EA023331B1

EA023331B1 - Композиции антител к vegfr-3

Info

Publication number: EA023331B1
Application number: EA201390117A
Authority: EA
Inventors: Бронислав Пытовски; Кришнадатт Персауд; Натали Зайек
Original assignee: Имклон Ллк
Priority date: 2010-09-07
Filing date: 2011-09-01
Publication date: 2016-05-31
Also published as: US8784818B2; ES2568801T3; AU2011299443A1; MX2013002718A; AU2011299443B2; UA109148C2; CA2809375A1; US20130280278A1; AR082641A1; GT201300058A; ZA201300804B; KR20130042601A; US8481034B2; US20120058126A1; WO2012033696A1; CA2809375C; CO6690754A2; BR112013005423A2; ECSP13012481A; PE20131328A1

Abstract

Изобретение предлагает моноклональные антитела к VEGFR-3, фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела, и применение указанных антител для лечения заболеваний.

Description

Изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с рецептором фактора роста эндотелия сосудов-3 (УЕОРК-3), в частности приведенным в данном описании аминокислотным и нуклеотидным последовательностям антител к УЕОРК-3, фармацевтическим композициям и применению указанных антител в способах лечения заболеваний, опосредованных УЕОРК-3.

Специфические для эндотелиальных клеток факторы роста и рецепторы, как полагают, в первую очередь ответственны за стимуляцию роста эндотелиальных клеток, дифференциацию, а также некоторые клеточные функции. Одним из широко изученных семейств факторов роста является семейство Факторов Роста Эндотелия Сосудов (УЕОРк).

УЕОРК-3 - это единственный тирозин-киназный рецептор (ТКР), экспрессия которого в нормальных зрелых тканях ограничивается эндотелием лимфатических сосудов. Образовавшиеся УЕОР-С и УЕОР-И специфически связываются с УЕОРК-3. Протеолитическое расщепление Ν- и С-концевых участков этих белков приводит к высвобождению зрелых УЕОР-С^д_С и УЕОР-Экоторые приобретают увеличенное сродство к УЕОРК-3. Эти лиганды активируют сигнальный путь УЕОРК-3 и инициируют лимфангиогенез (т.е. образование новых лимфатических сосудов из уже существующих лимфатических сосудов).

Характер экспрессии лигандов для УЕОРК-3 предполагает их участие не только в развитии и поддержании нормальной сосудистой системы, но и в опухолевом ангиогенезе и лимфангиогенезе. Кроме того, экспрессия УЕОРК-3 была обнаружена в кровеносных сосудах внутри опухоли. Таким образом, моноклональные антитела (МАТ), которые ингибируют связывание УЕОР-С и/или УЕОР-И с УЕОРК-3 могут быть эффективны в подавлении опухолевого ангиогенеза.

Кроме того, было показано, что блокирование деятельности УЕОРК-3 ингибирует связанный с УЕОР-С лимфангиогенез в опухоли. Для многих видов рака первым местом образования метастазов являются лимфатические узлы и, следовательно, блокирование УЕОРК-3 может быть эффективно для подавления метастазирования опухоли.

В работе Регкаий с1 а1, 1. Се11 8аеисе 777:2745-56 (2004), описаны определенные свойства моноклональных антител человека к УЕОРК-3, но не раскрыты последовательности ни этих антител, ни эпитопов, которые такие антитела могут связывать. Таким образом, сохраняется необходимость в высоко аффинных антителах к УЕОРК-3, которые связывают неизвестные эпитопы УЕОРК-3 и которые способны блокировать связывание лиганда и активацию рецептора. Также сохраняется потребность в антителах к УЕОРК-3, которые демонстрируют высокую противоопухолевую активность против различных типов опухолей, без значительных негативных побочных эффектов.

Изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают УЕОРК-3 человека, для которых:

a) эффективность связывания указанных антител с УЕОРК-3 человека уменьшается по меньшей мере на 90% при наличии точечной замены Рго-219 в УЕОРК-3 человека на Ьеи; и

b) эффективность связывания указанных антител с УЕОРК-3 человека уменьшается по меньшей мере на 50% при наличии точечной замены Уа1-175 в УЕОРК-3 человека на А1а.

Предпочтительно измерять уровень связывания между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и человеческим или мутантным УЕОРК-3 путем экспрессии растворимого внеклеточного домена человеческого или мутантного УЕОРК-3 слитого со щелочной фосфатазой, а затем определять количество связавшегося с антителом белка с помощью хемилюминесцентного анализа.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

В дополнение, изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем и, возможно, по меньшей мере одним другим терапевтическим ингредиентом.

Изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению для использования в качестве лекарственного средства.

Кроме того, изобретение предлагает антитела или антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению для использования в лечении или профилактике рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах.

Изобретение также предлагает способ лечения одного из следующих заболеваний: рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах у млекопитающих. Лечение включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела или антигенсвязывающей части антитела согласно настоящему изобретению.

Изобретение также относится к применению антитела или его антигенсвязывающей части для производства лекарственного средства для лечения какой-либо из перечисленных ниже опухолей: рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, почечно-клеточного рака, рака под- 1 023331 желудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах.

Изобретение также предлагает антитело или антигенсвязывающий участок антитела согласно настоящему изобретению в сочетании с одним из противоопухолевых агентов (цисплатин, 5-фторурацил, лейковорин, оксалиплатин и доцетаксел) для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от рака, выбранного из группы, состоящей из рака яичников, эритролейкемии, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного сочетания антитела или антигенсвязывающей части антитела согласно настоящему изобретению и другого противоопухолевого агента, выбранного из цисплатина, 5-фторурацила, лейковорина, оксалиплатина и доцетаксела.

Антитела согласно настоящему изобретению связывают второй иммуноглобулиноподобный (ИГподобный) домен УЕСРК-3 млекопитающих. Второй ИГ-подобный домен УЕСРК-3 человека отвечает остаткам 138-226 полноразмерного рецептора. См. Ращ5о1а е1. а1., Сапсег Кек. 52:5738-5743 (1992).

Термин второй ИГ-подобный домен УЕСРК-3 человеческого/мышиного/млекопитающего (и его разновидности) предназначен для обозначения естественных форм домена (например, выделенного из клетки, которая экспрессирует домен при нормальных условиях), а также рекомбинантных вариантов, например, кодируемых природных или искусственных точечных мутантов или делетированных вариантов.

Антитела согласно настоящему изобретению связывают эпитоп во втором ИГ-подобном домене УЕСРК-3 человека, в котором Р219 является главным компонентом эпитопа, VI75 - вспомогательный компонент эпитопа, а Ь221 -побочный компонент эпитопа. (нумерация этих остатков основана на полноразмерном УЕСРК-3 человека, как описано у Ращ5о1а е1. а1., выше, и базе данных ЕМВЬ, номер доступа X 68203.) Этот вывод основан на следующем наблюдении: введение мутаций У175А, или Р219Ь, или Ь221У (т.е. замены на остатки из ортологичного мышиного УЕСРК-3) в УЕСРК-3 человека полностью препятствует или значительно ослабляет связывание антитела согласно настоящему изобретению с мутантным УЕСРК-3 человека.

Более того, антитела согласно настоящему изобретению, которые связывают эпитоп УЕСРК-3 человека (в котором Р219 - главный компонент эпитопа, У175 - вспомогательный компонент эпитопа, а Ь221 - побочный компонент эпитопа) способны блокировать связывание лиганда УЕСР-С с УЕСРК-3 и, таким образом, нейтрализовать активацию рецептора. Соответственно, настоящее изобретение предлагает новый нейтрализующий эпитоп УЕСРК-3 человека, что позволяет получать новые нейтрализующие антитела к УЕСРК-3 человека, которые способны блокировать связывание УЕСР-С человека с рецептором. Таким образом, изобретение предлагает эпитоп УЕСРК-3 человека, в котором Р219 является главным компонентом эпитопа, У175 является вспомогательным компонентом эпитопа, а Ь221 является побочным компонентом эпитопа.

Изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающий участок, которые связывается с эпитопом УЕСРК-3 человека, содержащим аминокислотные остатки Р219 и У175. Предпочтительно изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающий участок, которые связываются с эпитопом УЕСРК-3 человека, содержащим аминокислоты Р219, У175 и Ь221. Такие эпитопы связываются антителами согласно настоящему изобретению (например, антителом 1) и, следовательно, изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые реагируют с тем же эпитопом УЕСРК-3 человека, как антитело, имеющее легкую цепь, представленную аминокислотной последовательностью 8ЕС ГО № 15, и тяжелую цепь, представленную аминокислотной последовательностью 8ЕС ГО № 16. Антитела, взаимодействующие с тем же эпитопом человеческого УЕСРК-3, как некоторые антитела согласно настоящему изобретению (например, антитело 1) будут конкурировать за связывание с УЕСРК-3 человека и, соответственно, изобретение также предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые конкурируют за связывание УЕСРК-3 человека с антителом, имеющим легкую цепь, представленную аминокислотной последовательностью 8ЕС ГО № 15, и тяжелую цепь, представленную аминокислотной последовательностью 8ЕС ГО № 16.

Предпочтительно, антитело согласно настоящему изобретению также связывается с мутантным мышиным УЕСРК-3, имеющим последовательность, представленную 8ЕС ГО № 20 (которая включает мутацию Ь219Р) и мутантным УЕСРК-3 мыши, имеющим последовательность, показанную в 8ЕС ГО № 21 (которая включает мутацию А175У), а связывание мутантного УЕСРК-3 мыши, имеющего последовательность, показанную в 8ЕС ГО № 20, превышает более чем в 50 раз связывание с мышиным УЕСРК-3 дикого типа (8ЕС ГО № 19), и связывание мутантного УЕСРК-3 мыши, имеющего последовательность, показанную в 8ЕС ГО № 21, превышает более чем в 10 раз связывание мышиного УЕСРК-3 дикого типа.

Предпочтительно измерять уровень связывания между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и мутантным УЕСРК-3 мыши или мышиного УЕСРК-3 дикого типа путем экспрессии растворимого внеклеточного домена мышиного УЕСРК-3 или УЕСРК-3 дикого типа, слитого со щелочной фосфатазой, а затем определять количество связавшегося с антителом белка с помощью хемилюминес- 2 023331 центного анализа.

Предпочтительно, антитела согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части имеют высокое сродство к УЕСРК-З человека. Например, антитела или их антигенсвязывающие части, которые имеют К, между 1х10^-9 и 5.6х100^-11 М для УЕСРК-З человека, при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса на биосенсоре В1АСОКЕ® 2000 при 20°С. Наиболее предпочтительно, чтобы антитела согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части имели Κ,ι между 1 х 10^-10 и 5.6х10^-11 М для УЕСРК-З человека, при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса на биосенсоре В1АСОКЕ® 2000 при 20°С.

Предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела к УЕСРК-З или их антигенсвязывающие части, которые подавляют связывание УЕСР-С человека с УЕСРК-З человека с 1С₅₀ между 2 и 1.З нМ.

Предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела к УЕСРК-З или их антигенсвязывающие части, которые подавляют стимулированный УЕСР-С митогенный ответ с 1С₅₀ между 10 и 5 нМ. Более предпочтительно, антитела или их антигенсвязывающий участок подавляет стимулированный УЕСР-Смитогенный ответ с 1С₅₀ между 8 и 5 нМ, наиболее предпочтительно между 6 и 5 нМ при анализе, описанном в примере 5.

Предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают УЕСРК-З человека и которые включают вариабельный участок легкой цепи (ЬСУК) и вариабельный участок тяжелой цепи (НСУК), где ЬСУК включает участки, определяющие комплементарность (СОК) ЬСОК1, ЬСОК2, и ЬСОКЗ, а НСУК включает СОК НСЭК1. НСГОК2 и НСЭКЗ. где ЬСОК1 представлен аминокислотной последовательностью 5>ЕО ГО № 1, ЬСОК2 представлен полипептидом с последовательностью 8ЕС ГО № 2, ЬСОКЗ представлен полипептидом с последовательностью 8ЕС ГО № З, НСГОК1 представлен полипептидом с последовательностью 8ЕС ГО № 6, НСГОК2 представлен полипептидом с последовательностью 8ЕС ГО № 7 и НС'ГОКЗ представлен полипептидом с последовательностью 8ЕС ГО № 8.

Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают УЕСРК-З человека, которые включают полипептид ЬСУК с последовательностью 5>ЕО ГО № 5 и полипептид НСУК с последовательностью 5>ЕО ГО № 10.

Наиболее предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают УЕСРК-З человека, и которые содержат легкую цепь, состоящую из полипептида с последовательность 8ЕС ГО № 15, и тяжелую цепь, состоящую из полипептида с последовательностью 5>ЕО ГО № 16.

Еще более предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает антитела или их антигенсвязывающие части, которые связывают УЕСРК-З человека, которые включают две легких цепи, состоящих из полипептида 8ЕС ГО № 15, и две тяжелых цепи, состоящих из полипептида с последовательностью 8ЕС ГО № 16.

Предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые конкурируют с антителами согласно настоящему изобретению за связывание УЕСРК-З человека.

Предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые являются антителами человека.

Предпочтительно, настоящее изобретение предлагает антитела или их антигенсвязывающие части, которые являются сконструированными человеческими антителами.

Определения

Термин антитело, используемый в данном описании, предназначен для обозначения моноклональных антител, которые могут быть полностью человеческими антителами или сконструированными человеческими антителами, а также фрагментами расщепления, отдельными частями или их вариантами, в том числе антителами-миметиками, частями антител, которые имитируют структуру и/или функции антитела или специфическими фрагментами или их частями, в том числе одноцепочечными антителами и их фрагментами, которые сохраняют способность связываться со вторым ИГ-подобным доменом УЕСРК-З человека. Например, фрагменты антител, способные специфически связываться со вторым ИГ подобным доменом УЕСРК-З человека, включенные в настоящее изобретение, включают фрагменты РаЬ (например, после гидролиза папаином), фрагмент РасЬ (например, после расщепления плазмином), Р(аЬ')₂-фрагменты (например, после расщепления пепсином) и стабилизированные дисульфидными связями вариабельные фрагменты (б§Ру) или вариабельные фрагменты одной цепи (§сРу), созданные с помощью способов молекулярной биологии. Фрагменты антител также включены в этот термин, например, антитела с удаленным доменом, диатела и тритела, которые сохраняют способность связываться со вторым ИГ-подобным доменом УЕСРК-З человека.

Антитела представляют собой молекулу иммуноглобулина, включающую четыре пептидных цепи, две тяжелых цепи (Н) и две легких цепи (Ь), связанных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (сокращен в данном описании как НСУК) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из З доменов: СН1, СН2

- З 023331 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (сокращен в данном описании как ЬСУК) и константный участок легкой цепи. Легкая цепь антител любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко определенных типов, называющихся каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности их константных доменов. Используемое в данном описании выражение ЬСУК. относится как к вариабельной части легкой цепи типа каппа (Ук). так и к вариабельной части легкой цепи типа лямбда (νλ). Константный участок легкой цепи состоит из одного домена. СЬ. Участки НСУК и ЬСУК включают гипервариабельные участки. называемые участками. определяющими комплементарность (СИК). рассеянные внутри более консервативных участков. называемых каркасными участками (РК). Каждый НСУК и ЬСУК состоит из трех СИК и четырех РК. расположенных от Ν-конца к С-концу в следующем порядке: РК1-СПК1-РК2-СПК2-РК3-СПК3-РК4. В соответствии с целями настоящего изобретения СИК ЬСУК сокращены как ЬСИЮ. ЕСИК2 и ЬСИКЗ. а СИК НСУК сокращены как НСИК1. НСИК2 и НСИКЗ.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей. антитела могут быть отнесены к различным классам. Есть пять основных классов интактных антител: 1дА. 1§ϋ. 1дЕ. 1дС. и 1дМ. Некоторые из них могут быть разделены на подклассы (изотипы). например 1дС1. 1дС2. 1дС3. 1дС4. 1дА. и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи. которые соответствуют различным классам антител. называются альфа (а). дельта (Δ). эпсилон (ε). гамма (γ). и мю (μ) соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные структуры различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Настоящее изобретение относится к антителам. которые относятся к любому из вышеупомянутых классов или подклассов (изотипов).

Используемый в данном описании термин моноклональное антитело относится к антителу. полученному из популяции практически гомогенных антител. например. отдельные антитела. составляющие популяцию. являются. по существу. идентичными. за исключением возможных природных мутаций или присутствия незначительных посттрансляционных модификаций. Моноклональные антитела являются очень специфичными. и направлены против одного антигенного сайта (также называемого детерминантой или эпитопом). который. как указано в данном описании. содержится во втором ИГ-подобном домене УЕСРК-3 млекопитающих. Кроме того. в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител. которые обычно включают различные антитела. направленные против различных детерминант. каждое моноклональное антитело направлено против одной антигенной детерминанты. Термин моноклональное указывает на характер антитела. в смысле получения из практически гомогенной популяции антител. и не должно толковаться как требующие получения антитела каким-либо конкретным способом.

Используемый в данном описании термин антитело человека относится к антителам. последовательность которых в вариабельных и константных областях соответствует последовательности иммуноглобулина в клетках зародышевой линии человека (как описано в КаЬа1 с1 а1.. (1991) Зедиеиеек о£ РгсИейъ о£ 1ттипо1ощса1 [ШегеЫ. 5ΐΗ Εάίίίοη. И.8. ИерайтеШ о£ НеаИЪ апб Нитап Зегуюех. №Н РиЬИсаИоп Νο. 91-3242). Термин антитело человека. используемый в данном описании. не обозначает антитела. в которых последовательности СЭР. полученные из клеток зародышевой линии других видов млекопитающих. таких как мышь. соединены с каркасными участками антител человека.

Изменения в аминокислотной последовательности антитела 1. описанные в данном описании. включены в объем настоящего изобретения. в частности. в связи с повышением аффинности связывания и/или других биологических свойств антител. В этом контексте термин сконструированное антитело человека. используемый в данном описании. относится к дополнительным антителам. которые имеют аналогичные функциональные свойства с антителом 1 (например. способность к связыванию эпитопа человеческого УЕСРК-3. содержащего Р219 и У175) и которые имеют почти или полностью человеческие каркасные участки. которые окружают человеческие СИК. которые получены из антитела 1. Почти каркасными участками антител человека в контексте настоящего изобретения являются те. которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательности каркасных участков антитела 1. Предпочтительно. чтобы такие почти каркасные участки антител человека имели по меньшей мере около 85. около 90. около 95 или около 99% идентичности с последовательностью каркасных участков антитела 1. Последовательности каркасных участков антител клеток зародышевой линии человека описаны в \УО 2007/044411. Например. каркасный участок легкой цепи клеток зародышевой линии может быть выбран из группы. состоящей из А11. А17. А18. А19. А20. А27. А30. Ь1. Ьй. Ь12. Ь2. Ь5. Ь15. Ьб. Ь8. О12. О2. и О8 и каркасный участок тяжелой цепи клеток зародышевой линии может быть выбран из группы. состоящей из УН2-5. УН2-26. УН2-70. УН3-20. УН3-72. ДМС-46. УН3-9. УН3-бб. УН3-74. УН4-31. УН 1-18. УН Я-б9. УН3-11. УН3-15. УН3-21. УН3-23. УН3-30. УН3-48. УН4-39. УН4-59. и УН5-51.

Генетически модифицированные человеческие антитела. полученные из антитела 1. могут включать делецию. и/или вставку. и/или замену аминокислотных остатков в последовательности антитела 1. Тем не менее. конечная конструкция должна сохранять желаемые функциональные характеристики антитела 1 (например. способность связывать эпитоп УЕСРК-3 человека. содержащий Р219 и У175).

Сконструированные антитела человека. имеющие сходные функциональные характеристики с антителом 1. могут быть созданы с помощью нескольких различных подходов. каждый подход начинается

- 4 023331 с антитела 1 (т.е. антитела, имеющего последовательности ЬСУР и НСУР, показанные в 8ЕЦ ГО № 5 и 8ЕЦ ГО № 10 соответственно) в качестве шаблона или родительского антитела для изготовления дополнительных антител. В первом подходе, СОК антитела 1 соединяют с различными каркасными участками антител человека, которые в значительной степени идентичны последовательности каркасных участков антитела 1. Совпадение последовательности новых каркасных участков должно составлять не менее 80, не менее 85, не менее 90, не менее 95 или не менее 99% с соответствующими каркасными участками антитела 1. Это соединение может привести к снижению аффинности связывания антител по сравнению с антителом 1. Если это произошло, то в каркасные участки можно ввести мутации, приводящие к восстановлению последовательности каркасных участков антитела 1 в отдельных позициях. Позиции для введения мутаций выбирают на основе определенных критериев, опубликованных в работе Сисе η с1 а1., Ргос. Ν;·ιΟ. Асай. 8с1. И8А 88, 2869 (1991). Идентификация остатков, которые необходимо заменить, может быть осуществлена следующим образом: если аминокислота попадает под одну из следующих категорий, аминокислотный остаток каркасного участка человеческого антитела эмбрионального типа, который используется (акцепторный каркасный участок) заменяется аминокислотным остатком из каркасного участка антитела 1 (донорный каркасный участок):

(a) аминокислота в каркасном участке акцепторного каркасного участка необычна для каркасного участка антитела человека в этой позиции, в то время как соответствующая аминокислота в антителе 1 является типичной для каркасного участка антитела человека в этой позиции;

(b) аминокислота находится в положении, непосредственно примыкающем к одному из СЭР. или (c) любой атом радикалов аминокислот, составляющих каркасный участок, находится на расстоянии около 5-6 ангстрем (от центра до центра) от любого атома аминокислотных остатков, составляющих СЭР, в трехмерной модели иммуноглобулина.

Если и аминокислотный остаток акцепторного каркасного участка, и соответствующий аминокислотный остаток каркасного участка антитела 1 являются необычными для каркасного участка человеческих антител эмбрионального типа, такие аминокислотные остатки могут быть заменены на аминокислотные остатки типичные для каркасного участка человеческих антител в этой позиции. Эти возвратные мутации позволяют восстановить у антитела активность антитела 1.

