRas Zellen an, die in ihrer Proliferation/Überlebensfähigkeit von TGFβ kaum beeinflußt werden. Die durch die Testsubstanzen vermittelte Aufhebung des Wachstumsarrests/Blockierung der Apoptose kann auf einfache Weise durch den Formazan/Farbassay oder durch Thymidineinbau gemessen werden, somit würde sich dieses Testsystem für HTS Primärscreens eignen.

Eine weitere Möglichkeit für ein zelluläres Assay- System, mit dem Substanzen auf ihre inhibierende Wirkung auf die durch Aktivierung des TGFβ- Rezeptorsystems ausgelöste EF-Konversion getestet werden können, beruht auf der Expression von Proteinen, die für den fibroblastoiden Zelltyp nach EF-Konversion charakteristisch und somit ein Indikator für das Eintreten der EF-Konversion sind. Ein Beispiel dafür ist Vimentin (Reichmann et al, 1992), von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt wurde, daß seine Expression mit der durch Kooperation von Ras und TGFβ ausgelösten EF-Konversion einhergeht. Weitere Beispiele für andere Marker des fibroblastoiden Phänotyps sind der Verlust der Expression von E-Cadherin mRNA sowie die de-novo Expression von Fibronektin und diverser Proteasen (UPA, TPA, Reichmann et al, 1992). Eine geeignete, Ras exprimierende Testzelle ist mit einem Plasmid transformiert, in dem ein Reportergen unter der Kontrolle des Vimentin-Gen Promoters oder von Promotoren eines der anderen erwähnten fibroblastoiden Marker-Gene steht. Die Modulation der Reportergenexpression durch eine Testsubstanz sollte dann mit durch die gleichen Inhibitoren bewirkten Modulation der EC-Konversion korrelieren.

Eine weitere Möglichkeit, Substanzen zu finden, die die Aktivierung des TGFβ-Rezeptorsystems inhibieren, benutzt als Nachweissystem die Expression von TGFβ selbst. Dieses Assay-Prinzip beruht auf der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnenen Erkenntnis, daß die Aktivierung des TGFβ-Rezeptorsystems in Ras exprimierenden Zellen durch den Liganden TGFβ die autokrine Produktion von TGFβ bewirkt, welcher in einer autokrinen Schleife (autocrine loop) auf die Zellen zurückwirkt. In einem solchen Assay, mit dem sowohl die durch Aktivierung des TGFβ-Rezeptorsystems als auch durch die Expression von Ras bewirkte Induktion des autokrinen TGFβ-Loops erfaßt werden kann (die Wirkung von Substanzen, die in einem solchen Test die TGFβ- Expression inhibieren, tun dies aufgrund ihrer Wirkung auf die Aktivierung des TGFβ-Rezeptorsystems und ihrer Wirkung auf Ras), enthalten die Zellen ein Reportergenkonstrukt, welches unter der Kontrolle des TGFβ-Gen-Promoters (Kim et al, 1989), steht.

In einem der beschriebenen Testsysteme im Primärscreen gefundene Inhibitoren des TGFβ-Rezeptors werden zweckmäßigerweise in Sekundärscreens auf ihre Spezifität getestet. Dies kann vor allem durch direkte Inhibition der TGFβ-abhängigen EF-Konversion von EpRas Zellen in Kollagen-Gelen erfolgen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Inkubation von auf Plastikschalen in geringer Dichte ausgesäten, konvertierten EpRas Zellen (z. B. aus Maustumoren) mit den gefundenen Inhibitoren des TGFβ-Rezeptors. Wirksame Substanzen sollten die Umwandlung von fibroblastoiden in epitheliale Zellen selbst in Anwesenheit von TGFβ auslösen.

Die Substanz, die die Expression oder die Funktion von onkogenem Ras und/oder die Überexpression von normalem Ras (bzw. die Folge dieser Überexpression) in den Zellen inhibiert, wird im folgenden als "Ras-Inhibitor" bezeichnet.

Ras-Inhibitoren im Sinne der Definition der vorliegenden Erfindung inhibieren entweder Ras direkt, indem sie die Aktivierung/Funktion von Ras selbst inhibieren, oder indirekt, indem sie die Aktivierung/Funktion eines Ras-Effektormoleküls inhibieren, das im Ras-Signalübertragungsweg unterhalb von Ras wirkt. Beispiele sind Inhibitoren von Raf. Für den Fall, daß die Aktivierung von Ras nicht auf eine Veränderung von Ras selbst, sondern auf die konstitutive Aktivierung von oberhalb von Ras wirkenden Rezeptor-Tyrosinkinasen zurückzuführen ist, kann eine Inhibierung der Ras-Aktivierung auch durch die Inhibierung dieser Rezeptoren bewirkt werden. Beispiele für derartige Rezeptoren sind die Rezeptor- Tyrosinkinasen EGF-Rezeptor ("Epidermal Growth Factor Receptor") und homologe Rezeptoren wie HER-2, HER-3 oder HER-4. Beispiele für chemische Verbindungen, die den EGF-Rezeptor inhibieren, sind der WO 96/07657 zu entnehmen.

Bekannte Ras-Inhibitoren sind monoklonale Antikörper (Furth et al., 1982), dominant-negative Mutanten (Stacey et al., 1991; Quilliam et al., 1994) und Antisense-RNA. Beispiele für niedermolekulare Ras- Inhibitoren sind Inhibitoren der Ras- Farnesyltransferasen (Kohl et al., 1993; Kohl et al., 1994; Kohl et al., 1995).

Um nach weiteren niedermolekularen Ras-Inhibitoren zu screenen, werden Gene, kodierend für Mutationen der Ras-Proteine H-Ras, K-Ras oder N-Ras, die zu einer konstitutiven Aktivierung von Ras führen, in Säugetierzellen eingebracht, z. B. mittels retroviraler Vektoren, und die selektive zytotoxische Wirkung von Testsubstanzen auf die ras-transformierten Zellen bestimmt. Eine geeignete Methode zur Identifizierung von ras-Inhibitoren ist z. B. in der EP-A 604 181 beschrieben.

Beispiele für Ras-transformierte Zellinien, die als Testzellen für die Identifikation von Ras-Inhibitoren verwendet werden können, wurden ferner von Andrejauskas und Moroni, 1989, sowie von Jenkins et al., 1993, beschrieben.

Eine Identifizierung von Ras-Inhibitoren kann auch mit einem Assay auf Grundlage der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten EpRas-Zellinie vorgenommen werden. Dafür enthalten die Zellen ein Reportergenkonkstrukt, in dem das Reportergen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz des TGFβ-Gens steht. Auf die Zellen wird zunächst TGFβ aufgebracht, um die EF-Konversion herbeizuführen. Danach werden die Zellen mit den Testsubstanzen beaufschlagt. Von Testsubstanzen, die in der Lage sind, die Aktivität des Reportergens zu hemmen, kann angenommen werden, daß sie Ras-Inhibitoren sind. Eine Bestätigung dafür kann dann in Sekundärscreens erfolgen, in denen die Substanzen darauf untersucht werden, ob sie die TGFβ-induzierte EF-Konversion von EpRas Zellen in Kollagengelen hemmen oder die bereits erfolgte EFC rückgängig machen können.

Mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel wird verhindert, daß die Zellen in den fibroblastoiden Zustand übergehen und invasiv werden, womit ihre Tumorigenität verhindert wird.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann einerseits verwendet werden, um die Umwandlung der Zellen vom epithelialen in den fibroblastoiden Zustand zu verhindern. Ein Beispiel dafür ist seine Verabreichung nach operativer Entfernung eines Tumors um zu verhindern, daß gegebenenfalls vorhandene metastasierende Zellen invasiv werden und weitere Tumoren erzeugen.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann andererseits verwendet werden, um die bereits erfolgte EF-Konversion der Zellen rückgängig zu machen. Hat die Konversion einmal stattgefunden, hält TGFβ den fibroblastoiden Zustand aufgrund eines autokrinen Loops aufrecht. Die Verabreichung eines TGFβ-Inhibitors allein bewirkt in diesem Fall eine Ausschaltung des autokrinen Loops und somit eine Reversion des fibroblastoiden, invasiven Zustandes der Zelle in den normalen, epithelialen Zustand. Diese Reversion ist jedoch vorübergehend, an dem durch Ras herbeigeführten transformierten Zustand der Zelle wird grundlegend nichts geändert. Dies bedeutet, daß bei Absetzen des TGFβ-Inhibitors die EF- Konversion von neuem herbeigeführt werden könnte. Wird hingegen, gegebenenfalls zusätzlich zum TGFβ-Inhibitor, ein Ras-Inhibitor verabreicht, wird der transformierte Zustand der Zelle aufgehoben, die Zelle verhält sich wie eine normale epitheliale Zelle und reagiert entsprechend normal auf TGFβ, d. h. die Einwirkung von TGFβ auf die Zelle kann keine EF-Konversion herbeiführen und bewirkt möglicherweise sogar eine Wachstumshemmung der Tumorzelle.

Um eine optimale Wirkung zu erhalten, enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel vorzugsweise eine Kombination von TGFβ-Inhibitor und Ras-Inhibitor.

Beim Übergang epithelialer Zellen in den fibroblastoiden Zustand werden verstärkt fibroblastoide Markerproteine, z. B. Vimentin, exprimiert. Die Zunahme der Expression dieser Marker ist somit einer der diagnostischen Parameter für Tumorerkrankungen, für deren Behandlung das erfindungsgemäße Arzneimittel eingesetzt werden kann.

