WO1997037678A1 - Arzneimittel für die behandlung von tumorerkrankungen - Google Patents

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WO1997037678A1
WO1997037678A1 PCT/EP1997/001699 EP9701699W WO9737678A1 WO 1997037678 A1 WO1997037678 A1 WO 1997037678A1 EP 9701699 W EP9701699 W EP 9701699W WO 9737678 A1 WO9737678 A1 WO 9737678A1
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tgfß
tumor
cell
ras
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PCT/EP1997/001699
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Hartmut Beug
Martin Oft
Ernst Reichmann
Karl-Heinz Heider
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to the field of tumor therapy.
  • epithelial tumors More than 80% of the tumors occurring in humans are of epithelial origin.
  • the formation of epithelial tumors is a multi-stage process, which is most clearly illustrated in the progression of human colon carcinoma (Powell, et al., 1993) and mouse skin tumor (Wright, et al., 1994).
  • Carcinomas are believed to originate from single or small groups of cells in which mutations have occurred. These cells develop into benign, epithelial hyper- or dysplastic areas. The progression of these hyperplastic areas to carcinoma in situ, which can then acquire invasive and metastatic properties, requires a number of further mutations in the tumor cell.
  • these cells acquire the ability to proteolytically degrade their basement membrane, evolve from a sedentary, polarized cell to a non-polarized cell capable of locomotion in tissue, survive in the bloodstream, and form metastases at distant sites (Liotta, et al. , 1991; Liotta and Stetler-Stevenson, 1991).
  • TGFßl belongs to a large super family of multifunctional polypeptide factors.
  • the TGFß family itself consists of three genes, TGFß1, TGFß2 and TGFß3, which have extremely high homology to one another.
  • the TGFß superfamily includes the various TGFß genes as well as the embryonic morphogens such as the family of activins, "Müllerian Inhibitory Substance", and the bmp family ("Bone Morphogenetic Protein"), which play important roles in both Regulation of embryonic development as in the reorganization or reorganization of epithelia play (Roberts and Sporn, 1992).
  • TGFß1 inhibits the growth of many cell types, including epithelial cells, but stimulates the proliferation of various types of mesenchymal cells.
  • TGFßs induce the synthesis of extracellular matrix proteins, modulate the expression of matrix proteinases and proteinase inhibitors and alter the expression of integrins.
  • TGFßs are expressed in large quantities in many tumors (Derynck, et al., 1985; Keski-Oja, et al., 1987). This strong presence in neoplastic tissues could indicate that TGFßs are strategic growth / morphogenesis factors that affect the malignant properties associated with the various stages of the metastatic cascade.
  • TGFßs inhibit the growth of normal epithelial and relatively differentiated carcinoma cells, whereas dedifferentiated tumor cells, which lack many epithelial properties, generally counter growth inhibition are resistant to TGFßs (Hoosein, et al., 1989; Murthy, et al., 1989).
  • TGFßl can increase the invasive and metastatic potential of a breast adenoma line (Welch, et al., 1990), which suggests the role of TGFßl in tumor progression.
  • the molecular mechanisms underlying the effect of TGFßs during tumor cell invasion and metastasis still require elucidation.
  • the object of the present invention was to provide new drugs for tumor therapy.
  • TGFß TGFß
  • the effect of TGFß on the tumor cell results in cooperation with (i) the expression of oncogenic Ras, with (ii) the overexpression of normal Ras or receptor tyrosine kinases that activate the Ras signaling pathway or with (iii) others in the tumor cell activated oncogenes to convert epithelial cells into fibroblastoid cells with invasive potential.
  • EFC epithelial-fibroblastoid conversion
  • TGFßl resulted in the same Ras-transformed cells developing into disordered strands consisting of spindle-shaped cells with fibroblastoid properties.
  • TGFßl was unable to make such changes.
  • the converted cells were highly invasive both in collagen gels and in the chicken heart invasion assay. Surprisingly, it was found that once the fibroblastoid cells had undergone the conversion, they themselves produced large amounts of TGFß1.
  • TGFßl was inactivated by a TGFßl neutralizing antibody, the cells developed back into a polarized, epithehal phenotype. This cell behavior indicates that the converted fibroblastoid phenotype is maintained by TGFßl, where TGFßl acts via an autocrine loop.
  • TGFßl is able to trigger and maintain the invasive phenotype of Ha-Ras-transformed breast epithelial cells in experimentally induced tumors.
  • TßRII-dn a dominant-negative TGFß receptor chain II
  • TßRII-dn a dominant-negative TGFß receptor chain II
  • Such expression of TßRII-dn resulted not only in Ras-transformed mouse breast epithelial cells, but also in a number of already mesenchymal, invasively growing carcinoma cell lines in humans and mice to abolish the malignant, invasive phenotype and to completely inhibit the formation of tumors or metastases obtained by these lines in the test animal.
  • TGFß also causes an increase in invasive growth in these cells when the TGFß receptor is switched off or the signal transmission paths activated by him to reverse the EFC, ie led to fibroblastoid-epithelial conversion (FEC) and / or loss of the invasive, tumorigenic cell phenotype.
  • FEC fibroblastoid-epithelial conversion
  • the spindle cell tumors clearly originated from the epithehal donor cells injected into the animal.
  • Spindle cells from the tumor survived the selection in G418 and still expressed cell- and tissue-specific cytokeratins, which confirms their donor cell properties and their epithelial origin.
  • the investigations carried out showed that the injected epithelial cells and the converted fibroblastoid tumor cells originated from the same cell clone and that a re-integration of the retroviral vector into other parts of the genome could be excluded as a possible cause of the changes.
  • TGFß1 induces EFC both in collagen gels and during tumor development.
  • this TGF ⁇ 1-induced conversion remarkably required the participation of an activated Ras protein; neither primary breast epithelial cells nor the parental EpH4 cells underwent TGFßI-induced EFC. From this it can be concluded that EFC is triggered by a synergy of different signal transmission paths which are activated on the one hand by TGFßl and on the other hand by Ha-Ras. This assumption is supported by other findings which show that activated Ras proteins can have similar effects on cells as members of the TGFß family. This applies e.g.
  • TGFß upregulates genes associated with the growth of the embryonic heart regulated by hemodynamic stress. These effects are at least partially mimicked by activated Ras (Parker, et al., 1990; Thorburn, et al., 1993), which suggests that, at least in certain biological systems, Ras and TGFß can act synergistically.
  • TGFßl is also abundant in many human tumors (Derynck, et al., 1985; Keski-Oja, et al., 1987; Thompson, et al., 1991), it can be concluded from the results obtained in the context of the present invention that that Ras and TGFßl-induced signals also act synergistically in human tumors. As the results of the experiments carried out in the context of the present invention show, the TGF ⁇ receptor can also control EFC and invasiveness in tumor cells which have been transformed by oncogenes other than Ras. Another essential finding in the context of the present invention is that TGFß cooperates with various oncoproteins, including Ras, tyrosine kinases, in regulating the plasticity of the polarized epithelic phenotype.
  • EpRas cells After serum-free (and TGFß-free) cell culture in reconstituted collagen gels, EpRas cells showed a high ability for organogenesis and a high degree of epithelial polarization. However, the Ep-Ras cells predominantly formed enlarged tubules and alveolar cavities, in contrast to the narrow, branching tubules formed by the parent EpH4 cells or by primary breast epithelial cells. This shows that the Ras oncoprotein alone, in the absence of TGFß, is able to modulate the morphogenetic behavior of epithelial cells to some extent. In other systems, stronger effects of activated Ras on epithelial polarity have been described (Eaton and Simons, 1995).
  • fibroblastoid, migratory cells should be able to develop back into well-differentiated secondary tumors in the new environment provided by a distant tissue (see below). Increased phenotypic plasticity is therefore a hallmark of invasive tumor cells.
  • EpRas cells have to undergo an EFC in order to produce significant amounts of TGFßl both in vitro and in vivo. It could be shown that tumor cells can maintain their fibroblastoid phenotype via the autocrine production of TGFßl and that the autocrine TGFßl production and reaction to the producing cell (autocrine loop) must be interrupted in order to enable the phenotypic re-conversion of the cells .
  • the ability of TGFßl to induce EFC and then to efficiently maintain the invasive phenotype can also explain why the initially epithehal Ras-transformed cells progressively and uniformly transformed into spindle cells during tumor growth.
  • TGFß1 vascular endothelial cells
  • stromal cells surrounding the microtumor produced the cytokine. These stromal cells could be identified as fibrocytes and endothelial cells, but it can be assumed that other cell types, such as macrophages and lymphocytes, were probably also present; All of these cell types are known to produce and release TGFß1.
  • the most likely conclusion from this is that the effects of TGFß1 are primarily regulated at the level of its proteolytic activation. The primary regulation of TGFß takes place through factors that control the processing of the latent to the biologically active molecule.
  • TGFß activation in vivo.
  • the protease plasmin can activate latent TGFß1 in co-culture systems of two cell types, but only if two different cell types are in direct contact or are close to one another (Antonelli-Orlidge, et al., 1989; Sato, et al., 1990).
  • This close contact of different cell types in the system used in the context of the present invention is likely to occur after encapsulation of the tumor by the stroma and, to an even greater extent, when donor tumor cells mix with stroma cells of the recipient animal during tumor development (Fig. 2B ).
  • TSP thrombospondin
  • an extracellular matrix protein activates latent TGFß.
  • the activation takes place in the soluble phase and does not require any proteolytic activity (Schultz-Cherry, et al., 1994).
  • the cancer-promoting role of thrombospondin and increased thrombospondin concentrations in malignant breast cancers have recently been reported (Castle, et al. 1991; Wong, et al., 1992). It was thus shown in the context of the present invention that the autocrine production of TGFßl, in cooperation with the oncoprotein Ha-Ras, maintains the fibroblastoid phenotype.
  • TGFßl is primarily produced by infiltrating cells of the tumor stroma, such as fibrocytes, endothelial cells, lymphocytes and macrophages.
  • the interaction of the tumor cells with the different cell types of the tumor stroma should trigger the efficient production and / or activation of TGFßl. This in turn should induce the epithelial tumor cells to transform into the fibroblastoid and invasive phenotype.
  • TGFßl fibroblastoid cells
  • autocrine loop autocrine loop
  • Other mutations or selective mechanisms are likely to cause some of these invasively growing cells to migrate in and out of blood vessels and eventually form secondary tumors at distant sites.
  • This model is consistent with findings that show that increased TGFß1 expression is also involved in the progression to malignancy in a prostate cancer mouse model (Thompson, et al., 1992; 1993).
  • EFC TGFßl production in the tumor
  • the TGF ⁇ receptor generally plays a central role in the regulation of EMT and invasive tumor cell growth. Not only in Ha-Ras-transformed breast epithelial cells, but in a number of other tumors that originate from other epithelial types and in which it is unknown which oncogenes take over the function of Ha-Ras, the TGFß receptor was able to be the decisive regulator of epithehal plasticity as well as the invasive growth of the tumor cells.
  • TßRII-dn a dominant-negative TGFß receptor
  • This TßRII-dn represents a so-called "kinase-dead” mutant of the receptor chain II, which binds to endogenous type I receptors, but cannot phosphorylate them.
  • TGFßl ligand
  • the total signal transmission from the TGFß receptor can be inhibited in these cells.
  • the expression of TßRIl is thus suitable for simulating the effect of inhibiting TGFß or the inhibition of the signal transmission path triggered by activation of the TGFß receptor.
  • TßRII-dn was overexpressed in Ha-Ras transformed mouse breast epithelial cells (EpRas). All clones obtained showed a strongly delayed tumor growth in nude mice. In addition, the cells isolated from such tumors had an epithelial phenotype and did not express epithelial markers (E-cadherin, ZO-1), however, no mesenchymal markers (vimentin). This shows that expression of a TßRII-dn inhibited EFC during tumor formation. After receiving these results, it was of interest to check whether switching off the signal transmission of the TGFß receptor also works in tumor cells that have already undergone EFC and thus have a stable, mesenchymal and invasive phenotype.
  • the mouse colon carcinoma line CT26 was selected as an example of such a cell line.
  • This tumor cell line has a very pronounced tendency to rapidly form lung metastases after subcutaneous injection into mice, so that the animals perish even after timely resection of the primary tumor on the lung metastases.
  • This cell shows mesenchymal morphology, grows in the collagen gel into disordered chains and strands of spindle-shaped cells and does not express any other epithehal markers apart from basal cytokeratins. Instead, the cells have high vimentin expression.
  • TßRII-dn the dominant-negative TGFß receptor
  • the cells form smaller or larger compact clumps in the collagen gel and grow on plastic as epithelioid cells, which form hemicysts (domes) and large amounts of E -cadherin and ZO-1 express.
  • the TßRII-dn apparently transformed the cells back into cells with an epithelial phenotype (fibroblastoid-epithelial conversion, FEC).
  • TßRII-dn the dominant-negative TGFß receptor
  • the findings obtained in the context of the present invention indicate that the increased sensitivity and altered responsiveness of the cells to the ability of TGFß to modulate the epithehal phenotype generally represents a property of epithehal tumor cells.
  • This altered willingness to react can be caused by Ras (onco) proteins, but also by tyrosine kinases, which activate Ras, and by other, previously unknown oncoproteins.
  • This oncogene induced change in response to normal environmental signals such as those induced by TGFß1 should lead to an altered gene expression in the tumor cell as well as to incorrect transmission or interpretation of signals between tumor and stromal cells.
  • This abnormal "crosstalk" between tumor cells and their immediate surroundings is likely to be the driving force behind what is commonly referred to as tumor progression.
  • the results of the experiments show that activated Ras, overexpressed receptor tyrosine kinases which activate the Ras signaling pathway and other, possibly unknown oncogenes, cooperate with the TGFß1 receptor both in normal development and in carcinogenesis.
  • Processes such as the induction / activation of stromal TGFßl through interaction of epithelial and mesenchymal cells and EF conversion induced and maintained by TGFßl are likely to be involved.
  • TGFßl has a physiological, strictly regulated function during the morphogenesis of normal cells.
  • transformation by oncogenes causes degeneration the function of TGFßl, ie constitutive, highly abnormal morphogenetic changes are triggered in the cells.
  • the present invention thus relates to a medicament containing, as an active compound, a substance which inhibits the action of TGF ⁇ on tumor cells of eptihelial origin, for the treatment of epithehal, invasive tumor diseases which are caused by a reversible transition of the cells from an epithehal, non-invasive in are characterized by an invasive condition.
  • the medicament also contains substances which inhibit the expression of oncogenic Ras and / or the overexpression of normal Ras or the action of Ras-activating receptor tyrosine kinases in the cells.
  • the tumor cells In epithehal invasive tumor diseases, the tumor cells have an increased phenotypic plasticity, i.e. they can undergo transitions from the epithal, non-invasive state to the fibroblastoid, invasive state (EF conversion) and vice versa (FE conversion).
  • TGFß inhibitor The substance which inhibits the action of TGFß on the cells or the signal transduction mediated by activation of the TGFß receptor is hereinafter referred to as "TGFß inhibitor".
  • TGFßs like the other members of the TGFß superfamily of multifunctional polypeptide factors such as activins, bone morphogenetic proteins (bmp ' s) etc., exert their effect by binding to specific cell surface receptors.
  • the TGFß receptors of type I and type II form heterodimeric complexes after binding of the ligand, which initiates signal transmission.
  • the type II receptors which are assigned to the group of the receptor serine / threonine kinases in terms of their activity, bind the ligand, but in order to be able to pass on the signal obtained from the ligand, association with the type I receptors requires which serine -Threonin kinases represent.
  • type II receptors While the type II receptors are responsible for the ligand specificity, they heterodimerize functionally different type I receptors with several type I I receptors. In this ligand-induced heterodimerization, the type II receptor chains phosphorylate the type I receptors on serine / threonine residues and thereby activate them. This interaction of the type II receptor with a specific type I receptor causes the activation of specific signal transmission pathways and, as a result, a transcriptional response to the signal transmitted to the cell by the ligand.
  • TGF ⁇ inhibitor blocks the cellular response triggered by receptor activation, i.e. it prevents the TGFß receptor system from being activated and thus triggering the cellular signaling pathway.
  • type I represents Receptor is one of the target molecules for the TGF ⁇ inhibitor. Because of the necessity for phosphorylation of the type I receptor by the type II receptor (and on the basis of the results presented with dominant negative type II receptors whose serine kinase activity is destroyed by mutation However, the type II receptor can also be used as a target molecule for inhibitors.
  • TGF ⁇ inhibitors are thus based on the prevention of the interaction between the ligand TGFß and the type II receptor, the prevention of the signal transmitted from the type II receptor to the type I receptor, which indicates the activation of the type I. - Receptor causes.
  • the blocking of the binding of TGF ⁇ to the type I receptor, the inhibition of the activity of the type I receptor or the inhibition of an effector molecule of the signal transmission pathways activated by the type I receptor are also possible targets for inhibitors.
  • TGFß inhibitors are antibodies which neutralize TGFß, in particular monoclonal antibodies, TGFß antisense RNA molecules (Fakhrai et al., 1996) or dominant-negative TGFß receptors of type I or II.
  • the invention relates to screening methods for identifying pharmacologically active substances for the treatment of epithehal, invasive tumor diseases which are characterized by a reversible transition of the cells from an epithehal, non-invasive to an invasive state.
  • One way to find suitable, in particular low molecular weight, inhibitors is to determine in a first step which type I receptors are responsible for the transition from the epithal to the fibroblastoid state of the cells.
  • the EpRas cell line used in the context of the present invention (or one of the other cell lines used which are able to bring about the EF conversion or have already undergone one) is examined to determine which TGF ⁇ type I / l I receptor expressed them.
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • oligonucleotides derived from known TGFß type I or type I I receptors, are used as PCR primers in order to extract the relevant receptor from EpRas DNA -DNA- to amplify and thus identify the TGF ⁇ type I or type II receptor expressed in these cells.
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • TGFß type II receptor subtype (as such) is directly or indirectly necessary for the signal transmission which results in the EF conversion.
  • This TGFß type II receptor subtype thus represents one of the target molecules for the TGFß inhibitor. This fulfills an essential prerequisite for establishing a cellular or biochemical screening assay which can be used to specifically screen for substances which inhibit this target molecule .
  • the expected effects can be divided into two groups:
  • the first group includes the effects of TGFß described in the literature on normal mesenchymal and epithelial cells, e.g. in wound healing.
  • the second group of changes are those that occur specifically in the effect of TGF ⁇ on transformed cells (such as in the experiments described in the present invention). While TGFß effects of the first group can be used for a primary HTS screen ("high throuput screen", screen with a high throughput rate), any inhibitor candidates found must be tested for their inhibitory effect on TGFß effects of the second group.
  • TGFß effects of the first type include i) the induction of extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, elastin; ii) induction of the protease inhibitor PAI (plasminogen activator inhibitor) and thus inhibition of cellular protease activity, and iii) inhibition of cell growth and induction of programmed cell death (apoptosis) in certain cell types. These primarily include normal epithelial cells and only slightly degenerate, essentially still epitheloid tumor cell lines. Induction of PAI-1 expression and TGFß-induced apoptosis lend themselves to processes which can be used to build up a cellular assay system for screening substances which act as TGFß receptor inhibitors. The selected effect is used directly as a detection system for the inhibitory effect of the substance.
  • PAI protease inhibitor
  • EpRas cell line used This type I / type II receptors are used to transmit the induction of PAI (or another molecule regulated by TGF ⁇ ) in non-transformed cells, for example in the normal starting cell line EpH4 (also used in the context of this invention) , for example it is checked whether the induction of PAI (or another molecule) or the very good growth inhibition in this cell line is blocked by a dominant-negative mutant of the same type I or II receptor, which also blocks the EF conversion.
  • This test cell which is a human or animal cell is stably transformed with a plasmid in which a reporter gene, e.g. the luciferase gene, is under the control of the regulatory sequence of the PAI gene (or a gene which is for another molecule regulated by TGF ⁇ , e.g.
  • the test cell is also transformed with the human type I or type II receptor, which after further experiments have been shown to be most efficient in triggering EF conversion as well as inducing PAI or one other molecule regulated by TGFß
  • the human TGFß type II receptor used for the construction of the TßRII-dn used is one m possible target molecules for a TGFß Inhibitors.
  • a parallel cell clone is expediently used as the control cell, in which the PAI-1 promoter-controlled reporter gene is activated by another receptor which is not related to the TGF ⁇ receptor (for example members of the FGF (fibroblast growth factor) receptor tyrosine kinase family) .
  • a second way of measuring the blocking of the TGFß receptor function by test substances can be measured in a simple manner by removing the growth inhibition caused by TGFß and apoptosis. Since TGFß efficiently induces apoptosis in normal EpH4 cells under certain conditions, effective inhibitors of the TGFß receptor should act as factors that stimulate survival or growth. EpH4 cells in which another apoptosis-inducing receptor was expressed can be used as control cells.
  • the Fas receptor is particularly suitable for this, which, after binding a special Fas ligand, efficiently induces apoptosis in almost all cell types.
  • the abolition of an apoptotic effect by effective TGFß receptor inhibitors has the advantage that it can easily be measured in commercially available test systems (for example in the MTS assay, which measures the number of living, metabolically active cells), and that toxic substances (the cause rather than cancel cell death) can be easily identified as such.
  • This test system is therefore also suitable for HTS primary screens.
  • a further possibility for a cellular assay system, with which substances can be tested for their inhibitory effect on the EF conversion triggered by activation of the TGF ⁇ receptor system is based on the expression of proteins which are characteristic of the fibroblastoid cell type after EF conversion and are therefore an indicator of the occurrence of EF conversion.
  • Vimentin (Reichmann et al, 1992), who was shown in the context of the present invention that its expression is associated with the EF conversion triggered by cooperation between Ras and TGFß.
  • markers of the fibroblastoid phenotype are the loss of expression of E-cadherin mRNA and the de novo expression of fibronectin and various proteases (UPA, TPA, Reichmann et al, 1992).
  • a suitable test cell transformed by Ras or other oncogenes is transformed with a plasmid in which a reporter gene is under the control of the vimentin gene promoter or promoters of one of the other fibroblastoid marker genes mentioned. The modulation of reporter gene expression by a test substance should then correlate with modulation of the EC conversion caused by the same inhibitors.
  • TGFß itself as a detection system.
  • This assay principle is based on the knowledge gained in the context of the present invention that the activation of the TGFß receptor system in oncogene expressing cells by the ligand TGFß causes the autocrine production of TGFß, which has an autocrine loop effect on the cells.
  • the cells contain a reporter gene construct which is under the control of the TGFß gene promoter (Kim et al, 1989).
  • Biochemical assays in which TGFß inhibitors are identified, the effect of which is based on the fact that they inhibit the TGFß signal transmission path can be carried out, for example, as follows: In an assay format, in the presence and in the absence of test substances (potential TGFß inhibitors ) the autophosphorylation of the TGFß receptor type II or its cytoplasmic domain, which contains the kinase domain, is measured on serine or threonine residues in vitro, such a kinase assay being carried out according to methods known from the literature, for example as described by Lin et al., 1992, or by Braunwalder et al., 1996, and using a receptor (or its domain) produced recombinantly, for example in E.
  • Inhibitors of the TGF ⁇ receptor found in one of the test systems described in the primary screen are expediently tested for their specificity in secondary screens. This can be done primarily by direct inhibition of the TGFß-dependent EF conversion of EpRas cells in collagen gels. Another possibility is the incubation of converted EpRas cells (eg from mouse tumors) sown on plastic dishes in sparse density with the inhibitors of the TGF ⁇ receptor found. Effective substances should trigger the conversion of fibroblastoids into epithelial cells even in the presence of TGFß. The same substances should cause re-epithelialization (FE conversion) in CT26 cells.
  • mice injected with CT26 cells can be tested to determine whether they slow down the growth of the primary tumor or inhibit metastasis after excision of the primary tumor.
  • the substance which inhibits the expression or function of oncogenic Ras and / or the overexpression of normal Ras (or the result of this overexpression) and / or the activation of normal Ras by receptor tyrosine kinases in the cells is hereinafter referred to as "Ras ⁇ inhibitor ".
  • Ras inhibitors in the sense of the definition of the present invention either inhibit Ras directly by inhibiting the activation / function of Ras itself or by inhibiting the activation / function of a Ras effector molecule which acts in the Ras signal transmission path below Ras.
  • Examples are inhibitors of Raf, such as Raf antisense oligonucleotides (Monia et al., 1996).
  • Ras activation can also be brought about by inhibiting these receptors.
  • EGF receptor Epidermal Growth Factor Receptor
  • homologous receptors such as HER-2, HER-3 or HER-4.
  • HER-2, HER-3 or HER-4 examples of chemical compounds that inhibit the EGF receptor can be found in WO 96/07657.
  • Ras inhibitors are monoclonal antibodies (Furth et al., 1982), dominant-negative mutants (Stacey et al., 1991; Quilliam et al., 1994) and antisense RNA.
  • low molecular weight Ras inhibitors are inhibitors of Ras famesyl transferases (Kohl et al., 1993; Kohl et al., 1994; Kohl et al., 1995).
  • genes coding for mutations of the Ras proteins H-Ras, K-Ras or N-Ras which lead to a constitutive activation of Ras are introduced into mammalian cells, e.g. using retroviral vectors, and the selective cytotoxic effect of test substances on the ras ⁇ transformed cells is determined.
  • a suitable method for identifying ras inhibitors is e.g. described in EP-A 604 181.
  • Ras-transformed cell lines that can be used as test cells for the identification of Ras inhibitors have also been developed by Andrejauskas and Moroni, 1989, and by Jenkins et al., 1993.
  • Ras inhibitors can also be identified using an assay based on the EpRas cell line used in the context of the present invention.
  • the cells contain a reporter gene construct in which the reporter gene is under the control of the regulatory sequence of the TGF ⁇ gene.
  • TGFß is first applied to the cells to effect EF conversion.
  • the cells are then exposed to the test substances.
  • Test substances that are capable of inhibiting the activity of the reporter gene can be assumed to be Ras inhibitors. Confirmation of this can then be given in secondary screens, in which the substances are examined to determine whether they inhibit the TGFß-induced EF conversion of EpRas cells in collagen gels or can reverse the EFC that has already taken place.
  • the medicament according to the invention can be used to prevent the cells from going into the fibroblastoid state and becoming invasive, thus preventing or reducing their tumorigenicity.
  • the medicament according to the invention can also be used to convert existing, fibroblastoid and invasively growing tumor cells into non- or less malignant, epithelial cells.
  • the medicament according to the invention can be used to prevent the conversion of the cells from the epithehal, non-invasive to a fibroblastoid, invasive state.
  • An example of this is its administration after surgical removal of a primary tumor in order to prevent tumor cells which may still be present from becoming invasive and producing further tumors by metastasis.
  • the medicament according to the invention can also slow down tumor growth via the same mechanism, as could be shown with the aid of the CT26 cells expressing TßRII-dn.
  • the medicament according to the invention can be used to reverse the EF conversion of the cells that has already taken place. Once the conversion has occurred, TGFß maintains the fibroblastoid state due to an autocrine loop.
  • the administration of a TGFß inhibitor alone causes the autocrine loop to be switched off and thus a reversion of the fibroblastoid, invasive state of the cell into the normal, epithehal state.
  • This reversion is temporary, however, and the transformed state of the cell brought about by Ras or other oncogenes is not fundamentally changed. This means that when the TGFß inhibitor is discontinued, the EF conversion could be brought about again.
  • an oncogene inhibitor for example a Ras inhibitor or a HER-1/2 inhibitor
  • the transformed state of the cell is abolished, the cell behaves like a normal epithelial cell and reacts accordingly normal on TGFß, ie the action of TGFß on the cell cannot bring about an EF conversion and even has the effect of inhibiting the growth of the tumor cell.
  • TGFß receptor
  • TGFß receptor
  • most tumors constantly produce TGFß see below
  • TGFß which is released into the environment and has an immunosuppressive effect there, i.e. inhibits the function of cytotoxic T lymphocytes and other cells of the immune system. If the conversion of invasive tumor cells into non-invasive, more epithelial cells is effected by the TGFß receptor inhibitor, these should switch off the TGFß secretion and thus be more easily attacked and lysed by cytotoxic T cells.
  • the medicament according to the invention preferably contains a combination of TGF ⁇ inhibitor and Ras inhibitor.
  • fibroblastoid marker proteins eg vimentin
  • the increase in expression of these markers is thus one of the diagnostic parameters for tumor diseases, for the treatment of which the medicament according to the invention can be used.
  • Such tumors include breast adenocarcinomas (Heatley et al., 1993), renal cell carcinomas (Beham et al., 1992), breast carcinosarcomas (Wargotz and Norris, 1989), esophageal carcinosarcomas (Guarino et al., 1993) or des female genital tract (de Brito et al., 1993), epithelioid sarcomas and spindle cell carcinomas of various locations, e.g. Lung carcinomas with spindle cell components (Matsui et al., 1992) or spindle cell carcinomas of the gallbladder (Nishihara et al., 1993).
  • the medicament according to the invention is preferably used for the treatment of breast tumors and renal cell carcinomas.
  • the medicaments according to the invention are administered in humans in doses of 0.01 to 100 mg / kg body weight, preferably 0.1 to 15 mg.
  • the drug contains customary inert carriers and auxiliary substances.
  • the person skilled in the art can find methods for the formulation of pharmaceutical preparations in relevant manuals, such as Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.
  • Fig. 1 Conversion of EpRas cells into fibroblastoid cells during tumor formation in mice.
  • Fig. 2 Epithelial / mesenchymal conversion (EFC) during the
  • Fig. 3 Organogenesis and epithelial polarity are destroyed by serum or TGFßl.
  • Fig. 4 TGFßl destroys cell polarity in Ras-transformed
  • EpRas cells upright via an autocrine loop.
  • Fig. 7 Converted EpRas cells produce high
  • TGFßl dissolves the in experimentally induced tumors
  • TGFßl induces in vitro morphogenesis and apoptosis in normal mammary epithelial cells
  • Fig. 11 In vivo expression of TGFßl during the formation of the normal mammary gland
  • Fig. 12 In vivo expression of TGFßl during the breakdown of the fully developed mammary gland after weaning Fig. 13. Inhibiting human invasiveness
  • FIG. 16 Expression of TßRII-dn in CT26 cells inhibits metastasis formation in vivo.