Во втором подходе сконструированные антитела человека, полученные из антитела 1, которые сохраняют функциональные характеристики антитела 1, (например, способность к связыванию эпитопа УЕСРР-3 человека, содержащего Р219 и У175), могут быть получены путем внесения мутаций в СЭР антитела 1 (случайных или направленных, чтобы избежать вырожденности аминокислотного кода) при сохранении каркасных участков антитела 1. Предпочтительно, мутации (делеции, вставки и/или замены) в аминокислотных последовательностях СЭР сконструированных антител человека, полученных из антитела 1, ограничить максимум тремя мутациями, более предпочтительно двумя мутациями или наиболее предпочтительно одной мутацией в последовательности СЭР сконструированных антител человека по сравнению с последовательностями СЭР антитела 1. Если присутствует более чем одна мутация, мутации могут быть распределены между последовательностями СЭР различными способами. Например, все мутации могут находиться в последовательности одного СЭР (например, ЬСЭР1), мутации могут находиться в последовательностях разных СЭР или две мутации могут находиться в последовательности одного СЭР, а третья мутация - в другой последовательности СЭР. Это приводит к созданию комбинаторной библиотеки сконструированных антител человека, в которой последовательности СЭР мутированы в одной или нескольких позициях, как описано выше, но сохранены каркасные участки антитела 1. Библиотека может быть исследована с целью обнаружения дополнительных вариантов антител, которые имеют аналогичные или улучшенные функциональные характеристики по сравнению с антителом 1.

Еще одним подходом для создания сконструированных антител человека, полученных из антитела 1 (которые сохраняют функциональные характеристики антитела 1, например способность связывать эпитоп УЕСРР-3 человека, содержащий Р219 и У175) является сочетание двух подходов, описанных выше, т.е. внесение изменений как в каркасные участки, так и в СЭР. Иными словами, после соединения СЭР антитела 1 с различными каркасными участками, отдельные аминокислотные остатки каркасных участков антител можно подвергнуть обратному мутированию, в дополнение к внесению изменений в СЭР. Основной принцип этой методики описан в работе \Уи е! а1. (1999), 1. Мо1. Βίο1. 294: 151-162.

Аминокислотные замены также могут изменить посттрансляционные модификации сконструированных антител человека, например изменить количество или положение сайтов гликозилирования.

Варианты антител с заменами могут быть получены путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков гипервариабельных участков антитела 1. Один из таких способов создания вариантов антител с заменами - это способ созревания аффинности с использованием фагового дисплея. Несколько фрагментов гипервариабельного участка (например, 6-7 фрагментов) мутируют для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом фрагменте. Варианты антител, полученных таким образом, экспонируются в моновалетной форме на нитевидных частицах фага, слитые с продуктом гена III фага М13, упакованного в каждой частице. Экспонированные фагом варианты антител затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в данном описании.

- 5 023331

Описанные в данном документе способы могут быть использованы для скрининга сконструированных антител человека, полученных из антитела 1, для выявления антител, имеющих в искусственных и естественных условиях функции, описанные в данном документе.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть изолированными антителами. Изолированное антитело практически не содержит других клеточных материалов и/или химических веществ.

Используемый в данном описании термин эпитоп относится к конкретному молекулярному участку на поверхности антигена, способному вызывать иммунный ответ и связывать специфические антитела, образованные в результате такого ответа. Эпитоп может быть линейным (т.е. состоять из смежных аминокислотных остатков, каждый из которых находится в одном коротком отрезке последовательности), или конформационным (т.е. состоящим из аминокислотных остатков, которые находятся в разных частях линейной последовательности антигена, но которые располагаются рядом и формируют сайт связывания антитела в результате образования антигеном его нормальной вторичной и третичной структуры). Как правило, эпитоп состоит из небольшого числа (например, от 2 до 5) ключевых аминокислотных остатков, и изменение этих остатков (например, замены на другой аминокислотный остаток) приводит к значительному снижению или даже полному нарушению связывания между антигеном и эпитопом.

Антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, которые конкурируют с молекулами, описанными в данном документе, являются такие, которые связывают УЕОРК-З человека в участке (участках), который идентичен или перекрывается с тем, который связывают молекулы согласно настоящему изобретению. Конкурентные сконструированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть определены, например, с помощью конкурентного анализа антител. Например, образец очищенного или частично очищенного УЕОРК-З человека иммобилизуют на твердой подложке. Затем добавляют антитело согласно настоящему изобретению и тестируемые моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, причем либо тестируемые антитела, либо антитела согласно настоящему изобретению помечены. Если меченые антитела и немеченые антитела связывают разные и неперекрывающиеся участки на УЕОРК-З, меченые антитела будут связываться на том же уровне, вне зависимости от присутствия других антител. Однако если участки взаимодействия являются одинаковыми или перекрываются, немеченые антитела будут конкурировать за связывание, и количество меченых антител, связанных с антигеном, будет снижено. Если немеченые антитела взяты в избытке, меченые антитела не будут связываться. Применительно к настоящему изобретению, конкурирующими сконструированными антителами человека или антигенсвязывающими фрагментами являются те, которые уменьшают связывание антител согласно настоящему изобретению примерно на 50, около 60, около 70, около 80, около 85, около 90, около 95 или около 99%. Подробная информация о процедурах проведения такого конкурентного анализа антител широко известна специалисту в данной области и может быть найдена, например, в Наг1оте аиб Ьапе (1988) АпйЪоЛез, А ЬаЪога1огу Мапиа1, Со1б Брппд НагЬог ЬаЪога1огу Ргезз, Со1б Брппд НагЬог, Ыете Уогк, радез 567-569, ΙδΒΝ 0-87969-314-2. Такие анализы могут быть выполнены количественно с помощью очищенных антител. Стандартной кривую получают путем титрования одного антитела против самого себя, т. е. те же антитела используются как меченые и как конкурентные. Затем определяют для немеченых конкурирующих моноклональных антител или антигенсвязывающих фрагментов емкость ингибирования связывания меченой молекулы к антигену. Результаты наносят на график и концентрации, необходимые для достижения желаемой степени подавления связывания, сравниваются.

УЕОРК-З человека существует в двух формах, которые образуются на основе транскриптов мРНК различной длины. Более длинный транскрипт кодирует белок, содержащий 65 дополнительных аминокислотных остатков на С-конце, по сравнению с белком, закодированном в коротком транскрипте, более длинный белок является основной формой, встречающейся в тканях. Два варианта белка идентичны в своих Ν-концевых внеклеточных доменах. Термин УЕОРК-З человека, если не указано иное, относится к обоим вариантам УЕОРК-З дикого типа (т.е. БЕЦ ГО № 17 и БЕЦ ГО № 18), которые получены из альтернативных транскриптов мРНК.

Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательностей ЬСУК антитела 1 приведены в БЕЦ ГО №4 и № 5 соответственно.

Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности НСУК антитела 1 приведены в БЕЦ ГО №9 и № 10 соответственно.

Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности легкой цепи антитела 1 приведены в БЕЦ ГО № 11 и № 12 соответственно. Аминокислотные остатки 1-19 в БЕЦ ГО № 12 представляют собой секреторную последовательность, которая удобна для экспрессии и выделения легкой цепи из различных клеточных линий млекопитающих, но которая не присутствуют в зрелых антителах. Аминокислотная последовательность легкой цепи зрелого антитела 1 приведена в БЕЦ ГО № 15.

Нуклеиновые кислоты и соответствующие аминокислотные последовательности тяжелой цепи антитела 1 приведены в БЕЦ ГО № 1З и № 14 соответственно. Как и в случае последовательности легкой цепи, аминокислотные остатки 1-19 в БЕЦ ГО № 14 представляют собой секреторную последовательность, которая удобна для экспрессии и выделения тяжелой цепи из различных клеточных линий млекопитающих, но которая не присутствует в зрелых антителах. Аминокислотная последовательность тяже- 6 023331 лой цепи зрелого антитела 1 приведена в БЕЦ ГО № 16.

Специфичность антител может быть определена на основе аффинности и/или авидности. Аффинность, выраженная в виде константы равновесия для реакции диссоциации комплекса антигена с антителом (К₄), измеряет прочность связывания между антигенной детерминантой и связывающим антитело участком. Авидность является мерой силы связывания антитела со своим антигеном. Авидность связана как с аффинностью эпитопа к антигенсвязывающей части антитела, так и с валентностью антител, которая определяется количеством антигенсвязывающих сайтов для конкретного эпитопа. Чем меньше значение Ка, тем сильнее сила связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим участком антитела.

Настоящее изобретение также предлагает полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1 - БЕЦ ГО № 13), или полинуклеотиды, которые содержат любой из участков УН или их части, или любой из СОК УН, включая любые их варианты, антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1). Настоящее изобретение также предлагает полинуклеотид, который кодирует легкую цепь антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1 - БЕЦ ГО № 11), или полину клеотиды, которые содержат любой из участков УЬ или их части, или любой из СОК УН, включая любые их варианты, антитела согласно настоящему изобретению (например, антитела 1).

Изобретение также включает экспрессионные векторы, содержащие любой из полинуклеотидов, описанных в данном документе. Примерами векторов являются плазмиды, фагмиды, космиды, нуклеиновые кислоты вирусов и фагов или другие молекулы нуклеиновых кислот, которые способны к репликации в прокариотических или эукариотических хозяевах, таких как клетки, например клетки млекопитающих. Типичные экспрессионные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициаторные последовательности, и промоторы, используемые для регуляции экспрессии молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Векторы также могут содержать генетическую экспрессионную кассету, содержащую независимую последовательность терминатора, последовательности, обеспечивающие репликацию вектора в эукариотах и прокариотах, т.е. бифункциональные векторы, а также селективные маркеры для прокариотических и эукариотических систем. Векторы обычно содержат маркер, чтобы обеспечить фенотипический признак для селекции трансформированных хозяев, такой как устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин или неомицин.

Подходящие промоторы включают конститутивные промоторы и индуцируемые промоторы. Типичными представителями регуляторных последовательностей/промоторов являются 1ас система, 1тр система, 1ас система, 1тс система, операторные и промоторные участки фага лямбда, регуляторный участок гена белка оболочки 16, гликолитические промоторы дрожжей, например промотор 3фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например Рйо5, промоторы дрожжевого альфа-фактора спаривания, промоторы, полученные из цитомегаловируса человека, промоторы металлотионинов, промотор вируса рака молочной железы мышей, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина и промоторы, полученные из вируса полиомы, аденовирусов, ретровирусов и БУ, например ранние и поздние промоторы БУ40.

Изобретение также включает хозяев, отличных от людей, таких как клетки, содержащие полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению. Под хозяином понимается отличный от человека многоклеточный организм или клетка-хозяин, которая является клеткой или популяцией клеток, в которые введены полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может быть эукариотической клеткой или клеточной линией, например клеткой или линией клеток растения, животного, позвоночного, млекопитающего, грызуна, мыши, примата, или клеткой или клеточной линией человека. Подходящие эукариотические клетки включают дрожжи и другие грибы, клетки насекомых, клетки растений, клетки человека и клетки животных, включая клетки млекопитающих, такие как линии гибридом, СОБ клетки, клетки ЫБ0 и клетки СНО. Под популяцией клеток-хозяев понимают группу культивируемых клеток, в которые может быть введен и экспрессирован полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению. Имеются в виду любые клеткихозяева, которые могут поддерживать экспрессию полинуклеотида или вектора согласно настоящему изобретению.

Хозяином для согласно настоящему изобретению также может быть прокариотический организм. Подходящие прокариотические хозяева включают, например, Е. сой, такие как Е. сой БО-936, Е. сой НВ 101, Е. сой ^3110, Е. сой Х1776, Е. сой Х2282, Е. сой ΏΗΙ, и Е. сой МКС1, Ркеиботопак, ВасШик, такие как ВасШик киЫШк и Б1тер1отусек.

Изобретение также включает способы получения антител согласно настоящему изобретению, которые влекут за собой культивирование клеток-хозяев, экспрессирующих один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению, и выделение антител из среды для культивирования.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения человека. Антитела могут быть введены различными путями. Наиболее предпочтительными являются фармацевтические композиции, содержащие антитела согласно настоящему изобре- 7 023331 тению, для парентерального введения. Такие фармацевтические композиции могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области (см., например, К.ештд1оп: ТЬе 8с1епсе апй Ртасйсе оГ РЬагтасу, 19^Л ей. (1995), А. Сеппато е1 а1., Маск РиЪйвЫпд Со.) и включают описанные в данном документе антитела и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

Используемый в данном описании термин подавлять или нейтрализовать в отношении биологической активности антитела согласно настоящему изобретению означает возможность существенно противостоять, нарушать, предотвращать, ограничивать, замедлять, разрушать, уничтожать, останавливать, сокращать или отменять биологическую активность УЕСРК-3 человека, в том числе, но не ограничиваясь, биологическую активность УЕСРК-3 человека, измеренную в примере 4 или 5 настоящей статьи.

Используемый в данном описании термин лечить и лечение относится к терапевтическому лечению, целью которого является предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательные физиологические изменения, связанные с заболеванием или расстройством. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают облегчение симптомов, уменьшение степени выраженности заболевания или расстройства, стабилизации заболевания или расстройства (т.е. когда заболевание или расстройство не ухудшается), задержку или замедление прогрессирования заболевания или расстройства, улучшение или временное улучшение заболевания или нарушения и ремиссию (частичную или полную) заболевания или расстройства, детектируемую или не детектируемую. Лечение может также означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемым выживанием при отсутствии лечения. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет заболевание или расстройство, а также лиц, склонных к возникновению заболевания или расстройства.

Композиции согласно настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество антитела согласно настоящему изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективные количества антитела могут варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия болезни, возраст, пол и вес человека, и способности антитела или части антитела вызвать желаемую реакцию в человеке. Терапевтически эффективное количество является также таким, в котором любые токсичные или вредные эффекты участков антител или антител перевешиваются благоприятными терапевтически эффектами.

Терапия может быть первой линии, т.е. первичной терапией для пациентов, которые ранее не получали противоракового лечения, как отдельно, так и в комбинации с другими способами лечения, или второй линии, для лечения пациентов, которые уже прошли курс противоракового лечения, как отдельно, так и в комбинации с другими способами лечения, или третьей линии, четвертой линии и др., как отдельно, так и в комбинации с другими способами лечения.

Терапия также может быть назначена пациентам, которые уже прошли, возможно, частично успешные курсы лечения, но которые плохо переносили данное лечение. Терапия также может быть адъювантной, т. е. предотвращающей повторное появления рака у пациентов, у которых в данное время не обнаруживается заболевания или после хирургического удаления опухоли.

Рак, который можно лечить с использованием изобретения, включает первичные и вторичные опухоли или метастазирующие опухоли, метастазы которых распространяются по лимфатической системе (в том числе метастазы из легких, молочной железы или простаты).

Рак, который можно лечить, включает опухоли, которые не являются васкуляризированными или еще не существенно васкуляризированы, а также васкуляризированные опухоли. Рак может быть представлен не-солидными опухолями (такими как лейкозы и лимфомы) или солидными опухолями.

Типы рака, которые следует лечить антителами согласно настоящему изобретению, включают рак яичников, эритролейкемию человека, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак легких и рак толстой кишки. Кроме того, учитывая роль УЕСР-С/УЕСРК-3 пути в продвижении лимфангиогенеза и учитывая, что для большинства видов рака, первым местом метастазирования являются лимфатические узлы, блокируя УЕСР-С/УЕСРК-3 сигнальный путь можно ожидать подавление метастазирования в лимфатических узлах, например рака груди, поджелудочной железы, желудка и колоректального рака (КоЪейв е1 а1., Сапсег Кев., 66(5), 2650-2657 (2006)).

Антитела могут быть введены самостоятельно (монотерапия) или в комбинации с одним или несколькими терапевтически эффективными средствами или способами лечения (комбинированная терапия). Другие терапевтически эффективные средства могут быть конъюгированы с антителом, включены в тот же состав, что и антитело, или введены как отдельная композиция. Другие терапевтически эффективные средства или лечение могут быть введены до, во время и/или после введения антител. Другие терапевтически эффективные средства могут быть введены для усиления терапевтического эффекта антитела или уменьшения негативных побочных эффектов антитела.

Способы лечения, описанные в данном документе, могут быть использованы для лечения любого подходящего млекопитающего, включая приматов, таких как обезьяны и человек, лошадей, коров, кошек, собак, кроликов и грызунов, таких как крысы и мыши. В одном из вариантов реализации млекопитающие, подлежащее лечению - это человек.

Как показано в следующих примерах, в которых антитело 1 связывается с эпитопом УЕСРК-3 чело- 8 023331 века, содержащим Р219 в качестве главного компонента эпитопа, У175 как вспомогательный компонент эпитопа, и Ь221 как побочный компонент эпитопа. Далее видно, что антитело 2 (соответствующее крысиное моноклональное антитело к УЕСРК-3мыши ) связывает эпитоп в УЕСРК-3 мыши, который включает остатки Ь219 и У221. Кроме того, примеры также показывают, что антитело 1 имеет высокое сродство к УЕСРК-3 человека (56 пМ), способно блокировать связывание лиганда УЕСР-С с УЕСРК-3, способно блокировать стимулирование УЕСР-С митогенного ответа и является эффективным в естественных условиях на модели ксенотрансплантатов рака яичников и эритролейкемии. Наконец, можно также заметить, что антитело 2 является эффективным в ксенотрансплантатной модели рака головы и шеи, рака молочной железы, рак легкого, почечно-клеточного рака, рака поджелудочной железы и рака толстой кишки.

Пример 1.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть сделаны и очищены с использованием различных подходящих способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Например, подходящую клетку-хозяина, такую как НЕК 293 ΞΕΝΑ или СНО, временно или стабильно трансфицировали экспрессионной системой для секретируемых антител с использованием оптимального предопределенного соотношения векторов, кодирующих легкую цепь и тяжелую цепь, или одним вектором, кодирующим легкую цепь (например, §ЕЦ ГО № 12 для антитела 1) и тяжелую цепь (например, §ЕЦ ГО № 14 для антитела 1). Среду, в которую секретировались антитела, очищали, используя любой из широко известных способов. Например, среду наносили на колонку с белком А или С 8ерйагоке РР, предварительно уравновешенную приемлемым буфером, таким как фосфатный буферный раствор (рН 7,4). Колонку промывали, чтобы удалить неспецифически связавшиеся компоненты. Антитело элюировали, например, градиентом рН (например, от 0,1 М натрий-фосфатного буфера с рН 6,8 до 0,1 М натрий-цитратного буфера с рН 2,5). Фракции, содержащие антитела детектировали, например, с помощью δΌδ-РАСЕ, а затем объединяли. Дальнейшая очистка является необязательной, в зависимости от предполагаемого использования. Антитела можно сконцентрировать и/или стерилизовать с помощью обычных способов. Растворимые агрегаты и мультимеры можно эффективно удалить обычными способами, в том числе гельфильтрационной, гидрофобной, ионообменнной или гидроксиапатитной хроматографией. Чистота антител после такой хроматографии составляет более 99%. Продукт может быть немедленно заморожен при температуре -70°С или может быть лиофилизирован. Последовательности СОК и вариабельных участков (определены с использованием способа КаЬа1) для антитела 1 приведены ниже.

Таблица 1. Аминокислотная последовательность СОК легкой цепи

МАТ	ьсши	ЬСОК2	ьсокз
Антитело 1	КА3081388РЬА (8Е<ЗГО№1)	АА8ТКАТ (8 Г. О ГО №2)	ООУСКЗЬЗ (8Е(ЗГО№3)

Таблица 2. Аминокислотная последовательность СОК тяжелой цепи

МАТ	НСИК1	НСОК2	НСГЖЗ
Антитело 1	ΟΝ8ΑΤ3ΥΝ (ЗЕО ГО №6)	ΚΤΥΥΚ3Κ\νΝΗΟΥΑΕ8νΚ8 (ЗЕО ГО №7)	ΟΟ8833ΥΥΑΡΟΥ (ЗЕО ГО №8)

Таблица 3. Аминокислотные последовательности ЬСУК, НСУК, легкой цепи и тяжелой цепи

МАТ	ЬСУК	НСУК	Легкая цепь	Тяжелая цепь
			(сигнальная последовательность с 1 по 19 остаток)	(сигнальная последовательность с 1 по 19 остаток)
Антитело 1	8ЕУ ГО №5	ЗЕО ГО №10	ЗЕО ГО №12	ЗЕО ГО №14

Пример 2.

В следующем примере описаны эксперименты, в которых определили эпитоп рецептора УЕСРК-3, с которым связываются антитела 1 и 2.

Получение УЕСЕ-Сд^_с и мышиного и человеческого кК3-АР. Рекомбинантный зрелый УЕСРСдт_С человека получили, как описано в Ру1о\ук1й е1 а1. (2005) 1. Ναΐΐ. Сапсег 1пкЬ 97(1).14-21. Полноразмерные (т.е. ИГ домены 1-7) растворимые внеклеточные участки УЕСРК-3 человека и мыши (кК3) соединили с кДНК, кодирующей щелочную фосфатазу (АР) человека, для получения химерного белка кК3АР (РегкаиФ е! а1. (2004) 1. Се11 8аепсе 777:2745-56; 1Мо\\кк1 е! а1. (2005) 1. №И. Сапсег Ιηκί. 97(1):14-21).

Получение химерного кК3-АР человек/мышь и сайт-специфических мутантов кК3-АР. Химерные конструкции человек/мышь и мышь/человек 3 Ν-концевых ИГ-подобных доменов кК3-АР получили с использованием реакции ПЦР с перекрывающимися фрагментами (Но е1 а1. (1989), Сепе 77:51-59) и клонировали в вектор, экспрессирующий АР (РегкаиФ е1 а1., кирга; Ру1о\ук1й е1 а1., кирга). Сайт-специфический мутагенез конструкций кК3-АР проводили с использованием набора ЦшскСйапде II ХЬ 8йе-Оиес1еФ Ми1адепек1к (81га1адепе) в соответствии с инструкциями производителя. Наличие желаемых мутаций проверяли секвенированием обеих цепей ДНК в мутированных участках с использованием АВ1 Рикш 3100 Сепейс апа1у/ег (АррйеФ ВюкуМешк) и набора для секвенирования ВщЭуе ТегпипаЮг ν3.1 Сус1е 8едиепс- 9 023331 шд Кй (Аррйей ВюууЧепге).