Zu solchen Tumorerkrankungen zählen Adenokarzinome der Brust (Heatley et al., 1993), Nierenzellkarzinome (Beham et al., 1992), Karzinosarkome der Brust (Wargotz und Norris, 1989), Karzinosarkome der Speiseröhre (Guarino et al., 1993) oder des weiblichen Genitaltrakts (de Brito et al., 1993), epitheloide Sarkome sowie Spindelzellkarzinome verschiedener Lokalisation, z. B. Lungenkarzinome mit Spindelzellkomponenten (Matsui et al., 1992) oder Spindelzellkarzinome der Gallenblase (Nishihara et al., 1993).

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden beim Menschen in Dosierungen von 0.01 bis 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0.1 bis 15 mg verabreicht. Neben den wirksamen Verbindungen enthält das Arzneimittel übliche inerte Träger- und Hilfsstoffe. Der Fachmann kann Methoden zur Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen einschlägigen Handbüchern, wie Remington′s Pharmaceutical Sciences, 1980, entnehmen.

Figurenübersicht

Fig. 1 Konversion von EpRas-Zellen in fibroblastoide Zellen während der Tumorbildung in Mäusen,

Fig. 2 Epithelial/mesenchymale Konversion (EFC) während der Tumorentwicklung: Zeitlicher Verlauf und Verhalten von Donor- und Empfänger-Zellen,

Fig. 3 Organogenese und epitheliale Polarität werden durch Serum oder TGFβ1 zerstört,

Fig. 4 TGFβ1 zerstört die Zellpolarität in Ras transformierten Brustepithelzellen,

Fig. 5 Fibroblastoide EpRas-Zellen sind im Hühnerembryoherz-Invasionsassay hoch invasiv,

Fig. 6 TGFβ1 hält den fibroblastoiden Phänotyp konvertierter EpRas-Zellen über einen autokrinen Loop aufrecht,

Fig. 7 Konvertierte EpRas-Zellen produzieren hohe Konzentrationen an TGFβ1,

Fig. 8 TGFβ1 löst in experimentell induzierten Tumoren den Übergang vom epithelialen zum fibroblastoiden Zustand sowie die Invasivität der Zellen aus,

Fig. 9 Modell für die Wirkung von TGFβ1 in der Tumorentwicklung,

Fig. 10 TGFβ1 induziert in vitro Morphogenese und Apoptose in normalen Brustdrüsenepithelzellen,

Fig. 11 In vivo Expression von TGFβ1 während der Bildung der normalen Brustdrüse,

Fig. 12 In vivo Expression von TGFβ1 beim Abbau der voll entwickelten Brustdrüse nach dem Abstillen.

In den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet:

a) Zellkultur

EpRas-Zellen wurden hergestellt, indem die parentale Brustepithelzellinie EpH4 (ein auf hohe Ausprägung eines polarisierten Phänotyps selektionierter Subklon der spontan immortalisierten Brustepithel-Zellinie Ep1 (Reichmann et. al, 1992)) mit einem Helfer-freien, v-Ha-Ras exprimierenden retroviralen Vektor (Redmond, et al., 1988) infiziert wurde. Die Selektion und Expansion der polarisierten epithelialen Klone wurde durchgeführt, wie von Reichmann, et al., 1992, beschrieben. Dazu wurden die Zellen auf Plastikschalen in Wachstumsmedium (Dulbecco′s modified Eagles medium; (DMEM), enthaltend 10% FCS (Boehringer Mannheim) und 20 mM HEPES, gezüchtet und bei einem Verhältnis von 1 : 3 zweimal pro Woche subkultiviert. Für die Induktion der Hemizysten(Kuppen)bildung wurden EpRas-Zellen und Zellen der parentalen Linie EpH4 bei hoher Dichte eine Woche lang ohne Subkultivierung gezüchtet.

b) Wachstum von organotypischen Zellstrukturen in Kollagengelen

Semikonfluente Kulturen der zu analysierenden Zellen wurden trypsinisiert und mit eiskaltem Wachstumsmedium auf eine Endkonzentration von 4 × 10⁴ Zellen pro ml eingestellt. Gleiche Volumina der Zellsuspension und einer angesäuerten Lösung von Rattenschwanz-Kollagen Typ 1 (Sigma) wurden bei 4°C gemischt, auf 35mm Gewebekulturschalen aufgebracht und 30 min bei 37°C inkubiert, um die Lösung zu einem Gel erstarren zu lassen. Um den Zellen die Bildung organotypischer Strukturen zu ermöglichen, wurden die Kollagengele mit einem serumfreien Medium (MEGM; Promocel), enthaltend Rinderhypophysenextrakt (BPE), rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Hydrocortison und Insulin (jeweils in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen) überschichtet. Wo angegeben, wurden 5 oder 10% FCS oder 5 µg/ml rekombinanter TGFβ1 (Literatur) beigegeben. Das die Kollagengele überschichtende Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Um das von den Zellen oder Zellstrukturen in den Kollagengelen produzierte TGFβ1 zu neutralisieren, wurden ein monoklonaler Antikörper gegen TGFβ1 (Genzyme) oder Kontrollantikörper bei Konzentrationen bis zu 50 µg/ml verwendet.

c) Tumorinduktion in Mäusen und Re-Isolierung von Zellen aus Tumoren oder Kollagengelen

Konfluente EpRas- oder EpH4-Zellen wurden trypsinisiert und gezählt. Dann wurden 10⁵ Zellen, suspendiert in 0.1 ml PBS, subkutan oder in die Brustdrüse von 5 Wochen alten BALB/c Mäusen oder Nacktmäusen injiziert. Die Mäuse wurden nach unterschiedlichen Zeitspannen (zwischen 3 und 28 Tagen) getötet und die Tumoren (oder Gewebezonen, welche die injizierten Zellen enthielten) herausgeschnitten. Für die anschließende histologische Analyse wurde das Gewebe sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Um die Tumorzellen für das weitere Wachstum in der Gewebekultur wieder zu isolieren, wurde das Gewebe unter sterilen Bedingungen unter Verwendung von zwei gegenüber angeordneten Skalpellen in kleine Stücke geschnitten und mit 2 mg/ml Kollagenase Typ 1 (Sigma) 1 h lang bei 37°C verdaut. Zur Entfernung der verbleibenden Wirtszellen, denen die retroviralen Neomycin- oder Hygromycin-Resistenzmarker der Donor- Zellen fehlten, wurden die aus den Tumoren gewonnenen Zellen für die ersten 5 Tage in Gegenwart von G418 bzw. Hygromycin gezüchtet. Die Kollagengele wurden auf ähnliche Weise mit Kollagenase verdaut, um die Zellen für die nachfolgende Gewebekultur wieder zu isolieren.

d) Antikörper

Kaninchenantiseren gegen Zytokeratin wurden von Reichmann, et al., 1992, beschrieben. Kaninchenantiserum und monoklonale Rattenantikörper gegen E-Cadherin wurden hergestellt, wie von Kemler, 1993 zitierten Literatur und der darin zitierten relevanten Literatur beschrieben (Kemler, 1993). Kaninchenantiserum, das Neomycin- Phosphotranspherase erkennt, wurde hergestellt, indem Neomycinphosphotransferase bakteriell exprimiert, aufgereinigt und in Kaninchen injiziert wurde. Nach angemessener Zeit wurde Kaninchenserum gewonnen und nativ für die Immunfärbungen eingesetzt. Der monokolonale Mausantikörper gegen Vimentin V3B (Boehringer Mannheim), der monoklonale Rattenantikörper gegen ZO-1 (Chemicon), der monoklonale Mausantikörper gegen TGFβ 1-3 (Genzyme), der TGFβ 2,3-Antikörper (Genzyme), das polyklonale Antiserum gegen aktivierten TGFβ (Promega), der TGFβ-neutralisierende polyklonale Kaninchenantikörper (R) sowie die monoklonalen TGFβ- Antikörper (Genzyme) wurden käuflich erworben.

e) Schnitte und Immunfluoreszenz

Um in den herausgeschnittenen Geweben und Kollagengelen die optimale biologische Aktivität von RNA und Proteinen zu erhalten, wurden das Tumormaterial und die Zellstrukturen enthaltenden Kollagen Typ I Gele unmittelbar nach der Isolierung in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Vor dem Einfrieren wurden die Kollagengele 2 min lang in Medium, enthaltend 5% DMSO getränkt, um eine Zellschädigung infolge von Eiskristallbildung zu verhindern. Auf Plastik gezüchtete Zellen oder Gefrierschnitte, hergestellt aus Tumoren oder Kollagengelen, wurden 15 min lang bei -20°C unter Verwendung von Aceton/Methanol, gemischt im Verhältnis 1/1, fixiert und durchlässig gemacht, luftgetrocknet und bei 4°C gelagert. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte für 1 h bei 37°C in PBS, das normalerweise Gelatine, BSA und Tween 20 (je 0.2%) enthielt, um unspezifische Antikörperfärbung zu verhindern, einwirken gelassen. Die Zellen oder Schnitte wurden dann in Moviol 1-88 (Hoechst) eingedeckt und mit einem Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Photografien wurden entweder konventionell oder computerunterstützt unter Verwendung einer Kaf 1400 CCD Kamera (Photometric) und dem Adobe Photoshop 3.0 Bildentwicklungsprogramm hergestellt.

f) RNA in situ Hybridisierung

Für die RNA in situ Hybridisierung wurden die Gefrierschnitte fixiert und extrahiert, wie von Oft, et al., 1993, beschrieben. Dazu wurden die Schnitte in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, zweimal in PBS gewaschen, 2 h lang vorhybridisiert und über Nacht mit der jeweiligen S³⁵-markierten Ribosonde bei 52°C in 50% Formamid, 0.6 M NaCl hybridisiert. Nach dem Waschen unter stringenten Bedingungen (T_m -20°C) wurden die Schnitte in Kodak NTB Flüssigemulsion getaucht und 2 Wochen lang belichtet. Die Objektträger mit den Schnitten wurden mit Hämatoxylin/Eosin gegengefärbt und in Licht- und Dunkelfeldbeleuchtung unter Verwendung eines Zeiss Axiophot Mikroskops analysiert.