  • FIG. 17 TßRII-dn expressing CT26 cells are incapable of being in the lungs even after intravenous injection
  • FIG. 18 Expression of a PAI-1 Promoter Reporter-
  • EpRas cells were produced by the parental breast epithelial cell line EpH4 (a subclone of the spontaneously immortalized breast epithelial cell line Ep1 (Reichmann et. Al., 1992) selected for high expression of a polarized phenotype) with a helper-free, v-Ha-Ras expressing retroviral Vector (Redmond, et al., 1988).
  • EpH4 a subclone of the spontaneously immortalized breast epithelial cell line Ep1 (Reichmann et. Al., 1992) selected for high expression of a polarized phenotype) with a helper-free, v-Ha-Ras expressing retroviral Vector (Redmond, et al., 1988).
  • the selection and expansion of the polarized epithelial clones was carried out as described by Reichmann, et al., 1992.
  • the cells were grown on plastic dishes in growth medium (Dulbecco's modified Eagles medium; (DMEM), containing 10% FCS (Boehringer Mannheim) and 20 mM HEPES) and subcultured twice at a ratio of 1: 3 for the induction of the hemicysts Epomas cells and cells of the parental line EpH4 were grown at high density for one week without subculturing.
  • growth medium Dulbecco's modified Eagles medium; (DMEM), containing 10% FCS (Boehringer Mannheim) and 20 mM HEPES
  • the human tumor cell lines MZ 1795 (renal carcinoma; Seliger et al. 1996) and KB (nasopharyngeal carcinoma ATCC CCL17; Derynck et al., 1985) were obtained from ATTC. They were cultivated in the same medium as the mouse EpH4 cells.
  • the mouse colon carcinoma line CT26 was also cultured in the same medium as the mouse EpH4 cells.
  • Infected clones were identified with G418 selected and expanded in Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM) containing 20% FCS (Boehringer Mannheim) and 20 mM HEPES. Expression of the TßRII-dn protein was detected in the Western blot via a hemagglutinin (HA) epitope present in the construct.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagles medium
  • FCS Boehringer Mannheim
  • EpRas or EpH4 cells were trypsinized and counted. Then 10 ⁇ cells suspended in 0.1 ml PBS were injected subcutaneously or into the mammary gland of 5-week-old BALB / c mice or nude mice. The mice were sacrificed after different periods of time (between 3 and 28 days) and the tumors (or tissue zones containing the injected cells) were excised. For the subsequent Histological analysis immediately flash frozen the tissue in liquid nitrogen. To isolate the tumor cells for further growth in tissue culture, the tissue was cut into small pieces under sterile conditions using two opposing scalpels and digested with 2mg / ml collagenase type 1 (Sigma) for 1 hour at 37 ° C .
  • the cells obtained from the tumors were grown for the first 5 days in the presence of G418 or hygromycin.
  • the collagen gels were similarly digested with collagenase to isolate the cells for subsequent tissue culture.
  • CT26 cells or CT26-TßRII-dn cells For tumor induction with CT26 cells or CT26-TßRII-dn cells, 1x10 6 cells per animal in nude mice were injected subcutaneously under the dorsal skin. The size of the palpable tumors was determined every 3 days and the animals were killed if the tumors exceeded a size tolerable for the well-being of the animals.
  • mice 1x10 6 cells per animal were injected into syngeneic mice (Balb / C). After the primary tumor had reached a size of 4 cm 3, the tumors were surgically removed so that no tumor tissue remained at the surgical site. The mice were then further monitored and examined for the presence of pulmonary metastases after death.
  • 5,000 and 50,000 cells of both types were iv injected into the tail vein of syngeneic Balb / C mice. The mice were then examined for death from lung metastases as above.
  • Rabbit antiserum that recognizes neomycin phosphotranspherase was prepared by bacterially expressing, purifying and injecting neomycin phosphotransferase into rabbits. After an appropriate time, rabbit serum was obtained and used natively for the immunostaining.
  • the monocolonal mouse antibody against Vimentin V3B (Boehringer Mannheim), the monoclonal rat antibody against ZO-1 (Chemicon), the monoclonal mouse antibody against TGFß 1-3 (Genzyme), the TGFß 2,3 antibody (Genzyme), the polyclonal antiserum against activated TGFß (Promega), the TGFß-neutralizing rabbit polyclonal antibody (R&D) and the monoclonal TGFß antibody (Genzyme) were purchased.
  • the tumor material and the collagen type I gels containing cell structures were snap-frozen in liquid nitrogen immediately after isolation. Before freezing, the collagen gels were soaked in medium containing 5% DMSO for 2 minutes to prevent cell damage due to ice crystal formation. Cells or frozen sections grown on plastic, made from tumors or collagen gels, were fixed and rendered permeable at -20 ° C for 15 minutes using acetone / methanol, mixed in a ratio of 1/1, air-dried and stored at 4 ° C. Incubation with the first antibody was carried out for 1 h at 37 ° C.
  • Anti-cytokeratin (clone MNF 116; DAKO, Denmark), anti-vimentin (clone V9; DAKO, Denmark) and a mixture of anti-TGFß1 and TGFß2 (Santa Cruz, California) were used as primary antibodies.
  • the result of the staining was evaluated with a Zeiss Axioskop microscope.
  • a double fluorescence analysis was carried out for the simultaneous detection of vimentin and cytokeratin in tissue sections.
  • Anti-vimentin (clone V9; DAKO, Denmark) and an anti-cytokeratin rabbit serum were used as primary antibodies, and Cy3-coupled anti-mouse IgG and FITC-coupled anti-rabbit IgG antibodies were used as secondary antibodies.
  • the fluorescence was evaluated using a Zeiss Axiophot 2 microscope with the aid of a Leica Quantimed Q500 image analysis system.
  • RNA in situ hybridization the frozen sections were fixed and extracted as described by Oft, et al., 1993. For this, the sections were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS, washed twice in PBS, prehybridized for 2 h and hybridized overnight with the respective S-labeled riboprobe at 52 ° C. in 50% formamide, 0.6 M NaCl. After washing under stringent conditions (T m -20 ° C) the sections were dipped in Kodak NTB liquid emulsion and exposed for 2 weeks. The slides with the sections were counterstained with hematoxylin / eosin and analyzed in light and dark field illumination using a Zeiss Axiophot microscope.
  • the hTGFßl cDNA (R&D) and the cDNA for neomycin phosphotransferase cut out from a suitable (Redmond, et al., 1988) retroviral vector, were inserted into the T3.T7 expression plasmids (Bluescript II KS Stratagene) cloned and in in vitro, in the presence of S35-UTP for the antisenseribo probe and for the sense control probe.
  • Non-radioactive in situ hybridization for TGFß in sections of human tumor tissue was carried out using digoxygenin-labeled probes.
  • the probe (hTGFßl, see previous section) was labeled using a DIG-RNA labeling kit from Boehringer Mannheim according to the manufacturer's instructions.
  • frozen sections (5-7 ⁇ m) were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min, washed twice in PBS and then acetylated for 10 min in 0.5% acetic anhydride. After washing twice in PBS, the sections were dehydrated in an ascending alcohol series, air-dried and then incubated for 30 min at 52 ° C. in a moist chamber.
  • Hybridization with the probe was carried out for 4 to 6 h at 52 ° C. in a moist chamber. After the hybridization, the slides were washed for 2 ⁇ 10 min in 2x SSC at 52 ° C. and then the bound probe was made visible using anti-digoxygenin antibodies in accordance with the Boehringer Mannheim instructions. The preparations were briefly counterstained with hematoxylin, capped and evaluated using a Zeiss Axioskop microscope.
  • the cells grown in the collagen gels were pre-fixed for 10 min in 3% paraformaldehyde in 0.2 M HEPES pH 7.3 at room temperature. The cells were further fixed in ice in 8% paraformaldehyde in 0.2 M HEPES pH 7.3 for 30-60 min.
  • the samples were dewatered in ethanol at increasingly lower temperatures, embedded in Lowicryl HM20 or K4M and polymerized at -35 ° C using UV light (Schwarz, et al., 1993).
  • the cells were postfixed with 1% osmium tetraoyxd in PBS pH 7.2 for 1 h on ice, stained with 1% aqueous uranyl acetate for 1 h, dehydrated in ethanol at room temperature and finally embedded in Epon.
  • ultra-thin sections were glued to cover slips (Schwarz, 1994). After blocking non-specific antibody binding sites with 0.5% bovine serum albumin and 0.2% gelatin in PBS, the sections were incubated with rabbit anti-catenin antibodies and then with Cy3-labeled goat anti-rabbit IgG. The marked sections were stained with 4 ', 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) in order to make the nuclei visible in the immunofluorescence microscope.
  • DAPI 6-diamino-2-phenylindole
  • DNA from cells or tumor material was isolated and processed using standard methods (Maniatis, et al., 1982). DNA extracted from cells before injection, from freshly excised tumor tissue (day 15 after the injection) and from tumor tissue that had been recultivated in vitro in the presence of G418 for 5 days was compared with the restriction enzyme EcoRI (which only used the retroviral vector once cuts) digested, blotted onto a gene screen membrane and hybridized with the cDNAs encoding either the neomycin phosphotransferase or the v-Ha-ras gene.
  • EcoRI which only used the retroviral vector once cuts
  • RNA (10 ⁇ g per lane) was run on denaturing formaldehyde-containing gels, blotted on gene screen membranes and with the entire coding region of hTGFßl cDNA (R&D), which has enough homology with mTGFßl, 2 and 3, to all to recognize three mouse TGFß isoforms hybridized.
  • RNA from cells grown on plastic, in collagen gels or from tumors was isolated and processed for semi-quantitative PCR.
  • a TGFßI -specific fragment was amphfected by RT-PCR under semi-quantitative conditions using actin primers as an internal control as described by Leonard, et al., 1993.
  • actin primers as an internal control as described by Leonard, et al., 1993.
  • the DNA was denatured at 94 ° C. for 1 min, which became primers annealed at 65 ° C for 1 min and polymerase reactions continued at 72 ° C for 1 min. Amplification was continued for 20 and 30 cycles.
  • the TGFß1-specific primers TGGACCGCAA CAACGCCATC TATGAGAAAA CC (up) and TGGAGCTGAA GCAATAGTTG GTATCCAGGG CT (down) (Clontech Inc.) were used.
  • the results of the PCR were evaluated quantitatively on an image quant phospho-imager. The values were normalized to the control product (-actin) and then compared to the value from control 3T3 fibroblasts.
  • TGFßl in tumor tissues by RT-PCR was carried out as described recently (Heider et al., 1996).
  • the TGF ⁇ 1-specific oligonucleotide GCCCTGGACACCAACTATT GCTTC was used as the ⁇ '-primer and the TGF ⁇ 1-specific oligonucleotide TGCTCCACCTTGGGCTTGC as the 3'-primer.
  • the amplification products were separated on an agarose gel containing 2% ethidium bromide and evaluated under UV light by means of a video camera (MWG Biotech).
  • a PAI-1 promoter-reporter construct (reporter gene was luciferase; 3TP-lux, Wrana et al., 1992) was transfected into CT26 cells or CT26-TßRII-dn cells by means of lipofectamine transfection (Gibco) according to the manufacturer's instructions. 8 hours after transfection, TGFß1 was added for 24 hours, control batches remained without TGFß. Thereafter, cell lysates were prepared and the luciferase activity as described by Wrana et al., 1992, measured in a Berthold Clinilumat.
  • EpH4 polarized EpRas and fibroblastoid EpRas cells, isolated from tumors or converted to TGFß in tumors or in vitro, were washed five times with PBS to remove exogenous TGFß and then 48 h grown long in serum-free DMEM. The cell culture supernatants were then collected and the TGFß1 concentrations were determined using a commercially available ELISA kit (Promega; G1230) according to the manufacturer's instructions.
  • TGFßl in the tissue culture supernatants 2 ml of serum-free cell supernatants were concentrated to a final volume of 0.1 ml by means of ultrafiltration (Centricon 10, Amicon). The concentrated supernatants were mixed with 5-fold concentrated SDS-PAGE sample buffer (without mercaptoethanol) and analyzed by SDS-PAGE under non-reducing conditions. The same protein aliquots (50 ⁇ g) were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; immunoblot analysis was performed as described by Hayman, et al., 1993.
  • This assay was performed as described by Behrens, et al., 1993.
  • the test cells were loaded with a vital fluorescent dye before the examination.
  • the cells for 1 hour contained in a glucose Hanks salt solution containing 10 mM 5,6-Carboxy-2, 7'-dichlorfluoreszeindiacetat succinimidyl ester (Molecular Probes) and 0.2 x 10 -6 M Pluronic F127 incubated.
  • the fluorescent dye is thus covalently bound to intracellular proteins without the viability or behavior of the cells, determined using various differentiation and proliferation assays affect.
  • the labeled cells were grown at high density for 24 hours, scraped from the plastic tray and contacted with pre-cultured heart fragments from 9 day old chicken embryos on the surface of a soft layer. After 7 days in culture, the fragments with the adhering cells were collected, flash frozen in liquid nitrogen, frozen sections were made, fixed in methanol / acetone and the fluorescent cells were determined by means of epifluorescence microscopy (Axiophot, Zeiss).
  • TGFßl-loaded slow release Elvax pellets and either EpRas epithelial cells or normal EpH4H cells were subcutaneously co-injected into mice.
  • pellets loaded with only BSA were co-injected. The pellets were each produced and loaded according to the manufacturer's instructions.
  • Ras-transformed mouse breast epithelial cells show two completely different cell phenotypes. When grown on plastic substrates, these cells grow as ordered, dome-forming monolayers (hemicysts), indicating a polarized epithelial phenotype (Fig. 1A, B). However, after injection into mice, these same polarized cells formed tumors consisting of depolarized spindle-shaped cells capable of invasive growth (Fig. 1A, C). In order to obtain further information about the mechanisms underlying this phenotypic plasticity, a combination of in vivo and in vitro was used experimental approaches investigated the observed cell conversion in detail.
  • EpH4 The cell clone EpH4 was used for this, which is derived from a well-characterized mouse breast epithelial cell line (Reichmann, et al., 1989; Reichmann, et al., 1992; Strange, et al., 1991). These cells show a stable polarized epithelial phenotype (Reichmann, et al., 1994).
  • EpH4 tumorigenic subclones of EpH4 were formed by stable expression of the v-Ha-Ras oncogene. After v-Ha-Ras expression was confirmed by Western blot analysis, cells from seven clones (referred to as EpRas clones) were injected subcutaneously or directly into the mammary glands of Balb / c mice. Tumors formed regularly that were palpable 5-7 days after the cells were injected.
  • the integration pattern of the retroviral construct was carried out by Southern blot Analysis determined.
  • EpRas cells before the injection cells from a 15-day tumor and re-isolated cells from a 30-day tumor were analyzed.
  • probes specific for the neomycin resistance gene or the ras gene were used, identical integration patterns were obtained in all three cell types (FIG. 1D).
  • the conversion of EpRas cells into fibroblastoid cells during tumor formation in mice is shown in FIG. 1.
  • Figure 1A shows the principle of the strategy used to study Ras cell EFC (7 different v-Ha-Ras expressing cell clones were used) in vivo.
  • Fig. 1B Before the injection, cells of the clone Ep5 show plastic dome formation and stain both on E-cadherin (FITC, green fluorescence, appearing dark in the black and white image) and on cytokeratins (Texas-Red, red fluorescence). . Note the common staining of both proteins on the cell periphery (yellow staining).
  • Ep5 cells isolated from a tumor 28 days after cell injection Ep5 cells isolated from a tumor 28 days after cell injection. These cells show a fibroblastoid appearance and express cytokeratins, but no E-cadherin.
  • Fig. 1 D Southern blot analysis.
  • EpRas clone (Ep5) taken before the injection (Ep5, plastic), taken from the tumor (Ep5, tumor), taken from the tumor and recultivated in G418 for 5 days (Ep5, ex tumor) shows the same retroviral integration pattern (detected with a neomycin phosphotranspherase (NPT) probe).
  • NPT neomycin phosphotranspherase
  • FIG. 2C Three different cell types could be distinguished 15 days after the injection: approx. 20% of the tumor cells represented green-colored vimentin-positive stromal cells. A further 20% only expressed cytokeratins, which indicates EpRas cells that epithehalen Have maintained the phenotype. The majority (50-60%) of the tumor mass consisted of cells that co-expressed cytokeratin and vimentin. These cells are most likely to be converted or converting EpRas cells. Both the epithelial and the converted fibroblastoid cells were also obtained after G418 selection. Finally, the epithelial portion could no longer be detected in five-week-old, fully developed tumors, neither in situ nor on plastic. In contrast, parental EpH4 cells never formed tumors.
  • the EpH4 cells When injected subcutaneously, the EpH4 cells developed into layers of epithelial cells that sometimes formed lumens and expressed cytokeratins but did not express vimentin (Fig. 2D). After a long time these cells necrotized and were reabsorbed by the surrounding stroma.
  • EFC epithelial / mesenchymal conversion
  • EpRas tumors Differently treated frozen sections of EpRas tumors (clone Ep2) are shown, which are on day 3 (FIG. 2A, E), on day 7 (FIG. 2B, F), on day 15 (FIG. 2C, G) and on Day 28 (Fig. 2H) were made after the injection.
  • the cell structures that are formed by non-tumorigenic EpH4 cells 15 days after the injection are shown in FIG. 2D.
  • the sections were examined by immunofluorescence (Fig. 2A-D) and in situ hybridization (Fig. 2E-H).
  • the sections were double-stained with antibodies against a 46 kDa cytokeratin (Texas Red, red fluorescence) and vimentin (FITC, green fluorescence).
  • RNA - // 7 situ hybridization using a neomycin phosphotransferase probe confirms the donor origin of the tumor cells and shows the increasing density of the tumor cells after EFC (FIG. 2E-H).
  • TGFßl induces EF conversion in vitro in Ras expressing but not in normal epithelial cells
  • EpH4 cells or Ras-transformed subclones of these cells were grown in reconstituted collagen type gels using serum-free medium. These conditions allowed the use of defined polypeptide growth factors and hormones which are known to be involved in the modulation of the epithehal phenotype.
  • EpH4 cells developed into organ-like glandular channels (tubules), which often ended in club-shaped, hollow swellings.
  • the EpRas clones also showed considerable lumen formation in these serum-free collagen gels. The lumens were visible 2-3 days after sowing. Subsequently, more than 95% of these structures developed relatively large cystic cavities (Fig. 3B, left and middle panels) which resembled the alveoli of the fully developed milk producing breast. On plastic, these cells in turn formed regular epithelial monolayers with domes, thus showed the same epithal properties as the non-tumorigenic starting cells (FIG. 3B, right panel).
  • EpRas cells behaved completely differently when cultured in 10% fetal calf serum (FCS). Under these conditions, they formed elongated, multicellular and invasively growing cell strands that never showed lumen formation. These strands consisted of non-polarized cells that had lost many epithelial properties (FIGS. 3C and 4) and which behaved strikingly similar to the ex vivo fibroblastoid tumor cells.
  • FCS fetal calf serum
  • TGFß1 was the only factor that showed striking and long-lasting effects on EpRas cells.
  • TGFßl was added, these cells grew into elongated, branching cell strands similar to those induced by FCS. On tissue culture plastic, these cells showed a clear fibroblastoid phenotype (Fig. 3D).
  • TGFß1 was unable to induce EF conversion in EpH4-KontroII cells and other non-tumorigenic breast epithelial cell clones.
  • epithelial cell-typical cell-cell contact structures ie tight junctions, characterized by the protein ZO-1, desmosomes (FIG. 4A) and the cell adhesion molecule E-cadherin (FIG. 4B), which is typical of "adherens junctions", could be attached to them typical lateral or basolateral positions .
  • the protein ß-catenin associated with E-cadherin showed basolateral localization in most cells (FIG. 4C).
  • Ras-transformed mouse breast epithelial cells show an extraordinary plasticity in the phenotype, which ranges from epithelially polarized cells organized in ordered epithelia to fibroblastoid, migratory and invasively growing cells.
  • Figure 3 shows the destruction of lumen formation and epithelial polarity by serum and TGFßL
  • Non-tumorigenic EpH4 cells Fig. 3A
  • tumorigenic EpRas cells clone Ep5, Fig. 3B-D
  • the macroscopically visible structures were photographed 8 days after plating out at low and high magnifications (left 97/37678 PC17EP97 / 01699
  • Fig. 3A Ep4H cells form channels and "end-bud” similar swellings in serum-free collagen gels. On plastic, these cells formed a regular epithelial monolayer and crests (Hemicysts, domes).
  • Fig. 3B EpRas cells form wide channels and alveoli-like cysts in serum-free collagen gels.
  • Fig. 3C addition of 10% FCS causes the cells to form invasively growing irregular cell strands without lumens. On plastic, these cells are fibroblast-like and spindle-shaped.
  • FIG. 3D TGFßl alone (5ng / ml) causes EpRas cells to grow into invasive cell strands similar to those induced by FCS.
  • FIG. 4 shows the breakdown of the epithelial cell polarity in Ras-transformed breast epithelial cells after incubation with TGFßL
  • Fig. 4A Transmission electron microscopy showed that the cysts obtained in the absence of TGFß1 consist of a monolayer of morphologically polarized cells which have microvilli exclusively on their apical, lumen-oriented domain (Fig. 4D). The insert picture shows such a single-layer cyst at low magnification. In contrast, the cell strands induced in the presence of TGFß1 consist of loosely adhering cells without microvilli, desmosomes or tight junctions.
  • 4B, E Frozen sections through an alveolar cyst, which were immunostained with an antibody against the cell adhesion molecule E-cadherin, showed a clear basolateral localization of the E-cadherin on most cells. The expression of E-cadherin is reduced in the TGFß1-induced cell strands and is expressed on the entire surface of the fibroblastoid cells.
  • FIGS. 4B and E immunocolored lowicryl sections through structures similar to those shown in FIGS. 4B and E are shown with an anti- ⁇ -catenin antibody. Note the basolateral expression of ß-catenin in most cells of the cyst (FIG. 4C) and the significantly reduced ß-catenin expression, which is now predominantly located in the cytoplasm (FIG. 4F).
  • Fibroblastoid EpRas cells are invasive
  • EpRas cells that had undergone EFC showed signs of invasive behavior in collagen gels.
  • the advantages of the chicken embryo heart invasion assay were used, the relevance of which for in vivo metastasis has already been documented in detail (Mareel, et al., 1979; Mareel, 1983).
  • the immigration of cells into embryo heart fragments was examined in this assay (FIG. 5A).
  • a fluorescent dye carbboxy-dichloro-fluorescein diacetate.
  • Parental EpH4 cells did not migrate into the chicken heart tissue during the seven day incubation period (Fig. 5A, B).
  • TGFßl maintains the fibroblastoid phenotype of converted EpRas cells via an autocrine loop
  • TGFßl had been shown to transform Ras-transformed epithelial cells into fibroblastoids
  • a possible explanation for the relative stability of the fibroblastoid phenotype was the autocrine production of larger amounts of TGFßl by the converted cells themselves.
  • fibroblastoid EpRas cells were used in extremely low concentrations in 1%. FCS (to keep the TGFßl concentration in the medium as low as possible) cultivated. Under these conditions, single cells grow into clearly spatially separated clones.
  • fibroblastoid cells (ex-tumor cells) isolated from a tumor in the presence or absence of TGFßl neutralizing antibodies in collagen gels bred. In the absence of the antibodies, the fibroblastoid tumor cells formed the expected thin, invasively growing cell strands (Fig. 6E). However, the same cells no longer grew invasively and developed into cystic structures consisting of an epithehal monolayer when treated with the neutralizing antibodies for eight days (FIG. 6F).
  • the amounts of the TGFßl mRNA expressed in the cells and of the TGFßl protein released into the culture medium were determined.
  • Three different EpRas clones and the parental EpH4 clone were grown in collagen gels for five days. When treated with 5 ng / ml TGFßl, the EpRas clones underwent EFC, while the untreated EpH4 cells treated the same maintained their epithehal phenotype. Analysis of these cells by means of semi-quantitative PCR (FIG. 7A) or by means of immunoblot (FIG. 7B) showed that the fibroblastoid cells induced by TGFßl produced amounts of TGFßl -mRNA which were comparable to those of control fibroblasts (FIG.
  • FIG. 7A shows that TGFß1 maintains the fibroblastoid phenotype of converted EpRas cells via an autocrine loop.
  • 6A-D Clones of fibroblastoid cells isolated from a tumor (ex-tumor cells) are gradually converted into clones consisting of epithelial cells. To generate the clones, 500 cells per 100 mm dish were sown in medium containing 1% FCS. The medium was changed daily to dilute any autocrine factors. The same typical cell clone was photographed on day 1 (A), day 3 (B), day 5 (C) and day 10 (D) after plating. The gradual conversion of fibroblastoid cells to cells with an epithelial morphology is clearly visible.
  • F Fibroblastoids, EpRas cells isolated from a tumor were selected in G418 for 5 days (to remove cells from the recipient animal) and then sown in serum-free collagen gels. This was done either in the absence (E) or in the presence (F) of TGFßl neutralizing antibodies. It can be seen that the tumor cells develop into lumen-shaped structures in the presence of a TGFßl neutralizing antibody, while in the absence of the antibody they form the expected disordered cell strands.
  • Fig. 7B Similar results were obtained when the TGFßl concentrations in cell culture supernatants by Western blot and ELISA were analyzed (the numbers above the Western blot gel traces show the amounts of TGFß1 in ng TGFß1 / ml determined in the ELISA). The data shown in Fig. 7B could be confirmed with two other EpRas clones (Ep2 and Ep6).
  • TGFßl is actually expressed in EpRas tumors and whether experimentally added TGFßl can also cause EFC and invasiveness of the cells in vivo.
  • Tumors growing out of injected EpRas cells were examined 4 and 15 days after the injection of the cells by means of RNA in situ hybridization and immunohistochemistry for the expression of TGFßl.
  • elevated concentrations of TGFß1 mRNA were detected on the outer edge of the nodes formed by the EpRas cells (FIG. 8A).
  • TGFß1 and neomycin phosphotransferase which is only expressed by the Ras-transformed donor cells
  • NPT neomycin phosphotransferase
  • TGFßl pellets localized near EpH4 cells could not significantly affect the phenotype of these non-tumorigenic cells.
  • Fig. 8 shows how TGFßl triggers the transition from epithelial to fibroblastoid state and the invasiveness of the cells in experimentally induced tumors:
  • RNA in situ hybridization shows that the TGFßl expression on day 4 in the outer tumor periphery (A), but on day 15 (C) in entire tumor takes place. Arrowheads indicate the boundary between the tumor and the surrounding stroma.
  • TGFßl Frozen sections were stained with an anti-TGFßl antibody (green fluorescence) and an anti-neomycin phosphotransferase antibody which recognizes the donor cells (red fluorescence). Side images show sections at a larger magnification. It should be noted that in early tumor stages TGFßl is only produced by the stroma surrounding the tumor (B). In contrast, in 15-day-old tumors, TGFß is also expressed in many donor cells within the tumor tissue (D, yellow fluorescence).
  • F Epithelial EpRas cells were injected subcutaneously into nude mice without (E) or together with 3-Elvax slow release pellets loaded with recombinant (active) TGFßl (F). Frozen sections obtained from 4-day-old tumors were double-stained with antibodies against cytokeratin (red) and vimentin (green). What is striking is the dramatic migration of cells into the surrounding tissue, which was induced in the vicinity of the TGFßl-releasing pellets (white circle).
  • TGFßl effect of TGFßl on normal breast epithelial cells: control of the milk tubule morphogenesis by regulating cell growth, cell polarization and apoptosis
  • TGFßl Since the TGFß superfamily of polypeptide factors is primarily involved in morphogenetic processes during embryonic development, the role of TGFßl in normal mammary gland development was also investigated in the context of the present invention.
  • normal breast epithelial cells of the cell line EpH4 were sown in serum-free collagen gels.
  • the serum necessary for the solidification of the collagen gel and washed out a day later was selected especially for a low content of TGFßl. Under these conditions, in vitro organogenesis was completely inhibited and none were formed tubular structures (Fig. 10 A).
  • TGFß1 In contrast, higher concentrations of TGFß1 (> 0.25 ng / ml) caused the normal epithelial cells to stop growing and die by programmed cell death (apoptosis) (Fig. 5C). This is an important difference between the normal epithelial cells and the cells containing Ha-Ras. While the latter are not induced to apoptose even at 20 times higher concentrations of TGFßl (5 ng / ml) and undergo EFC without exception, the TGFßl concentration is , which regulates morphogenetic processes in normal breast epithelial cells, strictly specified. An aberrant morphogenesis due to excessive TGFßl concentrations may be avoided by instead inducing growth inhibition and apoptosis in the cells.
  • tubular structures consisting of polarized cells with low concentrations of TGFß1 could be due to suboptimal culture conditions.
  • the complete organogenesis of tubular structures could depend on the fact that TGFß1 may only be present during certain phases of organoid development.
  • the cells were treated with 0.1 ng / ml TGFßl until structures were formed, as mentioned above, then TGFßl was washed out of the collagen gel.
  • the atypical structures without lumens reorganized and formed well-formed tubular structures with typical lumens (Fig. 10 D, transient TGFßl).
  • TGFßl is absolutely necessary for in vitro organogenesis, (ii) that the concentration is critical, with higher concentrations leading to apoptosis, and (iii) that TGFßl only affects the organ development during certain phases Cells must act.
  • This normal function of TGFßl in breast epithelial cell development is completely changed in the Ras-transformed cells, where TGFß causes an extremely abnormal form of tissue reorganization which causes a transition from the epithal to the fibroblastoid state (EFC) over a large concentration range.
  • EFC fibroblastoid state
  • the next step was to look for evidence that TGFß1 controls the morphogenesis and programmed cell death of mammary gland epithelium in vivo by analogy with these in vitro findings.