Экспрессия растворимых белков УЕСРК-3. кДНК, кодирующей внеклеточные участки мутированного 8К3-АР и 8К3-АР дикого типа, трансфицировали клетки Ртее81у1е™ 293 (1пуПгодеп. #К79007). выращиваемые в суспензионной культуре в среде Ртее81у1е™ 293 Ехртеккюп Мейнип (1пуйтодеп. #12338026) известного химического состава. не содержащей белка. В некоторых случаях отобранные 5К3-АР очищали с использованием аффинной хроматографии с антителами к АР. как описано выше (Ζΐιιι е! а1. (1998) Сапсег Ке8. 55:3209-14). или аффинной хроматографии с иммобилизованными моноклональными антителом 1 и антителом 2. описанными в данном документе.

Нормализация белков кК3 в кондиционированной среде (КС). КС исследовали на активность АР с использованием набора Сгеа! ЕксАРе™ 8ЕАР Сйетйиттексепсе кй 2.0 (С1оп1есй. МоиШаш У1е\у. СА) с применением люменометра Ττορίχ ТК7171 (Аррйей ВюкуЧетк. Ро51ет Сйу. СА). КС разводили пропорционально активности АР в фосфатно-солевом буфере (РВ§). содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (РВ§-В§А). и проводили повторное измерение для подтверждения нормализации по измерению активности АР и Вестерн-блоту.

Исследование связывания 5К3-АР. Сто (100) мкл нормализованной КС перенесли в 96-луночный титрационный микропланшет покрытый УЕСР-С ·,_Νν; или исследуемым антителом (200 нг/лунка). После 2 ч инкубации планшеты промывали 5 раз и связавшийся 5К3-АР детектировали по хемилюминесценции.

Специфичность связывания антитела 1 и контрольного крысиного моноклонального антитела к УЕСРК- 3 мыши (обозначено антитело 2) проверяли методом ЕЬРЗА с использованием иммобилизованных внеклеточных участков мышиного и УЕСРК-3 человека (ИГ домены 1-7). Антитело 1 и антитело 2 связывают сильно и дозозависимо УЕСРК-3 человека и мыши соответственно. Человеческое антитело антитело 1 демонстрирует слабую. но воспроизводимую кросс-реактивность с мышиным УЕСРК-3 в концентрации превышающей 10 нМ. Наоборот. антитело 2 не проявляет никакого детектируемого связывания с УЕСРК-3 человека.

Эпитопы антитела 1 и антитела 2 полностью содержаться во втором иммуноглобулин-подобном (ИГ) домене УЕСРК-3. Связывающие лиганд участки всех трех представителей семейства рецепторов УЕСР содержатся в трех Ν-концевых ИГ доменах внеклеточного участка. Видовую специфичность антитела 1 и антитела 2 использовали для того. чтобы определить. какой их трех ИГ доменов содержит эпитопы для этих антител. Последовательности ДНК. кодирующие ИГ человека и мыши домены с 1 по 3 соединили в различных комбинациях с получением следующих конструкций внеклеточного домена УЕСРК-3: 1) человеческий дикого типа; 2) мышиный дикого типа; 3) химерный 1 (ИГ1 человека - ИГ2 человека - ИГ3 мыши); 4) химерный 2 (ИГ1 человека - ИГ2 мыши - ИГ3 мыши); 5) химерный 3 (ИГ1 мыши - ИГ2 человека - ИГ3 мыши) и 6) химерный 4 (ИГ1 человека - ИГ2 мыши - ИГ3 человека). Конструкции экспрессировали в виде белков. слитых со щелочной фосфатазой (АР) Ре гений е! а1.. см. выше. Кодируемые белки выделяли из кондиционированной среды (КМ) временно трансфицированных клеток и нормализовали по содержанию белка и активности АР. 5К3-АР мыши и человека связывали УЕСРСдт_С с близкой аффинностью. Таким образом. способность различных химерных 5К3-АР связывать человеческий УЕОР-Сшди использовали для определения того. что химерные рецепторы сохраняют правильную укладку полипептидной цепи. Способность антитела 1 и антитела 2 связывать химерные белки 1 и 4 показывает. что эпитопы антитела 1 и антитела 2 полностью содержатся во втором ИГ домене (ИГ

2) УЕСРК-3 человека и мыши соответственно. Например. антитело 1 не связывает химерные конструкции 2 или 4. которые содержат последовательность домена ИГ2 УЕСРК3 мыши.

Определение аминокислотных остатков УЕСРК-3. которые образуют эпитопы для антитела 1 и антитела 2. определили двенадцать (12) позиций в аминокислотной последовательности второго ИГ домена УЕСРК-3. которые отличаются в белке человека и мыши. Эти позиции и аминокислотные остатки. нахо-

Использовали сайт-специфический мутагенез для замены каждого видоспецифичного аминокислотного остатка в последовательности мышиного и человеческого белка на соответствующий ортолог противоположного вида; каждый мутированный белок затем экспрессировали в виде белка 8К3-АР. содержащего первый. второй и третий ИГ домены. Картирование эпитопа проводили с использованием двух взаимодополняющих подходов. В первом подходе измеряли ослабление связывания антитела 1. специфичного для белка человека. и антитела 2. специфичного для белка мыши. с их соответствующими белками 5К3-АР человека и мыши из-за точечных аминокислотных замен в человеческом или мышином ортологах. Во втором подходе измеряли усиление связывания антитела 1 и антитела 2 с 5К3-АР противоположного вида. вызванное точечными аминокислотными заменами в человеческом или мышином ортологах. Остаток считали сильным кандидатом в компоненты эпитопа. если описанная выше мутация вызывала ослабление связывания в первом подходе и усиление связывания во втором. Связывание УЕСР- 10 023331

Сд^_С всеми мутантными белками измеряли параллельно, чтобы избежать различий из-за сильных изменений в структуре белка.

Измерение связывания проводили в трех повторностях и результат вычисляли как среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Из 12 проверенных замен во втором ИГ домене 8К3-ЛР человека, только одна (У184Ь) приводила к полному нарушению связывания с УЕСР-С.'д.. ,_с И антителом 1. Предполагается, что эта замена нарушает структуру 8К3-ЛР человека. Замена У175А приводила к приблизительно 50% ослаблению связывания с УЕОР-С и антителом 1. Замена Р219Ь приводила к примерно 75% ослаблению связывания с УЕОР-С и почти полному (~95%) нарушению связывания с антителом 1. Замена Ь221 на У не влияла на связывание 8К3-ЛР человека с УЕОР-С, но уменьшала связывание с антителом 1 приблизительно на 55%. Остальные замены ни привели к значительному изменению связывания ни с УЕОР-С, ни с антителом 1.

При проверке усиления связывания антитела 1 с мышиным 8К3-ЛР, в который были введены точечные мутации, заменяющие мышиные аминокислотные остатки на человеческие, обнаружили значительное усиление связывания для мутантного белка с заменами А175У (~ в 12 раз) и Ь219Р (~ в 60 раз), по сравнению с белком дикого типа. Другие замены не привели к усилению связывания с антителом 1.

Критерии для определения аминокислот, составляющих эпитоп антитела 1, были следующие: замены в 8К3-АР человека на аминокислоты мышиного ортолога должны значительно ослаблять связывание с антителом 1, но в то же время оставлять неизменным или ослаблять (но не отменять полностью) связывание с УЕОР-Сд^_С. В дополнение, аминокислотные остатки, составляющие эпитоп антитела 1, должны значительно увеличивать связывание с антителом 1 при введении этих аминокислотных остатков из человеческого ортолога в мышиный кК3-АР. Для антитела 1 этим критериям удовлетворяют У175 и Р219 человеческого 8К3-АР. У184 был исключен, так как его замена в человеческом 8К3-АР на мышиный ортолог нарушала связывание с УЕОР-С^_дС и с антителом 1, в то же время соответствующая замена в мышином 8К3-АР на аминокислоту из человеческого ортолога в этой же позиции не приводила к связыванию с антителом 1. Замена лейцина 221 в человеческом 8К3-АР на соответствующий валин из мышиного белка уменьшала связывание с антителом 1 на 55%. Тем не менее, соответствующая замена в мышином кК3-АР на аминокислоту из человеческого ортолога не приводила к связыванию с антителом 1. Таким образом, Ь221 может быть побочным компонентом эпитопа антитела 1, но не отвечает всем критериям, установленным выше.

Для дальнейшего изучения роли остатка в положении 221 мутации Р219Ь и Ь221У в 8К3-АР человека объединили в одну конструкцию. Связывание двойного мутанта с антителом 1 практически не наблюдалось, по сравнению белком с одной мутацией Р219Ь, который сохранял 5% связывание с человеческим 8К3-АР.

Подводя итог, эти результаты показывают, что главным компонентом эпитопа является Р219, а У175 является вспомогательным компонентом эпитопа человеческого УЕОРК-3 для антитела 1. Кроме того, вероятно Ь221 также является побочным компонентом эпитопа.

Затем проверили, какие именно аминокислотные остатки второго ИГ домена УЕОРК-3 мыши образуют эпитоп для антитела 2, используя аналогичный метод. Измерение связывания опять проводили в трех повторениях и результат вычисляли как среднее и стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Из 12 проверенных точечных мутаций, в которых мышиные аминокислотные остатки были заменены на соответствующие человеческие, 4 замены (Н177\У, Р1948, К199Н и Ν214Ό) значительно уменьшали связывание мышиного 8К3-АР с УЕОР-С и с антителом 2. Интересно, что мутации в положениях 219 и 221 (Ь219Р и У221Ь) уменьшали связывание с антителом 2, но не с УЕОР-С. Соответствующие замены аминокислотных остатков последовательности человека на мышиные в УЕОРК-3 человека в положениях 219 и 221 (Р219Ь и Ь221У) повышали связывание антитела 2 с человеческим 8К3-АР в 55 раз и в 10 раз соответственно по сравнению с человеческим белком дикого типа. Также было обнаружено, что связывание мышиных белков, с заменами в позициях 219 и 221 на аминокислотные остатки человеческого ортолога с УЕСЕ-С-,\ ,_С незначительно возрастало или оставалось неизменным, в то время как связывание таких мутантов с антителом 2 полностью нарушалось (219) или уменьшалось приблизительно на 85% (221).

Критерии для определения аминокислот, составляющих эпитоп антитела 2, были следующие: замены в мышином 8К3-АР на аминокислоты человеческого ортолога должны значительно ослаблять связывание с антителом 2, но в то же время оставлять неизменным или ослаблять (но не отменять полностью) связывание с УЕОР-С^^. В дополнение, аминокислотные остатки, составляющие эпитоп антитела 2, должны значительно увеличивать связывание с антителом 2 при введении этих аминокислотных остатков из мышиного ортолога в человеческий кК3-АР. Для антитела 2 этим критериям удовлетворяют Р219 и Ь221 мышиного 8К3-АР.

Другой способ выражения данных - это подсчет процента максимального связывания антитела 2 с мышиным 8К3-АР дикого типа, который воссоздан с помощью индивидуальных замен в последовательности человеческого 8К3-АР на аминокислоты мышиного ортолога. Он показывает, что индивидуальные замены Р219Ь и Ь221У в последовательности человеческого 8К3-АР приводят, соответственно, к 5 и 1%

- 11 023331 связыванию от максимального связывания антитела 2 с мышиным кКЗ-АР дикого типа. Этот метод также показывает, что Ь219 и У221 являются компонентами эпитопа антитела 2.

Видно, что антитело 1 и антитело 2 связывают очень похожие эпитопы в УЕОРК-З человека и УЕОРК-З мыши соответственно, остаток в положении 219 является ключевым остатком в каждом конкретном случае. Данные в следующих примерах показывают, что и антитело 1 и антитело 2 являются нейтрализующими антителами, которые способны блокировать активность своих антигенов, а также подавляют рост опухоли в естественных условиях в ксенотрансплантатной модели. Такие данные приводят дополнительные доказательства того, что новый эпитоп во втором ИГ домене УЕОРК-З, определенный в данном описании, является нейтрализующим эпитопом. Антитела, связывающиеся с указанным эпитопом, таким образом, способны блокировать связывание лигандов, сигнальный путь УЕОРК-З и подавлять рост опухолей в естественных условиях.

Пример 3. Измерение аффинности (К_б) антител к УЕОРК-З.

Кинетику связывания антитела 1 измеряли с применением поверхностного плазмонного резонанса с биосенсором В1АСОКЕ® 2000 (В1АСОКЕ®, Р15са1а\уау. ΝΥ) при 20°С. Растворимый внеклеточный домен УЕОРК-З человека ОРЗ-АР) иммобилизовали на сенсорном чипе и антитело 1 вводили через проточный канал в концентрации от 0.8 до 6.25 нМ. Сенсограмму анализировали в программе В1А Еуа1иайоп З.2 для определения скорости связывания (ка) и скорости диссоциации (кб). Константу диссоциации (К_б) высчитывали на основе ка и кб, используя уравнение: К_б = ка/кб. Анализ кинетики В1Асоге показал, что К_бкомплекса антитело 1 с кКЗ-АР составляет 56 пМ. Таким образом, антитело 1 имеет очень высокую аффинность к УЕОРК-З человека, причем эта аффинность почти на 2 порядка больше, чем у кКЗ-АР к УЕОР- ΟδΝΔΤ

Пример 4. Блокирование связывания УЕОР-С с УЕОРК-З антителами к УЕОРК-З.

Для измерения способности антител к УЕОРК-З блокировать связывание с УЕОР-С с УЕОРК-З человека использовали конкурентный анализ блокирования связывания УЕОР-С. Антитела или растворимые фаговые частицы в концентрации от 0.001 до 5 мкг/мл смешивали с 50 нг кКЗ-АР, инкубировали при комнатной температуре 1 ч и переносили в 96-луночный титрационный микропланшет, покрытый УЕОРС,^_С (200 нг/лунка). Через 2 ч микропланшет промывали 5 раз и добавляли п-нитрофенилфосфат (81дта) для количественного определения связавшихся молекул кКЗ-АР по поглащению света с длиной волны 405 нм. Вычисляли 1С₅₀, т.е. концентрацию РаЬ или 1§О, требуемую для 50% подавления связывания кКЗ-АР с УЕОР-С,^_С. РаЬ и 1дО формы антитела 1 сильно подавляли связывание кКЗ-АР с иммобилизованным УЕОР-С,^_С, 1С₅₀ составила 2 и 1.З нМ соответственно. Контрольное антитело к рецептору 1ОР человека, полученное из той же фаговой библиотеки, было неактивным.

Пример 5. Подавление стимулированного УЕОР-С.'·, \>_С митогенного ответа антителом 1.

Для того чтобы проверить способность антитела 1 подавлять передачу сигнала, опосредованную УЕОРК-З, создали клеточную линию ΝΙΗ-ЗТЗ, которая экспрессировала химерную форму УЕОРК-З, которая представляет собой внеклеточный домен УЕОРК-З человека соединенный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами сРМ§ человека. Эндогенной экспрессии УЕОРК-З родительскими клетками детектировано не было, а локализацию химерного рецептора на плазматической мембране продемонстрировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Клетки УЕОРК-З-РМ8 (5х10^З клеток/лунка) поместили в 96-луночный планшет для культивирования тканей (^а11ас, ОайЬещЬигд, МИ) в 200 мл бессывороточной среды и инкубировали при З7°С в течение 72 ч. Антитело в концентрации до 20 нМ добавляли и инкубировали при З7°С в течение 1 ч, затем добавляли УЕОР- СΔNΔС до конечной концентрации 20 нг/мл. После 18 ч инкубации добавляли в каждую лунку 0.25 мКи тимидина, содержащего тритий, ([^ЗН]-ТбК) (АтегкЬат) и инкубировали еще 4 ч. Клетки помещали на лед, промывали один раз средой, содержащей сыворотку, инкубировали 10 мин при 4°С с 10% ТХУ, а затем растворяли в 25 мл 2% §И§. Включение радиоактивной метки определяли на сцинтилляционном счетчике (^а11ас, Мобе1 1450 МюгоЬе1а §сшй11айоп Соип1ег). Включение [^ЗН]-ТбК ΝΙΗ-ЗТЗ клетками, экспрессирующими УЕОРК-З-сРМ§, увеличивалось по меньшей мере в З раза при добавлении УЕОР-С,^_С. Митогенный ответ специфически и дозозависимо блокировался антителом 1 с 1С₅₀ около 5 нМ.

Пример 6. Моноклональные антитела к УЕОРК-З в модели подкожного ксенотрансплантата на основе линии клеток карциномы яичников человека ОУСАК-8.

В данном эксперименте моноклональные антитела к УЕОРКЗ антитело 1 и антитело 2 использовали по отдельности или в комбинации на ксенотрансплантате культуры клеток карциномы яичников человека ОУСАК-8 (N0-60, Иеуе1ортейа1 ТЬегареийск Ргодгат, ΝΟΙ/ΝΊΉ) иммунодефицитных мышей линии 8СГО. ОУСАК-8 - одна из немногих х клеточных линий карциномы человека, которые экспрессируют УЕОРК-З человека. В этом эксперименте ожидали увидеть, что антитело 2 будет блокировать ангиогенез и лимфангиогенез в строме растущей опухоли, но не будет оказывать никакого эффекта на саму опухоль. А антитело 1, наоборот, будет действовать только на опухолевые клетки человека.

Клетки ОУСАК-8 вводили подкожно в левый бок 75 бестимусным самкам мышей в количестве 1 х 10⁷ клеток/мышь. Когда опухоль достигала объема ~ 180 мм^З, 1З дней после введения клеток, мышей случайным образом делили на 5 групп лечения (п = 12): стерильным физиологическим раствором (кон- 12 023331 троль), 0.5 мл/доза; крысиным 1§О в количестве 40 мг/кг; антителом 1 в количестве 40мг/кг; антителом 2 в количестве 40 мг/кг и антителом 1 в количестве 40 мг/кг + антителом 2 в количестве 40 мг/кг. Моноклональные антитела к νΡΟΡΚ-3 и контроль вводили интраперитонеально по схеме понедельник-средапятница. Измерение опухоли проводили 2 раза в неделю. Т/С% высчитывали для каждой группы лечения как отношение относительного объем опухоли в каждой группе лечения к относительному объему опухоли в контрольной группе. Для сравнения роста опухоли среди разных групп лечения на 41 день использовали дисперсионный анализ повторных измерений (КМ ΑΝΟνΑ).

Антитело 2 значительно подавляло рост опухоли ΟVСΑК-8, Т/С% составил 71% (Р = 0.0299). Антитело 1 продемонстрировало тенденцию к эффективности в этой модели (Т/С% составил 74%), но степень подавления опухоли не достигла статистической значимости (Р > 0.05). Это могло произойти из-за большого разброса объема опухолей на 41 день в этой группе (335-1504 мм³). Этот факт мог помешать достигнуть статистической значимости в этой группе.

Сочетание антитела 1 и антитела 2 увеличило эффект подавления опухоли антителом 2 (Т/С% составил 47% и разница с каждым антителом по отдельности была статистически значима (Р < 0.0358)).

Антитело 2 значительно подавляет рост опухоли ΟVСΑК-8, в то время как антитело 1 производит впечатление эффективного в этой модели, но не достигает статистической значимости. Тем не менее, так как сочетание двух моноклональных антител значительно подавляет рост опухоли ΟVСΑК-8 по сравнению с лечением только антителом 2, заключили, что антитело 1 показало терапевтическую эффективность в этом эксперименте. Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели карциномы яичников.

Пример 7. Моноклональное антитело к νΡΟΡΚ-З антитело 1 в модели подкожного ксенотрансплантата на основе клеток эритролейкемии человека (НЕЬ).

В следующем эксперименте обнаружили значительную противоопухолевую активность антитела 1 в ксенотрансплантатной модели эритролейкемии человека (НЕЬ).

Мышей линии Νιι/ηιι (самки, 7-8 недель) разместили по 5-6 в клетку и ввели подкожно 5х10⁶ НЕЬ клеток/мышь. Когда опухоли достигли приблизительно 400 мм³ в объеме, мышей рандомизировали по объему опухоли на 4 группы лечения (п=11/группу):

1) стерильный физиологический раствор, 10 мл/кг,

2) антитело 1,60 мг/кг (ударная доза 150 мг/кг в 1 день),

3) антитело 1,20 мг/кг (ударная доза 50 мг/кг в 1 день),

4) антитело 1,6 мг/кг (ударная доза 15 мг/кг в 1 день).

Антитело 1 растворяли в стерильном физиологическом растворе. Лекарства вводили интраперитонеально, дважды в неделю, в 10 мл раствора лекарства на килограмм массы тела. Первую дозу, ударную дозу, вводили в 1 день, затем поддерживающие дозы вводили два раза в неделю в течение всего срока исследования. Объем опухоли измеряли два раза в неделю. Массу тела измеряли по меньшей мере два раза в неделю на протяжении всего исследования. Т/С% рассчитывали для каждой группы в 18 день как отношение относительного объема опухоли в каждой группе лечения к относительному объему опухоли в контрольной группе (табл. 5). Рост опухоли и изменение массы тела в группах лечения сравнивали с использованием дисперсионного анализа повторных измерений.

Лечение антителом 1 привело к дозозависимому подавлению роста опухоли НЕЬ, причем при дозе антитела 1 60 мг/кг наблюдали значительное подавление роста опухоли (р=0.0031). Эффекта на массу тела лечение антителом 1 в данном исследовании не оказало (табл. 5). Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели НЕЬ, и приводят к минимальным побочным эффектам в этой модели.

Таблица 5

	Т/С% в 18 день	КМ ΑΝΟΥΑ объема опухоли	Конечное среднее % Изменения массы тела	КМ ΑΝΟνΑ массы тела
Контроль (физиологический раствор)			6.6
Антитело 1 60 мг/кг	52.5	0 0031	4.6	0 21
Антитело 1 20 мг/кг	69.6	0.13	3.2	0.20
Антитело 1 6 мг/кг	81.9	0 39	4.6	041

Пример 8. Моноклональное антитело к νΡΟΡΚ-3 антитело 2 в сочетании с цисплатином в модели ксенотрансплантата плоскоклеточного рака САЬ27.

