KR20170103767A - 전이성 질환을 치료하기 위한 rankl-특이적 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈액 중의 프리전이성 병변을 방지 또는 감소시키도록 암 환자를 치료하는데 사용하기 위한, 핵 인자 카파-B 리간드의 인간 혈소판-발현된 수용체 활성자 (pRANKL)를 인식하는 RANKL-특이적 길항제를 제공한다.

Description

전이성 질환을 치료하기 위한 RANKL-특이적 제제{RANKL-SPECIFIC AGENT FOR TREATING METASTATIC DISEASE}
본 발명은 암 환자의 치료에 사용하기 위한, 핵 인자 카파-B 리간드의 인간 혈소판-발현된 수용체 활성자 (pRANKL)를 인식하고 임의로 중화시키는 RANKL-특이적 길항제, 선도 후보제를 확인하는 방법, 및 암 환자의 전이 잠재력을 예측하는 방법에 관한 것이다.
연구 개발의 큰 분야는 암의 치료에 초점을 맞추고 있다. 개발 중인 제품은 키나아제 억제제부터 혈관신생 억제제, 종양 표적에 대한 단일클론 항체, 세포자멸 유도제, 항-종양 예방접종, 및 다양한 종양 표적에 대해 다양한 세포독성 효과를 갖는 통상의 화학요법제까지 걸쳐 있다. 암 환자의 예후는 주로 전이를 일으킬 위험에 의해 결정된다.
전이 동안, 호스트 세포는 피종된 종양 세포에 모집되어 전이 진행을 촉진하는 특수 미세환경 ["니치 (niche)"]을 형성하지만 이러한 니치의 어셈블리를 유도하는 메커니즘은 거의 알려지지 않았다. 예를 들어, Labelle 등 (PNAS 2014, E3053-3061)은, 종양 세포-유래된 신호보다는 혈소판-유래된 신호가 "초기 전이성 니치" 형성을 위해 과립구의 종양 세포로의 신속한 동원에 필요하다고 기재한다. 혈소판은 순환을 통해 이의 이동 동안 종양 세포와 상호작용하여 혈소판-종양 세포 응집체 (aggregate)를 형성하고 다중 기전을 통해 전이를 촉진시키는 것으로 기술되어 있다.
Gay 등 (Nature Reviews 2011, 11: 123-134)은 종양 전이에 대한 혈소판의 영향을 검토한다. 특히, 순환계 내에서 혈소판은 종양 세포를 면역 제거로부터 보호하고 내피에서의 어레스트 (arrest)를 촉진하여 이차 병변 (lesion)의 형성을 지지한다. 종양 세포에 대한 혈소판의 부착 및 혈소판 헤테로응집체로의 통합은 NK 세포 활성으로부터 종양 세포를 보호하는 것으로 기술되어 있다.
골 전이는 심각한 질환 부하 (burden)와 고통을 초래하는 많은 암의 빈번한 합병증이다. RANK (NF-kB의 수용체 활성자) 리간드 (RANKL)에 의한 암세포 이동 및 골 전이의 조절은 Jones 등 (Nature 2006, 440: 692-696)에 의해 기술되었다. RANKL은 수용체 RANK를 발현하는 인간 상피암 세포 및 흑색종 세포의 이동을 유발한다. RANK는 환자의 일련의 암세포주와 암세포에서 발현된다. 흑색종 전이의 마우스 모델에서, 오스테오프로테게린 (osteoprotegerin)에 의한 RANKL의 생체 내 중화는 마비로부터의 완전한 보호 및 골에서 종양 부하의 현저한 감소를 초래하지만, 다른 기관에서는 그렇지 않다. 골의 미세환경에 의해 생성된 RANKL은 RANK-양성 종양 세포의 비옥한 토양으로 간주된다.
Dougall 등(BoneKEy Reports 2014, 3: 519)은 RANK는 이의 동족 (cognate) 수용체 (RANK)를 통해 파골세포의 기능과 생존에 필수적인 매개자라고 기술하고 있다. 전임상 데이터는 RANKL 억제에 의한 종양-유도된 파골세포 생성의 봉쇄가 골 파괴를 막을 뿐만 아니라 확립된 골 전이의 진행을 억제하고 암 모델에서 신생 골 전이의 형성을 지연시킬 것을 확고히 하였다. 골 전이가 있는 환자에서 골격 합병증은 파골세포의 활성 증가로 인해 유발되며, 병리학적 골절, 척수 압박이 생기고, 골에 대한 방사선요법 또는 정형 외과 수술을 필요로 할 수 있다 (골격-관련 증상 (SLE)으로 통칭). RANKL에 대한 완전한 인간 단일클론 항체인 Denosumab은 골로 전이된 고형 종양 환자의 SRE를 예방하거나 지연시키는 것으로 기술되어 있다. 종양-유도된 골 용해, 골 파괴 및 골격 종양 진행에서의 중심 역할 외에도, 파골 세포와 무관하게 RANKL의 직접적인 프로전이 (prometastatic) 효과에 대한 증거가 나타나 있다. 예를 들어, RANKL은 또한 RANK-발현 암세포에서의 활성을 통해 전이를 자극하여 침입 및 이동을 증가시킨다.
Tan 등 (Nature 2011, 470 (7335): 548-553)은 섬유아세포-모집된 종양 침윤 CD4+ T 세포가 RANKL-RANK 시그널링을 통해 유방암 전이를 자극한다고 기술하고 있다.
Denosumab은 Prolia라는 상품명으로 골다공증 위험이 있는 폐경기 여성에서 사용하기 위해, 또한 Xgeva로 고형 종양으로부터 골 전이가 있는 환자의 SRE를 예방하기 위해 미국 식약청 (FDA)의 승인을 받았다. 임상 시험은 거대한 세포 종양, 골 전이가 있는 다발성 골수종 및 악성 종양의 고칼슘혈증에서 Denosumab을 조사하였다.
RANK/RANKL을 표적하는 치료법은 특히 Denosumab, 재조합 RANK-Fc (Schmiedel 등, 2013, Cancer Res. 73 (2): 683-94) 또는 RANKL-나노바디 (WO2008142164A2)와 같은 RANKL-특이적 결합제를 포함한다. RANKL-결합 펩타이드는 골 흡수 및/또는 파골세포 활성을 억제하는 것으로 기술되어 있다 (WO2012163887A1).
진행된 고형 종양 환자에서의 골 전이에 대한 Denosumab의 효과는 일련의 문헌, 예를 들어, 문헌 [Rolfo Christian 등 (Expert Opinion on Biological Therapy, Vol.14, no.1, 2014, pp 15-26), Scagliotti Giorgio Vittorio 등 (Journal of Thoracic Oncology, vol. 7, no. 12, 2012, pp 1823-1829), Morikawa K. 등 (Database Embase, Elsevier Science publishers, Amsterdam, XP002736136, Japanese Journal of Lung Cancer, vol. 52, no. 7, 2012, pp 1035-1040), Takeshi Yuasa 등 (Oncotargets and Therapy, vol.5, 2012, pp 221-229), Hilbe Wolfgang 등 (Magazine of European Medical Oncology, AT, vol. 6, no. 2, 2013, pp. 75-82), Laszlo Kopper (Pathology & Oncology Research, vol. 18, no. 4, 2012, pp. 743-747), Sonya Sarah Payton (Nature Reviews Urology, vol. 9, no. 1, 2011, pp 1-1), J. Snedecor 등 (Clinical Therapeutics, vol. 34, no. 6, pp. 1334-1349), WO 2013/176469 및 DATABASE WPI, Thomson Scientific, London, GB, XP002736138; US 2012/1 14665 A1 및 WO 01/08699 A1]에 기술되어 있다.