  • mammary glands of mice were subjected to histological analysis in combination with in situ hybridization using a probe against TGFß1 during puberty.
  • the virgin mammary glands grow into the surrounding adipose tissue (fat pad).
  • the growth, differentiation and morphogenesis of the resulting mammary gland are based on a structure called the end bud, which contains undifferentiated, not yet fully polarized epithelial cells) , takes place) were compared with sections through fully differentiated gland ducts (see the schematic drawing in Fig.
  • TGFß also regulates the programmed cell death (apoptosis) of breast epithelial cells in vivo.
  • apoptosis programmed cell death
  • the alveolar cells undergo massive apoptosis, while the cells in the ducts survive and are preserved. These cells are responsible for the regrowth of the mammary glands during a new pregnancy.
  • TGFßl To a possible participation of TGFßl To investigate this process, three days after the end of lactation, frozen sections were made through the dying alveolar zone of a mammary gland as well as through an adjacent gland duct region (FIG. 12, illustration in the middle).
  • the mesenchymal cells surrounding the dying alveoli expressed high levels of TGFßl (Fig. 12, left panel), while the mesenchymal cells surrounding the surviving ductal structures did not express TGFßl (Fig 12, right panels). In both cases, cross talk is likely to occur between the epithelial cells and the TGFßI production induced in the mesenchyme.
  • FIG. 10 shows that a low concentration of TGFß1 controls the in vitro morphogenesis of normal mammary epithelial cells, especially when the factor is given transiently. Higher concentrations of TGFßl cause apoptosis in the same cells.
  • Fig. 11 shows the in vivo expression of TGFßl during the formation of the normal mammary gland during puberty (day 25)
  • Frozen sections were made through end buds of a virgin mammary gland (left panels) or through already formed gland ducts (right panels) as indicated in the middle diagram. Successive sections of a section series were subjected to RNA in situ hybridization for TGFß1 mRNA (upper panels) or stained histologically. It can be clearly seen that mesenchymal cells, which surround the end bud express TGFßl strongly (left panel), whereas in cells that surround differentiated glandular tubules, no TGFßl expression is detectable.
  • Figure 12 shows the in vivo expression of TGFß1 in the breakdown of the fully developed mammary gland after weaning.
  • the young animals were taken away from nursing mouse mothers, which triggers the regression of the fully developed mammary gland. 3 days later, frozen sections were made through the dying areas of the mammary gland (left panels) and through gland canals (right panels) not affected by apoptosis (see diagram in the middle of the figure). The sections were then examined for TGFß1 expression, as in the legend to Fig. 11 described. While dying Alveoli TGFßl-producing cells are clearly detectable (left panels, there are no cells in the vicinity of the surviving glandular canals.
  • the table shows that human renal cell and breast carcinomas coexpress cytokeratin and vimentin. This is a clear indication of an expired EFC. All tumors examined also produce TGFß.
  • the upper part of table (A) shows the results of the staining for cytokeratin and vimentin on frozen sections of the indicated tumor types.
  • the lower part (B) shows the results of staining for TGFß on sections through the same breast tumors. Footnotes show the results of control experiments for the TGFß expression (by RT-PCR) and the expression of TGFß in the tumor stroma.
  • Fibroadenoma (FA) 3 2/3 (66%) invasive ductal canal (IDC)
  • RT-PCR from IDC and ILC 11 cases positive with Ak are also positive with RT-PCR
  • Figure 13 shows that TGF ⁇ neutralizing antibodies prevent invasive growth of human tumor cell lines in the collagen gel.
  • MZ 1795 cells and KB cells were seeded into serum-free collagen gels, to which either 2% serum or 5 ng / ml TGFß was added (+ TGFß, right panels) or to which a mixture of different antibodies against TGFß (- TGFß, left panels; see example) 5, Fig. 6) was added. After 10 days, microphotographs of the cells were taken in the collagen gels. While both the MZ 1795 cells (upper panels, higher magnification, lower panels; overviews, lower magnifications) and the KB cells (lower panels) massively grow into the coli gel if TGFß is present (right panels), the same cells form in the presence of TGFß-neutralizing antibodies, compact clumps without growing cells (left panels).
  • TGFß-neutralizing antibodies used in vitro, this was not possible in the context of these examples, because the large amounts of antibodies required for such in vivo experiments were not available. An alternative approach was therefore chosen.
  • TßRII-dn TGFß receptor type II
  • a cDNA of this TßRII-dn was expressed with the help of retroviral vectors in Ras-transformed EpH4 cells (Ep-Ras).
  • EpH4 cells Ras-transformed EpH4 cells
  • the clones obtained grew very slowly and required medium with a high (20%) serum content in order to be able to expand.
  • the tumor cells were isolated from the slowest growing Ep-Ras-TßRII-dn tumor and from a control tumor induced by Ep-Ras cells and taken in culture (see Example 1). While the cells of the control tumor showed the expected fibroblastoid morphology (Fig. 14 bottom, left panel), the cells isolated from the slowly growing Ep-Ras-TßRII-dn tumor had a clearly epitheloid morphology (Fig. 14 bottom, right panel) . This shows that the EF conversion occurring in tumor formation by Ep-Ras cells is inhibited by expression of T ⁇ RII-dn and that this leads to a slowdown in tumor growth. Fig. 14 shows that TßRII-dn expressing Ras transformed breast epithelial cells (Ep-Ras-TßRII-dn) show slower growth in the animal and that the cells isolated from these tumors have not undergone EF conversion.
  • Ep-Ras-TßRII-dn Ras transformed breast epithelial cells
  • Ep-Ras-TßRII-dn cells Four different clones of Ep-Ras-TßRII-dn cells and one Ep-Ras control clone were injected subcutaneously into 3 nude mice each (1 ⁇ 10 6 cells per animal). After 3 weeks, the tumors were cut out and weighed. The diagram in the upper part of FIG. 14 shows the mean values of the tumor weights obtained.
  • the tumor cells were cultured from an Ep-Ras-TßRII-dn tumor, obtained from the slowest tumor-forming Ep-Ras-TßRII-dn clone, and an Ep-Ras control tumor, selected in G418 (see Example 1 ) and photographed after 10 days under phase contrast.
  • the lower left panel shows the fibroblastoid cells grown from the Ep-Ras tumor, while the right panel shows the epithelioid cells grown from the Ep-Ras-TßRII-dn tumor.
  • TßRII-dn in fibroblastoid, highly metastatic colon carcinoma cells (CT26): inhibition of the invasive growth of these cells in vitro, delayed tumor formation and inhibition of the formation of lung metastases in mice
  • TßRII-dn the dominant-negative TGFß receptor
  • CT26-TßRII-dn Two types of TßRII-dn expressing CT-26 clones (CT26-TßRII-dn) were obtained.
  • the first type showed an implied epithelial but still abnormal morphology on plastic and expressed small amounts of the epithehal markers E-cadherin and ZO-1.
  • the second type of clone formed orderly turf of cells with epithelial morphology, which even formed hemicysts (domes). As expected, this second type of clone showed high, lateral expression of the epithehal markers E-cadherin and ZO-1.
  • Control CT26 cells infected with a retrovirus without insert showed the expected fibroblastoid morphology on plastic and no expression of epithelial markers. It was shown that TßRII-dn is able to convert the fibroblastoid CT26 cells into epithelial cells in vitro and thus induce an FE conversion.
  • FIG. 16 shows that the control cells grow out to the expected huge strands and networks of fibroblastoid cells (FIG. 15, upper half of the picture, left panels).
  • the CT26-TßRII-dn clones of type 1 formed compact clumps with only a few growing single cells (FIG. 15, upper half of the picture, middle panels), while the CT26-TßRII-dn clones of type 2 only formed tiny, compact cell groups outgrow (Fig. 15, upper half of the picture, right panels). This showed that TßRII-dn prevents the invasive growth of CT26 cells in the collagen gel.
  • mice with CT26-TßRII-dn clones were delayed by about 3-4 weeks, whereas in mice with CT26-TßRII-dn Type 2 clones were delayed by 6-10 weeks or completely inhibited for 24 weeks (end of experiment) (3 animals, data not shown in the figure).
  • mice were injected with CT26 control cells (3 mice) or 7 different CT26-TßRII-dn clones (type 1 and type 2, 3 mice per clone) and the growth of palpable tumors was awaited . After reaching a certain tumor volume (4 cm 3 ), the primary tumor was cut out so that no tumor cells remained at the injection site. The mice treated in this way were examined for lung metastases after their death.
  • TßRII-dn completely inhibits metastasis from CT26 primary tumors.
  • TßRII-dn stage of metastasis is inhibited by TßRII-dn. It is possible that only the migration of the CT26 cells from the primary tumor into the vessels is inhibited. The colonization of the cells from the circulation into the lungs could also be affected. The latter is important because, for example, surgical removal of a tumor in humans could result in more tumor cells being circulated.
  • various amounts of CT26 control cells and several CT26-TßRII-dn type 2 clones were injected intravenously into mice (3 animals per cell type). The animals were then examined for lung metastases after death.
  • CT26-TßRII-dn can also prevent CT26 cells that are already in circulation from settling in the lungs.
  • TßRII-dn both inhibits the invasive outgrowth of CT26 cells in the collagen gel and suppresses the invasiveness of the same cells in the chicken heart invasiveness test.
  • CT26 control cells C26, left panels
  • CT26-TßRII-dn clone of type I mouse panels
  • type 2 right panels
  • the gels were recorded at two different magnifications (lower magnification, upper panels, higher magnifications, lower panels).
  • CT26 control cells grew into large reticular and strand-like structures consisting of spindle-shaped, fibroblastoid cells (left panels)
  • CT26-TßRII-dn type 1 cells formed compact cell clumps with very few cells growing out of the gel (middle panels).
  • the CT26-TßRII-dn type 2 clones form only tiny compact cell groups without any ability to grow into the collagen gel (right panels).
  • test cells were loaded with a fluorescent vital dye, brought into contact with chicken heart fragments and examined histologically after 7 days (see methods and example 4).
  • the control cells efficiently migrated into the chicken heart fragment (left panel, bright cell groups and strands beyond the dashed line between test cells and chicken heart fragment, marked with H).
  • type 1 clones migrated only slightly into the chicken heart tissue (middle panel, see few bright cells in the area marked with H), while the CT26-TßRII-dn cells of type 2 did not grow invasively at all (all bright cells remained outside the Chicken heart fragment H (dashed line).
  • Figure 16 shows that expression of TßRII-dn in CT26 cells blocks their ability to produce lung metastases from a primary tumor.
  • CT26-TßRII-dn clones type 1 and 2, CT26 + TßRII-dn
  • CT26 control cells were used in the test.
  • Syngeneic Balb-C mice (3 per cell type) were injected with 1x10 6 cells per animal and tumor growth was awaited. After the primary tumors had reached a size of 4 cm 3 , these were surgically removed and the mice were examined for lung metastases after death. The results are shown in the diagram (upper half of the picture). While the 3 control animals died of lung metastases within 4 weeks (dashed line), all animals treated with CT26-TßRII-dn cells were still alive after 18 months and free of lung metastases (black lines).
  • Fig. 18 shows that TßRII-dn in CT26 cells also inhibits their ability to settle from the blood circulation into the lungs and form metastases there.
  • the diagram in the upper part of the picture shows the course of the experiment.
  • Syngeneic Balb-C mice (3 per cell type and cell amount) were intravenously injected with CT26 control cells and several CT26-TßRII-dn clones (tail vein).
  • CT26 control cells
  • the figure shows that all three mice treated with 5,000 and 50,000 control cells (CT26) had died of lung metastases after 28 and 14 days (+), while all animals injected with CT26-TßRII-dn clones were still alive and free after 40 days of lung metastases were (-).
  • the activated TGFß receptor activates the transient transcription of a PAI-1 promoter-reporter gene construct, a process that is inhibited by TßRII-dn
  • a test cell is produced as follows: A PAI-1 promoter is produced in a suitable cell (Ep-Ras or CT26) -Reportergen construct stably expressed. At the same time, the human TGFß receptor chain (e.g. TßRIl) selected for screening is expressed in this line. In contrast, in control cells, in addition to the PAI-1 reporter construct, an unrelated receptor is also expressed, which also induces PAI-1 transcription, e.g. FGF receptors).
  • TGF ⁇ -induced PAI-I expression is correlated in transient transfection tests with the tumor or metastasis formation of the corresponding cells.
  • CT26 control cells and 5 CT26-TßRII-dn clones which had already been tested in mice (see Example 11, FIG. 16) were constructed with the 3TP-lux PAI-1 reporter gene construct (Wrana et al., 1992) transfected, stimulated with TGFß or left untreated and tested for PAI-1 expression (measurement of luciferase activity).
  • TßRI T204D
  • TßRII-dn DNA together with the PAI-1 reporter construct were co-transfected into untreated CT26 cells.
  • 18 shows that untreated CT26 cells (CT26 control) without TGFß treatment have a basal activity which corresponds to that of the negative control (co-transfection of TßRII-dn).
  • TGFß activates reporter gene transcription to values which are achieved in the positive control by cotransfection of a constitutively active TGFß receptor.
  • CT26-TßRII-dn 1-5 Different CT26 clones expressing TßRII-dn behaved differently in this test (FIG. 18, CT26-TßRII-dn 1-5).
  • CT26-TßRII-dn 3 and 4 the luciferase activity achieved after TGFß stimulation was below or at the values found in the negative controls, regardless of whether the cells were injected or after isolation from the very slow growing tumor were tested.
  • the luciferase activity was only at the level of the negative controls before the injection into the animal; after isolation from the tumor, intermediate or even activities as in the positive controls were found (FIG. 18).
  • FIG. 18 shows that expression of TßRII-dn in CT26 cells suppresses TGFß-induced transcription of a PAI-1 promoter reporter gene construct.
  • CT26 control cells CT26 control
  • CT26TßRII-dn 1-5) 5 clones of CT26-TßRII-dn cells (CT26TßRII-dn 1-5) were transfected with a PAI-1 promoter-reporter gene construct (3TP-lux), the cells stimulated with TGFß (+ TGFß) or left unstimulated (- TGFß) and the luciferase activity measured in cell extracts.
  • the cDNA of a constitutively active TGF ⁇ receptor chain 1 (TßRI (T204D; Wrana et al., 1994) and the TßRII-dn cDNA together with 3TP-lux were co-transfected into the cells. This determination was carried out in cells before injection into the animal (before tumor induction) and after isolation and cultivation of the tumor cells for 3 days (isolated tumor cells) (see legend, box top right). The bars represent the normalized luciferase activity from extracts of the same protein content (see methods).

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Abstract

Arzneimittel, enthaltend als wirksame Verbindung eine Substanz, die die Wirkung von TGFβ auf Tumorzellen epithelialen Ursprungs inhibiert, für die Behandlung von epithelialen, invasiven Tumorerkrankungen, die durch einen reversiblen Übergang der Zellen von einem epithelialen, nicht-invasiven in einen fibroblastoiden, invasiven Zustand charakterisiert sind. Das Arzneimittel enthält einen TGFβ-Inhibitor, bevorzugt in Kombination mit einem Ras-Inhibitor. Verfahren zum Screenen von Substanzen für die Behandlung von epithelialen, invasiven Tumorerkrankungen.

Description

Arzneimittel für die Behandlung von Tumorerkrankungen
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Tumortherapie.
Mehr als 80% der im Menschen vorkommenden Tumoren sind epithelialen Ursprungs. Die Bildung epithelialer Tumoren (Karzinome) ist ein vielstufiger Prozeß, was am deutlichsten in der Progression des menschlichen Colonkarzinoms (Powell, et al., 1993) und des Hauttumors der Maus (Wright, et al., 1994) veranschaulicht wird. Von Karzinomen wird angenommen, daß sie von einzelnen oder kleinen Gruppen von Zellen ausgehen, in denen Mutationen stattgefunden haben. Diese Zellen entwickeln sich zu benignen, epithehalen hyper- oder dysplastische Bereichen. Die Progression dieser hyperplastischen Bereiche zu einem Karzinom in situ, die dann invasive und metastatische Eigenschaften erwerben kann, erfordert eine Anzahl weiterer Mutationen in der Tumorzelle. Charakteristischerweise erwerben diese Zellen die Fähigkeit, ihre Basalmembran proteolytisch abzubauen, sich von einer seßhaften, polarisierten Zelle zu einer nicht polarisierten, zur Fortbewegung im Gewebe befähigten Zelle zu entwickeln, im Blutstrom zu überleben und an entfernten Stellen Metastasen zu bilden (Liotta, et al., 1991 ; Liotta und Stetler-Stevenson, 1991).
Obwohl an den vielfachen Veränderungen in Architektur und Verhalten von bösartig transformierten Zellen tiefgreifende Veränderungen der Genexpression beteiligt sind, kommt keine dieser neu erworbenen Eigenschaften nur bei invasiven Tumorzellen vor. Das Anheften an die Basalmembran, deren Proteolyse sowie die Migration durch die Basalmembran und das darunterliegende Mesenchym stellen wichtige Schritte bei normalen Vorgängen dar, wie z.B. bei der Implantation des Trophoblasten, bei Gestaltungsbewegungen während der Embryonalentwicklung, bei der Entwicklung der Brustdrüse und der Reorganisation von Epithelien während der Wundheilung (Aznavoorian et al., 1993). Für ein besseres Verständnis der Entwicklung und Progression von Karzinomen ist es entscheidend zu verstehen, wie die Deregulierung dieser normalen Vorgänge bei der Zellinvasion und Metastasierung erfolgt. Arbeiten der letzten Jahre haben zur Aufklärung von molekularen Mechanismen beigetragen, die an der Modulation des epithehalen Phänotyps unter normalen und pathologischen Situationen beteiligt sind (Reichmann, et al., 1992; Frisch, 1994). Außerdem spielen exogene Polypeptidfaktoren wie Scatter Factor (SF)/Hepatozytenwachtstumsfaktor (HGF) und Neu-Regulin/HER-Regulin wichtige Rollen bei der Veränderung der Migrations- und Differenzierungseigenschaften von epithehalen Zellen (Birchmeier, et al., 1993; Hartmann, et al., 1994; Soriano, et al., 1995). Erst kürzlich wurde der Transformierende Wachstumsfaktor 1 ("Transforming Growth Factor 1", TGFßl) als ein weiterer potenter Modulator des Phänotyps von Brustepithelzellen identifiziert (Miettinen, et al., 1994; Zambruno, et al., 1995).
TGFßl gehört zu einer großen Superfamilie von multifunktionellen Polypeptidfaktoren. Die TGFß-Familie selbst besteht aus drei Genen, TGFßl , TGFß2 und TGFß3, die extrem hohe Homologie zueinander aufweisen. In Säugetieren gehören zur TGFß-Superfamilie die verschiedenen TGFß-Gene ebenso wie die embryonalen Morphogene, wie z.B. die Familie der Aktivine, "Müllerian Inhibitory Substance", und die bmp- Familie ("Bone Morphogenetic Protein"), die wichtige Rollen sowohl bei der Regulierung der Embryonalentwicklung wie bei der Re- oder Umorganisation von Epithelien spielen (Roberts und Sporn, 1992). TGFßl inhibiert das Wachstum vieler Zelltypen, einschließlich epithelialer Zellen, stimuliert jedoch die Proliferation verschiedener Arten von mesenchymalen Zellen. Darüberhinaus induzieren TGFßs die Synthese extrazellulärer Matrixproteine, modulieren die Expression von Matrixproteinasen und -proteinaseinhibitoren und verändern die Expression von Integrinen. Außerdem werden TGFßs in großer Menge in vielen Tumoren exprimiert (Derynck, et al., 1985; Keski-Oja, et al., 1987). Dieses starke Vorkommen in neoplastischen Geweben könnte darauf hinweisen, daß TGFßs strategische Wachstums-/Morphogenesefaktoren sind, die die malignen Eigenschaften beeinflussen, welche mit den verschiedenen Stufen der metastatischen Kaskade assoziiert sind. TGFßs inhibieren das Wachstum normaler epithelialer und relativ differenzierter Karzinomzellen, während dedifferenzierte Tumorzellen, denen viele epitheliale Eigenschaften fehlen, im allgemeinen gegen die Wachstumshemmung durch TGFßs resistent sind (Hoosein, et al., 1989; Murthy, et al., 1989). Darüberhinaus kann TGFßl das invasive und metastatische Potential einer Brustadenomzeliinie verstärken (Welch, et al., 1990), was für die Rolle von TGFßl in der Tumorprogression spricht. Die molekularen Mechanismen, welche der Wirkung von TGFßs während der Tumorzellinvasion und der Metastasierung zugrunde liegen, bedürfen jedoch weiterhin der Aufklärung.
An der Entstehung von Brustkrebs (Mammakarzinom) des Menschen sind die Überexpression von (mutierten, oder häufiger, nicht-mutierten) ras-Genen und die Überexpression von Rezeptor-Tyrosinkinasen, die den Ras-Signalübertragungsweg aktivieren, beteiligt (De Bortoli, et al., 1985; Kern, et al., 1990; LeJeune, et al., 1993).
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Arzneimittel für die Tumortherapie bereitzustellen.
Bei der Lösung der gestellten Aufgabe wurde von folgenden, aus den durchgeführten Versuchen gewonnenen Erkenntnissen ausgegangen:
1. Die Wirkung von TGFß auf die Tumorzelle führt in Kooperation mit (i) der Expression von onkogenem Ras, mit (ii) der Überexpression von normalem Ras oder von Rezeptortyrosinkinasen, die den Ras- Signalübertragungsweg aktivieren oder mit (iii) anderen in der Tumorzelle aktivierten Onkogenen zu einer Konversion von epithehalen Zellen in fibroblastoide Zellen mit invasivem Potential.
2. Die autokrine Produktion von TGFß durch die konvertierten Zellen führt zur Aufrechterhaltung des entarteten, invasiven Zellzustandes.
3. Eine Unterbrechung der durch den TGFß-Rezeptor vermittelten Signalübertragung verhindert die "epithelial-fibroblastoid conversion" (EFC) sowie die damit verbundene Invasivität und kann Zellen, die bereits eine EFC durchgemacht haben und stabil invasiv wachsen, zu epitheloiden, nicht mehr invasiv wachsenden Zellen zurückverwandeln (fibroblastoid- epithelial conversion; FEC).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde außerdem, im Hinblick auf eine Abschätzung möglicher Nebenwirkungen von TGFßl -Inhibitoren, die Rolle von TGFßl bei der normalen Brustdrüsenentwicklung untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde einerseits gezeigt, daß Ha- Ras-transformierte Brustepithelzellen (EpRas-Zellen) bei der Entstehung von Tumoren in Mäusen einen Übergang (Konversion) vom epithehalen zum fibroblastoiden (bzw. mesenchymalen) Zustand durchmachen. Dieser Übergang wird im folgenden als EF-Übergang oder EF-Konversion ("Epithelial-Fibroblastoid Cell Conversion", EFC) bezeichnet. Solch eine EF-Konversion wurde auch in vitro nachgewiesen. Hierzu wurden EpRas- Zellen in Typ I-Kollagen-Gelen kultiviert. In Abwesenheit von Serum entwickelten sich diese Zellen zu dreidimensionalen, zystischen Hohlstrukturen, deren Wände aus einer einlagigen Schicht (Monolayers) polarisierter epithelialer Zellen bestanden. TGFßl führte dazu, daß dieselben Ras-transformierten Zellen sich zu ungeordneten Strängen entwickelten, die aus spindelförmigen Zellen mit fibroblastoiden Eigenschaften bestanden. In nicht-transformierten Epithelzellen war TGFßl nicht in der Lage, solche Änderungen herbeizuführen. Die konvertierten Zellen waren sowohl in Kollagengelen als auch im Hühnerherz- Invasionsassay stark invasiv. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die fibroblastoiden Zellen, wenn sie einmal die Konversion durchgemacht hatten, selbst große Mengen TGFßl produzierten. Wurde dieses selbst produzierte TGFßl durch einen TGFßl neutralisierenden Antikörper inaktiviert, entwickelten sich die Zellen zu einem polarisierten, epithehalen Phänotyp zurück. Dieses Zellverhalten deutet darauf hin, daß der konvertierte fibroblastoide Phänotyp durch TGFßl aufrechterhalten wird, wobei TGFßl über eine autokrine Schleife ("autocrine loop") wirkt.
Ferner wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß der in vitro beobachtete Mechanismus auch in vivo gilt: Tumorzellen, die eine EF- Konversion durchgemacht hatten, produzierten selbst TGFßl . Außerdem ist TGFßl in der Lage, den invasiven Phänotyp von Ha-Ras- transformierten Brustepithelzellen in experimentell induzierten Tumoren auszulösen und aufrechtzuerhalten.
Außerdem konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß in menschlichen Tumoren verschiedener Genese (Nierenzellkarzinom, Mammakarzinom) Hinweise für ein Ablaufen der "Epithelial-Fibroblastoid Cell Conversion" (EFC) existieren (75% der untersuchten Nierenzellkarzinome und 25-60% der Mammatumoren koexprimierten den generellen epithehalen Marker Cytokeratin und den mesenchymalen Marker Vimentin). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß alle diese Tumoren selbst TGFßl produzieren. Dies ist ein Hinweis dafür, daß die mit dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendenten Modellsystem gewonnenen Erkenntnisse auf menschliche Tumoren übertragbar sind.
Viertens wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß mit Hilfe einer dominant-negativen TGFß-Rezeptorkette II (TßRII-dn) eine vollständige Hemmung der durch den TGFß Rezeptor induzierten Signalübertragung bewirkt werden kann. Eine solche Expression von TßRII-dn führte nicht nur in Ras-transformierten Maus-Brustepithelzellen, sondern auch bei bei einer Reihe von bereits mesenchymalen, invasiv wachsenden Karzinom-Zellinien des Menschen und der Maus zur Aufhebung des malignen, invasiven Phänotyps und zur kompletten Hemmung der durch diese Linien im Versuchstier erhaltenenen Bildung von Tumoren bzw. Metastasen.
Die vorliegenden Erfindung beruht somit auf folgenden Erkenntnissen:
An der Karzinogenese sind zahlreiche Mutationen in Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen beteiligt (Vogelstein und Kinzler, 1993). Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie bestimmte onkogene Mutationen mit definierten Veränderungen im Phänotyp der Zelle und in der Art, in der diese Veränderungen dann zur Tumorzellinvasion und Metastasierung beitragen, in Zusammenhang stehen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde zunächst an einem Modellsystem gezeigt, daß das Ras- Onkoprotein sowohl in Kollagengelen als auch in sich entwickelnden Tumoren die zelluläre Reaktion von Brustepithelzellen auf TGFßl dramatisch verändert. Dieses modifizierte Reaktionsvermögen der Zellen führt dazu, daß TGFßl eine EFC induziert. Wenn sie einmal konvertiert sind, produzierten diese fibroblastoiden Zellen selbst hohe Konzentrationen an TGFßl und behalten auf diese Weise ihre eigenen mesenchymalen und invasiven Eigenschaften bei. 97/37678 PC17EP97/01699
Die prinzipielle Gültigkeit dieses Prinzips konnte dann in einer Reihe nicht verwandter Tumormodelle des Menschen und der Maus nachgewiesen werden. In diesen Tumorzellen übernehmen sehr wahrscheinlich andere Onkogene die Funktion von Ha-Ras. Es konnte gezeigt werden, daß in all diesen Zellen sowohl TGFßl als auch die Unterbrechung einer ggf. bereits bestehenden autokrinen Stimulation durch TGFßl den Tumorzell-Phänotyp drastisch beeinflußt: TGFß bewirkt auch in diesen Zellen eine Steigerung des invasiven Wachstums, während Ausschalten des TGFß-Rezeptors bzw. der durch ihn aktivierten Signalübertragungswege zur Rückbildung der EFC, d.h. zu einer fibroblastoid-epithelialen Konversion (FEC) und/oder zum Verlust des invasiven, tumorerzeugenden Zellphänotyps führte.
Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen wurde ursprünglich von der Beobachtung ausgegangen, daß Ras¬ transformierte Mausbrustepithelzellen während der Tumorbildung zu invasiven Spindelzellen konvertieren. Ähnliche Spindelzelltumoren wurden im Gehirn, in der Haut, im Kolon und in der Brust beschrieben, sowohl beim Menschen als auch in Tiermodellen (Buchmann, et al., 1991 ; Guldberg, 1923; Sandford, et al., 1961 ; Sonnenberg, et al. 1986; Stoler, et al. 1993). Die Herkunft dieser Spindelzellkarzinome bleibt noch immer unklar, obwohl einige Forscher glauben, daß diese oft hochinvasiven Tumoren eine eigene Tumorklasse fibroblastoiden Ursprungs darstellen, während andere Autoren von einem epithehalen Ursprung dieser Tumoren ausgehen.