- 13 023331

Для того чтобы проверить активность антител к νΕΟΡΚ-3 против рака головы и шеи, использовали ксенотрансплантатную модель САЬ27. Суспензию клеток САЬ27 в количестве 1х10⁷ клеток/мышь вводили подкожно в левый бок 60 самкам бестимусных мышей. Когда опухоль достигала объема ~180 мм³, через 8 дней после введения клеток, мышей случайным образом разделяли на 4 группы лечения (п = 12): 1) стерильным физиологическим раствором (контроль), 0.5 мл интраперитонеально, 3 дня в неделю; 2) антитело 2 в количестве 40 мг/кг, 3 дня в неделю 3.) цисплатин в количестве 7 мг/кг, 7 дней в неделю 4.) антитело 2 в количестве 40 мг/кг, 3 дня в неделю + цисплатин в количестве 7 мг/кг, 7 дней в неделю.

Измерение опухоли проводили 2 раза в неделю; для сравнения роста опухоли в разных группах лечения на 61 день использовали КМ ΑΝΟνΑ. Критерий хи-квадрат использовали для проверки статистической значимости количества случае регрессии опухоли в группах лечения.

Лечение антителом 2 или цисплатином по отдельности значительно подавляло рост опухоли САЬ27 по сравнению с контрольной группой (Р < 0.0077). Т/С% составили 55 и 39% для антитела 2 и цисплатина соответственно. Совместное лечение антителом 2 и цисплатином привело к значительному подавлению роста опухоли по сравнению с монотерапией (Р < 0.0322). Влияние комбинированной терапии было сильнее, чем при простом сложении эффективности, как это определено с помощью метода разделения препаратов (Ртасйопа1 РтоДис! МсДюД). Таким образом, антитела к νΈΟΡΚ-3, а именно к эпитопу во втором ИГ домене νΕΟΡΚ-3, демонстрирует противоопухолевую эффективность в естественных условиях в модели рака головы и шеи в виде монотерапии или в комбинации с цисплатином.

Пример 9. Моноклональное антитело к νΕΟΡΚ-3 антитело 2 в сочетании с 5фторурацилом/лейковорином в ксенотрансплантатной модели рака молочной железы МЭА-МВ-231.

Для того чтобы проверить активность антител к νΕΟΡΚ-3 против рака молочной железы, использовали ксенотрансплантатную модель МЭА-МВ-231. Бестимусным мышам линии ΝΙΗ пи/пи (самки, 8 недель) вводили подкожно в жировую ткань, окружающую млечную железу, 6х10⁶ клеток МЭА-МВ-231 в 0.4 мл смеси вода/матригель (1:1). Когда опухоли достигали объема приблизительно 300 мм³, мышей рандомизировали по размеру опухоли на следующие группы лечения: (п=12): 1) стерильный физиологический раствор 10 мкл/г, 3 раза в неделю 2) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю 3) 125 мг/кг 5РИ (5фторурацила) + 62 мг/кг Εν (лейковорина), один раз в неделю 4) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю + 125 мг/кг и 62 мг/кг 5РИ и Ρν соответственно, один раз в неделю. Все вещества готовили в день введения и вводили интраперитонеально. Цитотоксическое лечение начали на день раньше, чем лечение антителами.

Сравнение объема опухолей у мышей контрольной группы и у мышей других групп лечения показало значительное подавление роста опухоли в группах, получавших лечение антителом 2 или антителом 2 + 5Ρυ/Ρν (см. табл. 6). Хотя эффект от лечения антителом 2 + 5-Ρυ/Ρν не превышает эффект от монотерапии, существует тенденция к увеличению противоопухолевого эффекта при сочетании препаратов. Соответственно, антитела к νΕΟΡΚ-3, связывающие эпитоп во втором ИГ домене νΕΟΡΚ-3, демонстрируют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели рака молочной железы (по сравнению с физиологическим раствором, использованным в качестве контроля), как в случае монотерапии, так и в сочетании с 5Ρυ/Ρν.

Таблица 6

	Объем опухоли
	'р- \а1ие	т/с%
Антитело 2 против физиологического раствора	р=0.04	49
5Ри/ЬУ против физиологического раствора	р=0.17	52
Антитело 2 + 5Ри/ЬУ против физиологического раствора	р<0.01	28
Антитело 2 против Антитело 2 + эги/ьу	р=0.09	57
5Ри/ЬУ против Антитело 2 + 5РТ1/ЬУ	р=0.09	54

КМΑΝΟΙΆ на 34 день

Пример 10. Моноклональное антитело к νΕΟΡΚ-3 антитело 2, отдельно или в сочетании с доцетакселом в ксенотрансплантатной модели рака легких Ν0Ι-Η292.

Для того чтобы определить активность антител к νΕΟΡΚ-3 против рака легких, использовали ксенотрансплантатную модель с клетками линии Ν0Ι-Η292. Мышам линии Νιι/пи (самки, возраст 7-8 недель) вводили подкожно 2х10⁶ Ν0Ι-Η292 клеток/мышь. Когда опухоли достигали объема около 300 мм³, мышей рандомизировали по размеру опухоли на следующие группы лечения (п=15): 1) физиологческий раствор в дозе 10 мкл/г, 3 раза в неделю, интраперитонеально, начиная со второго дня; 2) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю, интраперитонеально, начиная со второго дня; 3) 12 мг/кг доцетаксела, 7 дней в неделю, начиная с первого дня; 4) 12 мг/кг доцетаксела, 7 дней в неделю, начиная с первого дня и 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю, начиная со второго дня.

Объем опухоли и массу тела животных измеряли приблизительно 2 раза в неделю на протяжении всего исследования. В конце исследования мышей умерщвляли асфиксией в атмосфере СО₂. Т/С% вы- 14 023331 считывали для каждой группы лечения как отношение относительного объема опухоли в экспериментальной группе к относительному объему опухоли в контрольной группе. Рост опухоли и массу тела сравнивали с контрольной группой с использованием КМ ΑΝΟνΑ на 26 день.

Лечение антителом 2 и доцетакселом значительно подавляло рост опухоли Νί'.Ί-Η292 с значениями Т/С% 74 и 49% соответственно. Комбинированное лечение антителом 2 и доцетакселом значительно увеличивало противоопухолевую активность препаратов по сравнению с каждой монотерапией с Т/С% 24%. Соответственно, антитела к УЕСРК-3, связывающие эпитоп во втором ИГ домене УЕСРК-3, проявляют противоопухолевую активность в естественных условиях на модели рака легких, причем как при монотерапии (р=<0.0001), так и в сочетании с Доцетакселом (р=<0.0001).

Пример 11. Моноклональное антитело к УЕСРК-3 антитело 2 в подкожной ксенотрансплантатной модели почечно-клеточной карциномы человека 8К-КС-29.

Для того чтобы определить активность антител к УЕСРК-3 против почечно-клеточного рака (КСС), использовали ксенотрансплантатную модель КСС 8К-КС-29. Самкам бестимусных мышей линии пи/пи (п = 12 на группу) вводили подкожно 2х10⁶ клеток 8К-КС-29 КСС на мышь. Клетки вводили в смеси 1:1 с веществом базальной мембраны Майгде1® (У = 0.4 мл). Когда опухоли достигали объема 200-250 мм³, мышей разделяли на группы и начинали интраперитонеально вводить препараты для лечения - стерильный физиологический раствор контрольной группе (500 мкл/инъекция) и антитело 2 экспериментальной группе (60 мг/кг - первая доза и 40 мг/кг - последующие дозы). Измерение объема опухоли проводили дважды в неделю в течение 43 дней. Образцы опухолей (п = 4 на группу лечения) взяли на 48 день для гистологического анализа. Для определения достоверности противоопухолевого эффекта использовали статистический анализ КМ ΑNΟVΑ. Потери веса ни в одной группе лечения не наблюдалось, как показали измерения на 47 день. Наоборот, вес мышей, получавших лечение антителом 2, увеличился примерно на 5.5% за время исследования.

Чтобы определить противоопухолевую эффективность и вычислить значения Т/С%, все группы лечения сравнивали с мышами контрольной группы в день 32. Значение Т/С% для антитела 2 составило 62% (р=0.012); это показывает подавление роста почечно-клеточной карциномы в подкожной ксенотрансплантатной модели с минимальными побочными эффектами.

Пример 12. Моноклональное антитело к УЕСРК-3 антитело 2 в ксенотрансплантатной модели рака поджелудочной железы ВхРС-3.

Для того чтобы определить активность антител к УЕСРК-3 против рака поджелудочной железы, использовали ксенотрансплантатную модель рака поджелудочной железы ВхРС-3. Самкам бестимусных мышей линии пи/пи (п = 36) вводили подкожно 2х10⁶ клеток поджелудочной железы человека на одну мышь в смеси с матригелем в соотношении 1:1. Когда опухоли достигали объема ~350 мм³, животных разделяли на 3 группы лечения (п = 10): 1) физиологический раствор; 2) 10 мг/кг моноклонального антитела 2; 3) 40 мг/кг моноклонального антитела 2. Все препараты вводили интраперитонеально, 3 раза в неделю в количестве 0.1 мл/10 г массы тела. Измерения размера опухолей проводили 2 раза в неделю в течение 6 недель.

При лечении антителом 2 рост опухоли ВхРС-3 дозозависимо подавлялся. В конце исследования, на 40 день, значения Т/С% составили 75% (р=0.042) и 56% (р=0.002) групп с дозами 10 мг/кг и 40 мг/кг соответственно.

Пример 13. Моноклональное антитело к УЕСРК-3 антитело 2 в сочетании с оксалиплатином в ксенотрансплантатной модели рака толстой кишки НТ-29.

Для того чтобы испытать действие антител к УЕСРК-3 на рак толстой кишки, использовали ксенотрансплантатную модель рака толстой кишки. Суспензию клеток НТ-29, 5х10⁶/мышь, вводили подкожно в левый бок 60 самкам бестимусных мышей. Когда опухоли достигали объема ~ 180 мм³, на восьмой день после введения клеток, мышей рандомизировали и делили на 4 группы лечения (п = 12): 1) стерильный физиологический раствор, 0.5 мл интраперитонеально, 3 раза в неделю; 2) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю; 3) 12 мг/кг оксалиплатина, 7 дней в неделю; 4) 40 мг/кг антитела 2, 3 раза в неделю + 12 мг/кг оксалиплатина, 7 дней в неделю.

Измерения объема опухоли проводили 2 раза в неделю. Для сравнения роста опухоли в разных группах лечения использовали статистический анализ КМ ΑNΟVΑ. Антитело 2 отдельно не подавляло рост опухоли НТ-29; антитело имело тенденцию к эффективности с Т/С% 80%. Совместное лечение антителом 2 и оксалиплатином значительно подавляло рост опухоли НТ-29 по сравнению с контрольной группой и группами с монотерапией любым из препаратов (Р < 0.0280), значение Т/С% составило 47%. Соответственно, антитело к УЕСРК-3, связывающее эпитоп во втором ИГ домене УЕСРК-3, демонстрирует противоопухолевую активность в естественных условиях на модели рака толстой кишки при использовании вместе с оксалиплатином.

- 15 023331

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Имклон ЛЛК

Пытовски, Бронислав Зайек, Натали Персауд, Кришнадатт <120> КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ К УЕСЕК-3 <130> Х18726 <150> 61/380432 <151> 2010-09-07 <160> 22 <170> РаТепТ1п уегзтоп 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 1

Агд А1а 5ег С1п 5ег 11е 5ег 5ег 5ег РНе Ьей А1а 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 2

А1а А1а 5ег ТНг Агд А1а ТНг 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 3

С1п С1п Туг С1у Агд 5ег Ьей 5ег 1 5 <210> 4 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 4 даааТТдТдТ ТдасдсадТс Тссаддсасс сТдТсТТТдТ сТсТадддда аададссасс 60 сТсТссТдса дддссадТса дадТаТТадс адсадсТТсТ ТадссТддТа ссадсадааа 120 ссТддссадд сТсссаадсТ ссТсаТсТаТ дсТдсаТсса ссадддссас ТддсаТссса 180 дасаддТТса дТддсадТдд дТсТдддаса дасТТсасТс ТсассаТсад садасТддад 240 ссТдаадаТТ ТТдсТдТсТа ТТасТдТсад садТаТддТс дсТсасТсТс ТТТсддсдда 300 дддассаадд ТддаддТсаа а 321

- 16 023331 <210> 5 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 5

С1и 1

11е Уа1

Ьеи

ТНг 5

С1п

5ег

Рго С1у

ТНг 10

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

Ьеи 15

С1у

С1и

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

5ег

Суз

Агд

А1а

5ег

С1п

5ег

11е

5ег

20

25

30

РНе

Ьеи

А1а

Т гр

Туг

С1п

ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

ьуз

Ьеи

35

40

45

11е

Туг

А1а

5ег

ТНг

Агд

А1а

ТНг

С1у

11е

Рго

Азр

Агд

РНе

5ег

50

55

60

С1у

5ег

С1у

5ег

С1у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

11е

5ег

Агд

Ьеи

С1и

65

70

75

80

Рго

С1и

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

Туг

С1у

Агд

5ег

Ьеи

85

90

95

5ег

РНе

С1у

ТНг

ьуз

Уа1

С1и

Уа1

ьуз

100

105

<210> 6 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 6

С1у Азп 5ег А1а ТНг Тгр Азп 1 5 <210> 7 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 7

Агд ТНг Туг Туг Агд 5ег Ьуз Тгр Азп Нтз Азр Туг А1а С1и 5ег Уа1 1 5 10 15

Ьуз 5ег <210> 8 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 8

С1у Азр 5ег 5ег 5ег Тгр Туг А1а РНе Азр Туг 1 5 10

- 17 023331 <210> 9 <211> 369 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 9

саддЬасадс	ЬдсадсадЬс	аддЬссадда	сЬддЬдаадс	ссЬсдсадас	ТсЬсТсасЬс	60
ассЬдЬдсса	ЬсЬссдддда	садТдЬсЬсЬ	ддсаасадЬд	сЬасЬЬддаа	сЬддаЬсадд	120
садЬссссаЬ	сдсдаддссЬ	ЬдадЬддсЬд	ддааддасаЬ	аЬЬасаддЬс	саадЬддааЬ	180
саЬдаЬЬаЬд	садааЬсЬдЬ	даааадЬсда	аЬаассаЬса	асссадасас	аЬссаадаас	240
садЬЬсЬссс	ЬдсадсЬдаа	сТсЬдЬдасЬ	сссдаддаса	сддсЬдЬдЬа	ТЬасЬдЬдса	300
аддддьдаьа	дсадсадсЬд	дЬасдссЬЬЬ	дасЬасЬддд	дссадддсас	ссЬддЬсасс	360
дЬсЬсаадс						369

<210> 10 <211> 123 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 10

С1п Уа1 1

С1п

Ьеи С1п 5

С1п

5ег

С1у

Рго

С1у Ьеи 10

Уа1

ьуз

Рго

5ег 15

С1п

ТНг

Ьеи

5ег

Ьеи

ТНг

Суз

А1а

11е

5ег

С1у

Азр

5ег

Уа1

5ег

С1у

Азп

20

25

30

5ег

А1а

ТНг

Т гр

Азп

Т гр

11е

Агд

С1п

5ег

Рго

5ег

Агд

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Т гр

Ьеи

С1у

Агд

ТНг

Туг

Агд

5ег

ьуз

Т гр

Азп

Нтз

Азр

Туг

А1а

50

55

60

С1и

5ег

Уа1

Ьуз

5ег

Агд

11е

ТНг

11е

Азп

Рго

Азр

ТНг

5ег

ьуз

Азп

65

70

75

80

С1п

РНе

5ег

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

5ег

Уа1

ТНг

Рго

С1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг

Суз

А1а

Агд

С1у

Азр

5ег

Т гр

Туг

А1а

РНе

Азр

Туг

100

105

110

Т гр

С1у

С1п

С1у

ТНг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

5ег

	115	120
<210>	11
<211>	702
<212>	ДНК
<213>	Ното зартепз
<400>	11
аЬдддаЬддЬ саТдЬаЬсаЬ	ссЬТЬТЬсТа	дЬадсаасЬд	саасЬддадЬ	асаЬЬсадаа	60
аТТдЬдТЬда сдсадЬсЬсс	аддсасссЬд	ЬсТТЬдЬсТс	Ьаддддааад	адссасссЬс	120

- 18 023331

ТссТдсаддд	ссадТсадад	ТаТТадсадс	адсТТсТТад	ссТддТасса	дсадааассТ	180
ддссаддсТс	ссаадсТссТ	саТсТаТдсТ	дсаТссасса	дддссасТдд	саТсссадас	240
аддТТсадТд	дсадТдддТс	Тдддасадас	ТТсасТсТса	ссаТсадсад	асТддадссТ	300
даадаТТТТд	сТдТсТаТТа	сТдТсадсад	ТаТддТсдсТ	сасТсТсТТТ	сддсддаддд	360
ассааддТдд	аддТсааасд	аасТдТддсТ	дсассаТсТд	ТсТТсаТсТТ	сссдссаТсТ	420
даТдадсадТ	ТдаааТсТдд	аасТдссТсТ	дТТдТдТдсс	ТдсТдааТаа	сТТсТаТссс	480
адададдсса	аадТасадТд	дааддТддаТ	аасдсссТсс	ааТсдддТаа	сТсссаддад	540
адТдТсасад	адсаддасад	сааддасадс	ассТасадсс	Тсадсадсас	ссТдасдсТд	600
адсааадсад	асТасдадаа	асасааадТс	ТасдссТдсд	аадТсассса	ТсадддссТд	660
адсТсдсссд	Тсасааадад	сТТсаасадд	ддададТдТТ	ад		702

<210> 12 <211> 233 <212> БЕЛОК

<213>

Ното

зар

ι епз

<400>

12

МеТ

С1у

Тгр

5ег

суз

11е

Ьеи

РНе

Ьеи

Уа1

А1а

ТНг

А1а

ТНг

С1у

1

5

10

15

Уа1

Нтз

5ег

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТНг

С1п

5ег

Рго

С1у

ТНг

Ьеи

5ег

Ьеи

20

25

30

5ег

Ьеи

С1у

С1и

Агд

А1а

ТНг

Ьеи

5ег

суз

Агд

А1а

5ег

С1п

5ег

11е

35

40

45

5ег

РНе

Ьеи

А1а

Т гр

Туг

С1п

ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

50

55

60

Ьуз

Ьеи

11е

Туг

А1а

5ег

ТНг

Агд

А1а

ТНг

С1у

11е

Рго

Азр

65

70

75

80

Агд

РНе

5ег

С1у

5ег

С1у

5ег

С1у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

11е

5ег

85

90

95

Агд

Ьеи

С1и

Рго

С1и

Азр

РНе

А1а

Уа1

Туг

суз

С1п

Туг

С1у

100

105

110

Агд

5ег

Ьеи

5ег

РНе

С1у

ТНг

ьуз

Уа1

С1и

Уа1

ьуз

Агд

ТНг

115

120

125

Уа1

А1а

Рго

5ег

Уа1

РНе

11е

РНе

Рго

5ег

Азр

С1и

С1 п

Ьеи

130

135

140

Ьуз

5ег

С1у

ТНг

А1а

5ег

Уа1

суз

Ьеи

Азп

РНе

Туг

Рго

145

150

155

160

Агд

С1и

А1а

ьуз

Уа1

С1п

Т гр

ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

5ег

С1у

165

170

175

- 19 023331

Азп

5ег

С1п

С1и

5ег

Уа1

ТНг

С1и

С1п

Азр

5ег

Ьуз

Азр

5ег

ТНг

Туг

180

185

190

5ег

Ьеи

5ег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

5ег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Нт з

195

200

205

Ьуз

Уа1

Туг

А1 а

Суз

С1и

Уа1

ТНг

Нт'з

С1п

С1у

Ьеи

5ег

Рго

Уа1

210

215

220

ТНг

Ьуз

5ег

РНе

Азп

Агд

С1у

С1и

Суз

225 230 <210> 13 <211> 1419 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 13

а£ддда£дд£ са£д£а£са£ сс£££££с£а дТадсаасТд саасТддадТ асаТТсасад	60
дТасадсТдс адсадТсадд ТссаддасТд дТдаадсссТ сдсадасТсТ сТсасТсасс	120
£д£дсса£с£ ссддддасад £д£с£с£ддс аасадТдсТа с££ддаас£д даТсаддсад	180
ТссссаТсдс даддссТТда дТддсТддда аддаса£а££ асаддТссаа д£ддаа£са£	240
да££а£дсад аа£с£д£даа аадТсдааТа ассаТсаасс садасасаТс саадаассад	300
££с£ссс£дс адсТдаасТс ТдТдасТссс даддасасдд с£д£д£а££а сТдТдсаадд	360
ддТдаТадса дсадсТддТа сдссТТТдас ТасТддддсс адддсасссТ ддТсассдТс	420
ТсаадсдсТа дсассааддд сссаТсддТс ТТсссссТдд сасссТссТс саададсасс	480
ТсТдддддса садсддсссТ дддсТдссТд дТсааддасТ асТТссссда ассддТдасд	540
д£д£сд£дда асТсаддсдс ссТдассадс ддсдТдсаса ссТТсссддс ТдТссТасад	600
ТссТсаддас £с£ас£ссс£ садсадсдТд дТдассдТдс ссТссадсад сТТдддсасс	660
садассТаса ТсТдсаасдТ дааТсасаад сссадсааса ссааддТдда саадададТТ	720
дадсссаааТ с££д£дасаа аасТсасаса ТдсссассдТ дсссадсасс ТдаасТссТд	780
дддддассдТ сад£с££сс£ сТТсссссса ааасссаадд асасссТсаТ даТсТсссдд	840
ассссТдадд ТсасаТдсдТ ддТддТддас дТдадссасд аадасссТда дд£саад££с	900
аас£дд£а£д ТддасддсдТ ддаддТдсаТ ааТдссаада сааадссдсд ддаддадсад	960
Тасаасадса сд£ассд£д£ ддТсадсдТс сТсассдТсс Тдсассаада с£ддс£даа£	1020
ддсааддадТ асаадТдсаа ддТсТссаас ааадсссТсс садсссссаТ сдадаааасс	1080
аТсТссааад ссааадддса дссссдадаа ссасаддТдТ асасссТдсс сссаТсссдд	1140
даддадаТда ссаадаасса адТсадссТд ассТдссТдд ТсаааддсТТ сТаТсссадс	1200
дасаТсдссд ТддадТддда дадсааТддд садссддада асаасТасаа дассасдссТ	1260
сссдТдсТдд асТссдасдд с£сс££с££с с£с£а££сса адсТсассдТ ддасаададс	1320
аддТддсадс аддддаасдТ с££с£са£дс ТссдТдаТдс а£даддс£с£ дсасаассас	1380
Тасасдсада ададссТсТс сс£д£с£ссд ддсаааТда	1419