Zur Herstellung der S³⁵-markierten Ribosonden wurden die hTGFβ1-cDNA (R) und die cDNA für Neomycinphosphotransferase, herausgeschnitten aus einem geeigneten (Redmond, et al., 1988) retroviralen Vektor, in die T_3-T₇ Expressionsplasmide (Bluescript II KS Stratagene) kloniert und in vitro, in Gegenwart von S³⁵-UTP für die Antisenseribosonde und für die Sense- Kontrollsonde, transkribiert.

g) Elektronenmikroskopie

Die in den Kollagengelen gewachsenen Zellen wurden 10 min in 3% Paraformaldehyd in 0.2 M HEPES pH 7.3 bei Raumtemperatur vorfixiert. Die Zellen wurden in 8% Paraformaldehyd in 0.2 M HEPES pH 7.3 30-60 min lang auf Eis weiter fixiert. Für die Immunzytochemie wurden die Proben in Ethanol bei zunehmend niedrigeren Temperaturen entwässert, in Lowicryl HM20 oder K4M eingebettet und bei -35°C mittels UV-Licht polymerisiert (Schwarz, et al., 1993). Für die Ultrastrukturuntersuchungen wurden die Zellen mit 1% Osmiumtetraoyxd in PBS pH 7.2 1 h lang auf Eis nachfixiert, mit 1% wässerigem Uranylacetat 1 h lang gefärbt, in Ethanol bei Raumtemperatur entwässert und schließlich in Epon eingebettet. Für die Immunzytochemie wurden ultradünne Schnitte auf Deckgläsern aufgeklebt (Schwarz, 1994). Nach der Blockierung unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen mit 0.5% Rinderserumalbumin und 0.2% Gelatine in PBS wurden die Schnitte mit Kaninchen-anti-Catenin- Antikörpern und anschließend mit Cy3-markiertem Ziegen anti-Kaninchen IgG inkubiert. Die markierten Schnitte wurden mit 4′,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt, um die Kerne im Immunfluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen.

h) Southern Blot Analyse

Gesamt-DNA von Zellen oder Tumormaterial wurde unter Verwendung von Standardmethoden (Maniatis, et al., 1982) isoliert und verarbeitet. DNA, extrahiert aus Zellen vor der Injektion, aus frisch herausgeschnittenem Tumorgewebe (Tag 15 nach der Injektion) und aus Tumorgewebe, das in vitro in Gegenwart von G418 5 Tage lang rekultiviert worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI (das den retroviralen Vektor nur einmal schneidet) verdaut, auf eine Gene Screen Membran geblottet und mit den cDNAs, kodierend entweder für das Neomycin-Phosphotransferase- oder für das v-Ha-ras-Gen, hybridisiert.

i) Northern Blot Analyse

Die Northern Blot Analyse wurde durchgeführt, wie von Chomczyhski und Sacchi, 1987; sowie von Reichmann, et al., 1992, beschrieben. Gesamt-RNA (10 µg pro Spur) wurde auf denaturierenden, Formaldehyd enthaltenden Gelen gelaufen, auf Gene Screen Membranen geblottet und mit der gesamten kodierenden Region von hTGFβ1-cDNA (R), die genug Homologie mit mTGFβ1, 2 und 3 aufweist, um alle drei Maus-TGFβ-Isoformen zu erkennen, hybridisiert.

j) Halbquantitative PCR

Gesamt-RNA aus Zellen, gezüchtet auf Plastik, in Kollagengelen oder aus Tumoren, wurde isoliert und für die halbquantitative PCR verarbeitet. Ein TGFβ1- spezifisches Fragment wurde mittels RT-PCR unter halbquantitativen Bedingungen, unter Verwendung von -Actin-Primern als interne Kontrolle, amplifiziert, wie von Leonard, et al., 1993, beschrieben. Dazu wurde die DNA bei 94°C 1 min lang denaturiert, die Primer wurden bei 65°C 1 min lang annealt, und die Polymerasereaktionen wurden bei 72°C 1 min lang fortgesetzt. Die Amplifizierung wurde während 20 und 30 Zyklen fortgesetzt. Es wurden die TGFβ1-spezifischen Primer TGGACCGCAA CAACGCCATC TATGAGAAAA CC (aufwärts) und TGGAGCTGAA GCAATAGTTG GTATCCAGGG CT (abwärts) (Clontech Inc.) verwendet. Die Ergebnisse der PCR wurden auf einem Image Quant Phospho-Imager quantitativ ausgewertet. Die Werte wurden auf das Kontrollprodukt (-Actin) normalisiert und anschließend in Relation zu dem Wert aus Kontroll-3T3-Fibroblasten gebracht.

k) Quantitative Bestimmung von löslichem TGFβ mittels ELISA-Assay

Um die TGFβ-Konzentrationen mittels ELISA-Assay zu bestimmen, wurden EpH4-, polarisierte EpRas- und fibroblastoide EpRas-Zellen, isoliert aus Tumoren oder in vitro mit TGFβ konvertiert, fünfmal mit PBS gewaschen, um exogenen TGFβ zu entfernen, und anschließend 48 h lang in serumfreiem DMEM gezüchtet. Danach wurden die Zellkulturüberstände gesammelt und die TGFβ1-Konzentrationen mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kit (Promega; G1230) nach Vorschrift des Herstellers bestimmt.

l) Immunoblots

Um TGFβ1 in den Gewebekulturüberständen zu bestimmen, wurden 2 ml serumfreie Zellüberstände mittels Ultrafiltration (Centricon 10, Amicon) auf ein Endvolumen von 0.1 ml konzentriert. Die konzentrierten Überstände wurden mit 5fach konzentriertem SDS-PAGE Probenpuffer (ohne Mercaptoethanol) gemischt und mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Gleiche Proteinaliquots (50 µg) wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen; die Immunoblot-Analyse wurde durchgeführt, wie von Hayman, et al., 1993, beschrieben.

m) Hühnerembryoherz-Invasionsassay

Dieser Assay wurde durchgeführt, wie von Behrens, et al., 1993, beschrieben. Um invasive Donor-Zellen eindeutig von Hühnerherzzellen unterscheiden zu können, wurden die Testzellen vor der Untersuchung mit einem Vitalfluoreszenzfarbstoff beladen. Dazu wurden die Zellen 1 h lang in einer Glukose enthaltenen Hanks- Salzlösung, enthaltend 10 mM 5,6-Carboxy-2′,7′- dichlorfluoreszeindiacetat-succinimidylester (Molecular Probes) und 0.2 × 10^-6 M Pluronic F127, inkubiert. Damit wird der Fluoreszenzfarbstoff kovalent an intrazelluläre Proteine gebunden, ohne die Lebensfähigkeit oder das Verhalten der Zellen, bestimmt mittels verschiedener Differenzierungs- und Proliferationsassays, zu beeinträchtigen. Die markierten Zellen wurden 24 h lang bei hoher Dichte gezüchtet, von der Plastikschale geschabt und mit vorkultivierten Herzfragmenten von 9 Tage alten Hühnerembryos auf der Oberfläche einer Weichagerschicht in Berührung gebracht. Nach 7 Tagen in Kultur wurden die Fragmente mit den anhaftenden Zellen gesammelt, in flüssigem Stickstoff blitzgefroren, Gefrierschnitte angefertigt, in Methanol/Aceton fixiert und die fluoreszierenden Zellen mittels Epifluoreszenzmikroskopie (Axiophot, Zeiss) bestimmt.

n) Implantation von TGFβ1-beladenen Slow Release Pellets in Mäuse

Um Ras-transformierte Brustepithelzellen sehr früh in der Tumorentwicklung aktiviertem TGFβ1 auszusetzen, wurden TGFβ1-beladene Slow Release Elvax Pellets und entweder EpRas-Epithelzellen oder normale EpH4H-Zellen subkutan in Mäuse koinjiziert. Für Kontrollzwecke wurden Pellets, die nur mit BSA beladen waren, koinjiziert. Die Pellets wurden jeweils nach Vorschrift des Herstellers hergestellt und beladen.

Beispiel 1 Ras exprimierende polarisierte epitheliale Zellen machen während der Tumorentwicklung EF-Konversion durch

Die durchgeführten Versuche wurden durch die Beobachtung angeregt, daß Ras-transformierte Maus- Brustepithelzellen (EpRas-Zellen) zwei gänzlich verschiedene Zellphänotypen zeigen. Wenn sie auf Plastiksubstraten gezüchtet werden, wachsen diese Zellen als geordnete, Kuppen bildende Monolayers (Hemizysten), was auf einen polarisierten epithelialen Phänotyp hinweist (Fig. 1A, B). Nach Injektion in Mäuse bildeten jedoch diese gleichen polarisierten Zellen Tumoren, die aus depolarisierten spindelförmigen Zellen mit der Fähigkeit zu invasivem Wachstum bestanden (Fig. 1A, C). Um weitere Erkenntnisse über die Mechanismen zu erhalten, die dieser phänotypischen Plastizität zugrunde liegen, wurde durch eine Kombination von in vivo und in vitro experimentellen Ansätzen die beobachtete Zellkonversion detailliert untersucht. Dafür wurde der Zellklon EpH4 verwendet, der abgeleitet ist von einer gut charakterisierten Maus-Brustepithelzellinie (Reichmann, et al., 1989; Reichmann, et al., 1992; Strange, et al., 1991). Diese Zellen zeigen einen stabilen polarisierten epithelialen Phänotyp (Reichmann, et al., 1994).