In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung zunächst verwendeten Modellsystem stammten die Spindelzelltumoren eindeutig von den ins Tier injizierten epithehalen Donor-Zellen ab. Aus dem Tumor stammende Spindelzellen überlebten die Selektion in G418 und exprimierten noch zell- und gewebespezifische Zytokeratine, was ihre Donorzelleigenschaft und ihre epitheliale Herkunft bestätigt. Ferner ergaben die durchgeführten Untersuchungen, daß die injizierten Epithelzellen und die konvertierten fibroblastoiden Tumorzellen vom gleichen Zellklon abstammten und eine Re-Integration des retroviralen Vektors in andere Stellen des Genoms als mögliche Ursache der Veränderungen ausgeschlossen werden konnte. Beinahe noch wichtiger war, daß der fibroblastoide Phänotyp der konvertierten Zellen unter Standardkulturbedingungen absolut stabil war und daß sich die Zellen nach Neutralisierung der TGFßl -Aktivität effizient zu polarisierten epithehalen Zellen rückverwandelten. Dies schließt aus, daß genetische oder epigenetische Veränderungen für die Zellkonversion verantwortlich sind. Die wahrscheinlichste Erklärung für die dramatische Veränderung des Phänotyps in vivo ist die, daß eine Wechselwirkung zwischen den Ras-transformierten Zellen und mesenchymalen Zellen in ihrer Umgebung zu einer Umwandlung der epithehalen Zellen in fibroblastoide Zellen führt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde somit gezeigt, daß EFC in bestimmten Tumoren ein für die Karzinogenese relevanter Mechanismus ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde außerdem gezeigt, daß TGFßl sowohl in Kollagen-Gelen als auch während der Tumorentwicklung EFC induziert. Im zunächst verwendeten Zellmodell erforderte diese TGFßl -induzierte Konversion bemerkenswerterweise die Mitwirkung eines aktivierten Ras-Proteins; weder primäre Brustepithelzellen noch die parentalen EpH4-Zellen machten eine TGFßl -induzierte EFC durch. Daraus kann geschlossen werden, daß EFC durch eine Synergie verschiedener Signalübertragungswege ausgelöst wird, die einerseits von TGFßl und andererseits von Ha-Ras aktiviert werden. Diese Annahme wird durch andere Befunde gestützt, die zeigen, daß aktivierte Ras-Proteine ähnliche Wirkungen auf Zellen haben können wie Mitglieder der TGFß- Familie. Dies trifft z.B. zu für die myogene Differenzierung (Payne, et al., 1987) und für die Bildung des Mesoderms (Whitman und Melton, 1992). Im Herzmuskel reguliert TGFß Gene hoch, die mit dem durch hämodynamische Belastung regulierten Wachstum des embryonalen Herzes assoziiert sind. Diese Effekte werden zumindest teilweise durch aktiviertes Ras nachgeahmt (Parker, et al., 1990; Thorburn, et al., 1993), was vermuten läßt, daß, zumindest in bestimmten biologischen Systemen, Ras und TGFß synergistisch wirken können.
In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, daß die Überexpression von normalem und mutiertem Ras in einer beträchtlichen Zahl humaner Karzinome, einschließlich solcher der Brust (De Bortoli, et al., 1985; Hand, et al., 1984; Slamon, et al., 1984), beobachtet wurde. Darüberhinaus sind autokrine Produktion von Liganden sowie Überexpression und/oder eine konstitutive Aktivierung von Rezeptor-Tyrosinkinasen, die am Anfang von c-Ras einschließenden Signalübertragungswegen stehen (z.B. HER-1 , HER-2), häufige Änderungen in Brustkazinomen (Kern, et al., 1990; LeJeune, et al., 1993). Da TGFßl auch in vielen humanen Tumoren reichlich vorhanden ist (Derynck, et al., 1985; Keski-Oja, et al., 1987; Thompson, et al., 1991) kann aufgrund der im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse gefolgert werden, daß Ras- und TGFßl- induzierte Signale auch in humanen Tumoren synergistisch wirken. Wie die Ergebnisse der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche zeigen, kann der TGFß-Rezeptor auch in Tumorzellen, die durch andere Onkogene als Ras transformiert sind, EFC und invasivität steuern. Ein weiterer wesentlicher Befund im Rahmen der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, daß TGFß mit verschiedenden Onkoproteinen, u.a. Ras, Tyrosinkinasen, bei der Regulation der Plastizität des polarisierten epithehalen Phänotyps kooperiert.
Nach serumfreier (und TGFß-freier) Zellkultur in rekonstituierten Kollagen- Gelen zeigten EpRas-Zellen eine hohe Fähigkeit zur Organogenese und einen hohen Grad an epithelialer Polarisierung. Die Ep-Ras Zellen bildeten jedoch vorwiegend erweiterte Tubuli sowie alveoläre Hohlräume, im Gegensatz zu den engen, sich verzweigenden Tubuli, die von den parentalen EpH4-Zellen oder von primären Brustepithelzellen gebildet wurden. Dies zeigt, daß das Ras-Onkoprotein allein, in Abwesenheit von TGFß, in der Lage ist, das morphogenetische Verhalten epithelialer Zellen bis zu einem gewissen Grad zu modulieren. In anderen Systemen wurden stärkere Wirkungen von aktiviertem Ras auf die epitheliale Polarität beschrieben (Eaton und Simons, 1995). Hier bewirkte die Transformation mit Ras eine Störung der polaren Expression apikaler Proteine, während die Expression basolateraler Markerproteine unbeeinflußt blieb. (Schoenenberger, et al., 1994). Da die vorbeschriebenen Experimente in Gegenwart von FCS (welches selbst TGFßl enthält) durchgeführt wurden, können sie jedoch nur schwer mit den im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen verglichen werden, in denen solche offensichtliche Polaritätsdefekte nicht beobachtet werden konnten. Da exogener TGFßl die Zellpolarität vollständig zerstörte, ist es möglich, daß die teilweise Zerstörung der Polarität in den oben erwähnten Ras¬ transformierten Zellsystemen auf die im Serum vorhandenen TGFßl- Konzentrationen zurückzuführen ist. Nichtsdestoweniger ist das morphogenetische Verhalten in EpRas-Zellen leicht verändert, möglicherweise als Folge einer verstärkten Proteaseaktivität. TGFß zerstörte die Polarität epithelialer Zellen vollständig und bewirkte, daß die Zellen spindelförmig und invasiv wurden. Diese Veränderungen waren von der ständigen Gegenwart von TGFßl abhängig, da die Spindelzellen sich bei Zugabe von TGFßl neutralisierenden Antikörpern rasch in polarisierte epitheliale Zellen rückverwandelten. Die wesentlichste Schlußfolgerung aus diesen Ergebnissen ist die, daß Ras-transformierte Zellen durch TGFßl zwischen einem quasi-normalen und einem hochtumorigenen Phänotyp hin und her geschaltet werden können. Solch eine verstärkte phänotypische Plastizität könnte für invasiv wachsende Zellen im allgemeinen charakteristisch sein und dürfte erklären, warum invasive Tumorzellen oft die migratorischen Eigenschaften von Fibroblasten zeigen. Nach der Extravasation sollten sich diese fibroblastoiden, migratorischen Zellen in der neuen Umgebung, die durch ein entfernt hegendes Gewebe bereitgestellt wird, zu gut differenzierten sekundären Tumoren zurückentwickeln können (siehe unten). Eine erhöhte phänotypische Plastizität ist somit ein Kennzeichen von invasiven Tumorzellen.
Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnene wesentliche Erkenntnis ist die, daß EpRas-Zellen eine EFC durchmachen müssen, um signifikante Mengen von TGFßl sowohl in vitro als auch in vivo zu produzieren. Es konnte gezeigt werden, daß Tumorzellen ihren fibroblastoiden Phänotyp über die autokrine Produktion von TGFßl aufrechterhalten können und daß die autokrine TGFßl -Produktion und Rückwirkung auf die produzierende Zelle (autocrine loop) unterbrochen werden muß, um die phänotypische Rück-Umwandlung der Zellen möglich zu machen. Die Fähigkeit von TGFßl, EFC zu induzieren und dann effizient den invasiven Phänotyp aufrechtzuerhalten, kann auch erklären, warum die zunächst epithehalen Ras-transformierten Zellen sich während des Tumorwachstums progressiv und einheitlich in Spindelzellen umwandelten. Kurz nach ihrer Injektion in Mäuse exprimierten polarisierte Ras¬ transformierte Epithelzellen weder signifikante Mengen an TGFßl noch setzten sie es frei. Wie mittels in situ Hybridisierung und Immunhistochemie festgestellt wurde, produzierten jedoch die den Mikrotumor umgebenden Stromazellen das Zytokin. Diese Stromazellen konnten als Fibrozyten und Endothelzellen identifiziert werden, es ist jedoch anzunehmen, daß andere Zelltypen, wie Makrophagen und Lymphozyten, wahrscheinlich ebenfalls vorhanden waren; von all diesen Zelltypen ist bekannt, daß sie TGFßl produzieren und freisetzen. Die wahrscheinlichste Schlußfolgerung daraus ist die, daß die Wirkungen von TGFßl vorwiegend auf der Ebene seiner proteolytischen Aktivierung reguliert werden. Die primäre Regulation von TGFß erfolgt durch Faktoren, die die Prozessierung des latenten zum biologisch aktiven Molekül steuern. Über die TGFß-Aktivierung in vivo ist jedoch fast nichts bekannt. Die Protease Plasmin kann in Ko- Kultursystemen zweier Zelltypen latentes TGFßl aktivieren, jedoch nur, wenn zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt stehen oder einander dicht angenähert sind (Antonelli-Orlidge, et al., 1989; Sato, et al., 1990). Dieser nahe Kontakt von verschiedenen Zelltypen dürfte in dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten System nach der Einkapselung des Tumors durch das Stroma stattfinden und, in einem sogar größeren Ausmaß, wenn Donor-Tumorzellen sich während der Tumorentwicklung mit Stromazellen des Empfängertieres vermischen (Fig. 2B). Darüberhinaus aktiviert Thrombospondin (TSP), ein extrazelluläres Matrixprotein, latenten TGFß. In diesem Fall findet die Aktivierung in der löslichen Phase statt und erfordert keine proteolytische Aktivität (Schultz-Cherry, et al., 1994). Tatsächlich wurde über die die Krebsentstehung unterstützende Rolle von Thrombospondin und eine erhöhte Thrombospondinkonzentrationen in malignen Brustkrebsen kürzlich berichtet (Castle, et al. 1991 ; Wong, et al., 1992). Es wurde somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß die autokrine Produktion von TGFßl , in Kooperation mit dem Onkoprotein Ha-Ras, den fibroblastoiden Phänotyp aufrecht erhält.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnenen Erkenntnisse und Schlußfolgerungen haben zu dem in Fig. 9 dargestellten hypothetischen Modell geführt. Es wird postuliert, daß der für die Tumorentstehung relevante TGFßl primär von infiltrierenden Zellen des Tumor-Stromas, wie Fibrozyten, Endothelzellen, Lymphozyten und Makrophagen, produziert wird. Die Wechselwirkung der Tumorzellen mit den verschiedenen Zelltypen des Tumor-Stromas dürfte die effiziente Produktion und/oder Aktivierung von TGFßl auslösen. Dies wiederum dürfte die epithehalen Tumorzellen dazu veranlassen, sich in den fibroblastoiden und invasiven Phänotyp zu verwandeln. Diese fibroblastoiden Zellen beginnnen dann, selbst TGFßl zu produzieren, welches in einer autokrinen Schleife (autocrine loop) auf sie zurückwirkt und somit sowohl die Aufrechterhaltung des fibroblastoiden Phänotyps bewirkt als auch die Rekrutierung weiterer epithelialer Zellen zur EFC erleichtert. Weitere Mutationen oder selektive Mechanismen dürften einen Teil dieser invasiv wachsenden Zellen dazu veranlassen, in Blutgefäße hinein- und wieder herauszuwandern und schließlich an entfernten Stellen sekundäre Tumoren zu bilden. Dieses Modell steht im Einklang mit Befunden, die zeigen, daß eine verstärkte TGFßl -Expression auch an der Progression zur Bösartigkeit in einem Prostatakrebs-Mausmodell beteiligt ist (Thompson, et al., 1992; 1993).
Die bisher beschriebenen Erkenntnisse wurden an einem kombinierten in vitro/in vivo Modellsystem gewonnen, in welchem durch Ras-transformierte Maus-Brustepithelzellen verwendet wurden. Im Rahmen weiterer Versuche wurden entscheidende Aspekte dieses Modells (EFC, TGFßl -Produktion im Tumor) in einer großen Zahl von primären menschlichen Karzinomen der Niere und der Brust nachweisbar sind. So konnte in der Mehrzahl aller untersuchten Nierenzellkarzinome sowie in einem vom Malignitätsgrad abhängigen Prozentsatz der untersuchten Mammatumoren das Ablaufen einer EFC durch Koexpression von Cytokeratin (genereller epithelialer Marker) und Vimentin (mesenchymaler Marker) nachgewiesen werden. Weiters konnte in allen untersuchten Tumoren die Produktion von TGFßl durch die Tumorzellen selbst nachgewiesen werden, sowohl auf der Proteinebene durch histochemische Färbung mit anti-TGFß-Antikörpem, als auch auf der Ebene der mRNA durch in situ-Hybridsierung und RT- PCR.
Mit Hilfe einer weiteren Serie von im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen konnte gezeigt werden, daß der TGFß-Rezeptor generell eine zentrale Stellung bei der Regulation der EMT und des invasiven Tumorzellwachstums einnimmt. Nicht nur in durch Ha-Ras transformierten Brustepithelzellen, sondern in einer Zahl anderer Tumoren, die von anderen Epitheltypen stammen und bei denen unbekannt ist, welche Onkogene die Funktion von Ha-Ras übernehmen, konnte der TGFß-Rezeptor als der entscheidende Regulator der epithehalen Plastizität sowie des invasiven Wachstums der Tumorzellen identifiziert werden. So gelang es, in Kollagen-Gelen das (vermutlich durch sezerniertes TGFßl bewirkte) invasive Wachstum zweier menschlicher Karzinom-Zellinien (Nieren-Karzinom-Linie MZ 1795, Nasopharyngeal-Karzinom-Linie KB) durch einen neutralisierenden anti-TGFßl -Antikörper komplett zu hemmen.
Die Beweisführung für obige Hypothese wurde letztlich mit Hilfe eines dominant-negativen TGFß-Rezeptors (TßRII-dn) durchgeführt. Dieser TßRII-dn stellt eine sog."kinase-dead" Mutante der Rezeptorkette II dar, welche an endogene Rezeptoren vom Typ I bindet, diese aber nicht phosphorylieren kann. Dadurch werden alle an TßRII-dn gebundenenen TGFß-Rezeptor-Ketten des Typs I inaktiviert, weil sie auch nach Bindung des Liganden (TGFßl) keine Signalübertragung aktivieren können, da die hierzu nötige Phosphorylierung durch die Rezeptorkette II fehlt. Wenn ein solcher dominant-negativer TGFß-Rezeptor in Tumorzellen überexprimiert wird, kann in diesen Zellen die gesamte, vom TGFß-Rezeptor ausgehende Signalübertragung inhibiert werden. Die Expression von TßRIl ist somit geeignet, die Wirkung der Inhibierung von TGFß bzw. der Inhibierung des durch Aktivierung des TGFß-Rezeptors ausgelösten Signalübertragungsweges zu simulieren.
Zunächst wurde TßRII-dn in Ha-Ras-transformierten Maus- Brustepithelzellen (EpRas) überexprimiert. Alle erhaltenen Klone zeigten ein stark verzögertes Tumorwachstum in Nacktmäusen. Zudem wiesen die aus solchen Tumoren isolierten Zellen einen epithehalen Phänotyp auf und exprimierten epitheliale Marker (E-Cadherin, ZO-1) jedoch keine mesenchymalen Marker (Vimentin). Dies zeigt, daß durch die Expression eines TßRII-dn die EFC während der Tumorbildung gehemmt wurde. Nach Erhalt dieser Ergebnisse war es von Interesse zu prüfen, ob ein Ausschalten der Signalübertragung des TGFß-Rezeptors auch in Tumorzellen wirkt, die bereits eine EFC durchgemacht haben und somit eine stabilen, mesenchymalen sowie invasiven Phänotyp besitzen. Als Beispiel für eine solche Zellinie wurde die Colon-Karzinom-Linie CT26 der Maus ausgewählt. Diese Tumorzellinie besitzt eine sehr ausgeprägte Neigung, nach subkutaner Injektion in Mäuse schnell Lungenmetastasen zu bilden, so daß die Tiere auch nach rechtzeitiger Resektion des Primärtumors an den Lungen-Metastasen zugrunde gehen. Diese Zelle zeigt mesenchymale Morphologie, wächst im Kollagengel zu ungeordneten Ketten und Strängen spindelförmiger Zellen aus und exprimiert außer basalen Cytokeratinen keine weiteren epithehalen Marker. Statt dessen weisen die Zellen eine hohe Vimentin-Expression auf. Wird in diesen Zellen der dominant-negative TGFß-Rezeptor (TßRII-dn) überexprimiert, so bilden die Zellen kleinere, oder größere kompakte Klumpen im Kollagengel aus und wachsen auf Plastik als epitheloide Zellen, welche Hemicysten (Dome) bilden und große Mengen von E-cadherin und ZO-1 exprimieren. Die Zellen wurden also durch den TßRII-dn offensichtlich in Zellen mit einem epithehalen Phänotyp zurückverwandelt (fibroblastoid-epithelial conversion, FEC).
Eine entsprechende Wirkung des dominant-negativen TGFß-Rezeptors (TßRII-dn) konnte auch in vivo beobachtet werden. Wurden verschiedene, TßRII-dn exprimierende Klone von CT26 Zellen in Mäuse injiziert, so war die Tumorbildung je nach Klon verschieden stark verzögert. Bei vielen Klonen trat eine Tumorbildung erst nach 6-8 Wochen auf, anstatt nach 1-2 Wochen wie bei Tieren, die mit Kontroll-CT26 Zellen ohne TßRII-dn injiziert wurden. Noch drastischer war die Wirkung des TßRII-dn jedoch, wenn den Mäusen die Primärtumoren bei einer bestimmten Größe entfernt wurden und die Bildung von Metastasen abgewartet wurde. In diesem Experiment entwickelten sich in keinem der mit TßRII-dn exprimierenden CT26 Zellen injizierten Mäuse Metastasen (selbst nach über 18 Wochen nicht) während die Kontrolltiere innerhalb 2-4 Wochen nach Tumorexcision an Lungeπmetastasen starben. Die für die vorliegende Erfindung entscheidende Schlußfolgerung aus diesen Experimenten ist, daß eine Hemmung der vom TGFß-Rezeptor vermittelten Signalübertragung nicht nur das Ablaufen einer EFC und den dadurch bedingten Erwerb invasiver Eigenschaften verhindern kann, sondern auch bereits vorhandene, invasiv wachsende Tumorzellen in einen gutartigeren, nicht mehr invasiven Zustand zurückführen kann.
Zusammenfassend weisen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Befunde darauf hin, daß die gesteigerte Empfindlichkeit und veränderte Reaktionsbereitschaft der Zellen gegenüber der Fähigkeit von TGFß, den epithehalen Phänotyp zu modulieren, generell eine Eigenschaft von epithehalen Tumorzellen darstellt. Diese veränderte Reaktionsbereitschaft kann durch Ras-(Onko)Proteine hervorgerufen werden, aber auch durch Tyrosinkinasen, welche Ras aktivieren, sowie durch weitere, bisher nicht bekannte Onkoproteine. Diese durch Onkogene induzierte veränderte Reaktionsweise auf normale Umgebungssignale, wie z.B. die durch TGFßl induzierten, dürfte sowohl zu einer veränderten Genexpression in der Tumorzelle als auch zu inkorrekter Übertragung oder Interpretation von Signalen zwischen Tumor- und Stromazellen führen. Dieser abnormale "Crosstalk" zwischen Tumorzellen und ihrer unmittelbaren Umgebung dürfte die treibende Kraft für das sein, was man gemeinhin als Tumorprogression bezeichnet.
Ferner zeigen die Ergebnisse der Versuche, daß aktiviertes Ras, überexprimierte Rezeptor-Tyrosinkinasen, die den Ras- Signalübertragungsweg aktivieren sowie andere, gegebenenfalls unbekannte Onkogene sowohl in der normalen Entwicklung als auch bei der Karzinogenese mit dem TGFßl -Rezeptor kooperieren. Daran dürften Prozesse, wie die Induktion/Aktivierung von stromalem TGFßl durch Wechselwirkung von epithehalen und mesenchymalen Zellen sowie EF- Konversion, induziert und aufrechterhalten durch TGFßl , beteiligt sein.
Der Hauptunterschied zwischen normalen und Onkogen-transformierten Tumorzellen dürfte daher folgender sein: TGFßl hat eine physiologische, strikt regulierte Funktion während der Morphogenese normaler Zellen. In der Tumorzelle bewirkt die Transformation durch Onkogene eine Entartung der Funktion von TGFßl , d.h. es werden konstitutive, höchst abnormale morphogenetische Veränderungen in den Zellen ausgelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Arzneimittel, enthaltend als wirksame Verbindung eine Substanz, die die Wirkung von TGFß auf Tumorzellen eptihelialen Urspungs inhibiert, für die Behandlung von epithehalen, invasiven Tumorerkrankungen, die durch einen reversiblen Übergang der Zellen von einem epithehalen, nicht-invasiven in einen invasiven Zustand charakterisiert sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthält das Arzneimittel außerdem Substanzen, die die Expression von onkogenem Ras und/oder die Überexpression von normalem Ras oder die Wirkung von Ras¬ aktivierenden Rezeptortyrosinkinasen in den Zellen inhibieren.
Bei epithehalen invasiven Tumorerkrankungen weisen die Tumorzellen eine erhöhte phänotypische Plastizität auf, d.h. sie können Übergänge vom epithehalen, nicht invasiven Zustand zum fibroblastoiden, invasiven Zustand (EF-Konversion) und umgekehrt (FE-Konversion) durchmachen.
Die Substanz, welche die Wirkung von TGFß auf die Zellen oder die durch Aktivierung des den TGFß-Rezeptors vermittelte Signaltransduktion inhibiert, wird im folgenden als "TGFß-lnhibitor" bezeichnet.
TGFßs, wie auch die anderen Mitglieder der TGFß Superfamilie von multifunktionellen Polypeptidfaktoren wie z.B. Aktivine, Bone Morphogenetic Proteins (bmp's) etc., üben ihre Wirkung durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren aus. Die TGFß- Rezeptoren vom Typ I und Typ II bilden nach Bindung des Liganden heterodimere Komplexe, wodurch die Signalübertragung eingeleitet wird. Die Typ II- Rezeptoren, die hinsichtlich ihrer Aktivität der Gruppe der Rezeptor- Serin/Threonin-Kinasen zugeordnet werden, binden den Liganden, benötigen jedoch, um das vom Liganden erhaltene Signal weiterleiten zu können, die Assoziierung mit den Typ I-Rezeptoren welche Serin-Threonin- Kinasen darstellen. Während die Typ Il-Rezeptoren für die Ligandenspezifität verantwortlich sind, heterodimerisieren die funktionell unterschiedlichen Typ I-Rezeptoren mit mehreren Typ I I-Rezeptoren. Bei dieser Ligand-induzierten Heterodimerisierung phosphorylieren die Typ II- Rezeptorketten die Typ I-Rezeptoren an Serin/Threoninresten und aktivieren sie dadurch. Dieses Zusammenwirken des Typ Il-Rezeptors mit einem bestimmten Typ I-Rezeptor bewirkt die Aktivierung spezifischer Signalübertragungswege und als Folge davon eine transkriptioneile Antwort auf das durch den Liganden an die Zelle übermittelten Signals.
Die Wirkung eines TGFß-lnhibitors beruht darauf, daß er die durch die Rezeptoraktivierung ausgelöste zelluläre Antwort blockiert, d.h. er verhindert, daß das TGFß-Rezeptorsystem aktiviert und damit der zelluläre Signalübertragungsweg ausgelöst wird.
Da es die Typ I-Rezeptoren sind, die nach Bindung des Liganden an den Typ Il-Rezeptor, und an den Typ I-Rezeptor selbst, für die spezifische transkriptionelle Antwort, die letztlich den fibroblastoiden Phänotyp hervorruft, verantwortlich sind, stellt der Typ I-Rezeptor eines der Zielmoleküle für den TGFß-lnhibitor dar. Wegen der Notwendigkeit einer Phosphorylierung des Typ I-Rezeptors durch den Typ Il-Rezeptor (und auf grund der dargestellten Ergebnisse mit dominant negativen Typ II- Rezeptoren, deren Serinkinase-Aktivität durch Mutation zerstört wurde, kommt jedoch auch der Typ Il-Rezeptor als Zielmolekül für Inhibitoren in Frage.
Weitere Mechanismen für die Wirkung eines TGFß-lnhibitors beruhen somit auf der Verhinderung der Interaktion zwischen dem Liganden TGFß und dem Typ Il-Rezeptor, der Verhinderung des vom Typ Il-Rezeptor an den Typ I-Rezeptor übermittelten Signals, das die Aktivierung des Typ I- Rezeptors bewirkt. Schließlich kommen auch die Blockierung der Bindung von TGFß an den Typ I-Rezeptor, die Inhibierung der Aktivität des Typ I- Rezeptors oder die Inhibierung eines Effektormoleküls der durch den Typ I- Rezeptor aktivierten Signalübertragungswege als mögliche Angriffspunkte von Inhibitoren in Frage.
Beispiele für TGFß-lnhibitoren sind Antikörper, die TGFß neutralisieren, insbesondere moπoklonale Antikörper, TGFß-Antisense-RNA-Moleküle (Fakhrai et al., 1996) oder dominant-negative TGFß Rezeptoren des Typs I oder II.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Screening-Verfahren zum Indentifizieren von pharmakologisch wirksamen Substanzen für die Behandlung von epithehalen, invasiven Tumorerkrankungen, die durch einen reversiblen Übergang der Zellen von einem epithehalen, nicht- invasiven in einen invasiven Zustand charakterisiert sind.
Ein Weg, um geeignete, insbesondere niedermolekulare, Inhibitoren zu finden, besteht darin, in einem ersten Schritt zu ermitteln, welcher der Typ I-Rezeptoren für den Übergang vom epithehalen zum fibroblastoiden Zustand der Zellen verantwortlich ist. Dazu wird zweckmäßig die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete EpRas-Zellinie (oder eine der anderen verwendeten Zellinien, die in der Lage sind, die EF- Konversion herbeizuführen bzw. eine solche bereits durchgemacht haben), daraufhin untersucht, welchen TGFß-Typ l/l I-Rezeptor sie exprimiert. Diese Untersuchung kann mittels RT-PCR ("Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction") vorgenommen werden, indem Oligonukleotide, abgeleitet von bekannten TGFß-Typ I oder Typ I I-Rezeptoren, als PCR Primer benutzt werden, um aus EpRas-DNA die betreffende Rezeptor-DNA- herauszuamplifizieren und damit den bzw. die in diesen Zellen exprimierten TGFß-Typ I- bzw Typ Il-Rezeptor zu identifizieren. Die in den Beispielen beschriebenen Experimente mit einer dominant-negativen Mutante des humanen Typ I I-Rezeptors TßR-ll (ausschließlich diese Kette kommt in allen bekannten Rezeptoren für TGFßl , 2,3 vor; Wrana et al., 1992, Wrana et al., 1994) sind eine Bestätigung dafür, daß dieser TGFß-Typ Il-Rezeptor Subtyp (als solcher) direkt oder indirekt für die die Signalübertragung, die die EF-Konversion zur Folge hat, notwendig ist. Dieser TGFß-Typ II- Rezeptor-Subtyp stellt somit eines der Zielmoleküle für den TGFß-lnhibitor dar. Damit ist eine wesentliche Vorasusetzung erfüllt, einen zellulären oder biochemischen Screening Assay zu etablieren, mit dem gezielt nach Substanzen gescreent werden kann, die dieses Zielmolekül inhibieren.
Als nächstes wird in einer Zelle, die die EF-Konversion durchläuft oder in der die EF-Konversion durch Hemmung der TGFß-Rezeptor Signalübertragung rückgängig gemacht werden kann, untersucht, welche der durch EF- Konversion oder deren Revertierung in der Zelle ablaufenden Vorgänge sich am besten für die Etablierung eines Screening Assays eignen. Zweckmäßigerweise werden hierfür wiederum die in den Beispielen verwendeten EpRas-Zellen oder die im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls gut charakterisierten CT26 Zellen verwendet.
Die zu erwartenden Effekte sind in zwei Gruppen zu unterteilen: Zu der ersten Gruppe gehören die in der Literatur beschriebenen Effekte von TGFß auf normale mesenchymale und epitheliale Zellen, z.B. bei der Wundheilung. Die zweite Gruppe von Veränderungen sind diejenigen, die speziell bei der Wirkung von TGFß auf transformierte Zellen auftreten (wie z.B. in den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Versuchen). Während TGFß-Wirkungen der ersten Gruppe für einen Primär-HTS-Screen ("High Throuput Screen", Screen mit hoher Durchsatzrate) herangezogen werden können, müssen gegebenfalls gefundene Inhibitor-Kandidaten unbedingt auf ihre inhibierende Wirkung auf TGFß Effekte der zweiten Gruppe getestet werden.
Zu TGFß-Effekten des ersten Typs zählen i) die Induktion extrazellulärer Matrixproteine, wie Fibronektin, Laminin, Elastin; ii) die Induktion des Proteaseinhibitors PAI (Plasminogen Activator Inhibitor) und damit die Inhibierung der zellulären Proteaseaktivität, und iii) eine Hemmung des Zellwachstums und eine Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose) in bestimmten Zelltypen. Hierzu gehören vor allem normale Epithelzellen sowie nur leicht entartete, im wesentlichen noch epitheloide Tumorzellinien. Die Induktion der PAI-1 Expression sowie die durch TGFß induzierte Apoptose bieten sich als Vorgänge an, die zum Aufbau eines zellulären Assay-Systems zum Screenen von Substanzen verwendet werden können, die als TGFß-Rezeptor-lnhibitoren fungieren. Der gewählte Effekt wird hierbei direkt als Nachweissystem für die inhibierende Wirkung der Substanz herangezogen.
Um festzustellen, ob die durch Aktivierung des TGFß-Rezeptorsystems ausgelöste EF-Konversion in der im Rahmen der vorliegenden Erfindung O 97/37678 PCΪ7EP97/01699
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verwendeten EpRas-Zellinie Über dieseiben Typ I-/Typ Il-Rezeptoren übermittelt wird wie die Induktion von PAI (bzw. eines anderen durch TGFß regulierten Moleküls) in nicht transformierten Zellen, z.B in der (ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung benutzten) normalen Ausgangszellinie EpH4, kann z.B. überprüft werden, ob die Induktion von PAI (bzw. eines anderen Moleküls) oder der in dieser Zellinie sehr gut ausgeprägten Wachstumshemmung, durch eine dominant-negative Mutante desselben Typ I- oder Il-Rezeptors blockiert wird, die auch die EF-Konversion blockiert. Im Falle der CT26 Zellen, welche den dominant-negativen Typ Il- Rezeptor (TßRII-dn) überexprimieren, konnte gezeigt werden, daß in den zu epithehalen Zellen revertierten, TßRII-dn exprimierenden CT26 Klonen die Aktivierung eines PAI-1 Promotor-gesteuerten Reportergens durch TGFß-1 komplett gehemmt war. Das Ausmaß der PAI-I Hemmung der Hemmung der Reportergenexpression durch PAI-I korrelierte direkt mit der Fähigkeit der verschiedenen Klone, Tumoren im Tier zu bilden. Weiterhin hatte ein spezieller CT26 Klon, der nach längerer Passage in vitro eine komplette TGFß-1-lnduzierbarkeit des PAI-1 Promotor-Reportergen- Konstrukts zurückgewonnen hatte (vermutlich durch Repression der TßRII-dn Expression) ebenso die Fähigkeit zurückgewonnen, in der Maus metastasierende Tumoren zu bilden.