Nakanishi 등 (Platelets 2014, Early Online 1-7)은 수지상 세포 (DC)가 매개하는 Th2 반응을 향상시켜 알레르기 염증에 기여하는 혈소판의 역할을 기술한다. 트롬빈 수용체 효능제 펩타이드 (TRAP)-활성화된 혈소판은 RANKL을 발현하고 골수성 DC의 성숙을 유도하는 것으로 밝혀졌다.
B.A. Kerr 등 (Oncogene, vol.32, no.36, 2013, pp 4319-4324)은 골에 대한 프리-전이성 (pre-metastatic) 종양 소통을 조절하는 혈소판의 역할을 기술하고 있다.
Sharma Deva 등 (Journal of Cellular Physiology, vol. 229, no. 8, 2014, pp. 1005-1015)은 종양 진행에서 혈소판의 역할을 기술한다. 혈소판은 종양 세포를 면역 숙주 반응으로부터 보호하고 종양 세포 생존을 촉진하는 것으로 기술되어 있다.
Esposito Mark 등 (Pharmacology and Therapeutics, GB, vol. 151, no. 2, pp. 222-233)은 골 전이에서의 종양 간질 상호작용의 표적화를 기술한다. 순환 종양 세포 생존은 TGFbeta의 혈소판 분비 및 혈소판 응집체의 형성에 의해 증가된다는 것이 기술되어 있다.
본 발명의 목적은 전이성 질환의 개선된 치료 및 각각의 항-전이성 제제를 제공하는 것이다.
상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.
본 발명은 혈액 중의 프리전이성 (premetastatic) 병변을 방지 또는 감소시키도록 암 환자를 치료하는데 사용하기 위한, 핵 인자 κ-B 리간드의 인간 혈소판-발현된 수용체 활성자 (pRANKL)를 인식하는 RANKL-특이적 길항제를 제공한다. 구체적으로, 의학 용도는 혈소판과 암세포와의 프리전이성 순환 세포 응집체를 방지 또는 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 응집체는 특히 pRANKL을 발현하는 활성화된 혈소판과 같은 혈소판을 포함한다. 구체적으로, RANKL-특이적 길항제는 혈액 내에서 이러한 프리전이성 순환 세포 응집체의 형성시 전이를 용이하게 하는 RANK-RANKL 상호작용시 신호의 전달을 방지하거나 또는 혈액 내에서 이러한 프리전이성 순환 세포 응집체의 형성을 방지하기 위해 유효량으로 사용된다.
특히, pRANKL을 결합 및 중화시키는 것은
a) 프리전이성 종양 세포의 파종 (dissemination),
b) 혈소판 및/또는 암 (또는 종양) 세포가 활성화되어 pRANKL을 발현시키거나 RANK-RANKL 시그널링을 유도 (이로써 세포가 프로전이성이 되는 변형 (tranformation)을 억제), 및/또는
c) 선택적으로 전이 형성이 뒤 따르는, 혈행 (haematogeneous) 확산을 일으킬 위험
을 억제할 것이다.
pRANKL은 특히 암세포와 상호작용할 때 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본원에 기재된 제제에 의한 pRANKL의 억제 또는 중화는 프리전이성 병변을 하향 조절할 것이다.
프리전이성 병변은 전형적으로 전구 병변의 세포를 수반하며, 이는 암이 되기 전, 또는 암세포의 경우엔 전이가 되기 전, 세포의 외관 또는 성질의 변화에 의해 특징지워진다.
따라서, 본 발명은 암 환자가 프리전이성 병변을 방지 또는 감소시키기 위해 유효량의 상기 제제로 치료되는 새로운 치료 방법을 제공한다.
특히, 암세포는 RANK-양성 암세포에서 유래한다. 암세포는 RANK-양성 종양-형성 암세포 또는 종양세포, 특히 고형 종양세포, 또는 혈액 및 혈액-생성 기관을 포함하는 RANK 양성 암세포, 예를 들어, 백혈병일 수 있다. 구체적으로, 프리전이성 병변은, 니치를 형성함으로써 암 전이를 촉진하거나 예를 들어 원거리 기관에서 전이 또는 골 전이를 발병시키는 위험을 증가시키는 순환성 프리전이 세포 클러스터로 고려되는, 활성화된 혈소판-암세포 응집체를 측정함으로써 확인된다. 암세포는, 활성화된 혈소판과 상호작용할 때, RANKL 양성 암세포로 변형될 수 있으며, 이는 프리전이성 병변의 또 다른 특징이다. 그러한 혈소판-암세포 응집체는 혈액-유래 (blood-borne)이기 때문에, 전이성 위험 또는 잠재력은 혈액-유래성 또는 혈행성으로도 불린다.
상기 제제는 pRANKL만을 특이적으로 인식하고 중화시키거나 다양한 형태의 RANKL을 교차-특이적으로 인식할 수 있다. 구체적으로, 상기 제제는 pRANKL, 및 핵 인자 카파-B 리간드의 가용성 수용체 활성자 (sRANKL) 및 핵 인자 카파-B 리간드의 막-결합 활성자 (mRANKL) 중 적어도 하나, 또는 둘 모두를 인식하고 선택적으로 중화시키는, 교차-반응성이다.
구체적으로, 상기 제제는 인간 RANKL의 전체 아미노산 서열 (서열번호 3), 또는 특히 RANKL 또는 pRANKL 및 선택적으로 임의의 다른 형태의 RANKL에 대한 RANK의 결합과 경쟁하여 RANK-RANKL 시그널링을 실질적으로 억제하는, pRANKL의 세포외 부분의 에피토프 (예를 들어, 서열번호 3의 AA 69-AA 317)를 포함할 수 있는 RANKL 폴리펩타이드를 인식한다.
구체적으로, 상기 제제는 pRANKL에 결합하여, pRANKL이 암세포, 예를 들어, 파종 또는 전이 종양세포 상의 그의 수용체를 활성화시키는 것을 억제한다.
구체적으로, 상기 제제는, pRANKL 단량체, 또는 다량체, 예컨대 혈소판의 표면 상에서 상호작용하는 RANKL 분자의 다량체에 결합하며, 예를 들어, 하나 이상의 pRANKL 분자는 혈소판의 표면 상에 결합되어 서로 상호작용하고/하거나 혈소판에 결합되지 않은 하나 이상의 RANKL 분자, 또는 sRANKL과 상호작용한다. 이러한 다량체는, 바람직하게는 혈소판 표면-결합된 pRANKL 및/또는 혈소판 표면으로부터 절단된 pRANKL, 및/또는 sRANKL, 및/또는 mRANKL과 복합체를 형성하는, 이량체 또는 삼량체 또는 그 이상의 다량체일 수 있다. 따라서, 결합은, 예를 들어, 혈소판의 표면 상에서, 혈소판과 암세포 사이의 미세환경에서, 또는 혈소판 표면으로부터의 pRANKL의 절단 시 순환물에서 일어날 수 있다.
구체적으로, 전이는 원거리 기관, 예를 들어, 폐, 간, 장, 피부, 근육, 비장, 췌장, 신장, 골 또는 뇌 중 임의의 기관에서 종양 세포 응집과 함께 혈액-유래이다. 구체적으로, 원발성 고형 종양 또는 혈액 및 림프계의 암을 앓고 있는 환자에서 혈행 전이성 질환의 발병 위험을 효과적으로 줄일 수 있다.
구체적으로, 암 환자는 최소 잔류 질환 및/또는 전이성 질환의 재발의 위험 또는 이를 앓고 있으며, 선택적으로 환자는, 예를 들어 전혈 또는 이의 혈액 분획 중 파종된 종양 세포수 또는 특이적 종양 세포 마커에 의해 측정되는, 검출가능한 수준의 순환 종양 세포를 혈액 샘플 중에 갖는다. 검출 가능한 수의 종양 세포는, 예를 들어, 적어도 5 mL, 7.5 mL 또는 10 mL의 전혈 샘플에서 10개 미만, 또는 5개 미만, 또는 4, 3, 2, 또는 1개의 순환 종양 세포를 포함한다.