Bei Verwendung geeigneter retroviraler Vektoren wurden durch stabile Expression des v-Ha-Ras-Onkogens tumorigene Subklone von EpH4 gebildet. Nachdem die Expression von v-Ha-Ras mittels Western Blot-Analyse bestätigt worden war, wurden Zellen von sieben Klonen (bezeichnet als EpRas-Klone) subkutan oder direkt in die Brustdrüsen von Balb/c-Mäusen injiziert. Es bildeten sich regelmäßig Tumoren, die 5-7 Tage nach der Injektion der Zellen tastbar waren.

Der Phänotyp dieser konvertierten Tumorzellen wurde mit dem der ursprünglichen differenzierten Klone verglichen: vor der Injektion zeigten alle sieben EpRas-Klone den erwarteten polarisierten Phänotyp (Fig. 1B und Tabelle 1). Im Gegensatz dazu wurden bei Herausschneiden von Zellen aus den Tumoren und Rekultivierung in Gegenwart von G418 nur konvertierte, fibroblastoide Zellen erhalten (Fig. 1C, Tabelle 1). Obwohl sie bis zu einem gewissen Grad nach wie vor Zytokeratine exprimierten, hatten diese Zellen viele ihrer epithelialen Eigenschaften verloren und die Expression fibroblastischer Marker erworben (Fig. 1C, Tabelle 1). Um nachzuweisen daß die Tumorzellen von den ursprünglich injizierten EpH4 Donor-Zellen abstammten, sowie um zu zeigen, daß kein Rearrangement oder keine Reintegration des Ras enthaltenden Retrovirus während der Tumorigenese und anschließenden in vitro Kultur stattgefunden hatte, wurde das Integrationsmuster des retroviralen Konstrukts mittels Southern Blot-Analyse bestimmt. Dazu wurden EpRas Zellen vor der Injektion, Zellen aus einem 15-Tage-Tumor und re-isolierte Zellen aus einem 30-Tage-Tumor analysiert. Bei Verwendung von Sonden mit Spezifität für das Neomycinresistenz-Gen oder das ras-Gen wurden in allen drei Zelltypen identische Integrationsmuster erhalten (Fig. 1D).

Die Konversion von EpRas-Zellen in fibroblastoide Zellen während der Tumorbildung in Mäusen ist in Fig. 1 dargestellt.

Fig. 1A zeigt das Prinzip der Strategie, die verwendet wurde, um EFC von Ras-Zellen (es wurden 7 verschiedene v-Ha-Ras exprimierende Zellklone verwendet) in vivo zu studieren.

Fig. 1B: Vor der Injektion zeigen Zellen des Klons Ep5 auf Plastik Kuppenbildung und färben sowohl auf E-Cadherin (FITC, grüne Fluoreszenz, in der Schwarz- Weißabbildung dunkel erscheinend), als auch auf Zytokeratine (Texas-Red, rote Fluoreszenz). Zu beachten ist die gemeinsame Färbung beider Proteine an der Zellperipherie (gelbe Färbung).

Fig. 1C: Eps-Zellen, isoliert aus einem Tumor 28 Tage nach der Zellinjektion. Diese Zellen zeigen ein fibroblastoides Erscheinungsbild und exprimieren Zytokeratine, aber kein E-Cadherin.

Fig. 1D: Southern Blot Analyse. Der EpRas-Klon (Ep5), vor der Injektion (Ep5, plastic), aus dem Tumor entnommen (Ep5, tumor), aus dem Tumor entnommen und 5 Tage lang in G418 rekultiviert (Ep5, ex tumor), zeigt das selbe retrovirale Integrationsmuster (nachgewiesen mit einer Neomycin-Phosphotranspherase (NPT)-Sonde).

Beispiel 2 Zeitlicher Verlauf der EF-Konversion und Verhalten von Donor- und Empfängertier-Zellen während der Tumorigenese in vivo

Als nächstes wurde untersucht, in welchem Stadium der Tumorentwicklung, wenn überhaupt, die subkutan injizierten epithelialen EpRas-Zellen eine EF-Konversion durchmachen. Drei Tage nach der Injektion bildeten die EpRas-Zellen deutlich begrenzte Knötchen, in denen die Zellen charakteristische Zytokeratine, aber kein Vimentin exprimierten (Fig. 2A). Diese epithelialen Zellknoten waren bereits von Stromazellen eingekapselt (Fig. 2A). Zellen die aus diesen Mikrotumoren auf Plastik und in Gegenwart von G418 herauswuchsen, zeigten noch immer epitheliale Eigenschaften. Sieben Tage nach der Injektion wurde beobachtet, daß sich am Rand des Tumors der feste Zellverband der Ep-Ras Zellen aufzulösen begann und die Epithelzellen sich an der Peripherie der Mikrotumoren mit Vimentin-positiven Stromazellen vermischten (durch Einwanderung der Stromazellen oder Auswanderung der Donorzellen). Zu diesem Zeitpunkt zeigten die Donorzellen immer noch epitheliale Eigenschaften, sowohl im Tumor als auch nach Isolierung und in vitro Kultivierung in G418.

15 Tage nach der Injektion konnten drei verschiedene Zelltypen unterschieden werden (Fig. 2C): ca. 20% der Tumorzellen stellten grün gefärbte Vimentin-positive stromale Zellen dar. Weitere 20% exprimierten nur Zytokeratine, was auf EpRas-Zellen hinweist, die den epithelialen Phänotyp beibehalten haben. Der überwiegende Anteil (50-60%) der Tumormasse bestand jedoch aus Zellen, die Zytokeratin und Vimentin co exprimierten. Diese Zellen stellen höchstwahrscheinlich konvertierte oder konvertierende EpRas-Zellen dar. Sowohl die epithelialen als auch die konvertierten fibroblastoiden Zellen wurden auch nach G418-Selektion erhalten. Schließlich konnte in fünf Wochen alten, voll entwickelten Tumoren der epitheliale Anteil nicht mehr nachgewiesen werden, weder in situ, noch auf Plastik. Im Gegensatz dazu bildeten parentale EpH4-Zellen nie Tumoren. Wenn sie subkutan injiziert wurden, entwickelten sich die EpH4-Zellen zu Schichten epithelialer Zellen, die manchmal Lumina bildeten und Zytokeratine, aber kein Vimentin exprimierten (Fig. 2D). Nach längerer Zeit nekrotisierten diese Zellen und wurden vom umliegenden Stroma resorbiert.

Um die ursprünglich injizieren Donor-Zellen in den drei verschiedenen Tumorstadien eindeutig zu identifizieren, wurde eine in situ Hybridisierung an das Neomycinresistenz-Gen durchgeführt. Diese Versuche ergaben, daß alle Zytokeratin exprimierenden Zellen von Donor-Zellen abstammten. Die Häufigkeit von Donor- Zellen relativ zu den Stroma-Zellen der Empfängertiere nahm mit der Tumorgröße zu und war in voll entwickelten Tumoren am höchsten (Fig. 2E, F, G, H).

Insgesamt zeigen diese Daten, daß sowohl die Ras exprimierenden Zellen als auch die epithelialen Kontrollzellen in vivo anfänglich einen epithelialen Phänotyp aufweisen. Mit fortschreitender Entwicklung der Ras-Zelltumoren erwerben die Ras-transformierten Zellen progressiv fibroblastoide Eigenschaften. Im Gegensatz dazu behalten die nicht-tumorigenen parentalen Zellen ihre epithelialen Eigenschaften stabil bei, bis sie absterben.

Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der epithelial/ mesenchymalen Konversion (EFC) während der Tumorentwicklung und demonstriert das Schicksal von Donor- und Empfängerzellen während dieses Vorgangs.

Es werden verschieden behandelte Gefrierschnitte von EpRas-Tumoren (Klon Ep2) gezeigt, die am Tag 3 (Fig. 2A, E) , am Tag 7 (Fig. 2B, F), am Tag 15 (Fig. 2C, G) und am Tag 28 (Fig. 2H) nach der Injektion angefertigt wurden. Die Zellstrukturen, die von nicht tumorigenen EpH4-Zellen 15 Tage nach der Injektion gebildet werden, sind in Fig. 2D dargestellt. Die Schnitte wurden mittels Immunfluoreszenz (Fig. 2A-D) und in situ Hybridisierung (Fig. 2E-H) untersucht. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen ein 46 kDa Zytokeratin (Texas-Red, rote Fluoreszenz) und Vimentin (FITC, grüne Fluoreszenz) doppelgefärbt. Es war zu beobachten, daß in 3-Tage-Tumoren die injizierten epithelialen Zellen (rotgefärbt) und die mesenchymalen Zellen des Wirts (grüngefärbt) deutlich getrennt sind. In 15-Tage-Tumoren werden große Mengen von Zytokeratin/Vimentin-doppeltpositiven Zellen sichtbar (gelbgefärbte Zellen). Diese Zellen haben EFC durchgemacht. RNA-in situ Hybridisierung unter Verwendung einer Neomycin-Phosphotransferase-Sonde bestätigt den Donor-Ursprung der Tumorzellen und zeigt die zunehmende Dichte der Tumorzellen nach EFC (Fig. 2E-H).