- 20 023331 <210> 14 <211> 472 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 14

Ме! С1у 1

Тгр

5ег

суз 5

11е

Ьеи

РНе

Ьеи 10

Уа1

А1а

ТНг

А1а

ТНг 15

С1у

Уа1

Нт'з

5ег

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

5ег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

ьуз

20

25

30

Рго

5ег

С1п

ТНг

Ьеи

5ег

Ьеи

ТНг

суз

А1а

11е

5ег

С1у

Азр

5ег

Уа1

35

40

45

5ег

С1у

Азп

5ег

А1а

ТНг

Т гр

Азп

Т гр

11е

Агд

С1п

5ег

Рго

5ег

Агд

50

55

60

С1у

Ьеи

С1и

Т гр

Ьеи

С1у

Агд

ТНг

Туг

Агд

5ег

ьуз

Т гр

Азп

Нт з

65

70

75

80

Азр

Туг

А1а

С1и

5ег

Уа1

ьуз

5ег

Агд

11е

ТНг

11е

Азп

Рго

Азр

ТНг

85

90

95

5ег

ьуз

Азп

С1п

РНе

5ег

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

5ег

Уа1

ТНг

Рго

С1 и

Азр

100

105

110

ТНг

А1а

Уа1

Туг

суз

А1а

Агд

С1у

Азр

5ег

Т гр

Туг

А1а

115

120

125

РНе

Азр

Туг

Т гр

С1у

С1п

С1у

ТНг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

5ег

А1а

5ег

130

135

140

ТНг

ьуз

С1у

Рго

5ег

Уа1

РНе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

5ег

ьуз

5ег

ТНг

145

150

155

160

5ег

С1у

ТНг

А1а

Ьеи

С1у

суз

Ьеи

Уа1

ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

165

170

175

С1и

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

5ег

Т гр

Азп

5ег

С1у

А1а

Ьеи

ТНг

5ег

С1у

Уа1

180

185

190

Нт з

ТНг

РНе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

5ег

С1у

Ьеи

Туг

5ег

Ьеи

5ег

195

200

205

5ег

Уа1

ТНг

Уа1

Рго

5ег

Ьеи

С1у

ТНг

С1п

ТНг

Туг

11е

210

215

220

суз

Азп

Уа1

Азп

Нт з

ьуз

Рго

5ег

Азп

ТНг

ьуз

Уа1

Азр

ьуз

Агд

Уа1

225

230

235

240

С1и

Рго

ьуз

5ег

суз

Азр

ьуз

ТНг

Нт'з

ТНг

суз

Рго

суз

Рго

А1а

245 250 255

- 21 023331

Рго

С1и

Ьеи

Ьеи 260

С1у

Рго

5ег Уа1 265

РПе

Ьеи

РПе

Рго

Рго 270

Ьуз

Рго

ьуз

Азр

Тпг

Ьеи

МеТ

11е

5ег

Агд

ТПг

Рго

С1и

Уа1

ТПг

суз

Уа1

275

280

285

Уа1

Азр

Уа1

5ег

Нт з

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

Ьуз

РПе

Азп

Т гр

Туг

Уа1

290

295

300

Азр

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Нт з

Азп

А1а

Ьуз

ТПг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

С1 и

С1п

305

310

315

320

Туг

Азп

5ег

ТПг

Туг

Агд

Уа1

5ег

Уа1

Ьеи

ТПг

Уа1

Ьеи

Нт з

С1п

325

330

335

Азр

Т гр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

суз

Ьуз

Уа1

5ег

Азп

Ьуз

А1а

340

345

350

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Ьуз

ТПг

11е

5ег

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

С1 п

Рго

355

360

365

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТПг

Ьеи

Рго

5ег

Агд

С1и

МеТ

ТПг

370

375

380

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

5ег

Ьеи

ТПг

суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РПе

Туг

Рго

5ег

385

390

395

400

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Т гр

С1и

5ег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Туг

405

410

415

Ьуз

ТПг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

5ег

Азр

С1у

5ег

РПе

Ьеи

Туг

420

425

430

5ег

Ьуз

Ьеи

ТПг

Уа1

Азр

Ьуз

5ег

Агд

Тгр

С1п

С1у

Азп

Уа1

РПе

435

440

445

5ег

суз

5ег

Уа1

МеТ

Нт з

С1и

А1а

Ьеи

Нт з

Азп

Нт'з

Туг

ТПг

С1 п

Ьуз

450

455

460

5ег

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

Рго

С1у

Ьуз

465

470

<210> :

15

<211> '

214

<212>

БЕЛОК

<213>

Ното

зарт епз

<400>

15

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТПг

С1п

5ег

Рго

С1у

ТПг

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

Ьеи

С1у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТПг

Ьеи

5ег

суз

Агд

А1а

5ег

С1п

5ег

11е

5ег

20

25

30

- 22 023331

РНе	Ьей	А1а Тгр Туг С1п 35	С1п	Ьуз 40	Рго С1у	С1п	А1а	Рго 45	Ьуз	Ьей	Ьей
11е	Туг	А1а А1а 5ег ТНг	Агд	А1а	ТНг С1у	11е	Рго	Азр	Агд	РНе	5ег
	50		55				60
С1у	5ег	С1у 5ег С1у ТНг	Азр	РНе	ТНг Ьей	ТНг	11е	5ег	Агд	Ьей	С1и
65		70				75					80
Рго	С1и	Азр РНе А1а Уа1	Туг	Туг	Суз С1п	С1п	Туг	С1у	Агд	5ег	Ьей
		85			90					95
5ег	РНе	С1у С1у С1у ТНг	Ьуз	Уа1	С1и Уа1	Ьуз	Агд	ТНг	Уа1	А1а	А1а
		100			105				110
Рго	5ег	Уа1 РНе 11е РНе	Рго	Рго	5ег Азр	С1и	С1п	Ьей	Ьуз	5ег	С1у
		115		120				125
ТНг	А1а	5ег Уа1 Уа1 Суз	Ьей	Ьей	Азп Азп	РНе	Туг	Рго	Агд	С1 и	А1а
	130		135				140
Ьуз	Уа1	С1п Тгр Ьуз Уа1	Азр	Азп	А1а Ьей	С1п	5ег	С1у	Азп	5ег	С1п
145		150				155					160
С1и	5ег	Уа1 ТНг С1и С1п	Азр	5ег	Ьуз Азр	5ег	ТНг	Туг	5ег	Ьей	5ег
		165			170					175
5ег	ТНг	Ьей ТНг Ьей 5ег	Ьуз	А1а	Азр Туг	С1и	Ьуз	Нтз	Ьуз	Уа1	Туг
		180			185				190
А1а	Суз	С1и Уа1 ТНг Нтз	С1п	С1у	Ьей 5ег	5ег	Рго	Уа1	ТНг	Ьуз	5ег
		195		200				205
РНе	Азп	Агд С1у С1и Суз
	210
<210>	16
<211>	453
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зартепз
<400>	16
С1п	Уа1	С1п Ьей С1п С1п	5ег	С1у	Рго С1у	Ьей	Уа1	Ьуз	Рго	5ег	С1п
1		5			10					15
ТНг	Ьей	5ег Ьей ТНг Суз	А1а	11е	5ег С1у	Азр	5ег	Уа1	5ег	С1у	Азп
		20			25				30
5ег	А1а	ТНг Тгр Азп Тгр	11е	Агд	С1п 5ег	Рго	5ег	Агд	С1у	Ьей	С1и
		35		40				45
Т гр	Ьей	С1у Агд ТНг Туг	Туг	Агд	5ег Ьуз	Т гр	Азп	Нтз	Азр	Туг	А1а
	50		55				60

- 23 023331

С1и 5ег 65

С1п РНе

Туг Туг

Тгр С1у

Уа1 Ьуз

5ег Ьеи

Суз А1а 100

С1п С1у 115

Рго 5ег 130

Уа1 РНе

ТНг А1а 145

А1а Ьеи

ТНг Уа1

5ег Тгр

Рго А1а

Уа1 Ьеи 180

ТНг Уа1

Рго 5ег 195

Азп Нт'з 210

Ьуз Рго

5ег Суз 225

Азр Ьуз

Ьеи С1у

С1у Рго

Ьеи Ме!

11е 5ег 260

5ег Нт'з

С1и Азр 275

С1и Уа1 290

Нт'з Азп

ТНг Туг 305

Агд Уа1

Азп С1у

Ьуз С1и

Рго 11е

С1и Ьуз

5ег

С1п

Агд

ТНг

Рго

С1у

Азп

165

С1п

5ег

ТНг

5ег

245

Агд

Рго

А1а

Уа1

Туг

325

ТНг

Агд 11е 70

Ьеи Азп

С1у Азр

Ьеи Уа1

Ьеи А1а 135

Суз Ьеи 150

5ег С1у

5ег 5ег

5ег Ьеи

Азп ТНг 215

Нт'з ТНг 230

Уа1 РНе

ТНг Рго

С1и Уа1

Ьуз ТНг 295

5ег Уа1 310

Ьуз Суз

11е 5ег

ТНг

5ег

ТНг Уа1 120

Рго

Уа1

А1а

С1у

С1у 200

Ьуз

Суз

Ьеи

С1и

Ьуз 280

Ьуз

Ьеи

Ьуз

11е	Азп	Рго 75
Уа1	ТНг 90	Рго
5ег 105	5ег	Т гр

Азр ТНг

С1и Азр

Туг А1а

5ег 5ег

5ег	5ег	Ьуз
Ьуз	Азр	Туг 155
Ьеи	ТНг 170	5ег
Ьеи 185	Туг	5ег
ТНг	С1п	ТНг
Уа1	Азр	Ьуз
Рго	Рго	Суз 235
РНе	Рго 250	Рго
Уа1 265	ТНг	Суз
РНе	Азп	Т гр
Рго	Агд	С1и
ТНг	Уа1	Ьеи 315
Уа1	5ег 330	Азп
А1а	Ьуз	С1у

5ег ТНг 140

РНе Рго

С1у Уа1

Ьеи 5ег

Туг 11е 205

Агд Уа1 220

Рго А1а

Ьуз Рго

Уа1 Уа1

Туг Уа1 285

С1и С1п 300

Нт'з С1п

Ьуз А1а

С1п Рго

А1а 5ег 125

5ег

ТНг

РНе

110

ТНг

5ег

С1и

Нт з

5ег

190

Суз

С1и

Рго

Ьуз

Уа1

270

Азр

Туг

Азр

Ьеи

Агд

Ьуз Азп 80

А1а Уа1 95

Азр Туг

Ьуз С1у

С1у С1у

Рго Уа1 160

ТНг РНе 175

Уа1 Уа1

Азп Уа1

Рго Ьуз

С1и Ьеи 240

Азр ТНг 255

Азр Уа1

С1у Уа1

Азп 5ег

Тгр Ьеи 320

Рго А1а 335

С1и Рго

- 24 023331

	340	345	350
С1п Уа1 Туг 355	ТНг Ьеи Рго Рго	5ег Агд 360	С1и С1и Ме! ТНг Ьуз Азп С1п 365
Уа1 5ег Ьеи 370	ТНг Суз Ьеи Уа1 375	Ьуз С1у	РНе Туг Рго 5ег Азр 11е А1а 380
Уа1 С1и Тгр 385	С1и 5ег Азп С1у 390	С1п Рго	С1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг 395 400
Рго Рго Уа1	Ьеи Азр 5ег Азр 405	С1у 5ег	РНе РНе Ьеи Туг 5ег Ьуз Ьеи 410 415
ТНг Уа1 Азр	Ьуз 5ег Агд Тгр 420	С1п С1п 425	С1у Азп Уа1 РНе 5ег Суз 5ег 430
Уа1 Ме! Нтз С1и А1а Ьеи Нтз 435 Ьеи 5ег Рго С1у Ьуз 450 <210> 17 <211> 1363 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 17	Азп Нтз 440	Туг ТНг С1п Ьуз 5ег Ьеи 5ег 445
Ме! С1п Агд 1	С1у А1а А1а Ьеи 5	Суз Ьеи	Агд Ьеи Тгр Ьеи Суз Ьеи С1у 10 15
Ьеи Ьеи Азр	С1у Ьеи Уа1 5ег 20	С1у Туг 25	5ег Ме! ТНг Рго Рго ТНг Ьеи 30
Азп 11е ТНг 35	С1и С1и 5ег Нтз	Уа1 11е 40	Азр ТНг С1у Азр 5ег Ьеи 5ег 45
11е 5ег Суз 50	Агд С1у С1п Нтз 55	Рго Ьеи	С1и Тгр А1а Тгр Рго С1у А1а 60
С1п С1и А1а 65	Рго А1а ТНг С1у 70	Азр Ьуз	Азр 5ег С1и Азр ТНг С1у Уа1 75 80
Уа1 Агд Азр	Суз С1и С1у ТНг 85	Азр А1а	Агд Рго Туг Суз Ьуз Уа1 Ьеи 90 95
Ьеи Ьеи Нтз	С1и Уа1 Нтз А1а 100	Азп Азр 105	ТНг С1у 5ег Туг Уа1 Суз Туг 110
Туг Ьуз Туг 115	11е Ьуз А1а Агд	11е С1и 120	С1у ТНг ТНг А1а А1а 5ег 5ег 125
Туг Уа1 РНе	Уа1 Агд Азр РНе	С1и С1п	Рго РНе 11е Азп Ьуз Рго Азр

- 25 023331

130 135 140

тНг 145

Ьеи

Ьеи Уа1

Азп

Агд 150

Ьуз Азр А1а МеГ тгр 155

Уа1

Рго

Суз

Ьеи

Уа1 160

5ег

11е

Рго

С1у

Ьеи

Азп

Уа1

тНг

Ьеи

Агд

5ег

С1п

5ег

Уа1

Ьеи

165

170

175

т гр

Рго

Азр

С1у

С1п

С1и

Уа1

т гр

Азр

Агд

С1у

МеГ

Ьеи

180

185

190

Уа1

5ег

тНг

Рго

Ьеи

Нт'з

Азр

А1а

Ьеи

туг

Ьеи

С1п

Суз

С1 и

тНг

195

200

205

тНг

т гр

С1у

Азр

С1п

Азр

РНе

Ьеи

5ег

Азп

Рго

РНе

Ьеи

Уа1

Нт з

11е

210

215

220

тНг

С1у

Азп

С1и

Ьеи

туг

Азр

11е

С1п

Ьеи

Рго

Агд

Ьуз

5ег

Ьеи

225

230

235

240

С1и

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

Суз

тНг

Уа1

тгр

А1а

245

250

255

С1и

РНе

Азп

5ег

С1у

Уа1

тНг

РНе

Азр

тгр

Азр

туг

Рго

С1у

Ьуз

С1п

260

265

270

А1 а

С1и

Агд

С1у

Ьуз

т гр

Уа1

Рго

С1и

Агд

5ег

С1п

тНг

Нт з

275

280

285

тНг

С1и

Ьеи

5ег

11е

Ьеи

тНг

11е

Нт з

Азп

Уа1

5ег

С1п

Нт з

Азр

290

295

300

Ьеи

С1у

5ег

туг

Уа1

Суз

Ьуз

А1а

Азп

С1у

11е

С1п

Агд

РНе

Агд

305

310

315

320

С1и

5ег

тНг

С1и

Уа1

11е

Уа1

Нт'з

С1и

Азп

Рго

РНе

11е

5ег

Уа1

С1и

325

330

335

т гр

Ьеи

Ьуз

С1у

Рго

11е

Ьеи

С1и

А1а

тНг

А1а

С1у

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

340

345

350

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

туг

Рго

С1и

РНе

С1 п

т гр

355

360

365

туг

Ьуз

Азр

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

5ег

С1у

Агд

Нт'з

5ег

Рго

Нт з

А1а

Ьеи

370

375

380

Уа1

Ьеи

ьуз

С1и

Уа1

тНг

С1и

А1а

5ег

тНг

С1у

тНг

туг

тНг

Ьеи

А1а

385

390

395

400

Ьеи

т гр

Азп

5ег

А1а

С1у

Ьеи

Агд

Азп

11е

5ег

Ьеи

С1 и

Ьеи

405

410

415

- 26 023331

Уа1

Азп

Уа1 420

Рго

С1п

11е

Нт'з 425

С1и

Ьуз

С1и А1а

5ег 430

5ег

Рго

5ег

11е

Туг

5ег

Агд

Нт з

5ег

Агд

С1п

А1а

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

Туг

435

440

445

С1у

Уа1

Рго

Ьеи

Рго

Ьеи

5ег

11е

С1п

Тгр

Нт'з

Т гр

Агд

Рго

Тгр

ТЬг

450

455

460

Рго

Суз

ьуз

МеГ

РЬе

А1а

С1п

Агд

5ег

Ьеи

Агд

С1п

С1 п

С1п

465

470

475

480

Азр

Ьеи

МеГ

Рго

С1п

Суз

Агд

Азр

Т гр

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

С1 п

Азр

485

490

495

А1 а

Уа1

Азп

Рго

11е

С1и

5ег

Ьеи

Азр

ТЬг

Т гр

ТЬг

С1и

РЬе

Уа1

С1и

500

505

510

С1у

Ьуз

Азп

Ьуз

ТЬг

Уа1

5ег

Ьуз

Ьеи

Уа1

11е

С1п

Азп

А1а

Азп

Уа1

515

520

525

5ег

А1а

МеГ

Туг

Ьуз

Суз

Уа1

5ег

Азп

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

Азр

С1и

530

535

540

Агд

Ьеи

11е

Туг

РЬе

Туг

Уа1

ТЬг

11е

Рго

Азр

С1у

РЬе

ТЬг

11е

545

550

555

560

С1и

5ег

Ьуз

Рго

5ег

С1и

Ьеи

С1и

С1у

С1п

Рго

Уа1

Ьеи

565

570

575

5ег

Суз

С1п

А1а

Азр

5ег

Туг

Ьуз

Туг

С1и

Нт'з

Ьеи

Агд

Т гр

Туг

Агд

580

585

590

Ьеи

Азп

Ьеи

5ег

ТЬг

Ьеи

Нт'з

Азр

А1а

Нт з

С1у

Азп

Рго

Ьеи

595

600

605

Азр

Суз

Ьуз

Азп

Уа1

Нт з

Ьеи

РЬе

А1а

ТЬг

Рго

Ьеи

А1а

5ег

Ьеи

610

615

620

С1и

Уа1

А1а

Рго

С1у

А1а

Агд

Нт'з

А1а

ТЬг

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

11е

625

630

635

640

Рго

Агд

Уа1

А1а

Рго

С1и

Нт'з

С1и

С1у

Нт з

Туг

Уа1

Суз

С1и

Уа1

С1п

645

650

655

Азр

Агд

5ег

Нт з

Азр

Ьуз

Нт'з

Суз

Нт з

Ьуз

Туг

Ьеи

5ег

Уа1

660

665

670

С1п

А1а

Ьеи

С1и

А1а

Рго

Агд

Ьеи

ТЬг

С1п

Азп

Ьеи

ТЬг

Азр

Ьеи

675

680

685

Уа1

Азп

Уа1

5ег

Азр

5ег

Ьеи

С1и

МеГ

С1п

Суз

Ьеи

Уа1

А1а

С1у

А1а

690

695

700

- 27 023331

Нт з 705

А1а Рго 5ег

11е

Уа1 710

Тгр Туг

Ьуз

Азр

С1и Агд 715

Ьеи

С1 и

С1и 720

ьуз

5ег

С1у

Уа1

Азр

Ьеи

А1а

Азр

5ег

Азп

С1п

Ьуз

Ьеи

5ег

11е

С1п

725

730

735

Агд

Уа1

Агд

С1и

Азр

А1а

С1у

Агд

Туг

Ьеи

Суз

5ег

Уа1

Суз

Азп

740

745

750

А1а

Ьуз

С1у

Суз

Уа1

Азп

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

Уа1

С1и

С1у

5ег

755

760

765

С1и

Азр

Ьуз

С1у

5ег

МеГ

С1и

11е

Уа1

11е

Ьеи

Уа1

С1у

ТНг

С1у

Уа1

770

775

780

11е

А1а

Уа1

РНе

Т гр

Уа1

Ьеи

11е

РНе

Суз

Азп

МеГ

785

790

795

800

Агд

Рго

А1а

Нт з

А1а

Азр

11е

Ьуз

ТНг

С1у

Туг

Ьеи

5ег

11е

805

810

815

МеГ

Азр

Рго

С1у

С1и

Уа1

Рго

Ьеи

С1и

С1п

Суз

С1и

Туг

Ьеи

5ег

820

825

830

Туг

Азр

А1а

5ег

С1п

Т гр

С1и

РНе

Рго

Агд

С1и

Агд

Ьеи

Нт з

Ьеи

С1у

835

840

845

Агд

Уа1

Ьеи

С1у

Туг

С1у

А1а

РНе

С1у

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

5ег

А1а

850

855

860

РНе

С1у

11е

Нт з

Ьуз

С1у

5ег

Суз

Азр

ТНг

Уа1

А1а

Уа1

Ьуз

МеГ

865

870

875

880

Ьеи

Ьуз

С1и

С1у

А1а

ТНг

А1а

5ег

С1и

Нт з

Агд

А1а

Ьеи

МеГ

5ег

С1и

885

890

895

Ьеи

Ьуз

11е

Ьеи

11е

Нт з

11е

С1у

Азп

Нт з

Ьеи

Азп

Уа1

Азп

Ьеи

900

905

910

Ьеи

С1у

А1а

Суз

ТНг

Ьуз

Рго

С1п

С1у

Рго

Ьеи

МеГ

Уа1

11е

Уа1

С1и

915

920

925

РНе

Суз

Ьуз

Туг

С1у

Азп

Ьеи

5ег

Азп

РНе

Ьеи

Агд

А1а

Ьуз

Агд

Азр

930

935

940

А1а

РНе

5ег

Рго

Суз

А1а

С1и

Ьуз

5ег

Рго

С1и

С1п

Агд

С1у

Агд

РНе

945

950

955

960

Агд

А1а

МеГ

Уа1

С1и

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

Азр

Агд

Рго

С1у

5ег

965

970

975

5ег

Азр

Агд

Уа1

Ьеи

РНе

А1а

Агд

РНе

5ег

Ьуз

ТНг

С1и

С1у

А1а

980

985

990

- 28 023331

Агд Агд А1а 5ег Рго Азр С1п С1и А1а С1и Азр Ьеи Тгр Ьеи 5ег Рго 995 1000 1005

Ьеи ТНг 1010

Ме! С1и Азр

Ьеи

Уа1 1015

Суз

Туг

5ег

РНе

С1 п 1020

Уа1

А1а

Агд

С1у

Ме!