특정 양태에 따라, 환자는 상피 종양 및 중간엽 종양, 또는 내배엽, 중배엽 및/또는 외배엽 기원의 종양으로 구성된 군으로부터 선택된 고형 종양, 또는 백혈병과 같은 혈액-유래 암을 겪는다.
특히, 환자는 유방암, 췌장암, 위암, 식도암, 신장 세포암, 폐암, 결장/직장/직장결장암, 흑색종, 전립선암, 두경부암 또는 백혈병을 겪는다.
특정 양상에 따르면, 치료는 종양의 적어도 일부를 제거하기 위한 외과적 중재 (surgical intervention) 및/또는 방사선요법과 병용되고, 제제는 네오애주번트 (neoadjuvant) 또는 애주번트 (adjuvant) 요법을 위해 투여된다. 따라서, 환자는 구체적으로 외과적 중재 및/또는 방사선요법을 준비 중이거나 이를 받고 있거나, 외과적 중재 및/또는 방사선요법으로 치료를 받았으며, 수술 전후에 본 발명에 따른 제제로 추가로 치료된다. 구체적인 예에 따르면, 이러한 치료는 수술 전 1 내지 30일 또는 수술 중 또는 수술 후 1 내지 30일 사이에 시작될 수 있으며, 상기 제제는 연속적인 기간 동안, 예를 들어, 1 내지 12개월 또는 그 이상 동안 투여될 수 있으며, 이때 상기 제제는 규칙적인 간격으로 투여된다. 외과적 중재는, 예를 들어, 종양 매쓰의 치료적 제거 또는 생검이다. 수술은 종양 세포를 혈류로 파종시켜 혈소판-종양 세포 응집체 형성을 유발하는 특정 위험 요소로 간주된다. 마찬가지로, 방사선요법은 종양 세포의 혈행 확산을 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 고형 종양 세포를 잠재적으로 파종시키는 수술 및/또는 방사선요법과 조합하여 구체적으로 지시된다.
특정 양상에 따르면, 상기 제제는 애주번트 또는 네오애주번트 병용 요법, 바람직하게는 화학 요법, 키나아제 억제제 요법 및/또는 면역요법과 병용하여 환자에게 투여된다. 이러한 병용 요법은 특히 암세포, 예를 들어, 상피 암세포 마커, 가용성 인자 또는 항-혈관형성 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 것과 같은 임의의 종양 관련 항원을 표적할 것이다.
특정 양상에 따르면, 상기 제제는 항체, 항체 단편, 수용체-융합 단백질, 예를 들어, RANK-Fc 융합 단백질, 펩타이드, 예를 들어, 오스테오프로테게린의 불활성화된 형태, 또는 이의 단편, 소분자, 예를 들어, RANK-특이적 유기 저분자, 또는 앱타머 (aptamer)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 예시적인 소분자는 RANKL 및 TNF의 소분자 억제제이며, 예를 들어, 문헌 (Coste E, 등 Ann Rheum Dis 2015; 74: 220-226. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-203700)에 기재되어 있다. 특정 예는 1kB의 RANKL-유도된 인산화 및 세포외 신호-조절된 키나아제 (ERK)를 억제할 수 있는 부탄디올 비페닐카르복실산 에스테르의 유도체이다. 예를 들어, 에스테르 결합이 케톤으로 대체된 화합물, 예컨대 하기 화학식으로 특징지어지는 ABD328 및 ABD345가 사용될 수 있다:
Figure pct00001
ABD328 ABD345
구체적으로, 상기 제제는 인간 또는 인간화 항체, 예를 들어 Denosumab, 또는 이의 기능적 변이체, 또는 이전의 것 중 임의의 것의 항원-결합 단편, 또는 RANK-Fc 융합 단백질이다. Denosumab (Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)은 RANKL에 특이적인 완전 인간 IgG2 단일클론 항체이며, 다양한 전이성 종양 환자에서 골 흡수 마커를 억제하는 것으로 기술되어 있으며, 골 전이의 예방 및 치료를 위한 여러 임상 시험에서 연구 중이다. 화학적으로, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 구성된다. 각 경쇄는 215개의 아미노산으로 이루어져 있다. 각 중쇄는 448개의 아미노산과 4개의 분자내 디설파이드로 구성된다. 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되며; 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시된다.
구체적으로, 상기 제제는, Fc 효과기 (effector) 기능을 감소시키도록 조작된 (예를 들어, FcxRIIIa 또는 CD16에 유의적으로 결합하지 않는), 인간 IgG1 Fc와 같은 Fc 항체 단편을 포함하며, 따라서 유의한 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)을 나타내지 않는다. Fc 효과기 기능을 감소시키기 위한 포인트 돌연변이를 포함하는 예시적인 Fc 단편은 E233P, L234V, L235A, deltaG236, A327G, A330S의 돌연변이 중 적어도 하나에 의해 특징지어지며, 여기서 명명법은 Kabat의 EU 지표에 따른다.
다르게는, 상기 제제는 ADCC와 같은 Fc 효과기 기능 (예: FcxRIIIIA 또는 CD16에 결합)을 갖는 Fc 항체 단편, 예컨대 인간 IgG1 Fc를 포함한다. 이러한 제제는, 면역계의 효과기 세포가 혈소판 및/또는 암세포, 바람직하게는 암-혈소판 응집체인 표적 세포를 능동적으로 파괴하는, 세포-매개된 면역 방어의 추가 이점을 가질 것이다.
특정 양상에 따르면, 상기 제제는 전신 투여, 바람직하게는 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다.
Denosumab을 사용한 선행 기술 요법은 일반적으로 피하 치료를 포함한다. 본 발명은 RANKL을 발현하는 활성화된 순환 혈소판 또는 순환 혈소판-암세포 응집체을 표적으로 할 것이다. 따라서, 정맥내 경로가 특히 바람직하다.
바람직한 투여량은, 예를 들어, 0.5 내지 1000mg, 바람직하게는 1 내지 400mg의 범위이다. 피하 투여하는 경우, 바람직한 투여량은 0.5 내지 400 mg 범위이다.
본 발명은 암 환자, 예를 들어, 고형 종양의 적어도 일부를 제거하기 위한 외과적 중재 및/또는 방사선요법을 준비 중이거나 받고 있는 환자, 또는 이러한 외과적 중재 및/또는 방사선요법을 받은 환자에서 프리전이성 병변 또는 최소 잔류 질환 및/또는 전이성 질환의 재발을 예방 또는 치료하는데 효과적인 선두 후보제를 확인하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 세포-기반 분석으로 하나 이상의 시험 제제를 스크리닝하는 것을 포함하며, 상기 분석은
a) 암세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 세포 배양물을 시험 제제를 갖는 반응 혼합물 중에서 인간 혈소판과 접촉시키는 단계; 및
c) 시험 제제가
i) pRANKL에 의한 RANK 시그널링을 억제하고/하거나;
ii) 암세포에 결합하는 혈소판의 수준을 감소시키는지를 검출하고,
이로써 프리전이성 병변을 예방 또는 치료하기 위한 선도 후보제, 및 선택적으로 암 환자에서 최소 잔류 질환 및/또는 전이성 질환의 재발을 예방 또는 치료하는 이의 잠재력을 확인하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 검출 단계 c)는 시험 제제가
i) pRANKL에 의한 RANK 시그널링을 억제; 및
ii) 암세포에 결합하는 혈소판의 수준을 감소
시키는지 둘 모두를 시험하는 것을 포함한다.
구체적으로, 활성화된 혈소판, 예를 들어, 트롬빈-활성화된 혈소판, 또는 pRANKL을 발현하도록 암 또는 종양 세포에 의해 활성화된, 예를 들어, RANKL-음성 종양 세포에 의해 활성화된 혈소판이 이러한 스크리닝 분석에 사용된다.