Beispiel 3 TGFβ1 induziert in vitro EF-Konversion in Ras exprimierenden, aber nicht in normalen epithelialen Zellen

Um den Mechanismus zu identifizieren, der der EF- Konversion zugrunde liegt, wurde ein experimentelles System eingesetzt, mit dem EF-Konversion in vitro unter definierten und physiologisch relevanten Bedingungen induziert werden kann. Zu diesem Zweck wurden normale EpH4-Zellen oder Ras-transformierten Subklone dieser Zellen (Ep-Ras Klone) in rekonstituierten Kollagen Typ I Gelen gezüchtet, unter Verwendung von serumfreiem Medium. Diese Bedingungen erlaubten es, definierte Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone einzusetzen, von denen bekannt ist, daß sie an der Modulation des epithelialen Phänotyps beteiligt sind. In solchen Gelen entwickelten sich normale EpH4-Zellen zu organähnlichen Drüsenkanälen (Tubuli) die häufig in keulenförmigen, hohlen Anschwellungen endeten. Diese Strukturen sahen den Endknospen (end buds) der sich entwickelnden Brustdrüse sehr ähnlich, welche von primären Brustepithelzellen sowohl in Kollagengelen als auch in vivo gebildet werden (Fig. 3A). Diese Strukturen konnten bei Zusatz von lactogenen Hormonen effizient zur Produktion von Milchproteinen induziert werden. Wenn diese Zellen aus dem Gel isoliert wurden und auf Gewebekultur-Plastik gezüchtet wurden, bildeten sie die erwarteten regelmäßigen epithelialen Monolayer, welche deutlich erkennbare Kuppen (domes) bildeten, ein Zeichen dafür, daß diese Zellen effizient polarisieren können (Fig. 3, rechte Tafel).

Überraschenderweise zeigten auch die EpRas-Klone in diesen serumfreien Kollagengelen beträchtliche Lumenbildung. Die Lumina waren bereits 2-3 Tage nach dem Aussäen sichtbar. Im Anschluß daran entwickelten mehr als 95% dieser Strukturen relativ große zystische Hohlräume (Fig. 3B, linke und mittlere Tafel) welche den Alveoli der voll entwickelten, Milch produzierenden Brustdrüse ähnlich sahen. Auf Plastik bildeten diese Zellen wiederum regelmäßige epitheliale Monolayer mit Kuppen (domes) aus, zeigten somit die gleichen epithelialen Eigenschaften, wie die nicht-tumorigenen Ausgangszellen (Fig. 3B, rechte Tafel).

Die gleichen EpRas-Zellen verhielten sich jedoch völlig anders, wenn sie in 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert wurden. Unter diesen Bedingungen bildeten sie längliche, vielzellige und invasiv wachsende Zellstränge aus, die nie Lumenbildung zeigten. Diese Stränge bestanden aus nicht-polarisierten Zellen, die viele epitheliale Eigenschaften verloren hatten (Fig. 3C und Fig. 4) und die sich auffallend ähnlich verhielten wie die ex vivo fibroblastoiden Tumorzellen. Diese Befunde deuteten daraufhin, daß ein im FCS enthaltener Faktor, Kooperation mit dem aktivierten Ha-Ras-Onkoprotein, die Konversion der epithelialen EpRas Zellen zu fibrobalstoiden Zellen bewirkt.

Um diese(n) Faktor(en) zu identifizieren, wurde eine Anzahl von Wachstumsfaktoren (TGFβ, Heregulin, Scatter- Faktor/heptocyte growth factor, saurer und basischer FGF, PDGF und TGFβ1) den in Kollagengelen gezüchteten Ras-transformierten Zellen zugesetzt. Überraschenderweise war TGFβ1 der einzige Faktor, der auffallende und lang anhaltende Wirkungen auf EpRas- Zellen zeigte. Bei Zugabe von TGFβ1 wuchsen diese Zellen zu länglichen, sich verzweigenden Zellsträngen aus, ähnlich denen, wie sie durch FCS induziert wurden. Auf Gewebekultur-Plastik zeigten diese Zellen einen deutlichen, fibroblastoiden Phänotyp (Fig. 3D). In EpH4 -Kontroll-Zellen und anderen nicht-tumorigenen Brustepithel-Zellklonen war TGFβ1 im Gegensatz dazu nicht in der Lage, EF-Konversion zu induzieren.

Um zu untersuchen, ob die Aktivität im Serum, welche EF-Konversion fördert, tatsächlich TGFβ1 darstellt, wurden Kulturen, die 5% FCS enthielten, mit TGFβ1 neutralisierenden Antikörpern inkubiert. Unter diesen Bedingungen bildeten EpRas-Zellen wiederum zystische Hohlräume aus, sehr ähnlich denen, die in Fig. 3B dargestellt sind. Damit wurde die in FCS vorhandene zellkonvertierende Aktivität als TGFβ1 identifiziert und gezeigt, daß TGFβ1 die einzige oder zumindestens vorherrschende Aktivität im FCS darstellt, die EF- Konversion auslösen kann.

Weitere ultrastruktur- und immunhistochemische Analysen ergaben, daß die meisten zystischen Strukturen aus einem Monolayer polarisierter Zellen bestanden (Fig. 4A). Diese Zellen bildeten reichlich Microvilli an ihrer apikalen (dem Lumen zugekehrten) Domäne, was auf eine polarisierte Organisation der Zellen hinweist (Fig. 4A). Außerdem konnten verschiedene Arten von epithelzell-typischen Zell-Zellkontaktstrukturen, d. h. tight junctions, charakterisiert durch das Protein ZO-1, Desmosomen (Fig. 4A) und das für sog. "adherens junctions typische Zelladhäsionsmolekül E-Cadherin (Fig. 4B) an ihren typischen lateralen oder basolateralen Positionen nachgewiesen werden. Ähnlich zeigte das mit E-Cadherin assoziierte Protein β-Catenin in den meisten Zellen eine basolaterale Lokalisierung (Fig. 4C).

Im Gegensatz dazu bestanden die strang-ähnlichen Zellstrukturen, die durch TGFβ1 induziert wurden, aus lose aneinander haftendenden spindelförmigen Zellen (Fig. 4D, Einsatzbild). Keine der erwähnten epithelialen Markerproteine und ultrastrukturell erkennbaren Kontaktstrukturen konnte nachgewiesen werden (Fig. 4D und Tabelle 1), mit der Ausnahme einer niedrigen, nicht-polarisierten Expression von E-Cadherin (Fig. 4E). Die Expression von β-Catenin war stark reduziert und hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert (Fig. 4F). Außerdem exprimierten diese Zellen die erwarteten mesenchymalen Marker (Tabelle 1).

Diese Ergebnisse zeigen, daß Ras-transformierte Maus- Brustepithelzellen eine außerordentliche Plastizität im Phänotyp zeigen, die von epithel polarisierten, in geordneten Epithelien organisierten Zellen bis zu fibroblastoiden, migratorischen und invasiv wachsenden Zellen reicht.

Fig. 3 zeigt die Zerstörung von Lumenbildung und epithelialer Polarität durch Serum und TGFβ1.

Nicht-tumorigene EpH4-Zellen (Fig. 3A) oder tumorigene EpRas-Zellen (Klon Ep5, Fig. 3B-D) wurden in Kollagen Typ I Matrices gezüchtet. Die makroskopisch sichtbaren Strukturen wurden 8 Tage nach dem Ausplattieren bei geringen und hohen Vergrößerungen fotografiert (linke und mittlere Tafel). Aus den Gelen isolierte und auf Gewebekulturplastik gezüchtete Zellen sind in den rechten Tafeln abgebildet.

Fig. 3A: Ep4H-Zellen bilden in serumfreien Kollagengelen Kanäle und "end-bud" ähnliche Anschwellungen aus. Auf Plastik bildeten diese Zellen einen regelmäßigen epithelialen Monolayer und Kuppen (Hemicysts, domes).

Fig. 3B: In serumfreien Kollagengelen werden von EpRas- Zellen weite Kanäle und Alveoli-ähnliche Zysten gebildet.

Fig. 3C: Zugabe von 10% FCS veranlaßt die Zellen zur Bildung invasiv wachsender unregelmäßiger Zellstränge ohne Lumen. Auf Plastik sind diese Zellen fibroblastenähnlich und spindelförmig.

Fig. 3D: TGFβ1 allein (5 ng/ml) veranlaßt EpRas-Zellen dazu, zu invasiven Zellsträngen, ähnlich den durch FCS induzierten, auszuwachsen.

Fig. 4 zeigt den Zusammenbruch der epithelialen Zellpolarität in Ras-transformierten Brustepithelzellen nach Inkubation mit TGFβ1.

Alveolen-ähnliche Zysten, gebildet von EpRas-Zellen (Klon Ep6) in serumfreien Kollagengelen (Fig. 4A-C), und ungeordnete Zellstränge, gebildet von den gleichen Zellen nach TGFβ1-Behandlung (Fig. 4D-F), wurden hinsichtlich ihrer epithelialen Organisation und Ausbildung von Zellpolarität analysiert. Schnitte durch einzelne Strukturen wurden bei hohen oder niedrigen (Einsatzabbildungen) Vergößerungen fotografiert.