С1и

РНе

Ьеи

А1а

5ег

Агд

Ьуз

Суз

11е

Нт з

Агд

Азр

Ьеи

1025

1030

1035

А1 а

А1а

Агд

Азп

11е

Ьеи

5ег

С1и

5ег

Азр

Уа1

Ьуз

11е

1040

1045

1050

Суз

Азр

РНе

С1у

Ьеи

А1а

Агд

Азр

11е

Туг

Ьуз

Азр

Рго

Азр

Туг

1055

1060

1065

Уа1

Агд

Ьуз

С1у

5ег

А1а

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьуз

Тгр

Ме!

А1а

Рго

1070

1075

1080

С1и

5ег

11е

РНе

Азр

Ьуз

Уа1

Туг

ТНг

С1п

5ег

Азр

Уа1

Тгр

1085

1090

1095

5ег

РНе

С1у

Уа1

Ьеи

Тгр

С1и

11е

РНе

5ег

Ьеи

С1у

А1а

5ег

1100

1105

1110

Рго

Туг

Рго

С1у

Уа1

С1п

11е

Азп

С1и

РНе

Суз

С1п

Агд

Ьеи

1115

1120

1125

Агд

Азр

С1у

ТНг

Агд

Ме!

Агд

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

ТНг

Рго

А1а

1130

1135

1140

11е

Агд

11е

Ме!

Ьеи

Азп

Суз

Т гр

5ег

С1у

Азр

Рго

Ьуз

А1а

1145

1150

1155

Агд

Рго

А1а

РНе

5ег

С1и

Ьеи

Уа1

С1и

11е

Ьеи

С1у

Азр

Ьеи

1160

1165

1170

С1п

С1у

Агд

С1у

Ьеи

С1п

С1и

Уа1

Суз

Ме!

А1а

Рго

1175

1180

1185

Агд

5ег

С1 п

5ег

С1и

С1у

5ег

РНе

5ег

С1п

Уа1

5ег

1190

1195

1200

ТНг

Ме!

А1а

Ьеи

Нт'з

11е

А1а

С1п

А1а

Азр

А1а

С1 и

Азр

5ег

Рго

1205

1210

1215

Рго

5ег

Ьеи

С1 п

Агд

Нт з

5ег

Ьеи

А1а

Агд

Туг

Азп

Тгр

1220

1225

1230

Уа1

5ег

РНе

Рго

С1у

Суз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

А1а

С1 и

ТНг

Агд

С1у

1235

1240

1245

5ег

Агд

Ме!

Ьуз

ТНг

РНе

С1и

РНе

Рго

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

- 29 023331

1250 1255 1260

ТНг Туг

Ьуз С1у

5ег

Уа1

Азр 1270

Азп С1п ТНг Азр

5ег 1275

С1у

Ме!

Уа1

1265

Ьеи

А1а

5ег

С1 и

С1и

РНе

С1и

С1п

11е

С1и

5ег

Агд

Нт з

Агд

С1п

1280

1285

1290

С1и

5ег

С1у

РНе

5ег

Суз

Ьуз

С1у

Рго

С1у

С1п

Азп

Уа1

А1а

Уа1

1295

1300

1305

ТНг

Агд

А1а

Нт з

Рго

А5р

5ег

С1п

С1у

Агд

Рго

С1и

1310

1315

1320

Агд

С1у

А1а

Агд

С1у

С1п

Уа1

РНе

Туг

Азп

5ег

С1и

Туг

С1у

1325

1330

1335

С1и

Ьеи

5ег

С1 и

Рго

5ег

С1и

Азр

Нт'з

Суз

5ег

Рго

5ег

А1а

1340

1345

1350

Агд

Уа1

ТНг

РНе

ТНг

Азр

Азп

5ег

Туг

1355 1360 <210> 18 <211> 1298 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 18

Ме! 1

С1п

Агд

С1у

А1а 5

А1а

Ьеи Суз

Ьеи Агд 10

Ьеи

Т гр

Ьеи

Суз

Ьеи 15

С1у

Ьеи

Азр

С1у

Ьеи

Уа1

5ег

С1у

Туг

5ег

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

Ьеи

20

25

30

Азп

11е

ТНг

С1и

5ег

Нт'з

Уа1

11е

Азр

ТНг

С1у

Азр

5ег

Ьеи

5ег

35

40

45

11е

5ег

Суз

Агд

С1у

С1п

Нт'з

Рго

Ьеи

С1и

Т гр

А1а

Тгр

Рго

С1у

А1а

50

55

60

С1п

С1и

А1а

Рго

А1а

ТНг

С1у

Азр

ьуз

Азр

5ег

С1и

Азр

ТНг

С1у

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Агд

Азр

Суз

С1и

С1у

ТНг

Азр

А1а

Агд

Рго

Туг

Суз

ьуз

Уа1

Ьеи

85

90

95

Ьеи

Нт'з

С1и

Уа1

Нт з

А1а

Азп

Азр

ТНг

С1у

5ег

Туг

Уа1

Суз

Туг

100

105

110

Туг

ьуз

Туг

11е

ьуз

А1а

Агд

11е

С1и

С1у

ТНг

А1а

5ег

115

120

125

Туг

Уа1

РНе

Уа1

Агд

Азр

РНе

С1и

С1п

Рго

РНе

11е

Азп

ьуз

Рго

Азр

- З0 023331

130 135 140

ТНг 145

Ьеи

Ьеи Уа1

Азп

Агд 150

Ьуз Азр А1а МеТ Тгр 155

Уа1

Рго

суз

Ьеи

Уа1 160

5ег

11е

Рго

С1у

Ьеи

Азп

Уа1

ТНг

Ьеи

Агд

5ег

С1п

5ег

Уа1

Ьеи

165

170

175

Т гр

Рго

Азр

С1у

С1п

С1и

Уа1

Т гр

Азр

Агд

С1у

МеТ

Ьеи

180

185

190

Уа1

5ег

ТНг

Рго

Ьеи

Нт'з

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

суз

С1 и

ТНг

195

200

205

ТНг

Т гр

С1у

Азр

С1п

Азр

РНе

Ьеи

5ег

Азп

Рго

РНе

Ьеи

Уа1

Нт з

11е

210

215

220

ТНг

С1у

Азп

С1и

Ьеи

Туг

Азр

11е

С1п

Ьеи

Рго

Агд

Ьуз

5ег

Ьеи

225

230

235

240

С1и

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

суз

ТНг

Уа1

Тгр

А1а

245

250

255

С1и

РНе

Азп

5ег

С1у

Уа1

ТНг

РНе

Азр

Тгр

Азр

Туг

Рго

С1у

Ьуз

С1п

260

265

270

А1а

С1и

Агд

С1у

Ьуз

Т гр

Уа1

Рго

С1и

Агд

5ег

С1п

ТНг

Нт з

275

280

285

ТНг

С1и

Ьеи

5ег

11е

Ьеи

ТНг

11е

Нт з

Азп

Уа1

5ег

С1п

Нт з

Азр

290

295

300

Ьеи

С1у

5ег

Туг

Уа1

суз

Ьуз

А1а

Азп

С1у

11е

С1п

Агд

РНе

Агд

305

310

315

320

С1и

5ег

ТНг

С1и

Уа1

11е

Уа1

Нт'з

С1и

Азп

Рго

РНе

11е

5ег

Уа1

С1и

325

330

335

Т гр

Ьеи

Ьуз

С1у

Рго

11е

Ьеи

С1и

А1а

ТНг

А1а

С1у

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

340

345

350

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

Туг

Рго

С1и

РНе

С1 п

Т гр

355

360

365

Туг

Ьуз

Азр

С1у

Ьуз

А1а

Ьеи

5ег

С1у

Агд

Нт'з

5ег

Рго

Нт з

А1а

Ьеи

370

375

380

Уа1

Ьеи

ьуз

С1и

Уа1

ТНг

С1и

А1а

5ег

ТНг

С1у

ТНг

Туг

ТНг

Ьеи

А1а

385

390

395

400

Ьеи

Т гр

Азп

5ег

А1а

С1у

Ьеи

Агд

Азп

11е

5ег

Ьеи

С1 и

Ьеи

405

410

415

- З1 023331

Уа1

Азп

Уа1 420

Рго

С1п

11е

Нтз 425

С1и

Ьуз

С1и А1а

5ег 430

5ег

Рго

5ег

11е

Туг

5ег

Агд

Нт з

5ег

Агд

С1п

А1а

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

А1а

Туг

435

440

445

С1у

Уа1

Рго

Ьеи

Рго

Ьеи

5ег

11е

С1п

Тгр

Нтз

Т гр

Агд

Рго

Тгр

ТНг

450

455

460

Рго

Суз

Ьуз

МеЬ

РНе

А1а

С1п

Агд

5ег

Ьеи

Агд

С1п

С1 п

С1п

465

470

475

480

Азр

Ьеи

МеЬ

Рго

С1п

Суз

Агд

Азр

Т гр

Агд

А1а

Уа1

ТНг

С1 п

Азр

485

490

495

А1а

Уа1

Азп

Рго

11е

С1и

5ег

Ьеи

Азр

ТНг

Т гр

ТНг

С1и

РНе

Уа1

С1и

500

505

510

С1у

Ьуз

Азп

Ьуз

ТНг

Уа1

5ег

Ьуз

Ьеи

Уа1

11е

С1п

Азп

А1а

Азп

Уа1

515

520

525

5ег

А1а

МеЬ

Туг

Ьуз

Суз

Уа1

5ег

Азп

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

Азр

С1и

530

535

540

Агд

Ьеи

11е

Туг

РНе

Туг

Уа1

ТНг

11е

Рго

Азр

С1у

РНе

ТНг

11е

545

550

555

560

С1и

5ег

Ьуз

Рго

5ег

С1и

Ьеи

С1и

С1у

С1п

Рго

Уа1

Ьеи

565

570

575

5ег

Суз

С1п

А1а

Азр

5ег

Туг

Ьуз

Туг

С1и

Нтз

Ьеи

Агд

Т гр

Туг

Агд

580

585

590

Ьеи

Азп

Ьеи

5ег

ТНг

Ьеи

Нтз

Азр

А1а

Нт з

С1у

Азп

Рго

Ьеи

595

600

605

Азр

Суз

Ьуз

Азп

Уа1

Нт з

Ьеи

РНе

А1а

ТНг

Рго

Ьеи

А1а

5ег

Ьеи

610

615

620

С1и

Уа1

А1а

Рго

С1у

А1а

Агд

Нтз

А1а

ТНг

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

11е

625

630

635

640

Рго

Агд

Уа1

А1а

Рго

С1и

Нтз

С1и

С1у

Нт з

Туг

Уа1

Суз

С1и

Уа1

С1п

645

650

655

Азр

Агд

5ег

Нт з

Азр

Ьуз

Нтз

Суз

Нт з

Ьуз

Туг

Ьеи

5ег

Уа1

660

665

670

С1п

А1а

Ьеи

С1и

А1а

Рго

Агд

Ьеи

ТНг

С1п

Азп

Ьеи

ТНг

Азр

Ьеи

675

680

685

Уа1

Азп

Уа1

5ег

Азр

5ег

Ьеи

С1и

МеЬ

С1п

Суз

Ьеи

Уа1

А1а

С1у

А1а

690

695

700

- 32 023331

Нт 5 705

А1а Рго 5ег

11е

Уа1 710

Тгр Туг

1_у5

А5р

С1и Агд 715

Ьей

С1 и

С1и 720

1_у5

5ег

С1у

Уа1

А5р

Ьей

А1а

А5р

5ег

А5п

С1п

1_у5

Ьей

5ег

11е

С1п

725

730

735

Агд

Уа1

Агд

С1и

А5р

А1а

С1у

Агд

Туг

Ьей

Су5

5ег

Уа1

Су5

А5п

740

745

750

А1 а

1_у5

С1у

Су5

Уа1

А5п

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

Уа1

С1и

С1у

5ег

755

760

765

С1и

А5р

1_у5

С1у

5ег

МеТ

С1и

11е

Уа1

11е

Ьей

Уа1

С1у

ТНг

С1у

Уа1

770

775

780

11е

А1а

Уа1

РНе

Т гр

Уа1

Ьей

11е

РНе

Су5

А5п

МеТ

785

790

795

800

Агд

Рго

А1а

Нт 5

А1а

А5р

11е

1_у5

ТНг

С1у

Туг

Ьей

5ег

11е

805

810

815

МеТ

А5р

Рго

С1у

С1и

Уа1

Рго

Ьей

С1и

С1п

Су5

С1и

Туг

Ьей

5ег

820

825

830

Туг

А5р

А1а

5ег

С1п

Т гр

С1и

РНе

Рго

Агд

С1и

Агд

Ьей

Нт 5

Ьей

С1у

835

840

845

Агд

Уа1

Ьей

С1у

Туг

С1у

А1а

РНе

С1у

1_у5

Уа1

С1и

А1а

5ег

А1а

850

855

860

РНе

С1у

11е

Нт 5

1_у5

С1у

5ег

Су5

А5р

ТНг

Уа1

А1а

Уа1

1_у5

МеТ

865

870

875

880

Ьей

1_у5

С1и

С1у

А1а

ТНг

А1а

5ег

С1и

НТ 5

Агд

А1а

Ьей

МеТ

5ег

С1и

885

890

895

Ьей

1_у5

11е

Ьей

11е

Нт 5

11е

С1у

А5п

НТ 5

Ьей

А5п

Уа1

А5п

Ьей

900

905

910

Ьей

С1у

А1а

Су5

ТНг

1_у5

Рго

С1п

С1у

Рго

Ьей

МеТ

Уа1

11е

Уа1

С1и

915

920

925

РНе

Су5

1_у5

Туг

С1у

А5п

Ьей

5ег

А5п

РНе

Ьей

Агд

А1а

1_у5

Агд

А5р

930

935

940

А1а

РНе

5ег

Рго

Су5

А1а

С1и

1_у5

5ег

Рго

С1и

С1п

Агд

С1у

Агд

РНе

945

950

955

960

Агд

А1а

МеТ

Уа1

С1и

Ьей

А1а

Агд

Ьей

А5р

Агд

Рго

С1у

5ег

965

970

975

5ег

А5р

Агд

Уа1

Ьей

РНе

А1а

Агд

РНе

5ег

1_у5

ТНг

С1и

С1у

А1а

980

985

990

- 33 023331

Ьеи ТНг 1010

Ме! С1и Азр

Ьеи

Уа1 1015

Суз

Туг

5ег

РНе

С1 п 1020

Уа1

А1а

Агд

С1у

Ме!

С1и

РНе

Ьеи

А1а

5ег

Агд

Ьуз

Суз

11е

Нт з

Агд

Азр

Ьеи

1025

1030

1035

А1а

Агд

Азп

11е

Ьеи

5ег

С1и

5ег

Азр

Уа1

Ьуз

11е

1040

1045

1050

Суз

Азр

РНе

С1у

Ьеи

А1а

Агд

Азр

11е

Туг

Ьуз

Азр

Рго

Азр

Туг

1055

1060

1065

Уа1

Агд

Ьуз

С1у

5ег

А1а

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьуз

Тгр

Ме!

А1а

Рго

1070

1075

1080

С1и

5ег

11е

РНе

Азр

Ьуз

Уа1

Туг

ТНг

С1п

5ег

Азр

Уа1

Тгр

1085

1090

1095

5ег

РНе

С1у

Уа1

Ьеи

Тгр

С1и

11е

РНе

5ег

Ьеи

С1у

А1а

5ег

1100

1105

1110

Рго

Туг

Рго

С1у

Уа1

С1п

11е

Азп

С1и

РНе

Суз

С1п

Агд

Ьеи

1115

1120

1125

Агд

Азр

С1у

ТНг

Агд

Ме!

Агд

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

ТНг

Рго

А1а

1130

1135

1140

11е

Агд

11е

Ме!

Ьеи

Азп

Суз

Т гр

5ег

С1у

Азр

Рго

Ьуз

А1а

1145

1150

1155

Агд

Рго

А1а

РНе

5ег

С1и

Ьеи

Уа1

С1и

11е

Ьеи

С1у

Азр

Ьеи

1160

1165

1170

С1п

С1у

Агд

С1у

Ьеи

С1п

С1и

Уа1

Суз

Ме!

А1а

Рго

1175

1180

1185

Агд

5ег

С1 п

5ег

С1и

С1у

5ег

РНе

5ег

С1п

Уа1

5ег

1190

1195

1200

ТНг

Ме!

А1а

Ьеи

Нт'з

11е

А1а

С1п

А1а

Азр

А1а

С1 и

Азр

5ег

Рго

1205

1210

1215

Рго

5ег

Ьеи

С1 п

Агд

Нт з

5ег

Ьеи

А1а

Агд

Туг

Азп

Тгр

1220

1225

1230

Уа1

5ег

РНе

Рго

С1у

Суз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

А1а

С1 и

ТНг

Агд

С1у

1235

1240

1245

5ег

Агд

Ме!

Ьуз

ТНг

РНе

С1и

РНе

Рго

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

- 34 023331

1250	1255	1260
ТНг Туг Ьуз С1у 5ег	Уа1 Азр	Азп С1п ТНг Азр 5ег С1у Ме! Уа1
1265	1270	1275
Ьеи А1а 5ег С1и С1и	РНе С1и	С1п 11е С1и 5ег Агд Нт'з Агд С1п
1280	1285	1290
С1и 5ег С1у РНе Агд

1295 <210> 19 <211> 1363 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 19

Ме! С1п 1

Рго С1у А1а А1а Ьеи 5

Азп

Ьеи

Агд 10

Ьеи

Т гр

Ьеи

Суз

Ьеи 15

С1у

Ьеи

С1п

С1у

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Туг

5ег

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

Ьеи

20

25

30

Азп

11е

ТНг

С1и

Азр

5ег

Туг

Уа1

11е

Азр

ТНг

С1у

Азр

5ег

Ьеи

5ег

35

40

45

11е

5ег

Суз

Агд

С1у

С1п

Нт'з

Рго

Ьеи

С1и

Т гр

ТНг

Тгр

Рго

С1у

А1а

50

55

60

С1п

С1и

Уа1

Ьеи

ТНг

С1у

ьуз

Азр

5ег

С1и

Азр

ТНг

Агд

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Нт'з

Азр

Суз

С1и

С1у

ТНг

С1и

А1а

Агд

Рго

Туг

Суз

ьуз

Уа1

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

С1п

ТНг

Нт з

А1а

Азп

ТНг

С1у

5ег

Туг

Нт з

Суз

Туг

100

105

110

Туг

ьуз

Туг

11е

ьуз

А1а

Агд

11е

С1и

С1у

ТНг

А1а

5ег

ТНг

115

120

125

Туг

Уа1

РНе

Уа1

Агд

Азр

РНе

ьуз

Нт'з

Рго

РНе

11е

Азп

ьуз

Рго

Азр

130

135

140

ТНг

Ьеи

Уа1

Азп

Агд

ьуз

Азр

5ег

Ме!

Т гр

Уа1

Рго

Суз

Ьеи

Уа1

145

150

155

160

5ег

11е

Рго

С1у

Ьеи

Азп

11е

ТНг

Ьеи

Агд

5ег

С1п

5ег

А1а

Ьеи

165

170

175

Нт з

Рго

Азр

С1у

С1п

С1и

Уа1

Ьеи

Т гр

Азр

Агд

С1у

Ме!