구체적으로, 분석은 효능제 (RANKL)에 의해 매개되는 수용체 (RANK) 시그널링을 억제하는 추정적 길항제 (시험 제제)의 능력을 측정하는 기능적 길항제 또는 중화 분석이다. 예를 들어, 화합물이 실질적으로 수용체-매개된 시그널링을 억제하는 경우, 화합물은 RANKL-특이적 길항제로서 확인될 수 있다.
본 발명은 암 환자에서 전이 잠재력을 예측하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은
a) 말초 혈액의 샘플 또는 혈소판 함유 혈액 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 샘플에서 pRANKL 발현을 측정하고 기준 값과 비교하는 단계를 포함하며, 차별적 발현은 프리전이성 병변 및 원거리 전이가 발생할 증가된 잠재력을 나타낸다.
예를 들어, 샘플 또는 혈소판은 규정된 전이 잠재력을 갖는 표준 암세포와 함께 인큐베이션될 수 있고, 혈소판-암세포 상호작용에 의한 RANK 시그널링 수준을 측정하여 특정 전이 잠재력에 대한 기준 값을 얻을 수 있다. 마찬가지로, 혈소판은 트롬빈으로 활성화될 수 있고, 샘플에서의 pRANKL 수준은 표준과 비교하여 측정될 수 있다.
pRANKL 발현은, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 또는 pRANKL 폴리펩타이드, 또는 그의 단편의 발현과 같은 pRANKL 발현 수준으로 측정된다. 그 수준은 정성적으로 측정될 수 있지만 반정량적으로 또는 정량적으로 측정될 수도 있다.
기준값은 양성 또는 음성 대조군 또는 둘다로부터 유도될 수 있다. 양성 대조군은, 예를 들어, 전이성 질병 상태로 고통받는 암 환자로부터의 혈소판의 pRANKL 발현 수준을 나타낸다. 음성 대조군은, 예를 들어. 건강한 대조 피험체의 pRANKL 발현 수준을 나타낸다.
도 1: RANKL 트랜스펙션된 흑색종 세포를 이용한 폐 전이 모델. 인간 RANKL (RANKL+)를 발현하도록 트랜스펙션시킨 마우스 B16-F10 흑색종 세포 (ATCC) (검은색으로 확인됨) 또는 대조군 세포 (모)를 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. B16-F10 세포 (마우스 당 100,000개 세포). 혈류를 통해 심장을 통과한 후 악성 세포가 폐로 파종된다. 동물 폐의 전이성 부하가 3주 후에 분석되었으며, RANKL+ 세포가 사용되었을 때 향상된 RANKL-매개된 시그널링에서 전이가 크게 증가하였다. 이것은 폐에 있는 검은색 영역과 파괴된 폐 구조의 더 많은 양에 의해 드러난다.
도 2: 정지 (resting) 및 활성화된 혈소판 ( thrombocyte ) 상의 RANKL 발현.
건강한 공여자의 인간 혈소판을 혈액 샘플의 원심 분리에 의해 분리한 다음, 0.2 U/ml의 고전적 혈소판 효능제인 트롬빈으로 자극하거나 (활성화) 비처리하였다 (정지). 활성화 마커 P selectin (CD62P) 및 RANKL의 혈소판 표면 발현을 유세포 측정으로 분석하였다.
도 3: RANK- Fc -KO의 구조. RANK-Fc-KO 융합 단백질은 인간 수용체 RANK의 세포외 도메인 (Q25-P207, Gen Bank Reference NP_0003830) 및 친화력 및 결과적으로 Fc 수용체 CD16에 대한 결합을 감소시키기 위해 아미노산 교환 E233P/L234V/L235A/△G236/A327G/A330S; Armor 등 2003, Mol Immunol. 40 (9): 585-93; Schmiedel 등 2013)를 갖는 인간 IgG1 Fc 부분 (P217-K447)으로 구성된다. 여기에서, 모든 번호는 Kabat [EU-lndex]에 따른다.
도 4: RANK- Fc -KO를 이용한 폐 전이 모델. 모 B16-F10 흑색종 세포를 표시된 수의 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다 (마우스 당 75,000개). 추가로, 상이한 그룹의 마우스를 종양 세포 주사 24시간 전 3 μg/g의 항-GPIbα 항체 적용에 의한 혈소판 고갈, RANK-Fc-KO (마우스 당 100 μg, 종양 세포 주사 당일, 2일 및 4일 후 반복됨) 및 지시된 바와 같은 적합한 대조군 (ctrl)으로 처리하였다. 폐 전이의 수는 3주 후에 생쥐를 희생시킨 후에 계산되었다.
도 5: RANKL 차단에 의한 불멸화된 MCF10A 세포에서 혈소판-유도된 (프로전이성) EMT 시그널링의 방지. EMT 분석을 위한 표준 모델로서 MCF10A 세포 (ATCC)를 (A) RANKL 및 (B) 중간엽 표현형 ZEB (Zink finger E-box binding homeobox 1, 좌측 컬럼) 및 NCadherin (우측 컬럼)에 대한 마커에 대해 정량적 실시간 PCR로 연구하였다. 이를 위해, RNA를 단리하고, 역전사하여 통상의 기술로 SYBR-그린에 기초한 PCR을 수행 하였다.
(A) MCF10A 세포와 적절한 대조군의 표적물 (RANKL) 대 참조물 (RPL13) 유전자 발현의 비율이 표시된다. 그 결과는 음성 대조군과 MCF10A 세포 간에 차이가 없으므로 MCF10A 세포 자체가 RANKL을 발현한다는 것을 배제시킨다.
(B) MCF10A 세포에서의 프로전이성 EMT 유전자 시그니처 (signature) 분석을 배양 2일 후 단독으로 (비처리) 또는 RANKL-중화 항체 Denosumab (10 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 혈소판 (혈소판/종양 세포 5:1 비율)으로 수행하였다. 혈소판 존재는 Denosumab의 존재로 인해 실질적으로 감소되었던 전이성 EMT 유전자 발현에 대한 마커로서 ZEB 및 NCadherin mRNA 발현을 유도하였다.
도 6: 서열
Denosumab 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열:
서열번호 1: 중쇄
서열번호 2: 경쇄
인간 RANKL 아미노산 서열 (GenBank: AAB8681.1.1):
서열번호 3: 전장 서열
도 7: RANKL의 중화는 불멸화된 MCF10A 세포의 혈소판-유도된 이동을 방지한다. 1 x 105 MCF10A 세포를 트랜스웰 삽입물 (8 μm 공극 크기)의 상부 챔버에 단독으로 (비처리) 또는 RANKL-중화 항체 Denosumab의 존재 또는 부재하의 인간 혈소판 (1.5 x 105/μl) 또는 각각의 이소타입 대조군 (각각 5㎍/ml)과 함께 시딩하였다. 인큐베이션 24시간 후, EGF (20 ng/ml)를 하부 챔버에 첨가하여 화학유인물질로 작용시켰다. 총 48 시간 인큐베이션한 후, 막 위쪽의 비-운동성 세포를 제거하고 아랫쪽의 이동된 세포를 고정시키고 DAPI로 염색하고 현미경으로 계수하였다.
도 8: 혈소판-특이적 RANKL 녹아웃 마우스를 이용한 폐 전이 모델. RANKL 유전자가 loxP 부위에 의해 플랭킹된 B6.129-Tnfsf11 tm1.1Caob/J 마우스 및 거핵세포/혈소판 특이적 재조합효소 (이하 Pf4cre)를 포함하는 C57BL/6-Tg(Pf4-cre)Q3Rsko/J 마우스를 The Jackson Laboratroy (Bar Harbor, ME USA)로부터 입수하고, 사육하여 RANKL이 거핵세포/혈소판에서 특히 녹아웃된 RANKL fl/fl Pf4 cre/+ 녹아웃 (ko) 마우스를 생성하였다. 혈소판-발현된 RANKL의 효과를 측정하기 위해, B16-F10 흑색종 세포 (마우스 당 75,000개)를 RANKL fl/fl Pf4 cre/+ 녹아웃 (ko) 마우스 및 C7BL/6 대조군 마우스 (ctrl) (ko, n=8 동물; ctrl, n=5 동물)의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 폐 전이의 수는 3주 후에 마우스를 희생시킨 후에 계산되었다.