Fig. 4A: Transmissions-Elektronenmikroskopie zeigte, daß die in Abwesenheit von TGFβ1 erhaltenen Zysten aus einem Monolayer von morphologisch polarisierten Zellen bestehen, die Mikrovilli ausschließlich an ihrer apikalen, in Richtung Lumen gerichteten Domäne aufweisen (Fig. 4D). Das Einsatzbild zeigt eine solche einschichtige Zyste bei niedriger Vergrößerung. Im Gegensatz dazu bestehen die in Gegenwart von TGFβ1 induzierten Zellstränge aus lose aneinander haftenden Zellen ohne Mikrovilli, Desmosomen oder tight junctions.

Fig. 4B, E: Gefrierschnitte durch eine alveoläre Zyste, die mit einem Antikörper gegen das Zelladhäsionsmolekül E-Cadherin immungefärbt waren, zeigten auf den meisten Zellen eine klar basolaterale Lokalisation des E- Cadherins. In den TGFβ1-induzierten Zellsträngen ist E-Cadherin in seiner Expression vermindert und auf der gesamten Oberfläche der fibroblastoiden Zellen exprimiert.

Fig. 4C, F: Gezeigt werden mit einem anti-β-Catenin- Antikörper immungefärbte Lowicryl-Schnitte durch Strukturen, ähnlich den in Fig. 4B und E dargestellten. Zu beachten ist die basolaterale Expression von β-Catenin in den meisten Zellen der Zyste (Fig. 4C) und die deutlich verringerte β-Catenin-Expression, welches jetzt vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist (Fig. 4F).

Beispiel 4 Fibroblastoide EpRas-Zellen sind invasiv

EpRas-Zellen, die EFC durchgemacht hatten, zeigten in Kollagen-Gelen Anzeichen von invasivem Verhalten. Um einen definitiven Beweis für diese invasive Eigenschaft zu erhalten, wurden die Vorteile des Hühnerembryoherz- Invasionsassays ausgenutzt, dessen Relevanz für die in vivo Metastasierung bereits ausführlich dokumentiert ist (Mareel, et al., 1979; Mareel, 1983). In diesem Assay wurde das Einwandern von Zellen in Embryoherzfragmente untersucht (Fig. 5A). Um die eindringenden Zellen deutlich zu identifizieren, wurden sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Carboxy-dichloro fluorescein-diacetat) markiert. Parentale EpH4-Zellen wanderten während der Inkubationszeit von sieben Tagen nicht in das Hühnerherzgewebe ein (Fig. 5A, B). Bei drei verschiedenen, vollpolarisierten Ep-Ras-Klonen war nur ein verschwindend geringer Anteil der Zellen in der Lage in das Herzgewebe einzuwandern (Fig. 5C). Die wenigen eingewanderten Zellen färbten sich stark mit einem Vimentin-Antikörper an, nicht dagegen mit einem anti-E-Cadherin Antikörper. Dies bestätigt ihre Konversion zu einem fibroblastoiden Phänotyp, was nicht verwunderlich ist, da die Ko-Kulturen Serum enthielten. Im Gegensatz zu den epithelialen Zellen wanderten die fibroblastoiden Zellen, die aus Tumoren gewonnen worden waren ("ex-Tu cells"), oder Zellen, die durch Anwendung von TGFβ1 in vitro zur EFC induziert worden waren, in großen Zahlen und relativ schnell in das Herzmuskelgewebe ein. (Fig. 5D). Diese Ergebnisse zeigen, daß EpRas-Zellen nach Durchlaufen des EFC hochinvasiv sind, während nichtkonvertierte epitheliale Zellen nur geringe Invasivität zeigen.

Fig. 5 zeigt die hohe Invasivität von fibroblastoiden EpRas-Zellen im Hühnerembryoherz-Invasionsassay.

In vivo fluoreszenzmarkierte Zellen wurden, um ihre Invasivität zu testen, mit Hühnerembryoherzfragmenten kokultiviert und Schnitte durch die Fragmente 7 Tage später histologisch untersucht. Die nicht-tumorigenen, epithelialen Ausgangszellen (EpH4-Zellen) wanderten nicht in die Herzfragmente ein (Fig. 5A, B), und nicht konvertierte epitheliale EpRas-Zellen zeigten nur geringfügige Invasivität (Fig. 5C). Im Gegensatz dazu waren die konvertierten, fibroblastoiden Zellen, die nach TGFβ1-Behandlung erhalten wurden, in der Lage, effizient in die Herzfragmente einzuwandern (Fig. 5D).

Beispiel 5 TGFβ1 erhält den fibroblastoiden Phänotyp konvertierter EpRas-Zellen über eine autokrine Schleife (autocrine loop) aufrecht

Nachdem gezeigt worden war, daß TGFβ1 Ras-tranformierte epitheliale Zellen in fibroblastoide umwandelt, erhob sich die Frage, ob TGFβ1 auch an der Aufrechterhaltung dieses Phänotyps beteiligt ist. Eine mögliche Erklärung für die relative Stabilität des fibroblastoiden Phänotyps (z. B. in Kulturen auf Plastik) war die autokrine Produktion von größeren Mengen an TGFβ1 durch die konvertierten Zellen selbst. Um diese Frage zu klären, wurden fibroblastoide EpRas-Zellen in extrem geringer Konzentration in 1% FCS (um die TGFβ1- Konzentration im Medium möglichst gering zu halten) kultiviert. Unter diesen Bedingungen wachsen Einzelzellen zu klar räumlich getrennten Klonen aus. Wie in den Fig. 6A und B gezeigt wird, wiesen die bald nach dem Ausplattieren erhaltenen, zunächst aus wenigen Zellen bestehenden Klone zunächst eine fibroblastoide Morphologie auf. Mit zunehmender Größe der Zellklone wandelten sich die Zellen in der überwiegenden Mehrzahl der Klone allmählich zu Zellen mit einem epithelialen Phänotyp um (Fig. 6A bis D). Diese Reversion war 10 Tage nach dem Ausplattieren im wesentlichen vollständig (Fig. 6D).

Um die Wirkungen von autokrin produziertem TGFβ1 vollständig zu unterbinden und damit definitiv nachzuweisen, daß TGFβ1 für die Aufrechterhaltung der EF Konversion wirklich notwendig ist, wurden aus einem Tumor isolierte fibroblastoide Zellen (ex-tumor cells) in Gegenwart oder Abwesenheit von TGFβ1 neutralisierenden Antikörpern in Kollagengelen gezüchtet. In Abwesenheit der Antikörper bildeten die fibroblastoiden Tumorzellen die erwarteten dünnen, invasiv wachsenden Zellstränge aus (Fig. 6E). Die gleichen Zellen wuchsen jedoch nicht mehr invasiv und entwickelten sich zu zystischen, aus einem epithelialen Monolayer bestehenden Strukturen, wenn sie acht Tage lang mit den neutralisierenden Antikörpern behandelt wurden (Fig. 6F).

Schließlich wurden die Mengen der in den Zellen exprimierer TGFβ1-mRNA und des ins Kulturmedium freigesetzten TGFβ1-Proteins bestimmt. Drei verschiedene EpRas-Klone sowie der parentale EpH4-Klon wurden fünf Tage lang in Kollagengelen gezüchtet. Wenn sie mit 5 ng/ml TGFβ1 behandelt wurden, machten die EpRas-Klone EFC durch, während die gleich behandelten, nicht transformierten EpH4-Zellen ihren epithelialen Phänotyp beibehielten. Die Analyse dieser Zellen mittels halbquantitativer PCR (Fig. 7A) oder mittels Immunoblot (Fig. 7B) zeigte, daß die durch TGFβ1 induzierten fibroblastoiden Zellen Mengen an TGFβ1-mRNA produzierten, die mit denjenigen von Kontroll- Fibroblasten vergleichbar waren (Fig. 7A). Dies traf auch für EpRas-Zellen zu, die sich in Tumoren zu fibroblastoiden Zellen umgewandelt hatten. Im Gegensatz dazu produzierten parentale EpH4-Zellen und epitheliale EpRas-Zellen keine oder nur geringe Mengen an TGFβ1-mRNA (Fig. 7A). Auf Proteinebene wurden im wesentlichen dieselben Ergebnisse erhalten, wenn serumfreie Kulturüberstände mittels ELISA und Westernblot analysiert wurden (Fig. 7B).

Fig. 6 zeigt, daß TGFβ1 den fibroblastoiden Phänotyp konvertierter EpRas-Zellen über eine autokrine Schleife (autocrine loop) aufrechthält.

Fig. 6A-D: Klone aus fibroblastoiden, aus einem Tumor isolierten Zellen (ex-Tumorzellen) wandeln sich allmählich in aus epithelialen Zellen bestehende Klone um. Zur Erzeugung der Klone wurden 500 Zellen pro 100 mm Schale in Medium, enthaltend 1% FCS, ausgesät. Das Medium wurde täglich gewechselt, um eventuelle autokrine Faktoren zu verdünnen. Der gleiche, typische Zellklon wurde am Tag 1 (A), Tag 3 (B), Tag 5 (C) und Tag 10 (D) nach dem Ausplattieren fotografiert. Die allmähliche Umwandlung der fibroblastoiden Zellen zu Zellen mit einer epithelialen Morphologie ist deutlich sichtbar.