Агд

180

185

190

Уа1

Рго

ТНг

С1п

Ьеи

Агд

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

Суз

С1 и

ТНг

- 35 023331

195

200

205

ТНг

Т гр

С1у

Азр

С1п

Азп

РНе

Ьеи

5ег

Азп

Ьеи

РНе

Уа1

Нт з

11е

210

215

220

ТНг

С1у

Азп

С1и

Ьеи

Туг

Азр

11е

С1п

Ьеи

Туг

Рго

Ьуз

5ег

МеТ

225

230

235

240

С1и

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

Суз

ТНг

Уа1

Тгр

А1а

245

250

255

С1и

РНе

Азр

5ег

С1у

Уа1

ТНг

РНе

Азр

Тгр

Азр

Туг

Рго

С1у

Ьуз

С1п

260

265

270

А1а

С1и

Агд

А1а

Ьуз

Т гр

Уа1

Рго

С1и

Агд

5ег

С1п

ТНг

Нт з

275

280

285

ТНг

С1и

Ьеи

5ег

11е

Ьеи

ТНг

11е

Нт з

Азп

Уа1

5ег

С1п

Азп

Азр

290

295

300

Ьеи

С1у

Рго

Туг

Уа1

Суз

С1и

А1а

Азп

С1у

11е

С1п

Агд

РНе

Агд

305

310

315

320

С1и

5ег

ТНг

С1и

Уа1

11е

Уа1

Нт'з

С1и

Ьуз

Рго

РНе

11е

5ег

Уа1

С1и

325

330

335

Т гр

Ьеи

Ьуз

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

С1и

А1а

ТНг

А1а

С1у

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

340

345

350

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

Туг

Рго

С1и

РНе

С1 п

Т гр

355

360

365

Туг

Ьуз

Азр

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

ТНг

С1у

Агд

Нт'з

Азп

Рго

Нт з

А1а

Ьеи

370

375

380

Уа1

Ьеи

ьуз

С1и

Уа1

ТНг

С1и

А1а

5ег

А1а

С1у

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

А1а

385

390

395

400

Ьеи

Т гр

Азп

5ег

А1а

С1у

Ьеи

Агд

С1п

Азп

11е

5ег

Ьеи

С1 и

Ьеи

405

410

415

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Нт'з

11е

Нт'з

С1и

Ьуз

С1и

А1а

5ег

Рго

420

425

430

5ег

11е

Туг

5ег

Агд

Нт з

5ег

Агд

С1п

ТНг

Ьеи

ТНг

Суз

ТНг

А1а

Туг

435

440

445

С1у

Уа1

Рго

С1п

Рго

Ьеи

5ег

Уа1

С1п

Тгр

Нт'з

Т гр

Агд

Рго

Тгр

ТНг

450

455

460

Рго

Суз

ьуз

ТНг

РНе

А1а

С1п

Агд

5ег

Ьеи

Агд

С1п

С1 п

Агд

465

470

475

480

- 3б 023331

Азр

С1у

МеТ

Рго С1п 485

Суз Агд Азр Тгр

Ьуз С1и Уа1 490

ТНг

С1п Азр 495

А1а

Уа1

Азп

Рго

11е

С1и

5ег

Ьей

Азр

5ег

Т гр

ТНг

С1и

РНе

Уа1

С1и

500

505

510

С1у

Ьуз

Азп

Ьуз

ТНг

Уа1

5ег

Ьуз

Ьей

Уа1

11е

С1п

Азр

А1а

Азп

Уа1

515

520

525

5ег

А1а

МеТ

Туг

Ьуз

Суз

Уа1

Азп

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

Азр

С1и

530

535

540

Агд

Ьей

11е

Туг

РНе

Туг

Уа1

ТНг

11е

Рго

Азр

С1у

РНе

5ег

11е

545

550

555

560

С1и

5ег

С1и

Рго

5ег

С1и

Азр

Рго

Ьей

С1и

С1у

С1п

5ег

Уа1

Агд

Ьей

565

570

575

5ег

Суз

Агд

А1а

Азр

Азп

Туг

ТНг

Туг

С1и

Нт'з

Ьей

Агд

Т гр

Туг

Агд

580

585

590

Ьей

Азп

Ьей

5ег

ТНг

Ьей

Нт'з

Азр

А1а

С1п

С1у

Азп

Рго

Ьей

595

600

605

Азр

Суз

Ьуз

Азп

Уа1

Нт з

Ьей

РНе

А1а

ТНг

Рго

Ьей

С1и

А1а

Азп

Ьей

610

615

620

С1и

А1а

С1и

Рго

С1у

А1а

Агд

Нт'з

А1а

ТНг

Ьей

5ег

Ьей

Азп

11е

625

630

635

640

Рго

Агд

Уа1

А1а

Рго

С1и

Азр

С1и

С1у

Азр

Туг

Уа1

Суз

С1и

Уа1

С1п

645

650

655

Азр

Агд

5ег

С1п

Азр

Ьуз

Нт'з

Суз

Нт з

Ьуз

Туг

Ьей

5ег

Уа1

660

665

670

С1п

А1а

Ьей

С1и

А1а

Рго

Агд

Ьей

ТНг

С1п

Азп

Ьей

ТНг

Азр

Ьей

675

680

685

Уа1

Азп

Уа1

5ег

Азр

5ег

Ьей

С1и

МеТ

Агд

Суз

Рго

Уа1

А1а

С1у

А1а

690

695

700

Нт з

Уа1

Рго

5ег

11е

Уа1

Т гр

Туг

Ьуз

Азр

С1и

Агд

Ьей

С1 и

Ьуз

705

710

715

720

С1и

5ег

С1у

11е

Азр

Ьей

А1а

Азр

5ег

Азп

С1п

Агд

Ьей

5ег

11е

С1п

725

730

735

Агд

Уа1

Агд

С1и

Азр

А1а

С1у

Агд

Туг

Ьей

Суз

5ег

Уа1

Суз

Азп

740

745

750

А1а

Ьуз

С1у

Суз

Уа1

Азп

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

Уа1

С1и

С1у

5ег

755

760

765

- 37 023331

С1и Азр

Ьуз

С1у

5ег

МеТ

С1и 775

11е Уа1

11е

Ьеи

11е С1у ТНг С1у Уа1 780

770

11е

А1а

Уа1

РНе

Т гр

Уа1

Ьеи

11е

РНе

Суз

Азп

МеТ

785

790

795

800

Ьуз

Агд

Рго

А1а

Нт з

А1а

Азр

11е

Ьуз

ТНг

С1у

Туг

Ьеи

5ег

11е

805

810

815

МеТ

Азр

Рго

С1у

С1и

Уа1

Рго

Ьеи

С1и

С1п

Суз

С1и

Туг

Ьеи

5ег

820

825

830

Туг

Азр

А1а

5ег

С1п

Т гр

С1и

РНе

Рго

Агд

С1и

Агд

Ьеи

Нт з

Ьеи

С1у

835

840

845

Агд

Уа1

Ьеи

С1у

Нт з

С1у

А1а

РНе

С1у

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

5ег

А1а

850

855

860

РНе

С1у

11е

Азп

Ьуз

С1у

5ег

Суз

Азр

ТНг

Уа1

А1а

Уа1

Ьуз

МеТ

865

870

875

880

Ьеи

Ьуз

С1и

С1у

А1а

ТНг

А1а

5ег

С1и

Нт з

Агд

А1а

Ьеи

МеТ

5ег

С1и

885

890

895

Ьеи

Ьуз

11е

Ьеи

11е

Нт з

11е

С1у

Азп

Нт з

Ьеи

Азп

Уа1

Азп

Ьеи

900

905

910

Ьеи

С1у

А1а

Суз

ТНг

Ьуз

Рго

Азп

С1у

Рго

Ьеи

МеТ

Уа1

11е

Уа1

С1и

915

920

925

РНе

Суз

Ьуз

Туг

С1у

Азп

Ьеи

5ег

Азп

РНе

Ьеи

Агд

Уа1

Ьуз

Агд

Азр

930

935

940

ТНг

РНе

Азп

Рго

Туг

А1а

С1и

Ьуз

5ег

Рго

С1и

С1п

Агд

РНе

945

950

955

960

Агд

А1а

МеТ

Уа1

С1и

С1у

А1а

Ьуз

А1а

Азр

Агд

Рго

С1у

5ег

965

970

975

5ег

Азр

Агд

А1а

Ьеи

РНе

ТНг

Агд

РНе

Ьеи

МеТ

С1у

Ьуз

С1у

5ег

А1а

980

985

990

Агд Агд А1а Рго Ьеи Уа1 С1п С1и А1а С1и Азр Ьеи Тгр Ьеи 5ег Рго 995 1000 1005

Ьеи ТНг МеТ С1и Азр Ьеи Уа1 Суз Туг 5ег РНе С1п Уа1 А1а Агд 1010 1015 1020

С1у МеТ С1и РНе Ьеи А1а 5ег Агд Ьуз Суз 11е Нт'з Агд Азр Ьеи 1025 1030 1035

А1а А1а Агд Азп 11е Ьеи Ьеи 5ег С1и 5ег Азр 11е Уа1 Ьуз 11е 1040 1045 1050

- 38 023331

суз Азр

РНе С1у

Ьеи А1а

Агд 1060

Азр

11е

Туг

Ьуз

Азр 1065

Рго

Азр

Туг

1055

Уа1

Агд

Ьуз

С1у

5ег

А1а

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьуз

Тгр

Ме!

А1а

Рго

1070

1075

1080

С1и

5ег

11е

РНе

Азр

Ьуз

Уа1

Туг

ТНг

С1п

5ег

Азр

Уа1

Тгр

1085

1090

1095

5ег

РНе

С1у

Уа1

Ьеи

Тгр

С1и

11е

РНе

5ег

Ьеи

С1у

А1а

5ег

1100

1105

1110

Рго

Туг

Рго

С1у

Уа1

С1п

11е

Азп

С1и

РНе

суз

С1п

Агд

Ьеи

1115

1120

1125

Ьуз

Азр

С1у

ТНг

Агд

Ме!

Агд

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

ТНг

Рго

А1а

1130

1135

1140

11е

Агд

Нт з

11е

Ме!

С1п

5ег

суз

Т гр

5ег

С1у

Азр

Рго

Ьуз

А1а

1145

1150

1155

Агд

Рго

А1а

РНе

5ег

Азр

Ьеи

Уа1

С1и

11е

Ьеи

С1у

Азр

Ьеи

1160

1165

1170

С1п

С1у

Т гр

С1п

С1и

Агд

Ме!

А1а

Ьеи

1175

1180

1185

Нт з

5ег

С1 п

5ег

С1и

Азр

С1у

РНе

Ме!

С1п

А1а

5ег

1190

1195

1200

ТНг

А1а

Ьеи

Нт'з

11е

ТНг

С1и

А1а

Азр

А1а

Азр

5ег

Рго

1205

1210

1215

Рго

5ег

Ме!

Нт з

суз

Нт з

5ег

Ьеи

А1а

Агд

Туг

Азп

суз

1220

1225

1230

Уа1

5ег

РНе

Рго

С1у

Агд

Ьеи

А1а

Агд

С1у

ТНг

Ьуз

ТНг

Рго

С1у

1235

1240

1245

5ег

Агд

Ме!

Ьуз

ТНг

РНе

С1и

Ьеи

Рго

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

1250

1255

1260

ТНг

Туг

Ьуз

А1а

5ег

Ме!

Азр

Азп

С1п

ТНг

Азр

5ег

С1у

Ме!

Уа1

1265

1270

1275

Ьеи

А1а

5ег

С1 и

С1и

РНе

С1и

Ьеи

С1и

5ег

Агд

Нт з

Агд

Рго

1280

1285

1290

С1и

С1у

5ег

РНе

5ег

суз

Ьуз

С1у

Рго

С1у

С1п

Нт з

Ме!

Азр

11е

1295

1300

1305

Рго

Агд

С1у

Нт з

Рго

Азр

Рго

С1п

С1у

Агд

Рго

ТНг

- 39 023331

1310

1315

1320

С1п

С1у

А1а

С1 п

С1у

Ьуз

Уа1

РНе

Туг

Азп

С1и

Туг

С1у

1325

1330

1335

С1и

Уа1

5ег

С1 п

Рго

Суз

ТНг

С1и

С1у

Азр

Суз

Рго

5ег

А1а

1340

1345

1350

С1у

5ег

ТНг

РНе

А1а

Азр

5ег

Туг

1355

1360

<210> 20 <211> 1363 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 20

МеГ С1п 1

Рго С1у А1а А1а Ьеи 5

Азп

Ьеи

Агд 10

Ьеи

Т гр

Ьеи

Суз

Ьеи 15

С1у

Ьеи

С1п

С1у

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Туг

5ег

МеГ

ТНг

Рго

ТНг

Ьеи

20

25

30

Азп

11е

ТНг

С1и

Азр

5ег

Туг

Уа1

11е

Азр

ТНг

С1у

Азр

5ег

Ьеи

5ег

35

40

45

11е

5ег

Суз

Агд

С1у

С1п

Нт'з

Рго

Ьеи

С1и

Т гр

ТНг

Тгр

Рго

С1у

А1а

50

55

60

С1п

С1и

Уа1

Ьеи

ТНг

С1у

Ьуз

Азр

5ег

С1и

Азр

ТНг

Агд

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Нт'з

Азр

Суз

С1и

С1у

ТНг

С1и

А1а

Агд

Рго

Туг

Суз

Ьуз

Уа1

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

С1п

ТНг

Нт з

А1а

Азп

ТНг

С1у

5ег

Туг

Нт з

Суз

Туг

100

105

110

Туг

Ьуз

Туг

11е

Ьуз

А1а

Агд

11е

С1и

С1у

ТНг

А1а

5ег

ТНг

115

120

125

Туг

Уа1

РНе

Уа1

Агд

Азр

РНе

Ьуз

Нт'з

Рго

РНе

11е

Азп

ьуз

Рго

Азр

130

135

140

ТНг

Ьеи

Уа1

Азп

Агд

Ьуз

Азр

5ег

МеГ

Т гр

Уа1

Рго

Суз

Ьеи

Уа1

145

150

155

160

5ег

11е

Рго

С1у

Ьеи

Азп

11е

ТНг

Ьеи

Агд

5ег

С1п

5ег

А1а

Ьеи

165

170

175

Нт з

Рго

Азр

С1у

С1п

С1и

Уа1

Ьеи

Т гр

Азр

Агд

С1у

МеГ

Агд

180

185

190

Уа1

Рго

ТНг

С1п

Ьеи

Агд

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

Суз

С1 и

ТНг

- 40 023331

195

200

205

тНг

т гр

С1у

Азр

С1п

Азп

РНе

Ьеи

5ег

Азп

Рго

РНе

Уа1

Нт з

11е

210

215

220

тНг

С1у

Азп

С1и

Ьеи

туг

Азр

11е

С1п

Ьеи

туг

Рго

Ьуз

5ег

МеГ

225

230

235

240

С1и

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

Суз

тНг

Уа1

тгр

А1а

245

250

255

С1и

РНе

Азр

5ег

С1у

Уа1

тНг

РНе

Азр

тгр

Азр

туг

Рго

С1у

Ьуз

С1п

260

265

270

А1а

С1и

Агд

А1а

Ьуз

т гр

Уа1

Рго

С1и

Агд

5ег

С1п

тНг

Нт з

275

280

285

тНг

С1и

Ьеи

5ег

11е

Ьеи

тНг

11е

Нт з

Азп

Уа1

5ег

С1п

Азп

Азр

290

295

300

Ьеи

С1у

Рго

туг

Уа1

Суз

С1и

А1а

Азп

С1у

11е

С1п

Агд

РНе

Агд

305

310

315

320

С1и

5ег

тНг

С1и

Уа1

11е

Уа1

Нт'з

С1и

Ьуз

Рго

РНе

11е

5ег

Уа1

С1и

325

330

335

т гр

Ьеи

Ьуз

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

С1и

А1а

тНг

А1а

С1у

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

340

345

350

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

туг

Рго

С1и

РНе

С1 п

т гр

355

360

365

туг

Ьуз

Азр

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

тНг

С1у

Агд

Нт'з

Азп

Рго

Нт з

А1а

Ьеи

370

375

380

Уа1

Ьеи

ьуз

С1и

Уа1

тНг

С1и

А1а

5ег

А1а

С1у

Уа1

туг

тНг

Ьеи

А1а

385

390

395

400

Ьеи

т гр

Азп

5ег

А1а

С1у

Ьеи

Агд

С1п

Азп

11е

5ег

Ьеи

С1 и

Ьеи

405

410

415

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Нт'з

11е

Нт'з

С1и

Ьуз

С1и

А1а

5ег

Рго

420

425

430

5ег

11е

туг

5ег

Агд

Нт з

5ег

Агд

С1п

тНг

Ьеи

тНг

Суз

тНг

А1а

туг

435

440

445

С1у

Уа1

Рго

С1п

Рго

Ьеи

5ег

Уа1

С1п

тгр

Нт'з

т гр

Агд

Рго

тгр

тНг

450

455

460

Рго

Суз

ьуз

тНг

РНе

А1а

С1п

Агд

5ег

Ьеи

Агд

С1п

С1 п

Агд

465

470

475

480

- 41 023331

Азр

С1у

МеТ

Рго С1п 485

Суз Агд Азр Тгр

Ьуз С1и Уа1 490

ТПг

С1п Азр 495

А1а

Уа1

Азп

Рго

11е

С1и

5ег

Ьеи

Азр

5ег

Т гр

ТПг

С1и

РПе

Уа1

С1и

500

505

510

С1у

Ьуз

Азп

Ьуз

ТПг

Уа1

5ег

Ьуз

Ьеи

Уа1

11е

С1п

Азр

А1а

Азп

Уа1

515

520

525

5ег

А1а

МеТ

Туг

Ьуз

суз

Уа1

Азп

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

Азр

С1и

530

535

540

Агд

Ьеи

11е

Туг

РПе

Туг

Уа1

ТПг

11е

Рго

Азр

С1у

РПе

5ег

11е

545

550

555

560

С1и

5ег

С1и

Рго

5ег

С1и

Азр

Рго

Ьеи

С1и

С1у

С1п

5ег

Уа1

Агд

Ьеи

565

570

575

5ег

суз

Агд

А1а

Азр

Азп

Туг

ТПг

Туг

С1и

Нт'з

Ьеи

Агд

Т гр

Туг

Агд

580

585

590

Ьеи

Азп

Ьеи

5ег

ТПг

Ьеи

Нт'з

Азр

А1а

С1п

С1у

Азп

Рго

Ьеи

595

600

605

Азр

суз

Ьуз

Азп

Уа1

Нт з

Ьеи

РПе

А1а

ТПг

Рго

Ьеи

С1и

А1а

Азп

Ьеи

610

615

620

С1и

А1а

С1и

Рго

С1у

А1а

Агд

Нт'з

А1а

ТПг

Ьеи

5ег

Ьеи

Азп

11е

625

630

635

640

Рго

Агд

Уа1

А1а

Рго

С1и

Азр

С1и

С1у

Азр

Туг

Уа1

суз

С1и

Уа1

С1п

645

650

655

Азр

Агд

5ег

С1п

Азр

Ьуз

Нт'з

суз

Нт з

Ьуз

Туг

Ьеи

5ег

Уа1

660

665

670

С1п

А1а

Ьеи

С1и

А1а

Рго

Агд

Ьеи

ТПг

С1п

Азп

Ьеи

ТПг

Азр

Ьеи

675

680

685

Уа1

Азп

Уа1

5ег

Азр

5ег

Ьеи

С1и

МеТ

Агд

суз

Рго

Уа1

А1а

С1у

А1а

690

695

700

Нт з

Уа1

Рго

5ег

11е

Уа1

Т гр

Туг

Ьуз

Азр

С1и

Агд

Ьеи

С1 и

Ьуз

705

710

715

720

С1и

5ег

С1у

11е

Азр

Ьеи

А1а

Азр

5ег

Азп

С1п

Агд

Ьеи

5ег

11е

С1п

725

730

735

Агд

Уа1

Агд

С1и

Азр

А1а

С1у

Агд

Туг

Ьеи

суз

5ег

Уа1

суз

Азп

740

745

750

А1а

Ьуз

С1у

суз

Уа1

Азп

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

Уа1

С1и

С1у

5ег

755

760

765

- 42 023331

С1и Азр

Ьуз

С1у

5ег

Ме!

С1и 775

11е Уа1

11е

Ьеи

11е С1у ТНг С1у Уа1 780

770

11е

А1а

Уа1

РНе

Т гр

Уа1

Ьеи

11е

РНе

Суз

Азп

Ме!

785

790

795

800

Ьуз

Агд

Рго

А1а

Нт з

А1а

Азр

11е

Ьуз

ТНг

С1у

Туг

Ьеи

5ег

11е

805

810

815

Ме!

Азр

Рго

С1у

С1и

Уа1

Рго

Ьеи

С1и

С1п

Суз

С1и

Туг

Ьеи

5ег

820

825

830

Туг

Азр

А1а

5ег

С1п

Т гр

С1и

РНе

Рго

Агд

С1и

Агд

Ьеи

Нт з

Ьеи

С1у

835

840

845

Агд

Уа1

Ьеи

С1у

Нт з

С1у

А1а

РНе

С1у

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

5ег

А1а

850

855

860

РНе

С1у

11е

Азп

Ьуз

С1у

5ег

Суз

Азр

ТНг

Уа1

А1а

Уа1

Ьуз

Ме!

865

870

875

880

Ьеи

Ьуз

С1и

С1у

А1а

ТНг

А1а

5ег

С1и

Нт з

Агд

А1а

Ьеи

Ме!

5ег

С1и

885

890

895

Ьеи

Ьуз

11е

Ьеи

11е

Нт з

11е

С1у

Азп

Нт з

Ьеи

Азп

Уа1

Азп

Ьеи

900

905

910

Ьеи

С1у

А1а

Суз

ТНг

Ьуз

Рго

Азп

С1у

Рго

Ьеи

Ме!

Уа1

11е

Уа1

С1и

915

920

925

РНе

Суз

Ьуз

Туг

С1у

Азп

Ьеи

5ег

Азп

РНе

Ьеи

Агд

Уа1

Ьуз

Агд

Азр

930

935

940

ТНг

РНе

Азп

Рго

Туг

А1а

С1и

Ьуз

5ег

Рго

С1и

С1п

Агд

РНе

945

950

955

960

Агд

А1а

Ме!

Уа1

С1и

С1у

А1а

Ьуз

А1а

Азр

Агд

Рго

С1у

5ег

965

970

975

5ег

Азр

Агд

А1а

Ьеи

РНе

ТНг

Агд

РНе

Ьеи

Ме!