도 9: RANKL의 중화는 SK-Mel 흑색종 세포에서 혈소판-유도된 프로전이성 EM T 시그널링을 방지한다. (A) SK-Mel (ATCC) 세포는 항-RANKL 항체 (채워진 히스토그램) 또는 각각의 이소타입 대조군 (점선)을 사용한 유세포 계측에 이어 항-마우스-PE로 분석되었다. 이소타입 대조군과 RANKL-특이적 항체-결합 간에 차이는 관찰되지 않았으며, 이로써 SK-Mel 세포 자체가 RANKL을 발현하는 것을 배제하였다.
(B) SK-Mel 흑색종 세포에서 프로전이성 EMT 유전자 시그니처의 분석은 배양 1일 후 단독으로 (비처리) 또는 혈소판 (혈소판/종양 세포 200:1 비율) 또는 혈소판 및 RANKL-중화 항체 Denosumab (5μg/ml)로 수행하였다. 이어서, 중간엽 표현형인 ZEB (Zink finger E-box binding homeobox 1), Twist 및 Vimentin에 대한 마커를 정량적 실시간 PCR로 분석하였다. 이를 위해, RNA를 단리하고, 역전사하여 통상의 기술로 SYBR-그린에 기초한 PCR을 수행하였다.
혈소판의 존재는 Denosumab의 존재에 의해 실질적으로 감소되었던 3개의 마커 유전자 모두의 프로전이성 mRNA 발현을 유도하였다.
본원에 사용된 용어 "애주번트 (adjuvant)"는, 예를 들어, 개선된 요법을 위해, 외과적 중재 및/또는 방사선요법 동안 또는 후에 암을 치료하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "네오애주번트 (neoadjuvant)"는, 예를 들어, 개선된 요법을 위해, 외과적 중재 및/또는 방사선요법 전에 암을 치료하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "RANKL-특이적 길항제"는 실질적으로 RANKL을 중화하고/하거나 그의 수용체 RANK에 대한 RANKL의 결합을 감소 또는 억제함으로써 RANK-RANKL 시그널링 경로를 길항시키는 RANKL 결합제인 화합물을 지칭한다.
상기 제제의 길항 작용은 구체적으로 효능제 (RANKL)에 의해 활성화된 수용체 (RANK)에 대한 세포 반응의 감소, 억제 또는 방지로 특징지어진다. 길항제는 특히 동일한 결합 부위에서 RANKL에 가역적으로 결합하거나 반드시 수용체를 활성화시키지는 않으면서 내인성 수용체로서 결합 부위 (활성 부위)를 방해할 수 있는 경쟁적 길항제이다.
상기 제제는 예를 들어 하기로부터 선택되는 임의의 적합한 결합제 또는 리간드일 수 있다: 작은 유기 또는 무기 분자, 탄수화물, 생물학적 마크로분자, 펩타이드, 단백질 (본원에서 폴리펩타이드라고도 함), 펩타이드 유사체, 펩타이드 모사체 (peptidomimetic), 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 항체, 핵산, 핵산 유사체, 및 상기의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, RANKL-특이적 길항제는 면역 치료제이다. 상기 제제의 특정 예는 항체, 수용체 또는 오스테오프로테게린 (그의 수용체 RANK에 대한 효능적 RANKL 결합을 피하기 위해, 불활성이거나 불활성으로 됨), 수용체-융합 단백질, 예를 들어, RANK-Fc 융합 단백질, 펩타이드, 앱타머 또는 소분자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
길항제를 생산하고 특성화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 실시양태에서, 길항적 결합제는 하나 이상의 세포-기반 검정법을 사용하여 미리 정의된 특성에 대해 생성되고 스크리닝된다. 이러한 분석법은 종종 세포 생존, 세포자멸, 세포 형태의 변화, 또는 자연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 발현과 같은 전사 활성화와 같은 결합제에 대한 세포의 반응을 모니터링하는 것을 포함한다.
재조합 폴리펩타이드 길항제의 생산은 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위해, 예를 들어, 폴리펩타이드를 암화화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 제작물 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템을 사용하는 것이 바람직하다.
한 실시양태에서, 길항제는, 예를 들어, 잠재적 약물 후보를 함유하는 조합 라이브러리 (랜덤 또는 세미-랜덤), 예를 들어, 펩타이드 라이브러리, 항체 라이브러리, 또는 화학적 화합물 라이브러리를 사용하는 스크린을 포함하는, 약물 발견 프로세스를 통해 확인된다. 스크린은 예를 들어 스크린을 사용하여 높은 처리량 방식으로 수행될 수 있고, 선택적으로 활성 RANK/RANKL 상호작용과 비활성 또는 차단된 RANK/RANKL 상호작용을 구별할 수 있다. 생물학적 스크린은 특히 pRANKL을 표적으로 하는 새로운 길항제를 찾는 것을 목표로 할 수 있다
RANK-RANKL 시그널링을 "실질적으로 감소시키거나 억제시키는"은 길항제가 (i) RANKL의 RANK에 대한 결합을 50% 초과, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 초과로 억제하거나, 이러한 결합을 완전히 억제하고/하거나, (ii) RANKL-유도된 경로, 및 특히 RANK 자극에 후속하는 시그널링, 예를 들어, 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 전이 형성에 수반되는 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) 또는 SRC-키나아제 또는 NF-κB 신호의 활성을 기능적으로 억제하는 것을 의미한다. 이러한 기능 억제는, 예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과의 전이 형성 억제 또는 완전한 억제이다.
다르게는, 기능적 억제는 생체 외에서, 예를 들어, 표준 분석에서 Erk1/2 및 Src의 활성화에 의해 초래되는 세포골격 재배열을 통해 암세포의 이동을 측정하여 결정될 수 있다. 구체적으로, 종양 세포의 이동 및 침습 잠재력은 다공성 및/또는 세포외-기질 모방 장벽을 통과한 세포의 부분을 측정함으로써 측정될 수 있다. 이러한 기능 억제는, 예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과의 이동 및/또는 침습 억제, 또는 완전한 억제이다.
기능적 억제는 또한 E-Cadherin, Claudin, SNAIL, 또는 Fibronectin 중 임의의 것을 측정하는, 예를 들어, 정량적 PCT-기반 방법에 의해, 상피-중간엽 전이 (EMT) 유전자 시그너처, 특히 암세포에서의 전이-관련된 유전자의 하향 조절을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 링커 서열을 갖거나 갖지 않는 면역 글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는 항체 도메인으로 구성되거나 이를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 항체는 RANKL 항원 또는 이러한 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하기 위한, 특히 VH, VL 또는 VHH와 같은 단일 가변 항체 도메인의 CDR 결합 부위를 포함하는 특이적 항원-결합 부위, 또는 VL/VH 쌍과 같은 가변 항체 도메인의 쌍의 결합 부위, VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함하는 항체, 예를 들어, Fab, F(ab'), (Fab')2, scFv, Fv, 또는 전장 항체를 갖는다.
특정 항체 포맷, 예를 들어, VH, VL 또는 VHH와 같은 단일 가변 항체 도메인, 또는 VL/VH와 같은 가변 항체 도메인의 쌍을 포함하는, 연결 서열 또는 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는, 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 항체, VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 항체, 예를 들어, 중쇄 항체, Fab, F (ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv, 또는 예를 들어, IgG 타입 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 전장 항체를 포함할 수 있다. 용어 "전장 항체"는 적어도 대부분의 Fc 도메인 및 자연 발생 항체 단량체에서 통상적으로 발견되는 다른 도메인을 포함하는 임의의 항체 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 이 문구는 본 명세서에서 특정 항체 분자가 항체 단편이 아님을 강조하기 위해 사용된다.