Fig. 6E, F: Fibroblastoide, aus einem Tumor isolierte EpRas-Zellen wurden 5 Tage lang in G418 selektioniert (um vom Empfängertier stammende Zellen zu entfernen) und anschließend in serumfreie Kollagengele ausgesät. Dies wurde entweder in Abwesenheit (E) oder in Gegenwart (F) von TGFβ1 neutralisierenden Antikörpern durchgeführt. Man sieht, daß die Tumorzellen sich in Gegenwart eines TGFβ1 neutralisierenden Antikörpers zu lumenförmigen Strukturen entwickeln, während sie in Abwesenheit des Antikörpers die erwarteten ungeordneten Zellstränge ausbilden.

Aus Fig. 7 ist ersichtlich, daß konvertierte EpRas- Zellen hohe Konzentrationen an TGFβ1 produzieren.

Fig. 7A: RNA aus nicht-konvertierten(epithelialen) und konvertierten (fibroblastoiden) EpRas-Zellen (Klon Ep5) ebenso wie aus nicht-tumorigene EpH4-Zellen und NIH- 3T3-Fibroblasten (ATCC CRL 1658) wurde zur halbquantitativen PCR-Analyse eingesetzt. Zu beachten ist der signifikante Anstieg in TGFβ1-mRNA in den fibroblastoiden Zellen. Die TGFβ1-Expression ist in % der mit NIH-3T3-Zellen erhaltenen Werte aufgetragen.

Fig. 7B: Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die TGFβ1-Konzentrationen in Zellkulturüberständen mittels Western Blot und ELISA analysiert wurden (die Ziffern oberhalb der Western-Blot Gel-Spuren zeigen die im ELISA bestimmten Mengen an TGFβ1 in ng TGFβ1/ml). Die in Fig. 7B gezeigten Daten konnten mit zwei anderen EpRas- Klonen (Ep2 und Ep6) bestätigt werden.

Insgesamt lassen diese Ergebnisse auf eine vorherrschende Rolle von TGFβ1 nicht nur bei der Induktion von EFC, sondern auch bei der Aufrechterhaltung des fibroblastoiden Phänotyps schließen.

Beispiel 6

Abschließend wurde untersucht, ob TGFβ1 tatsächlich in EpRas-Tumoren exprimiert wird und ob experimentell beigegebener TGFβ1 auch in vivo EFC und Invasivität der Zellen hervorrufen kann. Aus injizierten EpRas Zellen auswachsende Tumoren wurden 4 und 15 Tage nach der Injektion der Zellen mittels RNA in situ Hybridisierung und Immnunhistochemie auf die Expression von TGFβ1 untersucht. Bereits 4 Tage nach der Injektion der Zellen wurden am äußeren Rand der von den EpRas-Zellen gebildeten Knoten erhöhte Konzentrationen von TGFβ1-mRNA nachgewiesen (Fig. 8A). Die durch Doppel- Immunfluoreszenz gezeigte Ko-Expression von TGFβ1 und Neomycinphosphotransferase (NPT, welche ausschließlich von den Ras-tranformierten Donor-Zellen exprimiert wird) zeigte, daß die große Mehrzahl der Donor-Zellen (gekennzeichnet durch die rote Färbung auf NPT) in diesem Stadium der Tumorentwicklung kein TGFβ1 (grüne Färbung) produzierten. Vom Empfängertier stammende Zellen des umgebenden Tumor-Stromas, die nicht epithelialen Ursprungs waren, waren dagegen deutlich positiv für TGFβ1 (Fig. 8B). Im Gegensatz dazu zeigten Tumoren, die 28 Tage nach der Injektion entfernt worden waren, eine relativ hohe und gleichmäßige Expression von TGFβ1-mRNA über die gesamte Tumorregion (Fig. 8C). In diesen Tumoren zeigte sich, daß die injizierten EpRas-Zellen selbst TGFβ1 produzierten, weil sie mit Antikörpern gegen NPT und TGFβ1 gemeinsam anfärbbar waren, sie zeigten eine gelbe Färbung (Fig. 8D,). Bemerkenswerterweise zeigten die meisten Zellen, die TGFβ1 produzierten, eine verminderte Expression von Zytokeratin, während die Mehrzahl der Zellen mit hoher Zytokeratin-Expression mit Antikörpern gegen TGFβ1 nicht anfärbbar waren. Dies ist ein weiterer Beweis dafür, daß die konvertierten Zellen tatsächlich diejenigen sind, die auch im Tier in fortgeschrittenen Tumorstadien TGFβ produzieren.

Diese Ergebnisse zeigen, daß Wirtszellen, die das Tumorgewebe umgeben, die Zellkonversion initiieren können. Die konvertierten Tumorzellen wiederum produzieren selbst TGFβ, womit sie die Zellkonversion und anschließend die Invasionsvorgänge beschleunigen.

Um dieses direkt zu beweisen, wurden Slow Release Pellets, die mit rekombinantem humanen TGFβ1 beladen waren, in der Nähe der injizierten EpRas-Zellen appliziert. Gleiche TGFβ1-Pellets, kombiniert mit nicht tumorigenen EpH4-Zellen, wurden als Kontrollen verwendet. Überraschenderweise konvertierten EpRas- Zellen, die sich in der nahen Umgebung eines TGFβ1- Pellets befanden, bereits 4 Tage nach der Injektion zu unregelmäßig geformten Zellen und zeigten ausgiebige Auswanderung ins umliegende Wirtsgewebe. Überraschenderweise waren viele dieser Zellen bereits zu diesem frühen Zeitpunkt positiv für Vimentin (Fig. 8F). Im Gegensatz dazu bildeten gleiche EpRas Zellen, die in Abwesenheit von exogenem TGFβ1 injiziert worden waren, glatte homogene Knoten aus enge Zellkontakte bildenden, Vimentin-negativen Zellen (Fig. 8E). Wie erwartet konnten TGFβ1-Pellets, die in der Nähe von EpH4-Zellen lokalisiert waren, den Phänotyp dieser nicht-tumorigenen Zellen nicht auffallend beeinflussen. Diese in vivo Daten stimmen mit den in vitro Ergebnissen überein und lassen auf eine Schlüsselrolle von TGFβ1 bei der Regulation der Plastizität und Invasivität von Tumorzellen schließen.

Fig. 8 zeigt, wie TGFβ1 in experimentell induzierten Tumoren den Übergang vom epithelialen zum fibroblastoiden Zustand sowie die Invasivität der Zellen auslöst:

Fig. 8A-D: Gefrierschnitte von Tumorstadien am Tag 4 (A, B) und Tag 15 (C, D). Die RNA in situ Hybridisierung zeigt, daß die TGFβ1-Expression am Tag 4 in der äußeren Tumorperipherie (A), am Tag 15 (C) jedoch im gesamten Tumor stattfindet. Pfeilspitzen zeigen die Grenze zwischen Tumor und umgebendem Stroma an.

Fig. 8B, D: Gefrierschnitte wurden mit einem anti-TGFβ1- Antikörper (grüne Fluoreszenz) und einem anti- Neomycinphosphotransferase-Antikörper, der die Spenderzellen erkennt (rote Fluoreszenz), gefärbt. Nebenabbildungen zeigen Ausschnitte bei größerer Vergrößerung. Es ist darauf hinzuweisen, daß in frühen Tumorstadien TGFβ1 ausschließlich vom tumorumgebenden Stroma produziert wird (B). Im Gegensatz dazu wird in 15 Tage alten Tumoren TGFβ auch in vielen Donor-Zellen innerhalb des Tumorgewebes exprimiert (D, gelbe Fluoreszenz)
Fig. 8E, F: Epitheliale EpRas-Zellen wurden ohne (E) oder zusammen mit 3-Elvax Slow Release Pellets, die mit rekombinantem (aktivem) TGFβ1 (F) beladen waren, subkutan in Nacktmäuse injiziert. Gefrierschnitte, erhalten aus 4 Tage alten Tumoren, wurden mit Antikörpern gegen Zytokeratin (rot) und Vimentin (grün) doppelgefärbt. Auffallend ist die dramatische Auswanderung von Zellen ins umliegende Gewebe, die in der Nähe der TGFβ1 freisetzenden Pellets (weißer Kreis) induziert wurde.

Beispiel 7 Wirkung von TGFβ1 auf normale Brustepithelzellen: Steuerung der Milchkanälchen-Morphogenese durch Regulation von Zellwachstum, Zellpolarisierung und Apoptose

Da die TGFβ-Superfamilie von Polypeptid-faktoren vor allem an morphogenetischen Prozessen während der Embryonalentwicklung beteiligt ist, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Rolle von TGFβ1 bei der normalen Brustdrüsenentwicklung untersucht. Zu diesem Zweck wurden normale Brustepithelzellen der Zellinie EpH4 in serumfreie Kollagengele ausgesät. Anders als bei den Versuchen in Beispiel 3 wurde das beim Aussäen zum Erstarren des Kollagengels notwendige und einen Tag später ausgewaschene Serum besonders auf niedrigen Gehaltes an TGFβ1 selektioniert. Unter diesen Bedingungen war die in vitro Organogenese komplett inhibiert, und es bildeten sich keine tubulären Strukturen (Fig. 10 A). Wenn niedrige Konzentrationen von TGFβ1 (0.1 ng/ml) hinzugefügt wurden, konnten die Zellen proliferieren und atypische Strukturen bilden, denen im allgemeinen Lumina fehlten (Fig. 10 B).

Weitere Untersuchungen zeigten jedoch, daß diese Strukturen im Inneren ZO-1, ein tight-junction Protein, exprimierten. Somit hatten diese Strukturen gewisse Ähnlichkeit mit den Endknospen (end buds) der sich entwickelnden Brustdrüse.