С1у

Ьуз

С1у

5ег

А1а

980

985

990

Ьеи ТНг Ме! С1и Азр Ьеи Уа1 Суз Туг 5ег РНе С1п Уа1 А1а Агд 1010 1015 1020

С1у Ме! С1и РНе Ьеи А1а 5ег Агд Ьуз Суз 11е Нт'з Агд Азр Ьеи 1025 1030 1035

- 43 023331

Суз Азр

РЬе С1у

Ьеи А1а

Агд 1060

Азр

11е

Туг

Ьуз

Азр 1065

Рго

Азр

Туг

1055

Уа1

Агд

Ьуз

С1у

5ег

А1а

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьуз

Тгр

МеГ

А1а

Рго

1070

1075

1080

С1и

5ег

11е

РЬе

Азр

Ьуз

Уа1

Туг

ТЬг

С1п

5ег

Азр

Уа1

Тгр

1085

1090

1095

5ег

РЬе

С1у

Уа1

Ьеи

Тгр

С1и

11е

РЬе

5ег

Ьеи

С1у

А1а

5ег

1100

1105

1110

Рго

Туг

Рго

С1у

Уа1

С1п

11е

Азп

С1и

РЬе

Суз

С1п

Агд

Ьеи

1115

1120

1125

Ьуз

Азр

С1у

ТЬг

Агд

МеГ

Агд

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

ТЬг

Рго

А1а

1130

1135

1140

11е

Агд

Нт з

11е

МеГ

С1п

5ег

Суз

Т гр

5ег

С1у

Азр

Рго

Ьуз

А1а

1145

1150

1155

Агд

Рго

А1а

РЬе

5ег

Азр

Ьеи

Уа1

С1и

11е

Ьеи

С1у

Азр

Ьеи

1160

1165

1170

С1п

С1у

Т гр

С1п

С1и

Агд

МеГ

А1а

Ьеи

1175

1180

1185

Нт з

5ег

С1 п

5ег

С1и

Азр

С1у

РЬе

МеГ

С1п

А1а

5ег

1190

1195

1200

ТЬг

А1а

Ьеи

Нт'з

11е

ТЬг

С1и

А1а

Азр

А1а

Азр

5ег

Рго

1205

1210

1215

Рго

5ег

МеГ

Нт з

Суз

Нт з

5ег

Ьеи

А1а

Агд

Туг

Азп

Суз

1220

1225

1230

Уа1

5ег

РЬе

Рго

С1у

Агд

Ьеи

А1а

Агд

С1у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Рго

С1у

1235

1240

1245

5ег

Агд

МеГ

Ьуз

ТЬг

РЬе

С1и

Ьеи

Рго

МеГ

ТЬг

Рго

ТЬг

1250

1255

1260

ТЬг

Туг

Ьуз

А1а

5ег

МеГ

Азр

Азп

С1п

ТЬг

Азр

5ег

С1у

МеГ

Уа1

1265

1270

1275

Ьеи

А1а

5ег

С1 и

С1и

РЬе

С1и

Ьеи

С1и

5ег

Агд

Нт з

Агд

Рго

1280

1285

1290

С1и

С1у

5ег

РЬе

5ег

Суз

Ьуз

С1у

Рго

С1у

С1п

Нт з

МеГ

Азр

11е

1295

1300

1305

Рго

Агд

С1у

Нт з

Рго

Азр

Рго

С1п

С1у

Агд

Рго

ТЬг

- 44 023331

1310

1315

1320

С1п

С1у

А1а

С1 п

С1у

Ьуз

Уа1

РНе

Туг

Азп

С1и

Туг

С1у

1325

1330

1335

С1и

Уа1

5ег

С1 п

Рго

Суз

ТНг

С1и

С1у

Азр

Суз

Рго

5ег

А1а

1340

1345

1350

С1у

5ег

ТНг

РНе

А1а

Азр

5ег

Туг

1355

1360

<210> 21 <211> 1363 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 21

Ме! С1п 1

Рго С1у А1а А1а Ьеи 5

Азп

Ьеи

Агд 10

Ьеи

Т гр

Ьеи

Суз

Ьеи 15

С1у

Ьеи

С1п

С1у

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Туг

5ег

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

Ьеи

20

25

30

Азп

11е

ТНг

С1и

Азр

5ег

Туг

Уа1

11е

Азр

ТНг

С1у

Азр

5ег

Ьеи

5ег

35

40

45

11е

5ег

Суз

Агд

С1у

С1п

Нт'з

Рго

Ьеи

С1и

Т гр

ТНг

Тгр

Рго

С1у

А1а

50

55

60

С1п

С1и

Уа1

Ьеи

ТНг

С1у

Ьуз

Азр

5ег

С1и

Азр

ТНг

Агд

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Нт'з

Азр

Суз

С1и

С1у

ТНг

С1и

А1а

Агд

Рго

Туг

Суз

Ьуз

Уа1

Ьеи

85

90

95

Ьеи

А1а

С1п

ТНг

Нт з

А1а

Азп

ТНг

С1у

5ег

Туг

Нт з

Суз

Туг

100

105

110

Туг

Ьуз

Туг

11е

Ьуз

А1а

Агд

11е

С1и

С1у

ТНг

А1а

5ег

ТНг

115

120

125

Туг

Уа1

РНе

Уа1

Агд

Азр

РНе

Ьуз

Нт'з

Рго

РНе

11е

Азп

ьуз

Рго

Азр

130

135

140

ТНг

Ьеи

Уа1

Азп

Агд

Ьуз

Азр

5ег

Ме!

Т гр

Уа1

Рго

Суз

Ьеи

Уа1

145

150

155

160

5ег

11е

Рго

С1у

Ьеи

Азп

11е

ТНг

Ьеи

Агд

5ег

С1п

5ег

Уа1

Ьеи

165

170

175

Нт з

Рго

Азр

С1у

С1п

С1и

Уа1

Ьеи

Т гр

Азр

Агд

С1у

Ме!

Агд

180

185

190

Уа1

Рго

ТНг

С1п

Ьеи

Агд

Азр

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

С1п

Суз

С1 и

ТНг

- 45 023331

195

200

205

ТНг

Т гр

С1у

Азр

С1п

Азп

РНе

Ьеи

5ег

Азп

Ьеи

РНе

Уа1

Нт з

11е

210

215

220

ТНг

С1у

Азп

С1и

Ьеи

Туг

Азр

11е

С1п

Ьеи

Туг

Рго

Ьуз

5ег

МеТ

225

230

235

240

С1и

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азп

суз

ТНг

Уа1

Тгр

А1а

245

250

255

С1и

РНе

Азр

5ег

С1у

Уа1

ТНг

РНе

Азр

Тгр

Азр

Туг

Рго

С1у

Ьуз

С1п

260

265

270

А1а

С1и

Агд

А1а

Ьуз

Т гр

Уа1

Рго

С1и

Агд

5ег

С1п

ТНг

Нт з

275

280

285

ТНг

С1и

Ьеи

5ег

11е

Ьеи

ТНг

11е

Нт з

Азп

Уа1

5ег

С1п

Азп

Азр

290

295

300

Ьеи

С1у

Рго

Туг

Уа1

суз

С1и

А1а

Азп

С1у

11е

С1п

Агд

РНе

Агд

305

310

315

320

С1и

5ег

ТНг

С1и

Уа1

11е

Уа1

Нт'з

С1и

Ьуз

Рго

РНе

11е

5ег

Уа1

С1и

325

330

335

Т гр

Ьеи

Ьуз

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

С1и

А1а

ТНг

А1а

С1у

Азр

С1и

Ьеи

Уа1

340

345

350

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

Туг

Рго

С1и

РНе

С1 п

Т гр

355

360

365

Туг

Ьуз

Азр

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

ТНг

С1у

Агд

Нт'з

Азп

Рго

Нт з

А1а

Ьеи

370

375

380

Уа1

Ьеи

ьуз

С1и

Уа1

ТНг

С1и

А1а

5ег

А1а

С1у

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

А1а

385

390

395

400

Ьеи

Т гр

Азп

5ег

А1а

С1у

Ьеи

Агд

С1п

Азп

11е

5ег

Ьеи

С1 и

Ьеи

405

410

415

Уа1

Азп

Уа1

Рго

Нт'з

11е

Нт'з

С1и

Ьуз

С1и

А1а

5ег

Рго

420

425

430

5ег

11е

Туг

5ег

Агд

Нт з

5ег

Агд

С1п

ТНг

Ьеи

ТНг

суз

ТНг

А1а

Туг

435

440

445

С1у

Уа1

Рго

С1п

Рго

Ьеи

5ег

Уа1

С1п

Тгр

Нт'з

Т гр

Агд

Рго

Тгр

ТНг

450

455

460

Рго

суз

ьуз

ТНг

РНе

А1а

С1п

Агд

5ег

Ьеи

Агд

С1п

С1 п

Агд

465

470

475

480

- 46 023331

Азр

С1у

Ме!

Рго С1п 485

Суз Агд Азр Тгр

Ьуз С1и Уа1 490

ТНг

С1п Азр 495

А1а

Уа1

Азп

Рго

11е

С1и

5ег

Ьеи

Азр

5ег

Т гр

ТНг

С1и

РНе

Уа1

С1и

500

505

510

С1у

Ьуз

Азп

Ьуз

ТНг

Уа1

5ег

Ьуз

Ьеи

Уа1

11е

С1п

Азр

А1а

Азп

Уа1

515

520

525

5ег

А1а

Ме!

Туг

Ьуз

Суз

Уа1

Азп

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

Азр

С1и

530

535

540

Агд

Ьеи

11е

Туг

РНе

Туг

Уа1

ТНг

11е

Рго

Азр

С1у

РНе

5ег

11е

545

550

555

560

С1и

5ег

С1и

Рго

5ег

С1и

Азр

Рго

Ьеи

С1и

С1у

С1п

5ег

Уа1

Агд

Ьеи

565

570

575

5ег

Суз

Агд

А1а

Азр

Азп

Туг

ТНг

Туг

С1и

Нт'з

Ьеи

Агд

Т гр

Туг

Агд

580

585

590

Ьеи

Азп

Ьеи

5ег

ТНг

Ьеи

Нт'з

Азр

А1а

С1п

С1у

Азп

Рго

Ьеи

595

600

605

Азр

Суз

Ьуз

Азп

Уа1

Нт з

Ьеи

РНе

А1а

ТНг

Рго

Ьеи

С1и

А1а

Азп

Ьеи

610

615

620

С1и

А1а

С1и

Рго

С1у

А1а

Агд

Нт'з

А1а

ТНг

Ьеи

5ег

Ьеи

Азп

11е

625

630

635

640

Рго

Агд

Уа1

А1а

Рго

С1и

Азр

С1и

С1у

Азр

Туг

Уа1

Суз

С1и

Уа1

С1п

645

650

655

Азр

Агд

5ег

С1п

Азр

Ьуз

Нт'з

Суз

Нт з

Ьуз

Туг

Ьеи

5ег

Уа1

660

665

670

С1п

А1а

Ьеи

С1и

А1а

Рго

Агд

Ьеи

ТНг

С1п

Азп

Ьеи

ТНг

Азр

Ьеи

675

680

685

Уа1

Азп

Уа1

5ег

Азр

5ег

Ьеи

С1и

Ме!

Агд

Суз

Рго

Уа1

А1а

С1у

А1а

690

695

700

Нт з

Уа1

Рго

5ег

11е

Уа1

Т гр

Туг

Ьуз

Азр

С1и

Агд

Ьеи

С1 и

Ьуз

705

710

715

720

С1и

5ег

С1у

11е

Азр

Ьеи

А1а

Азр

5ег

Азп

С1п

Агд

Ьеи

5ег

11е

С1п

725

730

735

Агд

Уа1

Агд

С1и

Азр

А1а

С1у

Агд

Туг

Ьеи

Суз

5ег

Уа1

Суз

Азп

740

745

750

А1а

Ьуз

С1у

Суз

Уа1

Азп

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

Уа1

С1и

С1у

5ег

755

760

765

- 47 023331

С1и Азр

Ьуз

С1у

5ег

Ме£

С1и 775

11е Уа1

11е

Ьеи

11е С1у ТНг С1у Уа1 780

770

11е

А1а

Уа1

РНе

Т гр

Уа1

Ьеи

11е

РНе

Суз

Азп

Ме£

785

790

795

800

Ьуз

Агд

Рго

А1а

Нт з

А1а

Азр

11е

Ьуз

ТНг

С1у

Туг

Ьеи

5ег

11е

805

810

815

Ме£

Азр

Рго

С1у

С1и

Уа1

Рго

Ьеи

С1и

С1п

Суз

С1и

Туг

Ьеи

5ег

820

825

830

Туг

Азр

А1а

5ег

С1п

Т гр

С1и

РНе

Рго

Агд

С1и

Агд

Ьеи

Нт з

Ьеи

С1у

835

840

845

Агд

Уа1

Ьеи

С1у

Нт з

С1у

А1а

РНе

С1у

Ьуз

Уа1

С1и

А1а

5ег

А1а

850

855

860

РНе

С1у

11е

Азп

Ьуз

С1у

5ег

Суз

Азр

ТНг

Уа1

А1а

Уа1

Ьуз

Ме£

865

870

875

880

Ьеи

Ьуз

С1и

С1у

А1а

ТНг

А1а

5ег

С1и

Нт з

Агд

А1а

Ьеи

Ме£

5ег

С1и

885

890

895

Ьеи

Ьуз

11е

Ьеи

11е

Нт з

11е

С1у

Азп

Нт з

Ьеи

Азп

Уа1

Азп

Ьеи

900

905

910

Ьеи

С1у

А1а

Суз

ТНг

Ьуз

Рго

Азп

С1у

Рго

Ьеи

Ме£

Уа1

11е

Уа1

С1и

915

920

925

РНе

Суз

Ьуз

Туг

С1у

Азп

Ьеи

5ег

Азп

РНе

Ьеи

Агд

Уа1

Ьуз

Агд

Азр

930

935

940

ТНг

РНе

Азп

Рго

Туг

А1а

С1и

Ьуз

5ег

Рго

С1и

С1п

Агд

РНе

945

950

955

960

Агд

А1а

Ме£

Уа1

С1и

С1у

А1а

Ьуз

А1а

Азр

Агд

Рго

С1у

5ег

965

970

975

5ег

Азр

Агд

А1а

Ьеи

РНе

ТНг

Агд

РНе

Ьеи

Ме£

С1у

Ьуз

С1у

5ег

А1а

980

985

990

Ьеи ТНг Ме£ С1и Азр Ьеи Уа1 Суз Туг 5ег РНе С1п Уа1 А1а Агд 1010 1015 1020

С1у Ме£ С1и РНе Ьеи А1а 5ег Агд Ьуз Суз 11е Нтз Агд Азр Ьеи 1025 1030 1035

- 48 023331

Суз Азр

РНе С1у

Ьеи А1а

Агд 1060

Азр

11е

Туг

Ьуз

Азр 1065

Рго

Азр

Туг

1055

Уа1

Агд

Ьуз

С1у

5ег

А1а

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьуз

Тгр

Ме!

А1а

Рго

1070

1075

1080

С1и

5ег

11е

РНе

Азр

Ьуз

Уа1

Туг

ТНг

С1п

5ег

Азр

Уа1

Тгр

1085

1090

1095

5ег

РНе

С1у

Уа1

Ьеи

Тгр

С1и

11е

РНе

5ег

Ьеи

С1у

А1а

5ег

1100

1105

1110

Рго

Туг

Рго

С1у

Уа1

С1п

11е

Азп

С1и

РНе

Суз

С1п

Агд

Ьеи

1115

1120

1125

Ьуз

Азр

С1у

ТНг

Агд

Ме!

Агд

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

ТНг

Рго

А1а

1130

1135

1140

11е

Агд

Нт з

11е

Ме!

С1п

5ег

Суз

Т гр

5ег

С1у

Азр

Рго

Ьуз

А1а

1145

1150

1155

Агд

Рго

А1а

РНе

5ег

Азр

Ьеи

Уа1

С1и

11е

Ьеи

С1у

Азр

Ьеи

1160

1165

1170

С1п

С1у

Т гр

С1п

С1и

Агд

Ме!

А1а

Ьеи

1175

1180

1185

Нт з

5ег

С1 п

5ег

С1и

Азр

С1у

РНе

Ме!

С1п

А1а

5ег

1190

1195

1200

ТНг

А1а

Ьеи

Нт'з

11е

ТНг

С1и

А1а

Азр

А1а

Азр

5ег

Рго

1205

1210

1215

Рго

5ег

Ме!

Нт з

Суз

Нт з

5ег

Ьеи

А1а

Агд

Туг

Азп

Суз

1220

1225

1230

Уа1

5ег

РНе

Рго

С1у

Агд

Ьеи

А1а

Агд

С1у

ТНг

Ьуз

ТНг

Рго

С1у

1235

1240

1245

5ег

Агд

Ме!

Ьуз

ТНг

РНе

С1и

Ьеи

Рго

Ме!

ТНг

Рго

ТНг

1250

1255

1260

ТНг

Туг

Ьуз

А1а

5ег

Ме!

Азр

Азп

С1п

ТНг

Азр

5ег

С1у

Ме!

Уа1

1265

1270

1275

Ьеи

А1а

5ег

С1 и

С1и

РНе

С1и

Ьеи

С1и

5ег

Агд

Нт з

Агд

Рго

1280

1285

1290

С1и

С1у

5ег

РНе

5ег

Суз

Ьуз

С1у

Рго

С1у

С1п

Нт з

Ме!

Азр

11е

1295

1300

1305

Рго

Агд

С1у

Нт з

Рго

Азр

Рго

С1п

С1у

Агд

Рго

ТНг

- 49 023331

1310

1315

1320

С1п

С1у

А1а

С1 п

С1у

1_у5

Уа1

РНе

Туг

А5п

С1и

Туг

С1у

1325

1330

1335

С1и

Уа1

5ег

С1 п

Рго

Су5

ТНг

С1и

С1у

А5р

Су5

Рго

5ег

А1а

1340

1345

1350

С1у

5ег

ТНг

РНе

А1а

А5р

5ег

Туг

1355

1360

<210> 22 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Ното 5артеп5 <400> 22

ТНг 1

С1и С1и

ТНг

11е 5

1_у5

РНе

А1а А1а

А1а 10

НТ5 Туг А5п ТНг

С1 и 15

11е

Ьей

1_у5

5ег

11е

А5р

А5п

С1и

Тгр

Агд

1_у5

ТНг

С1п

Су5

МеТ

Рго

Агд

20

25

30

С1и

Уа1

Су5

11е

А5р

Уа1

С1у

1_у5

С1и

РНе

С1у

Уа1

А1а

ТНг

А5п

ТНг

35

40

45

РНе

1_у5

Рго

Су5

Уа1

5ег

Уа1

Туг

Агд

Су5

С1у

Су5

50

55

60

А5п

5ег

С1и

С1у

Ьей

С1п

Су5

МеТ

А5п

ТНг

5ег

ТНг

5ег

Туг

Ьей

5ег

65

70

75

80

1_у5

ТНг

Ьей

РНе

С1и

11е

ТНг

Уа1

Рго

Ьей

5ег

С1п

С1у

Рго

1_у5

Рго

85

90

95

Уа1

ТНг

11е

5ег

РНе

А1а

А5п

НТ5

ТНг

5ег

Су5

Агд

Су5

МеТ

5ег

1_у5

100

105

110

Ьей

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антитело или его антигенсвязывающая часть, специфично связывающее νΕΟΡΚ-3 человека, которое включает Ε0ΌΚ1 с последовательностью 5Ε0 ГО № 1, Ε0ΌΚ2 с последовательностью 5Ε0 ГО № 2, Ε0ΌΚ3 с последовательностью 5Ε0 ГО № 3, Η0ΌΚ1 с последовательностью 5Ε0 ГО № 6, Η0ΌΚ2 с последовательностью 5>Ε0 ΙΌ № 7 и Η0ΌΚ3 с последовательностью 5Ε0 ГО № 8.
2. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которое включает вариабельный участок легкой цепи с последовательностью 5Ε0 ГО № 5 и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью 5>Ε0 ΙΌ № 10.
3. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанное антитело включает легкую цепь с последовательностью 5ΕΟ ГО № 15 и тяжелую цепь с последовательностью 5>ΕΟ ΙΌ № 16.

- 50 023331
4. Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.3, отличающееся тем, что указанное антитело включает две легкие цепи с последовательностью БЕЦ ГО № 15 и две тяжелые цепи с последовательностью БЕЦ ГО № 16.
5. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что:

a) связывание указанного антитела с УЕОРК-3 человека уменьшается по меньшей мере на 90% при точечной замене Рго-219 в УЕОРК-3 человека на Ьеи и

b) связывание указанного антитела с УЕОРК-3 человека уменьшается по меньшей мере на 50% при точечной замене Уа1-175 в УЕОРК-3 человека на А1а.
6. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что связывание указанного антитела с УЕОРК-3 человека уменьшается по меньшей мере на 50% при точечной замене Ьеи-221 в УЕОРК-3 человека на Уа1.
7. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, которое также связывает мутантный мышиный УЕОРК-3 с последовательностью БЕЦ ГО № 20 и мутантный мышиный УЕОРК-3 с последовательностью БЕЦ ГО № 21, причём связывание указанного мутантного мышиного УЕОРК-3 с последовательностью БЕЦ ГО № 20 увеличено больше чем в 50 раз по сравнению со связыванием мышиного УЕОРК-3 дикого типа (БЕЦ ГО № 19), а связывание мутантного мышиного УЕОРК-3 с последовательностью БЕЦ ГО № 21 увеличено больше чем в 10 раз по сравнению со связыванием мышиного УЕОРК-3 дикого типа.
8. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанное антитело имеет К_а от 1 х 10^-9 до 5.6х10^-11 М для УЕОРК-3 человека при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса с биосенсором В1АСОКЕ® 2000 при 20°С.
9. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанное антитело подавляет связывание УЕОР-С человека (БЕЦ ГО № 22) с УЕОРК-3 человека с 1С₅₀от 2 до 1.3 нМ.
10. Антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанное антитело подавляет стимулированный УЕОЕ-С митогенный ответ с 1С₅₀ от 10 до 5 нМ.
11. Фармацевтическая композиция для лечения рака, выбранного из группы, включающей рак яичников, эритролейкемию человека, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак толстой кишки и метастазы в лимфатических узлах, которая содержит антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-10 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит по меньшей мере один другой противоопухолевый агент.
13. Применение антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-10 в качестве лекарственного средства для лечения рака, выбранного из группы, включающей рак яичников, эритролейкемию человека, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак толстой кишки и метастазы в лимфатических узлах.
14. Применение антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-10 для лечения рака яичников, эритролейкемии человека, рака головы и шеи, рака молочной железы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака толстой кишки и метастазов в лимфатических узлах.