용어 "항체"는 구체적으로 상이한 표적 항원에 대해 지시되거나 또는 항체 도메인의 상이한 구조배열을 포함하는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 분리된 형태로 포함해야 한다. 여전히, 단리된 항체는, 단리된 항체와 예를 들어 적어도 하나의 다른 항체, 예를 들어, 상이한 특이성을 갖는 단일클론 항체 또는 항체 단편과의 조합을 포함하는, 조합된 제제에 포함될 수 있다.
용어 "항체"는 인간 종, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 쥐, 또는 조류, 예를 들어, 닭 (hen)을 포함하여 동물 기원의 항체에 적용되어야 하며, 상기 용어는 특히 동물 기원의 서열, 예를 들어, 인간 서열에 기초한 재조합 항체를 포함한다.
용어 "항체"는 쥐 및 인간 기원의 서열과 같은 상이한 종 기원의 서열을 갖는 키메라 항체에 추가로 적용된다.
항체와 관련하여 사용되는 용어 "키메라"는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열에 상동성인 항체를 의미하며, 쇄의 나머지 부분은 다른 종 또는 부류의 상응하는 서열과 상동성이다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 포유류의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 다른 종 유래의 항체의 서열과 상동성이다. 예를 들어, 가변 영역은, 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 비-인간 호스트 유기체로부터의 용이하게 이용 가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 알려진 공급원으로부터 유도될 수 있다.
용어 "항체"는 인간화된 항체에도 적용될 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 "인간화된"이란 용어는 비인간 종으로부터의 면역 글로불린으로부터 실질적으로 유도된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 말하며, 분자의 나머지 면역 글로불린 구조는 인간 면역 글로불린의 구조 및/또는 서열을 포함한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인에서 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역 (FR)에 이식된 상보성 결정 영역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된, 바람직하게는 인간 면역글로불린과 매우 유사하도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열 (예를 들어, 마우스 항체로부터 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보유한다. 다른 형태는 원래의 항체와 관련하여 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
"항체"라는 용어는 인간 항체에도 적용된다.
항체와 관련하여 사용되는 용어 "인간"은 인간 생식계 (germline) 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR에서, 인간 생식선 면역 글로불린 서열 (예를 들어, 시험관 내에서의 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역 글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린에 대해 형질전환된 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
"항체"라는 용어는 특히 모든 부류 또는 서브부류의 항체에 적용된다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 부류에 할당될 수 있으며, 이들 중 수개는 하위 분류 (이소타입), 예를 들어, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2로 더욱 분류될 수 있다.
상기 용어는 추가로 모노클로날 항체 또는 다클론 항체, 특히 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체 및 항체 구조를 포함하는 재조합 항체, 예컨대 상이한 기원의 유전자 또는 서열을 포함하는 동물, 예를 들어 사람을 포함하는 포유동물로부터 유래되는 항체, 예를 들어, 쥐, 키메라, 인간화된 항체, 또는 하이브리도마 유도된 항체에도 적용된다. 추가의 예는 항체를 발현하도록 형질전환 호스트 세포로부터 분리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합적 조합 라이브러리로부터 분리된 항체, 또는 항체 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.
항체 도메인은 천연 구조일 수 있거나, 예를 들어, 항원 결합 특성 또는 임의의 다른 특성, 예를 들어, Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fcgamma 수용체 (FCGR)에 대한 결합과 같은 안정성 또는 기능적 특성을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수 있다. 폴리펩타이드 서열은, 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 2개 이상의 베타-가닥으로 이루어진 베타-배럴 구조를 포함하는 경우, 항체 도메인으로 간주된다.
용어 "항체"는 또한 항체의 유도체, 특히 기능적으로 활성인 유도체를 의미하며, 본원에서는 항체의 기능적 변이체로도 지칭된다. 항체 유도체는 항체의 임의의 도메인이 다른 항체, 예를 들어, CDR 루프를 포함하는 결합 구조물, 수용체 폴리펩타이드, 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등과 같은 하나 이상의 다른 단백질의 임의의 위치에서 융합될 수 있는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 융합 단백질의 임의의 조합으로 이해된다. 항체의 유도체는 공유 커플링, 정전기적 상호작용, 디설파이드 결합 등과 같은 다양한 화학적 기술에 의해 다른 물질과 화합 또는 결합함으로써 수득될 수 있다. 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이들의 임의 조합 (예를 들어, PEG, 전구 약물 또는 약물)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는, 예를 들어, 항체-약물 접합체를 수득하기 위해, 약물을 포함하는 유도체이다. 구체적으로, 항체는 태그와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 항체는, 예를 들어, 생체 내 진단제로서 사용하기 위한 것을 포함하여 분석 또는 진단 목적을 위해, 태그를 포함하는 유도체일 수 있다. 사용 가능한 태그에 관해서는 항체의 표적 항원에 대한 결합에 대해 부정적인 영향이 없거나 허용 가능한 한 특별한 제한이 없다. 적합한 태그의 예는 His-태그, Myc-태그, FLAG-태그, Strep-태그, Calmodulin-태그, GST-태그, MBP-태그 및 S-태그를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 항체는 라벨을 포함하는 유도체이다. 본원에 사용된 용어 "라벨"은 "라벨링된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 라벨은 그 자체로 검출될 수 있거나 (예: 방사성 동위원소 라벨 또는 형광 라벨), 또는 효소 라벨의 경우, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
유도체라는 용어는 또한, 예를 들어, 기능적이고 기능적 변이체 (예를 들어, 특정 표적물에 대한 결합)로서 사용될 수 있는, 당조작 (glycoengineering)에 의해 생성된, 예를 들어, 특정한 당화 패턴을 갖는, 항체의 단편, 변이체, 유사체 또는 상동체를 포함한다.
항체 서열과 관련하여 "당조작된"이란 용어는 당조작의 결과로서 변형된 면역원성, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 당화 변이체를 의미한다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역의 보존된 위치에 탄수화물 구조물을 포함하며, 각각의 이소타입은 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 가변적으로 영향을 미치는 N-결합된 탄수화물 구조물의 별개의 배열을 보유한다. IgG1 타입 항체는 각 CH2 도메인에서 Asn297에서 보존된 N 결합된 당화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 컴플렉스 2-안테나 (antennary) 올리고사카라이드는 CH2 도메인 사이에 묻어서 폴리펩타이드 골격과 광범위한 접촉을 형성하며, 이들의 존재는 항체가 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하는데 필수적이다. 예를 들어, N297을, 예를 들어, A로 돌연변이시키는 것을 통한, N297에서 N-글리칸의 제거, 또는 T299는 전형적으로 ADCC가 감소된 비당화된 항체를 생성한다.
항체 당화의 주요한 차이점은 세포주 간에 발생하며, 다른 배양 조건에서 성장한 소정의 세포주에서도 사소한 차이가 나타난다. 세균 세포에서의 발현은 전형적으로 비당화된 항체를 제공한다.
항체는 활성 Fc 모이어티가 없을 수 있으므로, 특히 CH2 및 CH3 도메인의 쇄가 없는 항체를 포함한, FCGR 결합 부위를 갖지 않는 항체 도메인으로 구성되거나, 예를 들어, Fc 효과기 기능을 감소시키기 위해, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 없애거나 감소시키기 위해 변형시킴으로써, Fc 효과기 기능이 결여된 항체 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 변형은, Fc 효과기 기능의 감소 또는 Fc 효과기 기능의 결여를 달성하기 위해, 돌연변이유발, 예를 들어, FCGR 결합 부위에서의 돌연변이에 의해, 또는 항체의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 제제에 의해 수행될 수 있으며, 이는 전형적으로 ADCC 및/또는 CDC 활성으로 측정시 비변형된 (야생형) 항체의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 효과기 기능을 지칭하는 것으로 이해된다.