Im Gegensatz dazu bewirkten höhere Konzentrationen von TGFβ1 (<0.25 ng/ml), daß die normalen epithelialen Zellen ihr Wachstum einstellten und durch programmierten Zelltod (Apoptose) abstarben (Fig. 5C). Dies stellt einen wichtigen Unterschied zwischen den normalen epithelialen Zellen und den Ha-Ras enthaltenden Zellen dar. Während die letzteren sogar bei 20 mal höheren Konzentrationen an TGFβ1 (5 ng/ml) nicht zur Apoptose induziert werden und ausnahmslos EFC durchmachen, ist die TGFβ1 Konzentration, die bei normalen Brustepithelzellen morphogenetische Prozesse reguliert, streng festgelegt. Möglicherweise wird eine aberrante Morphogenese durch zu hohe TGFβ1 Konzentrationen dadurch vermieden, daß in den Zellen statt dessen Wachstumsinhibition und Apoptose induziert wird.

Daß es nicht gelang, mit niedrigen Konzentrationen von TGFβ1 voll differenzierte, aus polarisierten Zellen bestehende tubuläre Strukturen zu induzieren, könnte auf suboptimale Kulturbedingungen zurückzuführen sein. Andererseits könnte die vollständige Organogenese von tubulären Strukturen davon abhängen, daß TGFβ1 nur während bestimmter Phasen der organoiden Entwicklung anwesend sein darf. Um dieses zu untersuchen, wurden die Zellen, wie oben erwähnt, mit 0.1 ng/ml TGFβ1 behandelt, bis sich Strukturen gebildet hatten, dann wurde TGFβ1 aus dem Kollagengel herausgewaschen. Überraschenderweise reorganisierten sich nun die atypischen Strukturen ohne Lumina und bildeten gut ausgebildete tubuläre Strukturen mit typischen Lumina (Fig. 10 D, transient TGFβ1). Diese Ergebnisse führen zu dem Schluß, (i) daß TGFβ1 für die in vitro Organogenese absolut notwendig ist, (ii) daß die Konzentration kritisch ist, wobei höhere Konzentrationen zur Apoptose führen und (iii) daß TGFβ1 nur während bestimmter Phasen der Organentwicklung auf die Zellen einwirken muß. Diese normale Funktion von TGFβ1 in der Brustepithelzellentwicklung ist in den Ras transformierten Zellen vollkommen verändert, wobei TGFβ hier eine extreme abnormale Form der Gewebereorganisation verursacht, die über einen großen Konzentrationsbereich einen Übergang vom epithelialen zum fibroblastoiden Zustand (EFC) bewirkt.

Der nächste Schritt war nun, nach Hinweisen zu suchen, daß TGFβ1 in Analogie zu diesen in vitro Befunden auch in vivo die Morphogenese und den programmierten Zelltod von Brustdrüsenepithel steuert. Dazu wurden Brustdrüsen von Mäusen während der Pubertät einer histologischen Analyse in Kombination mit in situ Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde gegen TGFβ1 unterzogen. Während dieser Phase wachsen die virginalen Brustdrüsen in das umliegende Fettgewebe (fat pad) ein. Wachstum, Differenzierung und Morphogenese der entstehenden Brustdrüse geht von einer Struktur aus, die als Endknospe bezeichnet wird und undifferenzierte, noch nicht voll polarisierte epitheliale Zellen enthält, stattfindet) Schnitte durch die Endknospe (wo die Proliferation und anschließende Organogenese, wie z. B. die Verzweigung der Milchkanälchen, stattfindet) wurden mit Schnitten durch volldifferenzierte Drüsengänge (s. die schematische Zeichnung in Fig. 11, Mitte) verglichen. Während TGFβ1 im mesenchymalen Stroma produziert wird, das die wachsenden Endknospen umgibt (Fig. 11, linke Tafel), wurde keine derartige Produktion von TGFβ1 in den Stromazellen gesehen, die einen bereits differenzierten Drüsengang umgeben (rechte Tafel). Diese Befunde entsprechen weitgehend den in vitro Daten, wo eine vorübergehende, pulsartige Behandlung der Brustepithelzellen mit TGFβ1 für die tubuläre Morphogenese erforderlich war.

Auf ähnliche Weise konnte ein Hinweis dafür erhalten werden, daß TGFβ auch in vivo den programmierten Zelltod (Apoptose) von Brustepithelzellen reguliert. Während der Rückbildung der Brustdrüse nach dem Abstillen machen die alveolären Zellen massiv Apoptose durch, während die Zellen in den Drüsengängen überleben und erhalten bleiben. Von diesen Zellen geht das erneute Auswachsen der Brustdrüsen während einer erneuten Schwangerschaft aus. Um eine mögliche Beteiligung von TGFβ1 an diesem Prozeß zu untersuchen, wurden drei Tage nach Ende der Laktation Gefrierschnitte durch die absterbende alveoläre Zone einer Brustdrüse sowie durch eine benachbarte Drüsengangregion angefertigt (Fig. 12, Darstellung in der Mitte). In der Region, die gerade Apoptose durchmachte, exprimierten die mesenchymalen Zellen, die die absterbenden Alveoli umgeben, hohe Konzentrationen an TGFβ1 (Fig. 12, linke Tafel), während die mesenchymalen Zellen, die die überlebenden duktalen Strukturen umgeben, kein TGFβ1 exprimierten (Fig. 12, rechte Tafeln). In beiden Fällen ist es wahrscheinlich, daß ein Crosstalk zwischen den Epithelzellen und der im Mesenchym induzierten TGFβ1-Produktion stattfindet.

Fig. 10 zeigt, daß eine niedrige Konzentration von TGFβ1 die in vitro Morphogenese normaler Brustdrüsenepithelzellen steuert, vor allem wenn der Faktor transient gegeben wird. Höhere Konzentrationen von TGFβ1 bewirken in den gleichen Zellen Apoptose Normale EpRas Zellen wurden in Kollagengele ausgesät, wobei ein auf besonders niedrigen TGFβ1-Gehalt selektioniertes fötales Kälberserum während des Aussäens verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen bilden die Zellen keine tubulären Strukturen aus (Fig. 10A) In Anwesenheit von 0,1 ng/ml TGFβ1 bilden die Zellen verzweigte Strukturen, denen jedoch Lumina fehlen (Fig. 10B). Wird in Kulturen mit solchen Strukturen das TGFβ1 am Tag 7 durch Waschen entfernt, bilden die Zellen deutliche Hohlstrukturen aus (Fig. 10D). Höhere Konzentrationen an TGFβ1 bewirken Zelltod (Apoptose, Fig. 10C, links niedrige, rechts höhere Vergrößerung).

Fig. 11: zeigt die In vivo Expression von TGFβ1 während der Bildung der normalen Brustdrüse während der Pubertät (Tag 25).

Gefrierschnitte wurden durch Endknospen einer virginalen Brustdrüse (linke Tafeln) oder durch bereits ausgebildete Drüsenkanäle (rechte Tafeln) wurden hergestellt wie in dem mittleren Schema angedeutet. Aufeinanderfolgende Schnitte einer Schnittserie wurden der RNA in situ Hybridisierung für TGFβ1 mRNA unterworfen (obere Tafeln) oder histologisch gefärbt. Es ist deutlich erkennbar, daß mesenchymale Zellen, welche die Endknospe umgeben, stark TGFβ1 exprimieren (linke Tafeln), während in Zellen, die differenzierte Drüsenkanälchen umgeben, keine TGFβ1-Expression nachweisbar ist.

Fig. 12 zeigt die in vivo Expression von TGFβ1 beim Abbau der 11069 00070 552 001000280000000200012000285911095800040 0002019613691 00004 10950voll entwickelten Brustdrüse nach dem Abstillen.

Säugenden Mäusemüttern wurden die Jungtiere weggenommen, was die Rückbildung der voll entwickelten Brustdrüse auslöst. 3 Tage später wurden Gefrierschnitte durch die absterbenden Bereiche der Brustdrüse (linke Tafeln) sowie durch von der Apoptose nicht betroffene Drüsenkanäle (rechte Tafeln) angefertigt (siehe Schema in der Mitte der Abbildung). Die Schnitte wurden dann auf TGFβ1 Expression untersucht, wie in der Legende zu Fig. 11 beschrieben. Während in der Umgebung absterbender Alveoli TGFβ1 produzierende Zellen deutlich nachweisbar sind (linke Tafeln, fehlen solche in der Umgebung der überlebenden Drüsenkanäle.

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Claims

1. Arzneimittel, enthaltend als wirksame Verbindung eine Substanz, die die Wirkung von TGFβ auf die Zellen inhibiert, und/oder eine Substanz, die die Expression oder die Funktion von onkogenem Ras und/oder die Überexpression von normalem Ras in den Zellen inhibiert, für die Behandlung von Tumorerkrankungen, die durch einen Übergang der Zellen vom epithelialen in den fibroblastoiden Zustand charakterisiert sind.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, enthaltend einen TGFβ-Inhibitor in Kombination mit einem Ras- Inhibitor.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend als Ras-Inhibitor eine Substanz, die die Aktivierung von Ras direkt inhibiert.

4. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend als Ras-Inhibitor eine Substanz, die die Aktivierung von Ras indirekt inhibiert.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Inhibitor einer Rezeptor-Tyrosinkinase ist.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Inhibitor des EGF-Rezeptors ist.