Die Bestätigung des Zusammenhanges zwischen EFC, Tumorbildung und TGFß-Rezeptor Typ Il-Funktion mit Hilfe der TßRII-dn-Experimente bietet die Voraussetzung für einen Screening-Assay auf der Grundlage einer PAI-1 "Reportergen-Testzelle. Diese Testzelle, die eine menschliche oder tierische Zelle ist, ist stabil mit einem Plasmid transformiert, in der ein Reportergen, z.B. das Luciferasegen, unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz des PAI-Gens (oder eines Gens, das für ein anderes von TGFß reguliertes Molekül, z.B. für ein extrazelluläres Matrixproteins, kodiert) steht. Die Testzelle ist außerdem transformiert mit dem menschlichen Typ I- oder Typ Il-Rezeptor, von dem sich nach Durchführung weiterer Versuche erwiesen hat, daß er sowohl am effizientesten die EF-Konversion auslöst als auch die Induktion von PAI oder eines anderen durch TGFß regulierten Moleküls. Der für die Konstruktion des verwendeten TßRII-dn herangezogene menschliche TGFß Typ Il-Rezeptor ist eines möglichen Zielmoieküle für einen TGFß- Inhibitoren. Als Kontrollzelle wird zweckmäßig ein Parallel-Zellklon verwendet, bei dem das PAI-1 -Promotor gesteuerte Reportergen durch einen anderen, nicht mit dem TGFß-Rezeptor verwandten Rezeptor (z.B. Mitglieder der FGF (fibroblast growth factor) Rezeptor-Tyrosinkinase- Familie) aktiviert wird.
Findet man in einem derartigen Screening-Assay eine Substanz, welche die TGFß-induzierte Reportergen-Expression ganz oder teilweise inhibiert, kann gefolgert werden, daß entweder der gewählte, Ligand-aktivierte Typ I-/Typ Il-Rezeptor oder die durch diesen Rezeptor vermittelte Signalübertragung durch die Substanz blockiert wird. Dieselbe Substanz sollte in der Kontrollzelle, bei der das Reportergen nicht durch TGFß, sondern durch FGF aktiviert wurde, keinen Einfluß auf die geringe, basale Reportergenexpression haben. Die Testsysteme, in denen die Reportergen-Aktivierung gemessen wird, können in robotisierten High Throughput Screen (HTS) Verfahren eingesetzt werden.
Eine zweite Möglichkeit, die Blockierung der TGFß-Rezeptorfunktion durch Testsubstanzen zu messen, kann auf einfache Weise durch die Aufhebung der durch TGFß bewirkten Wachstumshemmung und Apoptose gemessen werden. Da TGFß in normalen EpH4 Zellen unter bestimmten Bedingungen effizient Apoptose bewirkt, sollten wirksame Inhibitoren des TGFß- Rezeptors wie Überlebens- bzw. wachstumsstimulierende Faktoren wirken. Als Kontrollzellen können EpH4 Zellen verwendet werden, in denen ein anderer Apoptose induzierender Rezeptor exprimiert wurde. Hierfür bietet sich vor allem der Rezeptor Fas an, welcher nach Bindung eines speziellen Fas-Liganden in fast allen Zelltypen effizient Apoptose induziert. Die Aufhebung eines apoptotischen Effekts durch wirksame TGFß-Rezeptor- Inhibitoren hat den Vorteil, daß sie in kommerziell erhältlichen Testsystemen (z.B. im MTS-Assay, der die Zahl lebender, metabolisch aktiver Zellen erfasst) leicht gemessen werden kann, und daß toxische Substanzen (die den Zelltod verursachen anstatt aufheben) leicht als solche identifiziert werden können. Somit eignet sich auch dieses Testsystem für HTS Primärscreens. Eine weitere Möglichkeit für ein zelluläres Assay-System, mit dem Substanzen auf ihre inhibierende Wirkung auf die durch Aktivierung des TGFß-Rezeptorsystems ausgelöste EF-Konversion getestet werden können, beruht auf der Expression von Proteinen, die für den fibroblastoiden Zelltyp nach EF-Konversion charakteristisch und somit ein Indikator für das Eintreten der EF-Konversion sind. Ein Beispiel dafür ist Vimentin (Reichmann et al, 1992), von dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt wurde, daß seine Expression mit der durch Kooperation von Ras und TGFß ausgelösten EF-Konversion einhergeht. Weitere Beispiele für andere Marker des fibroblastoiden Phänotyps sind der Verlust der Expression von E-Cadherin mRNA sowie die de-novo Expression von Fibronektin und diverser Proteasen (UPA, TPA, Reichmann et al, 1992). Eine geeignete, durch Ras oder andere Onkogene transformierte Testzelle ist mit einem Plasmid transformiert, in dem ein Reportergen unter der Kontrolle des Vimentin-Gen Promotors oder von Promotoren eines der anderen erwähnten fibroblastoiden Marker-Gene steht. Die Modulation der Reportergenexpression durch eine Testsubstanz sollte dann mit durch die gleichen Inhibitoren bewirkten Modulation der EC-Konversion korrelieren.
Eine weitere Möglichkeit, Substanzen zu finden, die die Aktivierung des TGFß-Rezeptorsystems inhibieren, benutzt als Nachweissystem die Expression von TGFß selbst. Dieses Assay-Prinzip beruht auf der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewonnenen Erkenntnis, daß die Aktivierung des TGFß-Rezeptorsystems in Onkogen exprimierenden Zellen durch den Liganden TGFß die autokrine Produktion von TGFß bewirkt, welcher in einer autokrinen Schleife (autocrine loop) auf die Zellen zurückwirkt. In einem solchen Assay, mit dem sowohl die durch Aktivierung des TGFß-Rezeptorsystems als auch durch die Expression von Ras bewirkte Induktion des autokrinen TGFß-Loops erfaßt werden kann (die Wirkung von Substanzen, die in einem solchen Test die TGFß-Expression inhibieren, tun dies aufgrund ihrer Wirkung auf die Aktivierung des TGFß- Rezeptorsystems und ihrer Wirkung auf Ras), enthalten die Zellen ein Reportergenkonstrukt, weiches unter der Kontrolle des TGFß-Gen- Promotors (Kim et al, 1989) steht. Biochemische Assays, in denen TGFß-lnhibitoren identifiziert werden, deren Wirkung darauf beruht, daß sie den TGFß-Signalübertragungsweg inhibieren, können z.B. wie folgt durchgeführt werden: In einem Assay- Format wird, in Gegenwart und in Abwesenheit von Testsubstanzen (potentiellen TGFß-lnhibitoren) die Autophosphorylierung des TGFß- Rezeptors Typ II oder dessen zytoplasmatischer Domäne, welche die Kinasedomäne enthält, an Serin- oder Threoninresten in vitro gemessen, wobei ein solcher Kinase-Assays nach literaturbekannten Methoden durchgeführt wird, z.B. wie von Lin et al., 1992, oder von Braunwalder et al., 1996, beschrieben, und wobei ein rekombinant, z.B. in E. coli, hergestellter Rezeptor (bzw. dessen Domäne) verwendet wird. In einem alternativen Assay-Format wird, ebenfalls nach dem bekannten Prinzip von Kinase-Assays, in Gegenwart und in Abwesenheit potentieller Inhibitoren, die Fähigkeit des TGFß-Rezeptors Typ II, den TGFß-Rezeptor Typ I bzw. dessen sog. GS-Domäne (Wrana et al., 1994) zu phosphorylieren, gemessen. Die Modifikation eines solchen Assays für ein High Throughput Format kann unter Verwendung kommerziell erhältlicher Technologien, wie Filterplatten, FLASH-Platten (Amersham) oder SPA (Scintillation Proximity Assay)-Beads (Amersham), vorgenommen werden.
In einem der beschriebenen Testsysteme im Primärscreen gefundene Inhibitoren des TGFß-Rezeptors werden zweckmäßigerweise in Sekundärscreens auf ihre Spezifität getestet. Dies kann vor allem durch direkte Inhibition der TGFß-abhängigen EF-Konversion von EpRas Zellen in Kollagen-Gelen erfolgen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Inkubation von auf Plastikschalen in geringer Dichte ausgesäten, konvertierten EpRas Zellen (z.B aus Maustumoren) mit den gefundenen Inhibitoren des TGFß-Rezeptors. Wirksame Substanzen sollten die Umwandlung von fibroblastoiden in epitheliale Zellen selbst in Anwesenheit von TGFß auslösen. Dieselben Substanzen sollten Re- Epithelialisierung (FE-Konversion) in CT26 Zellen bewirken. Schließlich können besonders geeignete, wirksame Substanzen in Mäusen, die mit CT26 Zellen injiziert wurden, darauf getestet werden, ob sie das Wachstum des Primärtumors verlangsamen bzw. die Metastasierung nach Excision des Primärtumors hemmen. Die Substanz, die die Expression oder die Funktion von onkogenem Ras und/oder die Überexpression von normalem Ras (bzw. die Folge dieser Überexpression) und/oder die Aktivierung von normalem Ras durch Rezeptortyrosinkinasen in den Zellen inhibiert, wird im folgenden als "Ras¬ inhibitor" bezeichnet.
Ras-Inhibitoren im Sinne der Definition der vorliegenden Erfindung inhibieren entweder Ras direkt, indem sie die Aktivierung/Funktion von Ras selbst inhibieren oder indem sie die Aktivierung/Funktion eines Ras- Effektormoleküls inhibieren, das im Ras-Signalübertragungsweg unterhalb von Ras wirkt. Beispiele sind Inhibitoren von Raf, wie Raf-Antisense- Oligonukleotide (Monia et al., 1996). Für den Fall, daß die Aktivierung von Ras nicht auf eine Veränderung von Ras selbst, sondern auf die konstitutive Aktivierung von oberhalb von Ras wirkenden Rezeptor- Tyrosinkinasen zurückzuführen ist, kann eine Inhibierung der Ras- Aktivierung auch durch die Inhibierung dieser Rezeptoren bewirkt werden. Beispiele für derartige Rezeptoren sind die Rezeptor-Tyrosinkinasen EGF- Rezeptor ("Epidermal Growth Factor Receptor") und homologe Rezeptoren wie HER-2, HER-3 oder HER-4. Beispiele für chemische Verbindungen, die den EGF-Rezeptor inhibieren, sind der WO 96/07657 zu entnehmen. Bekannte Ras-Inhibitoren sind monoklonale Antikörper (Furth et al., 1982), dominant-negative Mutanten (Stacey et al., 1991 ; Quilliam et al., 1994) und Antisense-RNA. Beispiele für niedermolekulare Ras-Inhibitoren sind Inhibitoren der Ras-Famesyltransferasen (Kohl et al., 1993; Kohl et al., 1994; Kohl et al., 1995).
Um nach weiteren niedermolekularen Ras-Inhibitoren zu screenen, werden Gene, kodierend für Mutationen der Ras-Proteine H-Ras, K-Ras oder N-Ras, die zu einer konstitutiven Aktivierung von Ras führen, in Säugetierzellen eingebracht, z.B. mittels retroviraler Vektoren, und die selektive zytotoxische Wirkung von Testsubstanzen auf die ras¬ transformierten Zellen bestimmt. Eine geeignete Methode zur Identifizierung von ras-lnhibitoren ist z.B. in der EP-A 604 181 beschrieben.
Beispiele für Ras-transformierte Zellinien, die als Testzellen für die Identifikation von Ras-Inhibitoren verwendet werden können, wurden ferner von Andrejauskas und Moroni, 1989, sowie von Jenkins et al., 1993, beschrieben.
Eine Identifizierung von Ras-Inhibitoren kann auch mit einem Assay auf Grundlage der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten EpRas-Zellinie vorgenommen werden. Dafür enthalten die Zellen ein Reportergenkonkstrukt, in dem das Reportergen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz des TGFß-Gens steht. Auf die Zellen wird zunächst TGFß aufgebracht, um die EF-Konversion herbeizuführen. Danach werden die Zellen mit den Testsubstanzen beaufschlagt. Von Testsubstanzen, die in der Lage sind, die Aktivität des Reportergens zu hemmen, kann angenommen werden, daß sie Ras-Inhibitoren sind. Eine Bestätigung dafür kann dann in Sekundärscreens erfolgen, in denen die Substanzen darauf untersucht werden, ob sie die TGFß -induzierte EF-Konversion von EpRas Zellen in Kollagengelen hemmen oder die bereits erfolgte EFC rückgängig machen können.
Mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel kann erstens verhindert werden, daß die Zellen in den fibroblastoiden Zustand übergehen und invasiv werden, womit ihre Tumorigenität verhindert oder vermindert wird. Zum zweiten kann mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel auch die Umwandlung vorhandener, fibroblastoider und invasiv wachsender Tumorzellen in nicht- oder weniger maligne, epitheliale Zellen bewirkt werden.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann einerseits verwendet werden, um die Umwandlung der Zellen vom epithehalen, nicht-invasiven in einen fibroblastoiden, invasiven Zustand zu verhindern. Ein Beispiel dafür ist seine Verabreichung nach operativer Entfernung eines Primärtumors, um zu verhindern, daß gegebenenfalls noch vorhandene Tumorzellen invasiv werden und durch Metastasierung weitere Tumoren erzeugen. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Arzneimittel über den gleichen Mechanismus auch das Tumorwachstum verlangsamen, wie mit Hilfe der TßRII-dn exprimierenden CT26 Zellen gezeigt werden konnte. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann andererseits verwendet werden, um die bereits erfolgte EF-Konversion der Zellen rückgängig zu machen. Hat die Konversion einmal stattgefunden, hält TGFß den fibroblastoiden Zustand aufgrund eines autokrinen Loops aufrecht. Die Verabreichung eines TGFß-lnhibitors allein bewirkt in diesem Fall eine Aussschaltung des autokrinen Loops und somit eine Reversion des fibroblastoiden, invasiven Zustandes der Zelle in den normalen, epithehalen Zustand. Diese Reversion ist jedoch vorübergehend, an dem durch Ras oder andere Onkogene herbeigeführten transformierten Zustand der Zelle wird grundlegend nichts geändert. Dies bedeutet, daß bei Absetzen des TGFß- lnhibitors die EF-Konversion von neuem herbeigeführt werden könnte. Wird hingegen, gegebenenfalls zusätzlich zum TGFß-lnhibitor, ein Onkogen- Inhibitor, z.B. ein Ras-Inhibitor oder ein HER-1/2 Inhibitor, verabreicht, wird der transformierte Zustand der Zelle aufgehoben, die Zelle verhält sich wie eine normale epitheliale Zelle und reagiert entsprechend normal auf TGFß, d.h. die Einwirkung von TGFß auf die Zelle kann keine EF-Konversion herbeiführen und bewirkt sogar eine Wachstumshemmung der Tumorzelle.
Daß TGFß-(Rezeptor)-lnhibitoren eine Verlangsamung oder sogar Inhibition des Tumorwachstums bewirken könnten, wird durch folgenden Sachverhalt gestützt: die meisten Tumoren produzieren ständig TGFß (siehe unten), welches an die Umgebung abgegeben wird und dort immunsuppressiv wirkt, d.h. die Funktion von zytotoxischen T- Lymphozyten und anderen Zellen des Immuπsystems hemmt. Wird durch den TGFß-Rezeptor-lnhibitor die Umwandlung invasiver Tumorzellen in nicht-invasive, mehr epitheliale Zellen bewirkt, so sollten diese die TGFß- Sekretion abschalten und somit leichter von zytotoxischen T-Zellen angegriffen und lysiert werden können.
Um eine optimale Wirkung zu erhalten, enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel vorzugsweise eine Kombination von TGFß-lnhibitor und Ras- Inhibitor.
Beim Übergang epithelialer Zellen in den fibroblastoiden Zustand werden verstärkt fibroblastoide Markerproteine, z.B. Vimentin, exprimiert. Die Zunahme der Expression dieser Marker (siehe unten) ist somit einer der diagnostischen Parameter für Tumorerkrankungen, für deren Behandlung das erfindungsgemäße Arzneimittel eingesetzt werden kann.
Zu solchen Tumorerkrankungen zählen Adenokarzinome der Brust (Heatley et al., 1993), Nierenzellkarzinome (Beham et al., 1992), Karzinosarkome der Brust (Wargotz und Norris, 1989), Karzinosarkome der Speiseröhre (Guarino et al., 1993) oder des weiblichen Genitaltrakts (de Brito et al., 1993), epitheloide Sarkome sowie Spindelzellkarzinome verschiedener Lokalisation, z.B. Lungenkarzinome mit Spindelzellkomponenten (Matsui et al., 1992) oder Spindelzellkarzinome der Gallenblase (Nishihara et al., 1993).
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Arzneimittel für die Behandlung von Mammatumoren und Nierenzellkarzinomen verwendet.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden beim Menschen in Dosierungen von 0.01 bis 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0.1 bis 15 mg verabreicht. Neben den wirksamen Verbindungen enthält das Arzneimittel übliche inerte Träger- und Hilfsstoffe. Der Fachmann kann Methoden zur Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen einschlägigen Handbüchern, wie Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, entnehmen.
Figurenübersicht
Fig. 1 : Konversion von EpRas-Zellen in fibroblastoide Zellen während der Tumorbildung in Mäusen Fig. 2: Epithelial/mesenchymale Konversion (EFC) während der
Tumorentwicklung: Zeitlicher Verlauf und Verhalten von
Donor- und Empfänger-Zellen Fig. 3: Organogenese und epitheliale Polarität werden durch Serum oder TGFßl zerstört Fig. 4: TGFßl zerstört die Zellpolarität in Ras-transformierten
Brustepithelzellen Fig. 5: Fibroblastoide EpRas-Zellen sind im Hühnerembryoherz-
Invasionsassay hoch invasiv Fig. 6: TGFßl hält den fibroblastoiden Phänotyp konvertierter
EpRas-Zellen über einen autokrinen Loop aufrecht Fig. 7: Konvertierte EpRas-Zellen produzieren hohe
Konzentrationen an TGFßl Fig. 8: TGFßl löst in experimentell induzierten Tumoren den
Übergang vom epithehalen zum fibroblastoiden Zustand sowie die Invasivität der Zellen aus Fig. 9: Modell für die Wirkung von TGFßl in der
Tumorentwicklung Fig. 10: TGFßl induziert in vitro Morphogenese und Apoptose in normalen Brustdrüsenepithelzellen Fig. 11 : In vivo Expression von TGFßl während der Bildung der normalen Brustdrüse Fig. 12: In vivo Expression von TGFßl beim Abbau der voll entwickelten Brustdrüse nach dem Abstillen Fig. 13. Hemmung der Invasivität menschlicher
Tumorzellen durch TGFß-neutralisierende
Antikörper Fig. 14 Expression eines dominant-negativen TGFß-
Rezeptors (TßRII-dn) in Ras-transformierten
Brustepithelzellen hemmt die EFC und das
Tumorwachstum Fig. 15 Expression von TßRII-dn in Maus-Colon-
Karzinomzellen (CT26) verhindert das
Auswachsen in Kollagengelen und die Invasivität in vitro Fig. 16 Expression von TßRII-dn in CT26 Zellen hemmt die Metastasenbildung in vivo Fig. 17 TßRII-dn exprimierende CT26 Zellen sind auch nach intravenöser Injektion unfähig, in der Lunge
Metastasen zu bilden Fig. 18 Expression eines PAI-1-Promotor-Reporter-
Konstrukts in CT26- und CT26-TßRII-dn-Zellen ] In den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet:
a) Zellkultur
EpRas-Zellen wurden hergestellt, indem die parentale Brustepithelzellinie EpH4 (ein auf hohe Ausprägung eines polarisierten Phänotyps selektionierter Subklon der spontan immortalisierten Brustepithel-Zellinie Ep1 (Reichmann et. al,1992)) mit einem Helfer-freien, v-Ha-Ras exprimierenden retroviralen Vektor (Redmond, et al., 1988) infiziert wurde. Die Selektion und Expansion der polarisierten epithehalen Klone wurde durchgeführt, wie von Reichmann, et al., 1992, beschrieben. Dazu wurden die Zellen auf Plastikschalen in Wachstumsmedium (Dulbecco's modified Eagles medium; (DMEM), enthaltend 10% FCS (Boehringer Mannheim) und 20 mM HEPES, gezüchtet und bei einem Verhältnis von 1 :3 zweimal pro Woche subkultiviert. Für die Induktion der Hemizysten(Kuppen)bildung wurden EpRas-Zellen und Zellen der parentalen Linie EpH4 bei hoher Dichte eine Woche lang ohne Subkultivierung gezüchtet.
Die menschlichen Tumorzellinien MZ 1795 (Nierenkarzinom; Seliger et al. 1996) und KB (Nasopharyngealkarzinom ATCC CCL17; Derynck et al., 1985) wurden über die ATTC bezogen. Sie wurden im gleichen Medium wie die Maus-EpH4 Zellen kultiviert.
Die Maus-Colonkarzinomlinie CT26, deren Etablierung von Brattain et al., 1980, beschrieben wurde, wurde ebenfalls im gleichen Medium wie die Maus-EpH4 Zellen kultiviert.
Um den humanen, dominant negativen TGFß-Rezeptor Typ II (TßRII-dn, Wrana et al., 1992) in Maus-EpH4 und CT26 Zellen zu exprimieren, wurde die entsprechende cDNA (Wrana et al., 1992) in den helfer-freien Retrovirus-Vektor pbabe-puro (Morgenstern und Land, 1990) eingesetzt. Die Retrovirus-DNA wurde in BOSC 23 packaging cells transfiziert (Pear et al, 1993) und die virusproduzierenden, Mitomycin-C behandelten BOSC 23 Zellen mit EpH4 bzw CT26 Zellen kokultiviert. Infizierte Klone wurden mit G418 selektioniert und in Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM), enthaltend 20% FCS (Boehringer Mannheim) und 20 mM HEPES expandiert. Die Expression des TßRII-dn Proteins wurde im Western Blot über ein im Konstrukt vorhandenes Hämagglutinin (HA) Epitop nachgewiesen.
b) Wachstum von organotypischen Zellstrukturen in Kollagengelen
Semikonfluente Kulturen der zu analysierenden Zellen wurden trypsinisiert und mit eiskaltem Wachstumsmedium auf eine Endkonzentration von 4 x 104 Zellen pro ml eingestellt. Gleiche Volumina der Zellsuspension und einer angesäuerten Lösung von Rattenschwanz-Kollagen Typ 1 (Sigma) wurden bei 4°C gemischt, auf 35mm Gewebekulturschalen aufgebracht und 30 min bei 37CC inkubiert, um die Lösung zu einem Gel erstarren zu lassen. Um den Zellen die Bildung organotypischer Strukturen zu ermöglichen, wurden die Kollagengele mit einem serumfreien Medium (MEGM; Promocel), enthaltend Rinderhypophysenextrakt (BPE), rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Hydrocortison und Insulin (jeweils in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen) überschichtet. Wo angegeben, wurden 5 oder 10% FCS oder 5ng/ml rekombinanter TGFßl (Literatur) beigegeben. Das die Kollagengele überschichtende Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Um das von den Zellen oder Zellstrukturen in den Kollagengelen produzierte TGFßl zu neutralisieren, wurden ein monoklonaier Antikörper gegen TGFßl (Genzyme) oder Kontrollantikörper bei Konzentrationen bis zu 50μg/ml verwendet.
c) Tumorinduktion in Mäusen und Re-Isolierung von Zellen aus Tumoren oder Kollagengelen
Konfluente EpRas- oder EpH4-Zellen wurden trypsinisiert und gezählt. Dann wurden 10^ Zellen, suspendiert in 0.1ml PBS, subkutan oder in die Brustdrüse von 5 Wochen alten BALB/c Mäusen oder Nacktmäusen injiziert. Die Mäuse wurden nach unterschiedlichen Zeitspannen (zwischen 3 und 28 Tagen) getötet und die Tumoren (oder Gewebezonen, welche die injizierten Zellen enthielten) herausgeschnitten. Für die anschließende histologische Analyse wurde das Gewebe sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Um die Tumorzellen für das weitere Wachstum in der Gewebekultur wieder zu isolieren, wurde das Gewebe unter sterilen Bedingungen unter Verwendung von zwei gegenüber angeordneten Skalpellen in kleine Stücke geschnitten und mit 2mg/ml Kollagenase Typ 1 (Sigma) 1 h lang bei 37°C verdaut. Zur Entfernung der verbleibenden Wirtszellen, denen die retroviralen Neomycin- oder Hygromycin- Resistenzmarker der Donor-Zellen fehlten, wurden die aus den Tumoren gewonnenen Zellen für die ersten 5 Tage in Gegenwart von G418 bzw. Hygromycin gezüchtet. Die Kollagengele wurden auf ähnliche Weise mit Kollagenase verdaut, um die Zellen für die nachfolgende Gewebekultur wieder zu isolieren.
Zur Tumorinduktion mit CT26 Zellen bzw CT26-TßRII-dn-ZeIlen wurde 1x106 Zellen pro Tier in Nacktmäuse subkutan unter die Rückenhaut injiziert. Die Grosse der tastbaren Tumoren wurde alle 3 Tage bestimmt und die Tiere getötet, wenn die Tumoren eine für das Wohlbefinden der Tiere tolerable Grosse überschritten.
In einem weiteren Experiment wurden 1x106 Zellen pro Tier in syngene Mäuse (Balb/C) injiziert. Nach Erreichen einer Grosse des Primärtumors von von 4 cm3 wurden die Tumoren chirurgisch entfernt, so daß kein Tumorgewebe an der Operationsstelle zurückblieb. Die Mäuse wurden dann weiter überwacht und nach Tod auf das Vorhandensein von Lungenmetastasen untersucht. in einem letzten Experiment zum Nachweis der Fähigkeit der CT26- und CT26-TßRII-dn-Zellen, aus der Zirkulation in die Lunge abzusiedeln, wurden 5.000 und 50.000 Zellen beider Typen i.v. in die Schwanzvene von syngenen Balb/C Mäusen injiziert. Die Mäuse wurden dann nach Absterben wie oben auf das Auftreten von Lungenmetastasen untersucht.
d) Antikörper
Kaninchenantiseren gegen Zytokeratin wurden von Reichmann, et al., 1992, beschrieben. Kaninchenantiserum und monoklonale Rattenantikörper gegen E-Cadherin wurden hergestellt, wie von Kemler, 1993 zitierten Literatur und der darin zitierten relevanten Literatur O 97/37678 PC17EP97/01699
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beschrieben (Kemler, 1993). Kaninchenantiserum, das Neomycin- Phosphotranspherase erkennt, wurde hergestellt, indem Neomycinphosphotransferase bakteriell exprimiert, aufgereinigt und in Kaninchen injiziert wurde . Nach angemessener Zeit wurde Kaninchenserum gewonnen und nativ für die Immunfärbungen eingesetzt.
Der monokolonale Mausantikörper gegen Vimentin V3B (Boehringer Mannheim), der monoklonale Rattenantikörper gegen ZO-1 (Chemicon), der monoklonale Mausantikörper gegen TGFß 1-3 (Genzyme), der TGFß 2,3-Antikörper (Genzyme), das polyklonale Antiserum gegen aktivierten TGFß (Promega), der TGFß-neutralisierende polyklonale Kaninchenantikörper (R&D) sowie die monoklonalen TGFß-Antikörper (Genzyme) wurden käuflich erworben.
e) Schnitte und Immunfluoreszenz
Um in den herausgeschnittenen Geweben und Kollagengelen die optimale biologische Aktivität von RNA und Proteinen zu erhalten, wurden das Tumormaterial und die Zellstrukturen enthaltenden Kollagen Typ I Gele unmittelbar nach der Isolierung in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Vor dem Einfrieren wurden die Kollagengele 2 min lang in Medium, enthaltend 5% DMSO getränkt, um eine Zellschädigung infolge von Eiskristallbildung zu verhindern. Auf Plastik gezüchtete Zellen oder Gefrierschnitte, hergestellt aus Tumoren oder Kollagengelen, wurden 15 min lang bei -20°C unter Verwendung von Aceton/Methanol, gemischt im Verhältnis 1/1 , fixiert und durchlässig gemacht, luftgetrocknet und bei 4°C gelagert. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte für 1 h bei 37°C in PBS, das normalerweise Gelatine, BSA und Tween 20 (je 0.2%) enthielt, um unspezifische Antikörperfärbung zu verhindern, einwirken gelassen. Die Zellen oder Schnitte wurden dann in Moviol 1-88 (Hoechst) eingedeckt und mit einem Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Fotografien wurden entweder konventionell oder computerunterstützt unter Verwendung einer Kaf 1400 CCD Kamera (Photometric) und dem Adobe Photoshop 3.0 Bildentwicklungsprogramm hergestellt. Zum Nachweis von Cytokeratin, Vimentin und TGFß in menschlichem Tumorgewebe wurden Serienschnitte von Gefriermaterial immunhistochemisch mittels der ABC-Methode analysiert. Die immunhistochemische Analyse wurde durchgeführt, wie von Heider et al., 1995, beschrieben. Als Primärantikörper wurden Anti-Cytokeratin (Klon MNF 116; DAKO, Dänemark), Anti-Vimentin (Klon V9; DAKO, Dänemark) und eine Mischung aus Anti-TGFß1 und TGFß2 (Santa Cruz, Kalifornien) verwendet. Das Ergebnis der Färbung wurde mit einem Zeiss Axioskop Mikroskop ausgewertet.