본 발명의 항체는 Fc 효과기 기능을 나타낼 수도 아닐 수도 있다. 작용 모드는 주로 Fc 효과기 기능 없이 종양 세포 미세환경에서 RANKL-RANK 시그널링을 억제함으로써 중재되지만, Fc가 보체를 소집하고 면역 복합체 형성을 통해 순환물로부터 표적물인 혈소판-종양 세포 응집체의 제거를 도울 수 있다.
예시적인 항체는, 예를 들어, FcRn에 대한 결합 부위를 유지시켜 생체 내에서 실질적인 반감기를 갖는 항체를 수득하도록, Fc 단편 또는 Fc 단편의 적어도 일부를 포함한다.
추가의 예는 가능한 ADCC 및/또는 CDC 활성의 감소를 얻기 위해, 예를 들어, IgG1의 IgG2로의 스위치에 의하거나 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키기 위해, 예를 들어, 인간 G1 Fc에서 E132P 및/또는 L234V 및/또는 L235A 및/또는 D265G 및/또는 A327Q 및/또는 A330A 및/또는 G236, 결실 및/또는 A327G 및/또는 A330S에 의한 변형에 의해, Fc를 변형하는 것을 언급하며, 상기 번호매김은 Kabat (EU-Index)에 따른다.
추가의 예는 면역원성을 감소시키기 위해, 예를 들어, 렉틴 수용체에 대해 손상된 결합을 제공하는, K.O. 당화 부위, 예를 들어, N297Q에 의한 변형을 언급한다.
예시적인 항체는 Denosumab, 또는 예를 들어, IgG2 또는 임의의 다른 면역글로불린 타입 또는 서브타입의 프레임워크에 포함된, 이의 기능적 변이체 또는 항원-결합 단편이다. 예를 들어, Denosumab 항원-결합 부위 또는 CDR 서열은 Fc 효과기 기능을 갖거나 갖지 않는 IgG1 항체 내로 삽입될 수 있다.
용어 "항체"는 또한 모 CDR 서열의 기능적으로 활성인 CDR 변이체를 갖는 항체 및 모 항체의 기능적으로 활성인 변이체 항체를 포함하는 항체의 변이체를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 데노스마브의 기능적 변이체는 본원에서 추가로 기술된 대로 조작되고 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유래된 항체 변이체는 (모 항체의) CDR 영역 또는 이의 CDR 변이체의 적어도 하나 이상, 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 적어도 3개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 3개의 CDR을 포함할 수 있으며, CDR 또는 FR 영역 중 적어도 하나, 또는 중쇄 (HC) 또는 경쇄 (LC)의 불변 영역에서 적어도 하나의 포인트 돌연변이는 기능적으로 활성이며, 예를 들어, RANKL 항원에 특이적으로 결합한다.
용어 "변이체"는 특히, 예를 들어, 항체 안전성, 효과기 기능 또는 반감기를 조작하기 위해 불변 영역에서, 또는, 예를 들어, 당해 분야에서 이용가능한 친화성 성숙 기술에 의해, 항원-결합 특성을 개선하기 위해 가변 도메인에서, 특히 결실, 교화, 특정 항체 아미노산 서열 또는 영역에 삽입물 도입 또는 아미노산 서열의 화학적 유도체화를 위해, 돌연변이유발 방법에 의해 수득되는 돌연변이 항체 똔느 항체의 단편을 언급한다. 예를 들어, 랜덤화 기술에 의해 수득되는, 원하는 위치에서의 포인트 돌연변이를 포함하는 임의의 공지된 돌연변이유발 방법이 사용될 수 있다. 일부의 경우, 위치는, 예를 들어, 임의의 가능한 아미노산 또는 항체 서열을 랜덤화하기 위한 바람직한 아미노산의 선별에 의해 무작위로 선택된다. "돌연변이유발"이란 용어는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 변경하기 위한 당업계에서 인정된 기술을 의미한다. 바람직한 타입의 돌연변이유발은 에러 프론 (error prone) PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발 또는 다른 부위 돌연변이유발을 포함한다.
항체의 "기능적 활성 변이체"란 용어는 아미노산 서열, 또는 뉴클레오타이드 서열 내의 뉴클레오타이드 내, 또는 서열의 원위 말단 중 하나 또는 둘 모두에서, 예를 들어, CDR 서열에서 N-말단 및/또는 C-말단 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산, 및/또는 중심 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 (즉, CDR 서열의 중앙)에서, 삽입, 결실, 또는 하나 이상의 아미노산의 치환, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 유도체화에 의한 이러한 서열 (모 항체 또는 모 서열)의 변형으로부터 생기는 서열을 의미하며, 이러한 변형은 이러한 서열의 활성에 영향을 끼치지, 특별히 손상시키기 않는다. 선택된 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 결합 부위의 경우, 항체의 기능적 활성 변이체는, 비록 예를 들어 특정 에피토프에 대한 정교한 특이성, 친화성, 결합성 (avidity), Kon 또는 Koff 비율 등이 변화도록 변했지만, 여전히 예정된 결합 특이성, 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가질 것이다. 예를 들어, 친화도 성숙된 항체는 기능적 활성 변이체 항체로 구체적으로 이해된다. 따라서, 친화성 성숙된 항체에서 변형된 CDR 서열은 기능적 활성 CDR 변이체로 이해된다.
바람직하게는, 높은 친화도, 특히 높은 on 및/또는 낮은 off 비율, 또는 높은 결합 활성으로 pRANKL에 결합하는 제제가 사용된다. 결합 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd 또는 KD)로 알려진, 결합 부위의 절반이 차지되는, 제제의 농도로 특징지어진다. 통상적으로, 결합제는 Kd <10-8M, 바람직하게는 Kd <10-9M, 보다 더 바람직하게는 Kd <10-10M인 고친화성 결합제로 간주된다.
그러나, 대안적으로 바람직한 실시양태에서, 개별적인 항원 결합 친화성은, 예를 들어, 적어도 2개의 항원에 결합할 때, 중간 친화성 (medium affinity), 예를 들어, 10-6M 미만 및 10-8M 이하의 Kd이다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한 생물학적 활성"은 실질적으로 동일한 활성이 비교 항원 또는 모 항체에 대해 측정된 활성의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 예를 들어, 최대 200%인 활성을 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 모 항체의 기능적 활성 변이체는
a) 항체의 생물학적 활성 단편이고, 단편은 분자 서열의 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97% 이상, 98% 또는 99% 이상을 포함하고;
b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 항체로부터 유도되고, 기능적 활성 변이체는 분자 또는 그의 일부와 서열 동일성을 가지며, 예를 들어, 50% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97% 이상, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 항체이고; 및/또는
c) 항체 또는 이의 기능적 활성 변이체 및 추가적으로 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열에 대해 이종인 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 활성 변이체는 본질적으로 상기 기재된 변이체와 동일하지만, 상이한 종의 상동 서열로부터 유도된다는 점에서 그의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열 각각과 상이하다. 이들은 자연 발생 변이체 또는 유사체라고 한다.
"기능적 활성 변이체"라는 용어는 또한 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비-자연 발생 변이체도 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 본질적으로 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것으로 특징지어지는 (폴리)펩타이드의 대체 형태이다.
기능적으로 활성인 변이체는, 예를 들어, 하나 이상의 포인트 돌연변이에 의한, 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 서열 변경에 의해 수득될 수 있으며, 여기서 서열 변경은 본 발명과 조합하여 사용되는 경우 변경된 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 기능을 보유하거나 개선한다. 이러한 서열 변경은 (보존적) 치환, 첨가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보존적 치환은 측쇄 및 화학적 특성이 관련된 일 부류의 아미노산 내에서 일어난다. 이러한 부류의 예로는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비-극성 지방족 측쇄, 비-극성 방향족 측쇄, 비하전 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산이다.