Für den simultanen Nachweis von Vimentin und Cytokeratin in Gewebeschnitten wurde eine Doppelfluoreszenz-Analyse durchgeführt. Als Primärantikörper wurden Anti-Vimentin (Klon V9; DAKO, Dänemark) und ein Anti-Cytokeratin Kaninchenserum verwendet, als Sekundärantikörper wurden Cy3-gekoppelte Anti-Maus IgG bzw. FITC-gekoppelte Anti¬ Kaninchen IgG Antikörper verwendet. Die Auswertung der Fluoreszenz erfolgte mittels eines Zeiss Axiophot 2 Mikroskops unter Zuhilfenahme eines Leica Quantimed Q500 Bildanalyse-Systems.
f) RNA in situ Hybridisierung
Für die RNA in situ Hybridisierung wurden die Gefrierschnitte fixiert und extrahiert, wie von Oft, et al., 1993, beschrieben. Dazu wurden die Schnitte in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert, zweimal in PBS gewaschen, 2 h lang vorhybridisiert und über Nacht mit der jeweiligen S^ -markierten Ribosonde bei 52°C in 50% Formamid, 0.6 M NaCI hybridisiert. Nach dem Waschen unter stringenten Bedingungen (Tm -20°C) wurden die Schnitte in Kodak NTB Flüssigemulsion getaucht und 2 Wochen lang belichtet. Die Objektträger mit den Schnitten wurden mit Hämatoxylin/Eosin gegengefärbt und in Licht- und Dunkelfeldbeleuchtung unter Verwendung eines Zeiss Axiophot Mikroskops analysiert.
Zur Herstellung der S35-markierten Ribosonden wurden die hTGFßl-cDNA (R&D) und die cDNA für Neomycinphosphotransferase, herausgeschnitten aus einem geeigneten (Redmond, et al., 1988) retroviralen Vektor, in die T3.T7 Expressionsplasmide (Bluescript II KS Stratagene) kloniert und in vitro, in Gegenwart von S35-UTP für die Antisenseribosonde und für die Sense-Kontrollsonde, transkribiert.
Die nichtradioaktive in situ-Hybridisierung für TGFß in Schnitten von menschlichem Tumorgewebe wurde wurde mittels Digoxygenin-markierten Sonden durchgeführt. Die Markierung der Sonde (hTGFßl , siehe voriger Abschnitt) erfolgte mittels DIG-RNA Labelling Kit der Firma Boehringer Mannheim nach Angaben des Herstellers. Für die Hybridisierung wurden Gefrierschnitte (5-7 μm) in 4% Paraformaldehyd für 10 min fixiert, 2 mal in PBS gewaschen und anschließend für 10 min in 0,5 %igem Essigsäureanhydrid azetyliert. Nach zweimaligem Waschen in PBS wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert, luftgetrocknet und anschließend für 30 min bei 52°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Hybridisierung mit der Sonde erfolgte für 4 bis 6 h bei 52°C in einer feuchten Kammer. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger für 2 x 10 min in 2x SSC bei 52°C gewaschen und anschließend die gebundene Sonde mittels Anti-Digoxygenin Antikörper laut Vorschrift der Firma Boehringer Mannheim sichtbar gemacht. Die Präparate wurden kurz mit Hämatoxylin gegengefärbt, eingedeckelt und mittels eines Zeiss Axioskop Mikroskopes ausgewertet.
g) Elektronenmikroskopie
Die in den Kollagengelen gewachsenen Zellen wurden 10 min in 3% Paraformaldehyd in 0.2 M HEPES pH 7.3 bei Raumtemperatur vorfixiert. Die Zellen wurden in 8% Paraformaldehyd in 0.2 M HEPES pH 7.3 30-60 min lang auf Eis weiter fixiert. Für die Immunzytochemie wurden die Proben in Ethanol bei zunehmend niedrigeren Temperaturen entwässert, in Lowicryl HM20 oder K4M eingebettet und bei -35°C mittels UV-Licht polymerisiert (Schwarz, et al., 1993). Für die Ultrastrukturuntersuchungen wurden die Zellen mit 1% Osmiumtetraoyxd in PBS pH 7.2 1 h lang auf Eis nachfixiert, mit 1% wässerigem Uranylacetat 1 h lang gefärbt, in Ethanol bei Raumtemperatur entwässert und schließlich in Epon eingebettet. Für die Immunzytochemie wurden ultradünne Schnitte auf Deckgläsern aufgeklebt (Schwarz, 1994). Nach der Blockierung unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen mit 0.5% Rinderserumalbumin und 0.2% Gelatine in PBS wurden die Schnitte mit Kaninchen-anti-Catenin- Antikörpern und anschließend mit Cy3-markiertem Ziegen-anti-Kaninchen IgG inkubiert. Die markierten Schnitte wurden mit 4',6-Diamino-2- phenylindol (DAPI) gefärbt, um die Kerne im Immunfluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen.
h) Southern Blot Analyse
Gesamt-DNA von Zellen oder Tumormaterial wurde unter Verwendung von Standardmethoden (Maniatis, et al., 1982) isoliert und verarbeitet. DNA, extrahiert aus Zellen vor der Injektion, aus frisch herausgeschnittenem Tumorgewebe (Tag 15 nach der Injektion) und aus Tumorgewebe, das in vitro in Gegenwart von G418 5 Tage lang rekultiviert worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI (das den retroviralen Vektor nur einmal schneidet) verdaut, auf eine Gene Screen Membran geblottet und mit den cDNAs, kodierend entweder für das Neomycin-Phosphotransferase- oder für das v-Ha-ras-Gen, hybridisiert.
i) Northern Blot Analyse
Die Northern Blot Analyse wurde durchgeführt, wie von Chomczynski und Sacchi, 1987; sowie von Reichmann, et al., 1992, beschrieben. Gesamt- RNA (10 μg pro Spur) wurde auf denaturierenden, Formaldehyd enthaltenden Gelen gelaufen, auf Gene Screen Membranen geblottet und mit der gesamten kodierenden Region von hTGFßl-cDNA (R&D), die genug Homologie mit mTGFßl , 2 und 3 aufweist, um alle drei Maus-TGFß- Isoformen zu erkennen, hybridisiert.
j) Halbquantitative PCR
Gesamt-RNA aus Zellen, gezüchtet auf Plastik, in Kollagengelen oder aus Tumoren, wurde isoliert und für die halbquantitative PCR verarbeitet. Ein TGFßl -spezifisches Fragment wurde mittels RT-PCR unter halbquantitativen Bedingungen, unter Verwendung von -Actin-Primern als interne Kontrolle, amphfiziert, wie von Leonard, et al., 1993, beschrieben. Dazu wurde die DNA bei 94°C 1 min lang denaturiert, die Primer wurden bei 65°C 1 min lang annealt, und die Polymerasereaktionen wurden bei 72°C 1 min lang fortgesetzt. Die Amplifizierung wurde während 20 und 30 Zyklen fortgesetzt. Es wurden die TGFßl -spezifischen Primer TGGACCGCAA CAACGCCATC TATGAGAAAA CC (aufwärts) und TGGAGCTGAA GCAATAGTTG GTATCCAGGG CT (abwärts) (Clontech Inc.) verwendet. Die Ergebnisse der PCR wurden auf einem Image Quant Phospho-Imager quantitativ ausgewertet. Die Werte wurden auf das Kontrollprodukt (-Actin) normalisiert und anschließend in Relation zu dem Wert aus Kontroll-3T3-Fibroblasten gebracht.
Der Nachweis von TGFßl in Tumorgeweben mittels RT-PCR wurde durchgeführt wie kürzlich beschrieben (Heider et al., 1996). Als δ'-Primer wurde das TGF ß1 spezifische Oligonukleotid GCCCTGGACACCAACTATT GCTTC und als 3'-Primer das TGF ß1 spezifische Oligonukleotid TGCTCCACCTTGGGCTTGC verwendet. Die Amplifikationsprodukte wurden auf einem 2 %igem Ethidiumbromid- haltigem Agarosegel aufgetrennt und unter UV-Licht mittels einer Videokamera (MWG Biotech) ausgewertet.
k) Transiente Transfektion eines PAI-1-Promotor-Reportergen-Konstrukts.
Ein PAI-1 Promotor-Reporter-Konstrukt (Reportergen war Luciferase; 3TP- lux, Wrana et al., 1992) wurde mittels Lipofectamin-Transfektion (Gibco) nach Vorschrift des Herstellers in CT26 Zellen bzw CT26-TßRII-dn-Zellen transfiziert. 8 Stunden nach Transfektion wurde TGFßl für 24 Stunden zugegeben, Kontrollansätze verblieben ohne TGFß. Danach wurden Zeliysate hergestellt und die Luciferase-Aktivität, wie von Wrana et al., 1992, beschrieben, in einem Berthold Clinilumat gemessen. Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz wurden alle Zellen mit einem CMV- ß-Gal Reportergen-Konstrukt cotransfiziert und die erhaltenen Luziferaseaktivitäten auf die ß-Gal Fiuoreszenzintensität sowie auf die Proteinkonzentration des Extraktes (Bradford) normiert. I) Quantitative Bestimmung von löslichem TGFß mittels ELISA-Assay
Um die TGFß-Konzentrationen mittels ELISA-Assay zu bestimmen, wurden EpH4-, polarisierte EpRas- und fibroblastoide EpRas-Zellen, isoliert aus Tumoren oder in vitro mit TGFß konvertiert, fünfmal mit PBS gewaschen, um exogenen TGFß zu entfernen, und anschließend 48 h lang in serumfreiem DMEM gezüchtet. Danach wurden die Zellkulturüberstände gesammelt und die TGFßl -Konzentrationen mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kit (Promega; G1230) nach Vorschrift des Herstellers bestimmt.
m) Immunoblots
Um TGFßl in den Gewebekulturüberständen zu bestimmen, wurden 2 ml serumfreie Zellüberstände mittels Ultrafiltration (Centricon 10, Amicon) auf ein Endvolumen von 0.1 ml konzentriert. Die konzentrierten Überstände wurden mit 5fach konzentriertem SDS-PAGE Probenpuffer (ohne Mercaptoethanol) gemischt und mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Gleiche Proteinaliquots (50 μg) wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen; die Immunoblot-Analyse wurde durchgeführt, wie von Hayman, et al., 1993, beschrieben.
n) Hühnerembryoherz-Invasionsassay
Dieser Assay wurde durchgeführt, wie von Behrens, et al., 1993, beschrieben. Um invasive Donor-Zellen eindeutig von Hühnerherzzellen unterscheiden zu können, wurden die Testzellen vor der Untersuchung mit einem Vitalfluoreszenzfarbstoff beladen. Dazu wurden die Zellen 1 h lang in einer Glukose enthaltenen Hanks-Salzlösung, enthaltend 10 mM 5,6- Carboxy-2,,7'-dichlorfluoreszeindiacetat-succinimidylester (Molecular Probes) und 0.2 x 10-6 M Pluronic F127, inkubiert. Damit wird der Fluoreszenzfarbstoff kovalent an intrazelluläre Proteine gebunden, ohne die Lebensfähigkeit oder das Verhalten der Zellen, bestimmt mittels verschiedener Differenzierungs- und Proliferationsassays, zu beeinträchtigen. Die markierten Zellen wurden 24 h lang bei hoher Dichte gezüchtet, von der Plastikschale geschabt und mit vorkultivierten Herzfragmenten von 9 Tage alten Hühnerembryos auf der Oberfläche einer Weichagerschicht in Berührung gebracht. Nach 7 Tagen in Kultur wurden die Fragmente mit den anhaftenden Zellen gesammelt, in flüssigem Stickstoff blitzgefroren, Gefrierschnitte angefertigt, in Methanol/Aceton fixiert und die fluoreszierenden Zellen mittels Epifluoreszenzmikroskopie (Axiophot, Zeiss) bestimmt.
o) Implantation von TGFßl -beladenen Slow Release Pellets in Mäuse
Um Ras-transformierte Brustepithelzellen sehr früh in der Tumorentwicklung aktiviertem TGFßl auszusetzen, wurden TGFßl- beladene Slow Release Elvax Pellets und entweder EpRas-Epithelzellen oder normale EpH4H-Zellen subkutan in Mäuse koinjiziert. Für Kontrollzwecke wurden Pellets, die nur mit BSA beladen waren, koinjiziert. Die Pellets wurden jeweils nach Vorschrift des Herstellers hergestellt und beladen.
Beispiel 1
Ras exprimierende polarisierte epitheliale Zellen machen während der Tumorentwicklung EF-Konversion durch.
Die durchgeführten Versuche wurden durch die Beobachtung angeregt, daß Ras-transformierte Maus-Brustepithelzellen (EpRas-Zellen) zwei gänzlich verschiedene Zellphänotypen zeigen. Wenn sie auf Plastiksubstraten gezüchtet werden, wachsen diese Zellen als geordnete, Kuppen bildende Monolayers (Hemizysten), was auf einen polarisierten epithehalen Phänotyp hinweist (Fig. 1A, B). Nach Injektion in Mäuse bildeten jedoch diese gleichen polarisierten Zellen Tumoren, die aus depolarisierten spindelförmigen Zellen mit der Fähigkeit zu invasivem Wachstum bestanden (Fig. 1A, C). Um weitere Erkenntnisse über die Mechanismen zu erhalten, die dieser phänotypischen Plastizität zugrunde liegen, wurde durch eine Kombination von in vivo und in vitro experimentellen Ansätzen die beobachtete Zellkonversion detailliert untersucht. Dafür wurde derZellklon EpH4 verwendet, der abgeleitet ist von einer gut charakterisierten Maus-Brustepithelzellinie (Reichmann, et al., 1989; Reichmann, et al., 1992; Strange, et al., 1991). Diese Zellen zeigen einen stabilen polarisierten epithehalen Phänotyp (Reichmann, et al., 1994).
Bei Verwendung geeigneter retroviraler Vektoren wurden durch stabile Expression des v-Ha-Ras-Onkogens tumorigene Subklone von EpH4 gebildet. Nachdem die Expression von v-Ha-Ras mittels Western Blot- Analyse bestätigt worden war, wurden Zellen von sieben Klonen (bezeichnet als EpRas-Klone) subkutan oder direkt in die Brustdrüsen von Balb/c-Mäusen injiziert. Es bildeten sich regelmäßig Tumoren, die 5-7 Tage nach der Injektion der Zellen tastbar waren.
Der Phänotyp dieser konvertierten Tumorzellen wurde mit dem der ursprünglichen differenzierten Klone verglichen: vor der Injektion zeigten alle sieben EpRas-Klone den erwarteten polarisierten Phänotyp (Fig. 1B und Tabelle 1 ). Im Gegensatz dazu wurden bei Herausschneiden von Zellen aus den Tumoren und Rekultivierung in Gegenwart von G418 nur konvertierte, fibroblastoide Zellen erhalten (Fig. 1C, Tabelle 1 ). Obwohl sie bis zu einem gewissen Grad nach wie vor Zytokeratine exprimierten, hatten diese Zellen viele ihrer epithehalen Eigenschaften verloren und die Expression fibroblastischer Marker erworben (Fig. 1C, Tabelle 1). Um nachzuweisen daß die Tumorzellen von den ursprünglich injizierten EpH4 Donor-Zellen abstammten, sowie um zu zeigen, daß kein Rearrangement oder keine Reintegration des Ras enthaltenden Retrovirus während der Tumorigenese und anschließenden in vitro Kultur stattgefunden hatte, wurde das Integrationsmuster des retroviralen Konstrukts mittels Southern Blot-Analyse bestimmt. Dazu wurden EpRas Zellen vor der Injektion, Zellen aus einem 15-Tage-Tumor und re-isolierte Zellen aus einem 30-Tage- Tumor analysiert. Bei Verwendung von Sonden mit Spezifität für das Neomycinresistenz-Gen oder das ras-Gen wurden in allen drei Zelltypen identische Integrationsmuster erhalten (Fig. 1D). Die Konversion von EpRas-Zellen in fibroblastoide Zellen während der Tumorbildung in Mäusen ist in Fig. 1 dargestellt.
Fig. 1 A zeigt das Prinzip der Strategie, die verwendet wurde, um EFC von Ras-Zellen (es wurden 7 verschiedene v-Ha-Ras exprimierende Zeilklone verwendet) in vivo zu studieren.
Fig. 1 B: Vor der Injektion zeigen Zellen des Klons Ep5 auf Plastik Kuppenbildung und färben sowohl auf E-Cadherin (FITC, grüne Fluoreszenz, in der Schwarz-Weißabbildung dunkel erscheinend), als auch auf Zytokeratine (Texas-Red, rote Fluoreszenz). Zu beachten ist die gemeinsame Färbung beider Proteine an der Zellperipherie (gelbe Färbung).
Fig. 1C: Ep5-Zellen, isoliert aus einem Tumor 28 Tage nach der Zellinjektion. Diese Zellen zeigen ein fibroblastoides Erscheinungsbild und exprimieren Zytokeratine, aber kein E-Cadherin.
Fig. 1 D: Southern Blot Analyse. Der EpRas-Klon (Ep5), vor der Injektion (Ep5, plastic), aus dem Tumor entnommen (Ep5, tumor), aus dem Tumor entnommen und 5 Tage lang in G418 rekultiviert (Ep5, ex tumor), zeigt das selbe retrovirale Integrationsmuster (nachgewiesen mit einer Neomycin- Phosphotranspherase(NPT)-Sonde).
Beispiel 2
Zeitlicher Verlauf der EF-Konversion und Verhalten von Donor-und Empfängertier-Zellen während der Tumorigenese in vivo
Als nächstes wurde untersucht, in welchem Stadium der Tumorentwicklung, wenn überhaupt, die subkutan injizierten epithehalen EpRas-Zellen eine EF-Konversion durchmachen. Drei Tage nach der Injektion bildeten die EpRas-Zellen deutlich begrenzte Knötchen, in denen die Zellen charakteristische Zytokeratine, aber kein Vimentin exprimierten (Fig. 2A). Diese epithehalen Zellknoten waren bereits von Stromazellen eingekapselt (Fig. 2A). Zellen die aus diesen Mikrotumoren auf Plastik und in Gegenwart von G418 herauswuchsen, zeigten noch immer epitheliale Eigenschaften. Sieben Tage nach der Injektion wurde beobachtet, daß sich am Rand des Tumors der feste Zellverband der Ep-Ras Zellen aufzulösen begann und die Epithelzellen sich an der Peripherie der Mikrotumoren mit Vimentin-positiven Stromazellen vermischten (durch Einwanderung der Stromazellen oder Auswanderung der Donorzellen). Zu diesem Zeitpunkt zeigten die Donorzellen immer noch epitheliale Eigenschaften, sowohl im Tumor als auch nach Isolierung und in vitro Kultivierung in G418.
15 Tage nach der Injektion konnten drei verschiedene Zelltypen unterschieden werden (Fig. 2C): ca. 20% der Tumorzellen stellten grün gefärbte Vimentin-positive stromale Zellen dar. Weitere 20% exprimierten nur Zytokeratine, was auf EpRas-Zellen hinweist, die den epithehalen Phänotyp beibehalten haben. Der überwiegende Anteil (50-60%) der Tumormasse bestand jedoch aus Zellen, die Zytokeratin und Vimentin co- exprimierten. Diese Zellen stellen höchstwahrscheinlich konvertierte oder konvertierende EpRas-Zellen dar . Sowohl die epithehalen als auch die konvertierten fibroblastoiden Zellen wurden auch nach G418-Selektion erhalten. Schließlich konnte in fünf Wochen alten, voll entwickelten Tumoren der epitheliale Anteil nicht mehr nachgewiesen werden, weder in situ, noch auf Plastik. Im Gegensatz dazu bildeten parentale EpH4-Zellen nie Tumoren. Wenn sie subkutan injiziert wurden, entwickelten sich die EpH4-Zellen zu Schichten epithelialer Zellen, die manchmal Lumina bildeten und Zytokeratine, aber kein Vimentin exprimierten (Fig. 2D). Nach längerer Zeit nekrotisierten diese Zellen und wurden vom umliegenden Stroma resorbiert.
Um die ursprünglich injizieren Donor-Zellen in den drei verschiedenen Tumorstadien eindeutig zu identifizieren, wurde eine in situ Hybridisierung an das Neomycinresistenz-Gen durchgeführt. Diese Versuche ergaben, daß alle Zytokeratin exprimierenden Zellen von Donor-Zellen abstammten. Die Häufigkeit von Donor-Zellen relativ zu den Stroma-Zellen der Empfängertiere nahm mit der Tumorgröße zu und war in voll entwickelten Tumoren am höchsten (Fig. 2E, F, G, H). Insgesamt zeigen diese Daten, daß sowohl die Ras exprimierenden Zellen als auch die epithehalen Kontrollzellen in vivo anfänglich einen epithehalen Phänotyp aufweisen. Mit fortschreitender Entwicklung der Ras-Zelltumoren erwerben die Ras-transformierten Zellen progressiv fibroblastoide Eigenschaften. Im Gegensatz dazu behalten die nicht-tumorigenen parentalen Zellen ihre epithehalen Eigenschaften stabil bei, bis sie absterben.
Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der epithelial/ mesenchymalen Konversion (EFC) während der Tumorentwicklung und demonstriert das Schicksal von Donor- und Empfängerzellen während dieses Vorgangs.
Es werden verschieden behandelte Gefrierschnitte von EpRas-Tumoren (Klon Ep2) gezeigt, die am Tag 3 (Fig. 2A, E) , am Tag 7 (Fig. 2B, F), am Tag 15 (Fig. 2C, G) und am Tag 28 (Fig. 2H) nach der Injektion angefertigt wurden. Die Zellstrukturen, die von nicht-tumorigenen EpH4-Zellen 15 Tage nach der Injektion gebildet werden, sind in Fig. 2D dargestellt. Die Schnitte wurden mittels Immunfluoreszenz (Fig. 2A-D) und in situ Hybridisierung (Fig. 2E-H) untersucht. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen ein 46 kDa Zytokeratin (Texas-Red, rote Fluoreszenz) und Vimentin (FITC, grüne Fluoreszenz) doppelgefärbt. Es war zu beobachten, daß in 3- Tage-Tumoren die injizierten epithehalen Zellen (rotgefärbt) und die mesenchymalen Zellen des Wirts (grüngefärbt) deutlich getrennt sind. In 15-Tage-Tumoren werden große Mengen von Zytokeratin/Vimentin- doppeltpositiven Zellen sichtbar (gelbgefärbte Zellen). Diese Zellen haben EFC durchgemacht. RNA-//7 situ Hybridisierung unter Verwendung einer Neomycin-Phosphotransferase-Sonde bestätigt den Donor-Ursprung der Tumorzellen und zeigt die zunehmende Dichte der Tumorzellen nach EFC (Fig. 2E-H). Beispiel 3
TGFßl induziert in vitro EF-Konversion in Ras exprimierenden, aber nicht in normalen epithehalen Zellen
Um den Mechanismus zu identifizieren, der der EF-Konversion zugrunde liegt, wurde ein experimentelles System eingesetzt, mit dem EF- Konversion in vitro unter definierten und physiologisch relevanten Bedingungen induziert werden kann. Zu diesem Zweck wurden normale EpH4-Zellen oder Ras-transformierten Subklone dieser Zellen (Ep-Ras Klone) in rekonstituierten Kollagen Typl Gelen gezüchtet, unter Verwendung von serumfreiem Medium. Diese Bedingungen erlaubten es, definierte Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone einzusetzen, von denen bekannt ist, daß sie an der Modulation des epithehalen Phänotyps beteiligt sind. In solchen Gelen entwickelten sich normale EpH4-Zellen zu organähnlichen Drüsenkanälen (Tubuli) die häufig in keulenförmigen, hohlen Anschwellungen endeten. Diese Strukturen sahen den Endknospen (end buds) der sich entwickelnden Brustdrüse sehr ähnlich, welche von primären Brustepithelzellen sowohl in Kollagengelen als auch in vivo gebildet werden (Fig. 3A). Diese Strukturen konnten bei Zusatz von lactogenen Hormonen effizient zur Produktion von Milchproteinen induziert werden. Wenn diese Zellen aus dem Gel isoliert wurden und auf Gewebekultur-Plastik gezüchtet wurden, bildeten sie die erwarteten regelmäßigen epithehalen Monolayer, weiche deutlich erkennbare Kuppen (domes) bildeten, ein Zeichen dafür, daß diese Zellen effizient polarisieren können (Fig. 3, rechte Tafel).
Überraschenderweise zeigten auch die EpRas-Klone in diesen serumfreien Kollagengelen beträchtliche Lumenbildung. Die Lumina waren bereits 2-3 Tage nach dem Aussäen sichtbar. Im Anschluß daran entwickelten mehr als 95% dieser Strukturen relativ große zystische Hohlräume (Fig. 3B, linke und mittlere Tafel) welche den Alveoli der voll entwickelten, Milch produzierenden Brustdrüse ähnlich sahen. Auf Plastik bildeten diese Zellen wiederum regelmäßige epitheliale Monolayer mit Kuppen (domes) aus, zeigten somit die gleichen epithehalen Eigenschaften, wie die nicht- tumorigenen Ausgangszellen (Fig. 3B, rechte Tafel).
Die gleichen EpRas-Zellen verhielten sich jedoch völlig anders, wenn sie in 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert wurden. Unter diesen Bedingungen bildeten sie längliche, vielzellige und invasiv wachsende Zellstränge aus, die nie Lumenbildung zeigten. Diese Stränge bestanden aus nicht-polarisierten Zellen, die viele epitheliale Eigenschaften verloren hatten (Fig. 3C und Fig. 4) und die sich auffallend ähnlich verhielten wie die ex vivo fibroblastoiden Tumorzellen. Diese Befunde deuteten daraufhin, daß ein im FCS enthaltener Faktor, Kooperation mit dem aktivierten Ha-Ras-Onkoprotein, die Konversion der epithehalen EpRas Zellen zu fibrobalstoiden Zellen bewirkt.
Um diese(n) Faktor(en) zu identifizieren, wurde eine Anzahl von Wachstumsfaktoren (TGFß, Heregulin, Scatter-Faktor/heptocyte growth factor, saurer und basischer FGF, PDGF und TGFßl) den in Kollagengelen gezüchteten Ras-transformierten Zellen zugesetzt. Überraschenderweise war TGFßl der einzige Faktor, der auffallende und lang anhaltende Wirkungen auf EpRas-Zellen zeigte. Bei Zugabe von TGFßl wuchsen diese Zellen zu länglichen, sich verzweigenden Zellsträngen aus, ähnlich denen, wie sie durch FCS induziert wurden. Auf Gewebekultur-Plastik zeigten diese Zellen einen deutlichen, fibroblastoiden Phänotyp (Fig. 3D). In EpH4-KontroII-Zellen und anderen nicht-tumorigenen Brustepithel- Zellklonen war TGFßl im Gegensatz dazu nicht in der Lage, EF- Konversion zu induzieren.
Um zu untersuchen, ob die Aktivität im Serum, welche EF-Konversion fördert, tatsächlich TGFßl darstellt, wurden Kulturen, die 5% FCS enthielten, mit TGFßl neutralisierenden Antikörpern inkubiert. Unter diesen Bedingungen bildeten EpRas-Zellen wiederum zystische Hohlräume aus, sehr ähnlich denen, die in Fig. 3B dargestellt sind. Damit wurde die in FCS vorhandene zeilkonvertierende Aktivität als TGFßl identifiziert und gezeigt, daß TGFßl die einzige oder zumindestens vorherrschende Aktivität im FCS darstellt, die EF-Konversion auslösen kann. Weitere Ultrastruktur- und immunhistochemische Analysen ergaben, daß die meisten zystischen Strukturen aus einem Monolayer polarisierter Zellen bestanden (Fig. 4A). Diese Zellen bildeten reichlich Microvilli an ihrer apikalen (dem Lumen zugekehrten) Domäne, was auf eine polarisierte Organisation der Zellen hinweist (Fig. 4A). Außerdem konnten verschiedene Arten von epithelzell-typischen Zell-Zellkontaktstrukturen, d.h. tight junctions, charakterisiert durch das Protein ZO-1 , Desmosomen (Fig. 4A) und das für sog. "adherens junctions typische Zelladhäsionsmolekül E-Cadherin (Fig. 4B) an ihren typischen lateralen oder basolateralen Positionen nachgewiesen werden. Ähnlich zeigte das mit E-Cadherin assoziierte Protein ß-Catenin in den meisten Zellen eine basolaterale Lokalisierung (Fig. 4C).
Im Gegensatz dazu bestanden die strang-ähnlichen Zellstrukturen, die durch TGFßl induziert wurden, aus lose aneinander haftendenden spindelförmigen Zellen (Fig. 4D, Einsatzbild). Keine der erwähnten epithehalen Markerproteine und ultrastrukturell erkennbaren Kontaktstrukturen konnte nachgewiesen werden (Fig. 4D und Tabelle 1 ), mit der Ausnahme einer niedrigen, nicht-polarisierten Expression von E-Cadherin (Fig. 4E). Die Expression von ß-Catenin war stark reduziert und hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert (Fig. 4F). Außerdem exprimierten diese Zellen die erwarteten mesenchymalen Marker (Tabelle 1 ).
Diese Ergebnisse zeigen, daß Ras-transformierte Maus-Brustepithelzellen eine außerordentliche Plastizität im Phänotyp zeigen, die von epithel polarisierten, in geordneten Epithelien organisierten Zellen bis zu fibroblastoiden, migratorischen und invasiv wachsenden Zellen reicht.
Fig. 3 zeigt die Zerstörung von Lumenbildung und epithelialer Polarität durch Serum und TGFßL
Nicht-tumorigene EpH4-Zellen (Fig. 3A) oder tumorigene EpRas-Zellen (Klon Ep5, Fig. 3B-D) wurden in Kollagen Typ I Matrices gezüchtet. Die makroskopisch sichtbaren Strukturen wurden 8 Tage nach dem Ausplattieren bei geringen und hohen Vergrößerungen fotografiert (linke 97/37678 PC17EP97/01699
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und mittlere Tafel). Aus den Gelen isolierte und auf Gewebekulturplastik gezüchtete Zellen sind in den rechten Tafeln abgebildet.
Fig. 3A: Ep4H-Zellen bilden in serumfreien Kollagengelen Kanäle und "end-bud" ähnliche Anschwellungen aus. Auf Plastik bildeten diese Zellen einen regelmäßigen epithehalen Monolayer und Kuppen (Hemicysts, domes).
Fig. 3B: In serumfreien Kollagengelen werden von EpRas-Zellen weite Kanäle und Alveoli-ähnliche Zysten gebildet.
Fig. 3C: Zugabe von 10% FCS veranlaßt die Zellen zur Bildung invasiv wachsender unregelmäßiger Zeilstränge ohne Lumen. Auf Plastik sind diese Zellen fibroblastenähnlich und spindelförmig.
Fig. 3D: TGFßl allein (5 ng/ml) veranlaßt EpRas-Zellen dazu, zu invasiven Zellsträngen, ähnlich den durch FCS induzierten, auszuwachsen.
Fig.4 zeigt den Zusammenbruch der epithehalen Zellpolarität in Ras¬ transformierten Brustepithelzellen nach Inkubation mit TGFßL
Alveolen-ähnliche Zysten, gebildet von EpRas-Zellen (Klon Ep6) in serumfreien Koilagengelen (Fig. 4A-C), und ungeordnete Zellstränge, gebildet von den gleichen Zellen nach TGFßl -Behandlung (Fig. 4D-F), wurden hinsichtlich ihrer epithehalen Organisation und Ausbildung von Zellpolarität analysiert. Schnitte durch einzelne Strukturen wurden bei hohen oder niedrigen (Einsatzabbildungen) Vergößerungen fotografiert.
Fig. 4A: Transmissions-Elektronenmikroskopie zeigte, daß die in Abwesenheit von TGFßl erhaltenen Zysten aus einem Monolayer von morphologisch polarisierten Zellen bestehen, die Mikrovilli ausschließlich an ihrer apikalen, in Richtung Lumen gerichteten Domäne aufweisen (Fig. 4D). Das Einsatzbild zeigt eine solche einschichtige Zyste bei niedriger Vergrößerung. Im Gegensatz dazu bestehen die in Gegenwart von TGFßl induzierten Zellstränge aus lose aneinander haftenden Zellen ohne Mikrovilli, Desmosomen oder tight junctions. Fig. 4B, E: Gefrierschnitte durch eine alveoläre Zyste, die mit einem Antikörper gegen das Zeiladhäsionsmolekül E-Cadherin immungefärbt waren, zeigten auf den meisten Zellen eine klar basolaterale Lokalisation des E-Cadherins. In den TGFßl -induzierten Zellsträngen ist E-Cadherin in seiner Expression vermindert und auf der gesamten Oberfläche der fibroblastoiden Zellen exprimiert.
Fig. 4C, F: Gezeigt werden mit einem anti-ß-Catenin-Antikörper immungefärbte Lowicryl-Schnitte durch Strukturen, ähnlich den in Fig. 4B und E dargestellten. Zu beachten ist die basolaterale Expression von ß-Catenin in den meisten Zellen der Zyste (Fig. 4C) und die deutlich verringerte ß-Catenin-Expression, welches jetzt vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist (Fig. 4F).
Beispiel 4
Fibroblastoide EpRas-Zellen sind invasiv
EpRas-Zellen, die EFC durchgemacht hatten, zeigten in Kollagen-Gelen Anzeichen von invasivem Verhalten. Um einen definitiven Beweis für diese invasive Eigenschaft zu erhalten, wurden die Vorteile des Hühnerembryoherz-Invasionsassays ausgenutzt, dessen Relevanz für die in vivo Metastasierung bereits ausführlich dokumentiert ist (Mareel, et al., 1979; Mareel, 1983). In diesem Assay wurde das Einwandern von Zellen in Embryoherzfragmente untersucht (Fig. 5A). Um die eindringenden Zellen deutlich zu identifizieren, wurden sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Carboxy-dichloro-fluorescein-diacetat) markiert. Parentale EpH4-Zellen wanderten während der Inkubationszeit von sieben Tagen nicht in das Hühnerherzgewebe ein (Fig. 5A, B). Bei drei verschiedenen, vollpolarisierten Ep-Ras-Klonen war nur ein verschwindend geringer Anteil der Zellen in der Lage in das Herzgewebe einzuwandern (Fig. 5C). Die wenigen eingewanderten Zellen färbten sich stark mit einem Vimentin- Antikörper an, nicht dagegen mit einem anti-E-Cadherin Antikörper. Dies bestätigt ihre Konversion zu einem fibroblastoiden Phänotyp, was nicht verwunderlich ist, da die Ko-Kulturen Serum enthielten. Im Gegensatz zu den epithehalen Zellen wanderten die fibroblastoiden Zellen, die aus Tumoren gewonnen worden waren ("ex-Tu cells"), oder Zellen, die durch Anwendung von TGFßl in vitro zur EFC induziert worden waren, in großen Zahlen und relativ schnell in das Herzmuskelgewebe ein. (Fig. 5D). Diese Ergebnisse zeigen, daß EpRas-Zellen nach Durchlaufen des EFC hochinvasiv sind, während nichtkonvertierte epitheliale Zellen nur geringe Invasivität zeigen.
Fig. 5 zeigt die hohe Invasivität von fibroblastoiden EpRas-Zellen im Hühnerembryoherz-I nvasionsassay.
In vivo fluoreszenzmarkierte Zellen wurden, um ihre Invasivität zu testen, mit Hühnerembryoherzfragmenten kokultiviert und Schnitte durch die Fragmente 7 Tage später histologisch untersucht. Die nicht-tumorigenen, epithehalen Ausgangszellen (EpH4-Zellen) wanderten nicht in die Herzfragmente ein (Fig. 5A, B), und nicht-konvertierte epitheliale EpRas- Zellen zeigten nur geringfügige Invasivität (Fig. 5C). Im Gegensatz dazu waren die konvertierten, fibroblastoiden Zellen, die nach TGFßl - Behandlung erhalten wurden, in der Lage, effizient in die Herzfragmente einzuwandern (Fig. 5D).
Beispiel 5
TGFßl erhält den fibroblastoiden Phänotyp konvertierter EpRas-Zellen über eine autokrine Schleife (autocrine loop) aufrecht
Nachdem gezeigt worden war, daß TGFßl Ras-tranformierte epitheliale Zellen in fibroblastoide umwandelt, erhob sich die Frage, ob TGFßl auch an der Aufrechterhaltung dieses Phänotyps beteiligt ist. Eine mögliche Erklärung für die relative Stabilität des fibroblastoiden Phänotyps (z.B. in Kulturen auf Plastik) war die autokrine Produktion von größeren Mengen an TGFßl durch die konvertierten Zellen selbst. Um diese Frage zu klären, wurden fibroblastoide EpRas-Zellen in extrem geringer Konzentration in 1 % FCS (um die TGFßl -Konzentration im Medium möglichst gering zu halten) kultiviert. Unter diesen Bedingungen wachsen Einzelzellen zu klar räumlich getrennten Klonen aus. Wie in den Figuren 6A und B gezeigt wird, wiesen die bald nach dem Ausplattieren erhaltenen, zunächst aus wenigen Zellen bestehenden Klone zunächst eine fibroblastoide Morphologie auf. Mit zunehmender Größe der Zeilklone wandelten sich die Zellen in der überwiegenden Mehrzahl der Klone allmählich zu Zellen mit einem epithehalen Phänotyp um (Fig. 6A bis D). Diese Reversion war 10 Tage nach dem Ausplattieren im wesentlichen vollständig (Fig. 6D).
Um die Wirkungen von autokrin produziertem TGFßl vollständig zu unterbinden und damit definitiv nachzuweisen, daß TGFßl für die Aufrechterhaltung der EF Konversion wirklich notwendig ist, wurden aus einem Tumor isolierte fibroblastoide Zellen (ex-tumor cells) in Gegenwart oder Abwesenheit von TGFßl neutralisierenden Antikörpern in Kollagengelen gezüchtet. In Abwesenheit der Antikörper bildeten die fibroblastoiden Tumorzellen die erwarteten dünnen, invasiv wachsenden Zellstränge aus (Fig. 6E). Die gleichen Zellen wuchsen jedoch nicht mehr invasiv und entwickelten sich zu zystischen, aus einem epithehalen Monolayer bestehenden Strukturen, wenn sie acht Tage lang mit den neutralisierenden Antikörpern behandelt wurden (Fig. 6F).
Schließlich wurden die Mengen der in den Zellen exprimierer TGFßl - mRNA und des ins Kulturmedium freigesetzten TGFßl -Proteins bestimmt. Drei verschiedene EpRas-Klone sowie der parentale EpH4-Klon wurden fünf Tage lang in Kollagengelen gezüchtet. Wenn sie mit 5 ng/ml TGFßl behandelt wurden, machten die EpRas-Klone EFC durch, während die gleich behandelten, nicht-transformierten EpH4-Zellen ihren epithehalen Phänotyp beibehielten. Die Analyse dieser Zellen mittels halbquantitativer PCR (Fig. 7A) oder mittels Immunoblot (Fig. 7B) zeigte, daß die durch TGFßl induzierten fibroblastoiden Zellen Mengen an TGFßl -mRNA produzierten, die mit denjenigen von Kontroll-Fibroblasten vergleichbar waren (Fig. 7A). Dies traf auch für EpRas-Zellen zu, die sich in Tumoren zu fibroblastoiden Zellen umgewandelt hatten. Im Gegensatz dazu produzierten parentale EpH4-Zellen und epitheliale EpRas-Zellen keine oder nur geringe Mengen an TGFßl -mRNA (Fig. 7A). Auf Proteinebene wurden im wesentlichen dieselben Ergebnisse erhalten, wenn serumfreie Kulturüberstände mittels ELISA und Westernblot analysiert wurden (Fig. 7B). Fig. 6 zeigt, daß TGFßl den fibroblastoiden Phänotyp konvertierter EpRas- Zellen über eine autokrine Schleife (autocrine loop) aufrechthält.
Fig. 6A-D: Klone aus fibroblastoiden, aus einem Tumor isolierten Zellen (ex-Tumorzellen) wandeln sich allmählich in aus epithehalen Zellen bestehende Klone um. Zur Erzeugung der Klone wurden 500 Zellen pro 100 mm Schale in Medium, enthaltend 1% FCS, ausgesät. Das Medium wurde täglich gewechselt, um eventuelle autokrine Faktoren zu verdünnen. Der gleiche, typische Zellklon wurde am Tag 1 (A), Tag 3 (B), Tag 5 (C) und Tag 10 (D) nach dem Ausplattieren fotografiert. Die allmähliche Umwandlung der fibroblastoiden Zellen zu Zellen mit einer epithehalen Morphologie ist deutlich sichtbar.
Fig. 6E, F: Fibroblastoide, aus einem Tumor isolierte EpRas-Zellen wurden 5 Tage lang in G418 selektioniert (um vom Empfängertier stammende Zellen zu entfernen) und anschließend in serumfreie Kollagengele ausgesät. Dies wurde entweder in Abwesenheit (E) oder in Gegenwart (F) von TGFßl neutralisierenden Antikörpern durchgeführt. Man sieht, daß die Tumorzellen sich in Gegenwart eines TGFßl neutralisierenden Antikörpers zu lumenförmigen Strukturen entwickeln, während sie in Abwesenheit des Antikörpers die erwarteten ungeordneten Zellstränge ausbilden.
Aus Fig. 7 ist ersichtlich, daß konvertierte EpRas-Zellen hohe Konzentrationen an TGFßl produzieren.
Fig. 7A: RNA aus nicht-konvertierten(epithelialen) und konvertierten (fibroblastoiden) EpRas-Zellen (Klon Ep5) ebenso wie aus nicht- tumorigene EpH4-Zellen und NIH-3T3-Fibroblasten (ATCC CRL 1658) wurde zur halbquantitativen PCR-Analyse eingesetzt. Zu beachten ist der signifikante Anstieg in TGFßl -mRNA in den fibroblastoiden Zellen. Die TGFßl-Expression ist in % der mit NIH-3T3-Zellen erhaltenen Werte aufgetragen.
Fig. 7B: Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die TGFßl - Konzentrationen in Zellkulturüberständen mittels Western Blot und ELISA analysiert wurden (die Ziffern oberhalb der Western-Blot Gel-Spuren zeigen die im ELISA bestimmten Mengen an TGFßl in ng TGFß1/ml). Die in Fig. 7B gezeigten Daten konnten mit zwei anderen EpRas-Klonen (Ep2 und Ep6) bestätigt werden.
Insgesamt lassen diese Ergebnisse auf eine vorherrschende Rolle von TGFßl nicht nur bei der Induktion von EFC, sondern auch bei der Aufrechterhaltung des fibroblastoiden Phänotyps schließen.
Beispiel 6
Abschließend wurde untersucht, ob TGFßl tatsächlich in EpRas-Tumoren exprimiert wird und ob experimentell beigegebener TGFßl auch in vivo EFC und Invasivität der Zellen hervorrufen kann. Aus injizierten EpRas Zellen auswachsende Tumoren wurden 4 und 15 Tage nach der Injektion der Zellen mittels RNA in situ Hybridisierung und Immnunhistochemie auf die Expression von TGFßl untersucht. Bereits 4 Tage nach der Injektion der Zellen wurden am äußeren Rand der von den EpRas-Zellen gebildeten Knoten erhöhte Konzentrationen von TGFßl -mRNA nachgewiesen (Fig. 8A). Die durch Doppel-Immunfluoreszenz gezeigte Ko-Expression von TGFßl und Neomycinphosphotransferase (NPT, welche ausschließlich von den Ras-tranformierten Donor-Zellen exprimiert wird) zeigte, daß die große Mehrzahl der Donor-Zellen (gekennzeichent durch die rote Färbung auf NPT) in diesem Stadium der Tumorentwicklung kein TGFßl (grüne Färbung) produzierten. Vom Empfängertier stammende Zellen des umgebenden Tumor-Stromas, die nicht-epithelialen Ursprungs waren, waren dagegen deutlich positiv für TGFßl (Fig. 8B). Im Gegensatz dazu zeigten Tumoren, die 28 Tage nach der Injektion entfernt worden waren, eine relativ hohe und gleichmäßige Expression von TGFß1-mRNA über die gesamte Tumorregion (Fig. 8C). In diesen Tumoren zeigte sich, daß die injizierten EpRas-Zellen selbst TGFßl produzierten, weil sie mit Antikörpern gegen NPT und TGFßl gemeinsam anfärbbar waren, sie zeigten eine gelbe Färbung (Fig. 8D,). Bemerkenswerterweise zeigten die meisten Zellen, die TGFßl produzierten, eine verminderte Expression von Zytokeratin, während die Mehrzahl der Zellen mit hoher Zytokeratin- Expression mit Antikörpern gegen TGFßl nicht anfärbbar waren. Dies ist ein weiterer Beweis dafür, daß die konvertierten Zellen tatsächlich diejenigen sind, die auch im Tier in fortgeschrittenen Tumorstadien TGFß produzieren.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Wirtszellen, die das Tumorgewebe umgeben, die Zellkonversion initiieren können. Die konvertierten Tumorzellen wiederum produzieren selbst TGFß, womit sie die Zellkonversion und anschließend die Invasionsvorgänge beschleunigen.
Um dies direkt zu beweisen, wurden Slow Release Pellets, die mit rekombinantem humanen TGFßl beladen waren, in der Nähe der injizierten EpRas-Zellen appliziert. Gleiche TGFßl -Pellets, kombiniert mit nicht-tumorigenen EpH4-Zellen, wurden als Kontrollen verwendet. Überraschenderweise konvertierten EpRas-Zellen, die sich in der nahen Umgebung eines TGFßl -Pellets befanden, bereits 4 Tage nach der Injektion zu unregelmäßig geformten Zellen und zeigten ausgiebige Auswanderung ins umliegende Wirtsgewebe. Überraschenderweise waren viele dieser Zellen bereits zu diesem frühen Zeitpunkt positiv für Vimentin (Fig. 8F). Im Gegensatz dazu bildeten gleiche EpRas Zellen, die in Abwesenheit von exogenem TGFßl injiziert worden waren, glatte homogene Knoten aus enge Zellkontakte bildenden, Vimentin-negativen Zellen (Fig. 8E). Wie erwartet konnten TGFßl -Pellets, die in der Nähe von EpH4-Zellen lokalisiert waren, den Phänotyp dieser nicht-tumorigenen Zellen nicht auffallend beeinflussen. Diese in vivo Daten stimmen mit den in vitro Ergebnissen überein und lassen auf eine Schlüsselrolle von TGFßl bei der Regulation der Plastizität und Invasivität von Tumorzellen schließen.
Fig. 8 zeigt, wie TGFßl in experimentell induzierten Tumoren den Übergang vom epithehalen zum fibroblastoiden Zustand sowie die Invasivität der Zellen auslöst:
Fig. 8A-D: Gefrierschnitte von Tumorstadien am Tag 4 (A, B) und Tag 15 (C, D). Die RNA in situ Hybridisierung zeigt, daß die TGFßl -Expression am Tag 4 in der äußeren Tumorperipherie (A), am Tag 15 (C) jedoch im gesamten Tumor stattfindet. Pfeilspitzen zeigen die Grenze zwischen Tumor und umgebendem Stroma an.
Fig. 8B, D: Gefrierschnitte wurden mit einem anti-TGFßl -Antikörper (grüne Fluoreszenz) und einem anti-Neomycinphosphotransferase-Antikörper, der die Spenderzellen erkennt (rote Fluoreszenz), gefärbt. Nebenabbildungen zeigen Ausschnitte bei größerer Vergrößerung. Es ist darauf hinzuweisen, daß in frühen Tumorstadien TGFßl ausschließlich vom tumorumgebenden Stroma produziert wird (B). Im Gegensatz dazu wird in 15 Tage alten Tumoren TGFß auch in vielen Donor-Zellen innerhalb des Tumorgewebes exprimiert (D, gelbe Fluoreszenz).
Fig. 8E, F: Epitheliale EpRas-Zellen wurden ohne (E) oder zusammen mit 3-Elvax Slow Release Pellets, die mit rekombinantem (aktivem) TGFßl (F) beladen waren, subkutan in Nacktmäuse injiziert. Gefrierschnitte, erhalten aus 4 Tage alten Tumoren, wurden mit Antikörpern gegen Zytokeratin (rot) und Vimentin (grün) doppelgefärbt. Auffallend ist die dramatische Auswanderung von Zellen ins umliegende Gewebe, die in der Nähe der TGFßl freisetzenden Pellets (weißer Kreis) induziert wurde.
Beispiel 7
Wirkung von TGFßl auf normale Brustepithelzellen: Steuerung der Milchkanälchen-Morphogenese durch Regulation von Zellwachstum, Zellpolarisierung und Apoptose
Da die TGFß-Superfamilie von Polypeptid-faktoren vor allem an morphogenetischen Prozessen während der Embryonalentwicklung beteiligt ist, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch die Rolle von TGFßl bei der normalen Brustdrüsenentwicklung untersucht. Zu diesem Zweck wurden normale Brustepithelzellen der Zeliinie EpH4 in serumfreie Kollagengele ausgesät. Anders als bei den Versuchen in Beispiel 3 wurde das beim Aussäen zum Erstarren des Kollagengels notwendige und einen Tag später ausgewaschene Serum besonders auf niedrigen Gehaltes an TGFßl seiektioniert. Unter diesen Bedingungen war die in vitro Organogenese komplett inhibiert, und es bildeten sich keine tubulären Strukturen (Fig. 10 A). Wenn niedrige Konzentrationen von TGFßl (0.1 ng/ml) hinzugefügt wurden, konnten die Zellen proliferieren und atypische Strukturen bilden, denen im allgemeinen Lumina fehlten (Fig. 10 B). Weitere Untersuchungen zeigten jedoch, daß diese Strukturen im Inneren ZO-1 , ein tight-junction Protein, exprimierten. Somit hatten diese Strukturen gewisse Ähnlichkeit mit den Endknospen (end buds) der sich entwickelnden Brustdrüse.
Im Gegensatz dazu bewirkten höhere Konzentrationen von TGFßl (>0.25 ng/ml), daß die normalen epithehalen Zellen ihr Wachstum einstellten und durch programmierten Zelltod (Apoptose) abstarben (Fig. 5C). Dies stellt einen wichtigen Unterschied zwischen den normalen epithehalen Zellen und den Ha-Ras enthaltenden Zellen dar. Während die letzteren sogar bei 20 mal höheren Konzentrationen an TGFßl (5 ng/ml) nicht zur Apoptose induziert werden und ausnahmslos EFC durchmachen, ist die TGFßl Konzentration, die bei normalen Brustepithelzellen morphogenetische Prozesse reguliert, streng festgelegt. Möglicherweise wird eine aberrante Morphogenese durch zu hohe TGFßl Konzentrationen dadurch vermieden, daß in den Zellen statt dessen Wachstumsinhibition und Apoptose induziert wird.
Daß es nicht gelang, mit niedrigen Konzentrationen von TGFßl voll differenzierte, aus polarisierten Zellen bestehende tubuläre Strukturen zu induzieren, könnte auf suboptimale Kulturbedingungen zurückzuführen sein. Andererseits könnte die vollständige Organogenese von tubulären Strukturen davon abhängen, daß TGFßl nur während bestimmter Phasen der organoiden Entwicklung anwesend sein darf. Um dieses zu untersuchen, wurden die Zellen, wie oben erwähnt, mit 0.1 ng/ml TGFßl behandelt, bis sich Strukturen gebildet hatten, dann wurde TGFßl aus dem Kollagengel herausgewaschen. Überraschenderweise reorganisierten sich nun die atypischen Strukturen ohne Lumina und bildeten gut ausgebildete tubuläre Strukturen mit typischen Lumina (Fig. 10 D, transient TGFßl). Diese Ergebnisse führen zu dem Schluß, (i) daß TGFßl für die in vitro Organogenese absolut notwendig ist, (ii) daß die Konzentration kritisch ist, wobei höhere Konzentrationen zur Apoptose führen und (iii) daß TGFßl nur während bestimmter Phasen der Organentwicklung auf die Zellen einwirken muß. Diese normale Funktion von TGFßl in der Brustepithelzeilentwicklung ist in den Ras-transformierten Zellen vollkommen verändert, wobei TGFß hier eine extreme abnormale Form der Gewebereorganisation verursacht, die über einen großen Konzentrationsbereich einen Übergang vom epithehalen zum fibroblastoiden Zustand (EFC) bewirkt.
Der nächste Schritt war nun, nach Hinweisen zu suchen, daß TGFßl in Analogie zu diesen in vitro Befunden auch in vivo die Morphogenese und den programmierten Zelltod von Brustdrüsenepithel steuert. Dazu wurden Brustdrüsen von Mäusen während der Pubertät einer histologischen Analyse in Kombination mit in situ Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde gegen TGFßl unterzogen. Während dieser Phase wachsen die virginalen Brustdrüsen in das umliegende Fettgewebe (fat pad) ein. Wachstum, Differenzierung und Morphogenese der entstehenden Brustdrüse geht von einer Struktur aus, die als Endknospe bezeichnet wird und undifferenzierte, noch nicht voll polarisierte epitheliale Zellen enthält, stattfindet) Schnitte durch die Endknospe (wo die Proliferation und anschließende Organogenese, wie z.B. die Verzweigung der Milchkanälchen, stattfindet) wurden mit Schnitten durch volldifferenzierte Drüsengänge (s. die schematische Zeichnung in Fig. 11, Mitte) verglichen. Während TGFßl im mesenchymalen Stroma produziert wird, das die wachsenden Endknospen umgibt (Fig. 11 , linke Tafel), wurde keine derartige Produktion von TGFßl in den Stromazellen gesehen, die einen bereits differenzierten Drüsengang umgeben (rechte Tafel). Diese Befunde entsprechen weitgehend den in vitro Daten, wo eine vorübergehende, pulsartige Behandlung der Brustepithelzellen mit TGFßl für die tubuläre Morphogenese erforderlich war.
Auf ähnliche Weise konnte ein Hinweis dafür erhalten werden, daß TGFß auch in vivo den programmierten Zelltod (Apoptose) von Brustepithelzellen reguliert. Während der Rückbildung der Brustdrüse nach dem Abstillen machen die alveolären Zellen massiv Apoptose durch, während die Zellen in den Drüsengängen überleben und erhalten bleiben. Von diesen Zellen geht das erneute Auswachsen der Brustdrüsen während einer erneuten Schwangerschaft aus. Um eine mögliche Beteiligung von TGFßl an diesem Prozeß zu untersuchen, wurden drei Tage nach Ende der Laktation Gefrierschnitte durch die absterbende alveoläre Zone einer Brustdrüse sowie durch eine benachbarte Drüsengangregion angefertigt (Fig. 12, Darstellung in der Mitte). In der Region, die gerade Apoptose durchmachte, exprimierten die mesenchymalen Zellen, die die absterbenden Alveoli umgeben, hohe Konzentrationen an TGFßl (Fig. 12, linke Tafel), während die mesenchymalen Zellen, die die überlebenden duktalen Strukturen umgeben, kein TGFßl exprimierten (Fig. 12, rechte Tafeln). In beiden Fällen ist es wahrscheinlich, daß ein Crosstalk zwischen den Epithelzellen und der im Mesenchym induzierten TGFßl -Produktion stattfindet.
Fig. 10 zeigt, daß eine niedrige Konzentration von TGFßl die in vitro Morphogenese normaler Brustdrüsenepithelzellen steuert, vor allem wenn der Faktor transient gegeben wird. Höhere Konzentrationen von TGFßl bewirken in den gleichen Zellen Apoptose.
Normale EpRas Zellen wurden in Kollagengele ausgesät, wobei ein auf besonders niedrigen TGFßl -Gehalt selektioniertes fötales Kälberserum während des Aussäens verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen bilden die Zellen keine tubulären Strukturen aus (Fig. 10A) In Anwesenheit von 0,1 ng/ml TGFßl bilden die Zellen verzweigte Strukturen, denen jedoch Lumina fehlen (Fig. 10B). Wird in Kulturen mit solchen Strukturen das TGFßl am Tag 7 durch Waschen entfernt, bilden die Zellen deutliche Hohlstrukturen aus (Fig. 10D). Höhere Konzentrationen an TGFßl bewirken Zelltod (Apoptose, Fig. 10C, links niedrige, rechts höhere Vergrößerung).
Fig. 11 : zeigt die In vivo Expression von TGFßl während der Bildung der normalen Brustdrüse während der Pubertät (Tag 25)
Gefrierschnitte wurden durch Endknospen einer virginalen Brustdrüse (linke Tafeln) oder durch bereits ausgebildete Drüsenkanäle (rechte Tafeln) wurden hergestellt wie in dem mittleren Schema angedeutet. Aufeinanderfolgende Schnitte einer Schnittserie wurden der RNA in situ Hybridisierung für TGFßl mRNA unterworfen (obere Tafeln) oder histologisch gefärbt. Es ist deutlich erkennbar, daß mesenchymale Zellen, welche die Endknospe umgeben, stark TGFßl exprimieren (linke Tafeln), während in Zellen, die differenzierte Drüsenkanälchen umgeben, keine TGFßl -Expression nachweisbar ist.
Fig. 12 zeigt die in vivo Expression von TGFßl beim Abbau der voll entwickelten Brustdrüse nach dem Abstillen.
Säugenden Mäusemüttern wurden die Jungtiere weggenommen, was die Rückbildung der voll entwickelten Brustdrüse auslöst. 3 Tage später wurden Gefrierschnitte durch die absterbenden Bereiche der Brustdrüse (linke Tafeln) sowie durch von der Apoptose nicht betroffene Drüsenkanäle (rechte Tafeln) angefertigt (siehe Schema in der Mitte der Abbildung) Die Schnitte wurden dann auf TGFßl Expression untersucht, wie in der Legende zu Fig. 11 beschrieben. Während in der Umgebung absterbender Alveoli TGFßl produzierende Zellen deutlich nachweisbar sind (linke Tafeln, fehlen solche in der Umgebung der überlebenden Drüsenkanäle.
Beispiel 8
Koexpression von Vimentin und Cytokeratinen in menschlichem Tumorgewebe. Expression von TGFß durch menschliche Primärtumoren
In den vorigen Beispielen wurde ein gut charakterisiertes Zellmodell, nämlich Ras-transformierte Brustepithelzellen der Maus, verwendet. Es war somit sehr wichtig abzuschätzen, inwieweit die mit Hilfe dieses Modellsystems gewonnenen Erkenntnisse über die Wirkung des TGFß- Rezeptors auf die phänotypische Plastizität und Invasivität epithelialer Tumorzellen für menschliche Karzinome zutrifft. Zu diesem Zweck wurden 31 Nierenzellkarzinome und 64 Mammatumoren verschiedenen Malignitätsgrades mittels Immunhistochemie untersucht. Zum einen wurden entsprechende histologische Schnitte durch solche Tumoren mit Antikörpern gegen generelle epitheliale Cytokeratine und Antikörper gegen den mesenchymalen Marker Vimentin doppelmarkiert. Tumorzellen, die beide Marker koexprimieren, haben wahrscheinlich eine EFC durchlaufen. Zum zweiten wurden benachbarte Schnitte aus den Mammatumoren mit Antikörpern gegen menschliches TGFßl und 7GFß2 markiert, um festzustellen ob die Tumorzellen auch TGFß produzieren.
Wie die nachstehende Tabelle zeigt, exprimierten 74% der Nierenzellkarzinome sowohl Cytokeratin als auch Vimentin in den entarteten, epithehalen Tumorzellen. Wie erwartet, eprimierten die fibroblastoiden Zellen des Tumorstromas nur Vimentin, aber kein Cytokeratin. In den Mammakarzinomzellen war der Prozentsatz von Tumoren, die Cytokeratin und Vimentin koexprimierten, geringer, nämlich zwischen 24 und 27 %.
Noch deutlicher fiel das Ergebnis der histochemischen Analyse der gleichen Mammatumoren für die Expression von TGFß aus. Hier zeigten alle getesteten Tumoren deutliche Färbung der Tumorzellen für TGFß (Tabelle) Das Tumorstroma war bei den meisten Tumoren schwächer oder gar nicht gefärbt. Die Spezifität der Färbung wurde auch aus der Färbung von Normalgewebe deutlich, bei der Haut waren z.B., wie erwartet, nur die basalen Zellschichten der Keratinozyten positiv. Wie die Tabelle femer zeigt, konnten die Ergebnisse der histochemischen Färbung durch in-situ Hybridisierung für TGFß sowie durch RT-PCR voll bestätigt werden.
Aus diesen Ergebnissen folgt, daß für einen signifikanten Teil der untersuchten menschlichen Tumoren auf zwei Arten deutliche Hinweise dafür gefunden werden konnten, daß die Tumorzellen entsprechend dem Modell in Fig. 9 sowohl eine EFC durchgemacht als auch die Produktion von TGFß hochreguliert hatten.
Die Tabelle zeigt, daß menschliche Nierenzell- und Mammakarzinome Cytokeratin und Vimentin koexprimieren. Dies ist ein klarer Hinweis für eine abgelaufene EFC. Ebenso produzieren alle untersuchten Tumoren TGFß.
Der obere Teil der Tabelle (A) zeigt die Ergebnisse der Färbung für Cytokeratin und Vimentin auf Gefrierschnitten der angegebenen Tumortypen. Im unteren Teil (B) sind die Ergebnisse der Färbung für TGFß auf Schnitten durch die gleichen Mamma-Tumoren dargestellt. Fußnoten zeigen die Ergebnisse von Kontrollexperimenten für die TGFß Expression (durch RT-PCR) und die Expression von TGFß im Tumorstroma.
A Koexpression von Vimentin und basalen Cytokeratinen
Tumortyp Subtyp Anzahl der Anzahl der analysierten Tumoren mit
Tumoren Vim/Cytok. Coexpr.
Nierenzell
Karzinome 31 23/31 (74%)
(RCC)
Mamma¬ tumoren 64 18/64 (28%)
Fibroadenom (FA) 3 2/3 (66%) invasives ductales Ka. (IDC)
34 8/34 (24%) invasives lobuläres Ka. (ILC)
26 7/26 (27%) inv. ductal-lobulär. Ka. (IDLC)
1 1/1
B Expression von TGFß-1/2
Tumortyp Subtyp Antikörperfärbung In situ Hybridi¬ sierung
Mamma¬ tumoren
Fibroadenom (FA) 3/3 (100%) invasives ductales Ka. (IDC) 33/33 (100%) 13/13 (100%) invasives lobuläres Ka. (ILC) 23/23 (100%) 9/9 (100%) inv. ductal-lobulär. Ka. (IDLC) 1/1 (100%)
Zusätzliche Analysen
1 . RT-PCR von IDC and ILC: 11 Fälle positive mit Ak sind auch mit RT-PCR positiv
2. Expression im Tumorstroma: Antikörper: in 35/61 Fällen, schwache Färbung In situ Hybridisierung: in 3/22 Fällen Beispiel 9
Neutralisierende Antikörper gegen TGFß verhindern invasives Wachstum menschlicher Tumorzellinien im Kollagengel
In Beispiel 8 konnte durch histochemische Untersuchungen an Schnitten durch Tumorgewebe ein Hinweis dafür erbracht werden, daß die am Modellsystem gewonnenen Vorstellungen über TGFß-induzierte EFC und nachfolgende autokrine Produktion von TGFß auch für viele menschliche Tumoren zutreffen. Um hierfür noch direktere Hinweise zu erhalten, wurde untersucht, ob menschliche Tumorzellen, die im Kollagengel invasiv wachsen, durch Applikation von TGFß-neutralisierenden Antikörpern zu nicht-invasiv wachsenden Zellen umgewandelt werden können. Es wurden die Nierenkarzinomzellinie MZ 1795 sowie die Nasopharyngeal-Karzinom- Linie KB verwendet. Die Zellen beider Linien wuchsen in 5% FCS enthaltenden Kollagengelen ohne TGFß-Antikörper bzw. nach Zugabe von TGFß zu Netzen und Strängen fibroblastoider Zellen aus (Fig. 13, rechte Tafeln). In Gegenwart von TGFß neutralisierenden Antikörpern (siehe Beispiel 5, Fig. 6) bildeten die Zellen dagegen kompakte Klumpen ohne jeden Hinweis auf invasives Wachstum (Fig.13, linke Tafeln).
Fig. 13 zeigt, daß TGFß neutralisierende Antikörper das invasive Wachstum menschlicher Tumorzellinien im Kollagen-Gel verhindern.
MZ 1795-Zellen und KB Zellen wurden in serumfreie Kollagengele eingesät, denen entweder 2% Serum oder 5 ng/ml TGFß zugesetzt wurde (+ TGFß, rechte Tafeln) oder denen eine Mischung verschiedener Antikörper gegen TGFß (- TGFß, linke Tafeln; siehe Beispiel 5, Fig. 6) beigemischt wurde. Nach 10 Tagen wurden Mikrofotografien der Zellen in den Kollagengelen angefertigt. Während sowohl die MZ 1795 Zellen (obere Tafeln, stärkere Vergrößerung, untere Tafeln; Übersichten, schwächere Vergrößerung) als auch die KB-Zellen (untere Tafeln) massiv in das Koliagengel einwachsen, wenn TGFß vorhanden ist (rechte Tafeln), bilden die gleichen Zellen in Gegenwart von TGFß- neutralisierenden Antikörpern kompakte Klumpen ohne auswachsende Zellen (linke Tafeln). Beispiel 10
Die Expression eines dominant-negativen TGFß-Rezeptors verhindert die EF-Konversion und verlangsamt das Tumorwachstum von Ras¬ transformierten Brustepithelzellen
Der direkteste Beweis des angenommenen Wirkmechanismus (proof of principle) für eine tumorprogressionshemmende Wirkung von TGFß- Rezeptor-Inhibitoren besteht darin, ihre Wirkung direkt im tumortragenden Tier nachzuweisen. Mit den in vitro verwendeten TGFß-neutralisiererenden Antikörpern war dies im Rahmen dieser Beispiele nicht möglich, weil die für solche in vivo Versuche benötigten großen Antikörpermengen nicht zur Verfügung standen. Es wurde daher ein alternativer Ansatz gewählt.
Es existiert eine "kinase-dead" Mutante des menschlichen TGFß Rezeptors Typ II (TßRII-dn), welche als dominant-negativer (d.h. die Funktion des Wildtyp-Rezeptors ausschaltender) Rezeptor wirkt. Eine cDNA dieses TßRII-dn wurde mit Hilfe retroviraler Vektoren in Ras-transformierten EpH4 Zellen (Ep-Ras) exprimiert. Die erhaltenen Klone wuchsen sehr langsam und benötigten Medium mit hohem (20%) Serumgehalt, um expandiert werden zu können. Nach Injektion in Nacktmäuse bildeten diese Zellen zu dem Zeitpunkt, an dem die mit Kontrollzellen (Ep-Ras) gespritzten Mäuse wegen zu großer Tumoren getötet werden mußten, entweder noch gar keine oder kleine Tumoren (Fig. 14, oben).
Aus dem am langsamsten wachsenden Ep-Ras-TßRII-dn Tumor sowie aus einem durch Ep-Ras Zellen induzierten Kontrolltumor wurden die Tumorzellen isoliert und in Kultur genommen (siehe Beispiel 1). Während die Zellen des Kontrolltumors die erwartete fibroblastoide Morphologie zeigten (Fig. 14 unten, linke Tafel), wiesen die aus dem langsam wachsendem Ep-Ras-TßRII-dn Tumor isolierten Zellen eine deutlich epitheloide Morphologie auf (Fig. 14 unten, rechte Tafel). Dies zeigt, daß die bei der Tumorbildung durch Ep-Ras-Zellen ablaufende EF-Konversion durch Expression von TßRII-dn gehemmt wird und daß dies zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums führt. Fig. 14 zeigt, daß TßRII-dn exprimierende, Ras-transformierte Brustepithelzellen (Ep-Ras-TßRII-dn) ein verlangsamtes Wachstum im Tier zeigen und daß die aus diesen Tumoren isolierten Zellen keine EF- Konversion durchgemacht haben.
Vier verschiedene Klone von Ep-Ras-TßRII-dn Zellen sowie ein Ep-Ras- Kontroll-Klon wurden subkutan in jeweils 3 Nacktmäuse injiziert (1x 106 Zellen pro Tier). Nach 3 Wochen wurden die Tumoren herausgeschnitten und gewogen. Das Diagramm im oberen Teil von Fig. 14 gibt die Mittelwerte der erhaltenen Tumorgewichte an. Von je einem Ep-Ras-TßRII- dn Tumor, erhalten von dem am langsamsten Tumore bildenden Ep-Ras- TßRII-dn Klon, und einem Ep-Ras Kontroll-Tumor wurden die Tumorzellen in Kultur genommen, in G418 selektioniert (siehe Beispiel 1) und nach 10 Tagen unter Phasenkontrast fotografiert. Die linke, untere Tafel zeigt die fibroblastoiden, aus dem Ep-Ras Tumor ausgewachsenen Zellen, während die rechte Tafel die epitheloiden, aus dem Ep-Ras-TßRII-dn Tumor ausgewachsenen Zellen zeigt.
Beispiel 11
Expression von TßRII-dn in fibroblastoiden, hoch metastasierenden Colonkarzinomzellen (CT26): Hemmung des invasiven Wachstums dieser Zellen in vitro, Verzögerung der Tumorbildung und Hemmung der Bildung von Lungenmetastasen in Mäusen
Nachdem gezeigt werden konnte, daß der dominant-negative TGFß- Rezeptor (TßRII-dn) sowohl die EF-Konversion von EpRas Zellen verhindern konnte als auch das Tumorwachstum dieser Zellen stark verlangsamte, war es von Interesse, die Wirksamkeit dieses TßRII-dn in Tumorzellen zu überprüfen, die bereits stabil eine EF-Konversion durchgemacht hatten und die bereits hoch metastatisch waren. Hierfür wurde die Maus-Colonkarzinomzellinie CT26 ausgewählt, ein etabliertes Mausmodell für Lungenmetastasenbildung aus einem Primärtumor (Brattain et al. 1980). Diese Zellen wurden mit einem TßRII-dn- exprimierenden Retrovirus infiziert (siehe Beispiel 10), TßRII-dn- exprimierende Klone selektioniert und verschiedene Klone einer in vitro und in vivo Analyse unterworfen.
Es wurden zwei Typen von TßRII-dn-exprimierenden CT-26-Klonen (CT26- TßRII-dn) erhalten. Der erste Typ zeigte auf Plastik eine angedeutet epitheliale, aber noch abnormale Morphologie und exprimierte geringe Mengen der epithehalen Marker E-Cadherin und ZO-1. Der zweite Klon- Typus bildete dagegen auf Plastik geordnete Rasen von Zellen mit epithelialer Morphologie, die sogar Hemicysten (Dome) ausbildeten. Wie erwartet, zeigte dieser zweite Typ von Klonen eine hohe, laterale Expression der epithehalen Marker E-Cadherin und ZO-1. Kontroll-CT26 Zellen, die mit einem Retrovirus ohne Insert infiziert waren, zeigten auf Plastik die erwartete fibroblastoide Morphologie und keinerlei Expression epithelialer Marker . Damit wurde gezeigt, daß TßRII-dn in der Lage ist, in vitro die fibroblastoiden CT26 Zellen in epitheliale Zellen umzuwandeln und somit eine FE-Konversion hervorzurufen.
Als nächstes wurden repräsentative CT26-TßRII-dn Klone beider Typen sowie CT26 Kontrollzellen in Kollagengele mit 5% FCS ausgesät. Fig. 16 zeigt, daß die Kontrollzellen zu den erwarteten riesigen Strängen und Netzen fibroblastoider Zellen auswachsen (Fig. 15, obere Bildhälfte, linke Tafeln). Im Gegensatz dazu bildeten die CT26-TßRII-dn Klone des Typs 1 kompakte Klumpen mit nur wenigen auswachsenden Einzelzellen aus (Fig. 15, obere Bildhälfte, mittlere Tafeln) während die CT26-TßRII-dn Klone des Typs 2 nur zu winzigen, kompakten Zellgruppen auswuchsen (Fig. 15, obere Bildhälfte, rechte Tafeln). Damit wurde gezeigt, daß TßRII-dn das invasive Wachstum von CT26-Zellen im Kollagengel verhindert .
Dann wurden die gleichen Zelltypen im Hühnerherz-tnvasionsassay getestet (siehe Beispiel 4, Fig. 5). Während Kontroll-CT26 Zellen wie erwartet in diesem Assay stark invasiv wuchsen (Fig. 16, untere Bildhälfte, linke Tafel), waren die CT26-TßRII-dn Klone des Typs 1 und 2 in diesem Test geringfügig oder gar nicht invasiv (Fig. 15, untere Bildhälfte, mittlere und rechte Tafel. ) Diese Versuche zeigen, daß TßRII-dn eine FE-Konversion von CT26 Zellen bewirkt und ihr invasives Wachstum in zwei Assay-Systemen vollständig hemmt. Es war deshalb als nächstes von Interesse, das Verhalten dieser Zellen im Tier zu überprüfen. Deshalb wurden CT26 Kontrollzellen sowie je 6 CT26-TßRII-dn-Klone der Typen 1 und 2 in Nacktmäuse injiziert. Während die Kontrolltiere nach 2-3 Wochen wegen zu großer Tumoren getötet werden mußten, war das Tumorwachstum in Mäusen mit CT26- TßRII-dn-Klone des Typs 1 um ca 3-4 Wochen verzögert, während es in Mäusen mit CT26-TßRII-dn-Klonen des Typs 2 um 6-10 Wochen verzögert oder während 24 Wochen (Versuchsende) völlig inhibiert war (3 Tiere, Daten nicht in der Fig. dargestellt). Diese Ergebnisse zeigen, daß TßRII-dn auch das Wachstum von CT26-Primärtumoren z.T drastisch verzögern konnte.
Als nächstes wurde die Fähigkeit der CT26-TßRII-dn-Zellen überprüft, aus einem Primärtumor in die Lunge abzusiedeln und dort Metastasen zu bilden. Wie Fig. 17 (Schema untere Bildhälfte) zeigt, wurden Mäuse mit CT26 Kontrollzellen (3 Mäuse) oder 7 verschiedenen CT26-TßRII-dn- Klonen (Typ 1 und Typ 2, 3 Mäuse pro Klon) injiziert und das Wachtum von tastbaren Tumoren abgewartet. Nach Erreichen eines bestimmten Tumorvolumens (4 cm3) wurde der Primärtumor so herausgeschnitten, daß keine Tumorzellen an der Injektionsstelle verblieben. Die so behandelten Mäuse wurden nach ihrem Tod auf Lungenmetastasen untersucht.
Alle CT26-Tumor-tragenden Kontrolltiere (3 Mäuse) starben nach 2-4 Wochen an Lungenmetastasen (Fig. 16, Diagramm obere Bildhälfte, gestrichelte Linie). Dagegen konnte bei keinem der mit CT26-TßRII-dn- Klonen injizierten Tiere selbst nach 18 Wochen die Bildung von Lungenmetastasen festgestellt werden (Fig. 16, Diagramm obere Bildhälfte, schwarze Linien). 5 Tiere, bei denen eine lokale Rekurrenz des Primärtumors auftrat, wurden nicht in die Auswertung einbezogen.
Diese Daten zeigen deutlich, daß TßRII-dn die Metastasierung von CT26- Primärtumoren vollständig hemmt. Als letztes wurde überprüft, welches Stadium der Metastasierung durch TßRII-dn gehemmt wird. Es ist möglich, daß nur das Auswandern der CT26-Zellen aus dem Primärtumor in die Gefäße gehemmt wird. Es könnte aber auch das Absiedeln der Zellen aus der Zirkulation in die Lunge betroffen sein. Letzteres ist wichtig, weil z.B. bei einer chirurgischen Entfernung eines Tumors im Menschen vermehrt Tumorzellen in die Zirkulation gelangen könnten. Um dies zu testen, wurden verschiedene Mengen von CT26 Kontrollzellen und mehrerer CT26-TßRII-dn Klone des Typs 2 intravenös in Mäuse injiziert (3 Tiere pro Zelltyp). Die Tiere wurden dann nach Eintreten des Todes auf Lungenmetastasen untersucht. In Vorversuchen war festgestellt worden, daß bereits 500 CT26 Zellen pro Tier ausreichen, um auf diesem Wege Lungenmetastasen zu bilden. Es wurden deshalb die 10- und 100 fache Menge beider Zelltypen injiziert. Fig. 17 zeigt, daß die CT26 Kontroll-Zellen nach 14 (50.000 Zellen) und 28 Tagen (5.000 Zellen) in allen Tieren Lungenmetastasen ausgebildet hatten. Dagegen waren auch nach 40 Tagen alle mit CT26-TßRII-dn Klonen injizierten Tiere am Leben und hatten noch keine Lungenmetastasen ausgebildet, wie an einzelnen, zu diesem Zeitpunkt getöteten Mäusen bestätigt wurde. Somit kann TßRII-dn auch das Absiedeln von bereits in der Zirkulation befindlichen CT26 Zellen in die Lunge verhindern.
Fig. 15 zeigt, daß TßRII-dn sowohl das invasive Auswachsen von CT26 Zellen im Kollagengel hemmt, als auch die Invasivität der gleichen Zellen im Hühnerherz-Invasivitätstest unterdrückt.
Für den ersten Test (Kollagengel Assay, obere Bildhälfte) wurden CT26 Kontrollzellen (CT26, linke Tafeln) und je ein CT26-TßRII-dn Klon des Typs I (mittlere Tafeln) und Typs 2 (rechte Tafeln) in Kollagengele mit 5% Serum eingesät und nach 10 Tagen Mikrofotografien der Kollagengele angefertigt. Die Gele wurden bei zwei verschiedenen Vergrößerungen aufgenommen (schwächere Vergrößerung, obere Tafeln, stärkere Vergrößerung, untere Tafeln). Während die CT26 Kontrollzellen zu großen netz- und strangartigen Gebilden, bestehend aus spindelförmigen, fibroblastoiden Zellen auswuchsen (linke Tafeln), bildeten die CT26-TßRII-dn Typ 1 Zellen kompakte Zellklumpen mit sehr wenigen, ins Gel auswachsenden Zellen (mittlere Tafeln). Die CT26-TßRII-dn KLone des Typs 2 bilden nur winzige kompakte Zellgruppen ohne jede Fähigkeit aus, ins Kollagengel einzuwachsen (rechte Tafeln).
Für den Hühnerherz-Invasionsassay (untere Bildhälfte) wurden die Testzellen mit einem fluoreszierenden Vitalfarbstoff beladen, in Kontakt mit Hühnerherzfragmenten gebracht und nach 7 Tagen histologisch untersucht (siehe Methoden und Beispiel 4). Die Kontrollzellen wanderten effizient in das Hühnerherzfragment ein (linke Tafel, helle Zellgruppen und Stränge jenseits der durch eine gestrichelte Linie angedeuteten Grenze zwischen Testzellen und Hühnerherzfragment, mit H markiert). Im Gegensatz dazu wanderten Typ 1 Klone nur geringfügig in das Hühnerherzgewebe ein (mittlere Tafel, siehe wenige helle Zellen im mit H markierten Bereich), während die CT26-TßRII-dn Zellen des Typs 2 überhaupt nicht invasiv wuchsen (alle hellen Zellen blieben außerhalb des Hühnerherzfragmentes H (gestrichelte Linie).
Fig. 16 zeigt, daß die Expression von TßRII-dn in CT26-Zellen deren Fähigkeit blockiert, aus einem Primärtumor heraus Lungenmetastasen zu bilden.
Der Ablauf des Experiments ist in der unteren Bildhälfte schematisch dargestellt. Es wurden 7 verschiedene CT26-TßRII-dn Klone (Typ 1 und 2, CT26+TßRII-dn) sowie CT26 Kontrollzellen in den Test eingesetzt. Syngene Balb-C Mäuse (3 pro Zelltyp) wurden mit je 1x106 Zellen pro Tier injiziert und das Auswachsen von Tumoren abgewartet. Nach Erreichen einer Größe der Primärtumoren von 4 cm3 wurden diese operativ entfernt und die Mäuse nach Absterben auf Lungenmetastasen untersucht. Die Ergebnisse sind im Diagramm (obere Bildhälfte) dargestellt. Während die 3 Kontrolltiere innerhalb von 4 Wochen an Lungenmetastasen starben (gestrichelte Linie), waren alle mit CT26-TßRII-dn -Zellen behandelten Tiere nach 18 Monaten noch am Leben und frei von Lungenmetastasen (schwarze Linien). Im Falle der nach 14 Wochen endenden Linie (oberes Diagramm) erreichte der Primärtumor erst so spät die kritische Größe, daß bis Versuchsende noch keine 18 Wochen vergangen waren. Abb. 18 zeigt, daß TßRII-dn in CT26 Zellen auch deren Fähigkeit hemmt, aus der Blutzirkulation in die Lunge abzusiedeln und dort Metastasen zu bilden.
Das Schema im oberen Bildteil zeigt den Ablauf des Versuches. Syngene Balb-C Mäuse (3 pro Zelltyp und Zellmenge) wurden mit CT26 Kontrollzellen und mehreren CT26-TßRII-dn Klonen intravenös (Schwanzvene injiziert). Die Abbildung zeigt, daß alle drei mit 5.000 bzw. 50.000 Kontrollzellen (CT26) behandelten Mäuse nach 28 bzw 14 Tagen an Lungenmetastasen gestorben waren (+), während alle mit CT26-TßRII- dn Klonen injizierten Tiere nach 40 Tagen noch am Leben und frei von Lungenmetastasen waren (-).
Beispiel 12
Der aktivierte TGFß-Rezeptor aktiviert die transiente Transkription eines PAI-1- Promotor-Reportergen Konstrukts, ein Vorgang der durch TßRII-dn inhibiert wird
Im Hinblick auf das Auffinden von TGFß-(Rezeptor)-lnhibitoren mittels zellulärem Assay in einem High Throughput Screening (HTS) Verfahren wird eine Testzelle wie folgt hergestellt: In einer geeigneten Zelle (Ep-Ras oder CT26) wird ein PAI-1-Promotor-Reportergen-Konstrukt stabil exprimiert. Gleichzeitig wird in dieser Zeile die zum Screening ausgewählte humane TGFß-Rezeptorkette (z.B.TßRIl) exprimiert. In Kontrollzellen wird dagegen neben dem PAI-1-Reporter-Konstrukt ein nicht verwandter Rezeptor exprimiert, der ebenfalls PAI-1 Transkription induziert, z.B. FGF- Rezeptoren).
Eine Voraussetzung für das Entwickeln einer solchen Testzellinie ist, daß die (durch den Inhibitor unterdrückte) TGFß-induzierte PAI-I Expression in transienten Transfekfionstests mit der Tumor- bzw. Metastasenbildung der entsprechenden Zellen korreliert ist. Um dies zu prüfen, wurden CT26 Kontroll-Zellen und 5 bereits in Mäusen ausgetestete CT26-TßRII-dn Klone (siehe Beispiel 11 , Fig. 16) mit dem 3TP-lux PAI-1-Reportergenkonstrukt (Wrana et al., 1992) transfiziert, mit TGFß stimuliert oder unbehandelt gelassen und auf PAI-1 Expression getestet (Messung der Luciferaseaktivität). Als positive und negative Kontrolle wurden eine konstitutiv aktive TGFßR-Kette (TßRI(T204D); Wrana et al. 1994) sowie TßRII-dn DNA zusammen mit dem PAI-1 Reporterkonstrukt in unbehandelte CT26 Zellen kotransfiziert. Fig. 18 zeigt, daß unbehandelte CT26 Zellen (CT26 Kontrolle) ohne TGFß-Behandlung eine Basalaktivität besitzen, die der der negativen Kontrolle (Kotransfektion von TßRII-dn) entspricht. In denselben Kontrollzellen aktiviert TGFß die Reportergen- Transkription auf Werte, die in der positiven Kontrolle durch Kotransfektion eines konstitutiv aktiven TGFß Rezeptors erreicht werden.
Verschiedene TßRII-dn exprimierende CT26 Klone verhielten sich in diesem Test unterschiedlich (Fig.18, CT26-TßRII-dn 1-5). In zwei Klonen (CT26-TßRII-dn 3 und 4) lag die nach TGFß-Stimulation erreichte Luciferaseaktivität unter oder bei den Werten, die in den negativen Kontrollen gefunden wurden, unabhängig davon, ob die Zellen vor der Injektion oder nach Isolierung aus dem sehr langsam wachsenden Tumor getestet wurden. In den drei restlichen Klonen (bei denen die induzierten Tumoren schneller wuchsen) war die Luciferaseaktivität nur vor der Injektion ins Tier auf dem Niveau der negativen Kontrollen, nach der Isolation aus dem Tumor wurden intermediäre oder sogar Aktivitäten wie in den positiven Kontrollen gefunden (Fig. 18). Es ist anzunehmen, daß in den letzteren Klonen eine Selektion auf Zellen erfolgte, in welchen die Expression von TßRII-dn herunterreguliert wurde. Diese Annahme konnte dadurch gestützt werden, daß erneute Selektion in Puromycin der Zellen aus dem Tumor wiederum viele Zellen abtötete und die überlebenden, Puromycin-resistenten Zellen keine erhöhte PAI-1 Transkription nach TGFß-Stimulierung mehr zeigten. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß die Tumor/Metastasenbildung im Tier mit der TGFß-Aktivierbarkeit eines PAI-1 Promotor-Reportergenkonstrukts klar korreliert.
Fig. 18 zeigt, daß die Expression von TßRII-dn in CT26-Zellen die TGFß- induzierte Transkription eines PAI-1 Promotor-Reportergenkonstrukts unterdrückt. CT26-Kontrollzellen (CT26 Kontrolle) und 5 Klone von CT26-TßRII-dn Zellen (CT26TßRII-dn 1-5) wurden mit einem PAI-1 Promotor- Reportergenkonstrukt (3TP-lux) transfiziert, die Zellen mit TGFß stimuliert (+ TGFß) oder unstimuliert gelassen (- TGFß) und die Luziferaseaktivität in Zellextrakten gemessen. Als positive Kontrolle wurden die cDNA eines konstitutiv aktiven TGFß-Rezeptors Kette 1 (TßRI(T204D; Wrana et al., 1994) sowie die TßRII-dn-cDNA zusammen mit 3TP-lux in die Zellen kotransfiziert. Diese Bestimmung wurde in Zellen vor Injektion ins Tier (vor Tumorinduktion) und nach Isolierung und Kultivierung der Tumorzellen für 3 Tage (isolierte Tumorzellen) durchgeführt (siehe Legende, Kasten oben rechts). Die Balken stellen die normierte Luziferaseaktiviät aus Extrakten gleichen Proteingehalts (siehe Methoden) dar.
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Claims

Patentansprüche
1. Arzneimittel, enthaltend als wirksame Verbindung eine Substanz, die die Wirkung von TGFß auf Tumorzellen epithehalen Ursprungs inhibiert, für die Behandlung von epithehalen, invasiven Tumorerkrankungen, die durch einen reversiblen Übergang der Zellen von einem epithehalen, nicht-invasiven in einen invasiven Zustand charakterisiert sind.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1 , enthaltend als weitere wirksame Verbindung eine Substanz, die die Expression oder die Funktion von onkogenem Ras, und/oder die Überexpression von normalem Ras und/oder die Aktivierung von normalem Ras durch Rezeptortyrosinkinasen in den Zellen inhibiert.
3. Arzneimittel nach Anspruch 2, enthaltend als Ras-Inhibitor eine Substanz, die die Aktivierung von Ras direkt inhibiert.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend als Ras-Inhibitor eine Substanz, die die Aktivierung von Ras indirekt inhibiert.
5. Arzneimittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Inhibitor einer Rezeptor-Tyrosinkinase ist.
6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Inhibitor des EGF-Rezeptors ist.
7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Behandlung von Tumorerkrankungen durch Rückführung bereits etablierter, invasiver Tumorzellen in einen nicht-invasiven, epitheloiden Zustand.
8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung von Mammatumoren.
9. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung von Nierenzellkarzinomen.
10. Verfahren zum Screenen von pharmakologisch wirksamen Substanzen für die Behandlung von epithehalen, invasiven Tumorerkrankungen, die durch einen reversiblen Übergang der Zellen von einem epithehalen, nicht-invasiven in einen invasiven Zustand charakterisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man Wirkung von Testsubstanzen auf den durch TGFß ausgelösten Signalübertragungsweg in der menschlichen Zelle bestimmt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugerzellen züchtet, die transformiert sind mit a) einem Plasmid, enthaltend ein Reportergen, das unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz eines von TGFß regulierten zellulären Proteins steht; b) einem Plasmid, das die für einen funktionellen humanen TGFß- Rezeptor kodierende Sequenz enthält; daß man den TGFß-Rezeptor Ligand-aktiviert, daß man Testsubstanzen auf die Zellen aufbringt und die durch die Testsubstanz bewirkte Modulation der Reportergenexpression mißt.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit dem TGFß-Rezeptor Typ II transformiert sind.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz des Plasminogen Activator Inhibitors steht.
14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkung von Testsubstanzen auf den durch TGFß ausgelösten Signalübertragungsweg in der menschlichen Zelle bestimmt, indem man die Modulation der Autophosphorylierung des TGFß-Rezeptors Typ II oder dessen zytoplasmatischer Domäne durch die Testsubstanz bestimmt.
15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkung von Testsubstanzen auf den durch TGFß ausgelösten Signalübertragungsweg in der menschlichen Zelle bestimmt, indem man die durch die Testsubstanz bewirkte Modulation der Fähigkeit des TGFß-Rezeptors Typ II, den TGFß-Rezeptor Typ I bzw. dessen GS-Domäne zu phosphorylieren, bestimmt.
PCT/EP1997/001699 1996-04-05 1997-04-04 Arzneimittel für die behandlung von tumorerkrankungen WO1997037678A1 (de)

Priority Applications (4)

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