포인트 돌연변이는 특히 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 단일 (비-연속적) 또는 이중 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입으로 비-조작된 아미노산과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리뉴클레오타이드의 조작으로 이해된다.
바람직한 포인트 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 언급한다. 이와 관련하여, 아미노산은 64개의 삼중자 코돈에 의해 코딩된 20개의 자연 발생 아미노산을 언급한다. 이들 20개의 아미노산은 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 아미노산으로 분리될 수 있다.
"중성" 아미노산은 아래에 각각의 3 글자 및 1 글자 코드 및 극성과 함께 표시된다:
알라닌: (Ala, A) 비극성, 중성;
아스파라긴: (Asn, N) 극성, 중성;
시스테인: (Cys, C) 비극성, 중성;
글루타민: (Gln, Q) 극성, 중성;
글리신: (Gly, G) 무극성, 중성;
이소류신: (ILe, I) 비극성, 중성;
류신: (Leu, L) 비극성, 중성;
메티오닌: (Met, M) 비극성, 중성;
페닐알라닌: (Phe, F) 비극성, 중성;
프롤린: (Pro, P) 비극성, 중성;
세린: (Ser, S) 극성, 중성;
쓰레오닌: (Thr, T) 극성, 중성;
트립토판: (Trp, W) 비극성, 중성;
티로신: (Tyr, Y) 극성, 중성;
발린: (Val, V) 비극성, 중성; 및
히스티딘: (His, H) 극성, 양성 (10%) 중성 (90%).
"양으로" 하전된 아미노산은 다음과 같다:
아르기닌: (Arg, R) 극성, 양성; 및
리신: (Lys, K) 극성, 양성.
"음으로" 하전된 아미노산은 다음과 같다:
아스파르트산: (Asp, D) 극성, 음성; 및
글루탐산: (Glu, E) 극성, 음성.
본원에 기술된 항체 서열 및 상동체에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하도록 갭을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않은, 특정 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원에서 용어 "표적물"또는 "표적 항원"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "항원"은 전체 표적 분자 또는 항원을 특이적으로 인지하거나 표적물에 특이적으로 결합할 수 있는 제제에 의해 인식되는 그러한 분자의 단편, 예를 들어, 항체 결합 부위에 의한 결합을 통해 항원을 인식하는 항체를 지칭한다. 구체적으로, 일반적으로 "에피토프"로 지칭되는 항원, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 탄수화물의 서브구조물, 예를 들어, 면역학적으로 관련된, B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프는 이러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "에피토프"는, 특히 특정 결합 파트너를 완전히 구성할 수 있거나 본원에 기재된 바와 같은 제제의 결합 부위에 대한 특정 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩타이드 구조물, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 이의 유도체 및 이의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질와 같은 펩타이드 구조물에 포함되는 경우, 이는 적어도 3개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산을 일반적으로 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 구조적 (conformational) 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 또는 탄수화물 쇄의 일차 서열의 단일 분절로 구성된다.
선형 에피토프는 인접하거나 중첩될 수 있다. 구조적 에피토프는 3차 구조를 형성하기 위해 폴리펩타이드를 폴딩함으로써 함께 모인 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며, 아미노산은 반드시 선형 서열에서 서로 인접하지는 않는다.
본원에 기술된 항원은, 비록 pRANKL에 대한 특정 결합제가 sRANKL 및/또는 mRANKL을 교차-특이적으로 인식할 수 있거나 pRNAKL, 및 sRANKL 및 mRANKL 중 임의의 것 (또는 둘 모두)와 교차-반응성일 수는 있으나, 인간 RANKL, 특히 pRANKL이다. 인간 pRANKL은 구체적으로 인간 혁액 혈소판 (platelet 또는 thrombocyte)으로부터 유래된 RANKL, 예를 들어, 이에 결합하는 길항제로 표적될 수 있는, 인간 혈액 혈소판의 표면에, 바람직하게는 활성화된 혈소판에 의해, 발현된 항원으로서 이해된다. 혈소판은 또한 (RANKL 음성) 암세포와 상호작용하여 암세포를 그 자체가 RANKL을 발현할 수 있는 프리전이성 병변으로 전환시킬 수 있다. 따라서, 길항제는 또한 RANKL을 발현하는 암세포를 표적으로 할 수 있다. pRANKL은 혈소판의 표면으로부터 분리되거나 흘려질 수 있고, 길항제에 의해 가용성 리간드로서 억제될 수 있다. 혈소판 표면에 발현되는 pRANKL은 에피토프의 접근 가능성에서 sRANKL과 다를 수 있다. mRANKL은 조직, 또는 암세포에 의해 발현될 수 있고, 혈소판 및/또는 또 다른 암세포와 더 상호작용할 수 있다. 다른 형태의 RANKL과 비교하거나 암세포 및 골아세포와 같은 다른 기원의 세포로부터 유래하는 RANKLdhk 비교하여 pRANKL의 추가의 구조적 차이는 아미노산 서열 및 pRNAKL이 당화 패턴 분석을 통해 명백해질 수 있다.
용어 "RANKL"은 세포에 의해 자연적으로 발현되고 세포, 예를 들어, 인간 혈액 혈소판 또는 종양 세포의 표면에 결합되거나, 말초 혈액 샘플에서 측정되는 바와 같이 순환물 중 가용성 RANKL로서 존재하는, 인간 RANKL의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 포함한다.
pRANKL의 바람직한 에피토프는 RANKL 항원의 세포외 부분, 특히 pRANKL의 세포외 부분 또는 막관통 RANKL의 세포외 부분, 예를 들어 세포외 부분에 삽입되며, 예를 들어, 혈소판 또는 세포의 표면에서 접근가능한 에피토프이다.
본원에 기재된 길항제는 RANKL의 에피토프에 결합하여 RANKL이 그의 수용체 RANK에 결합하는 것을 실질적으로 억제함으로써 시그널링 경로를 억제하게 한다. RANKL은 생존을 촉진하고 RANK를 발현하는 다양한 암세포의 이동을 유도하기 때문에, 길항제는 암 또는 종양 세포의 프리전이성 이동 및 응집을 방지 또는 감소시킴으로써 암세포의 증식 및 전이를 방해한다.
본원에 기재된 용어 "전이"는 악성 종양이, 예를 들어, 최초 또는 원발성 종양으로부터 먼 2차 부위로 퍼지는 것을 지칭한다. 이는 일반적으로 원발 종양으로부터 암세포의 탈착, 신체 순환으로의 도입 및 신체 내 다른 곳의 정상 조직 내에서 성장하기 위해 정착하는 것을 포함한다. 이러한 원발 종양은 암 발생 부위에서 자라는 종양으로 이해된다. 조혈 질환 (백혈병, 림프종 및 골수종)은 진단 시 파종성인 것으로 간주된다. 그러나, 조혈 암도 전이성 종양을 형성할 수 있다. 드문 경우이지만 폐, 심장, 중추 신경계 및 다른 조직에 대한 혈액 및 림프계 암의 전이가 보고되었다. 전이성 종양 세포는 전이를 일으키는 능력이 있거나 이미 전이성 종양의 일부인 세포로 이해된다. 구체적으로, 본원에서 언급된 원발성 암세포 및/또는 전이는, 예를 들어, 표준 면역조직화학 또는 PCR-기반 방법에 의해 측정되는 바와 같이, RANK-양성이다.
원발성 중간엽 종양의 예는, 예를 들어, 근육, 섬유 조직 및 혈관 조직으로부터 유래되는, 연조직 종양이다.
원발성 중배엽 및/또는 외배엽 종양 중에는 각각 흑색종 및/또는 사기질모세포종 및 폐의 원시 신경-외배엽 종양이 있다.
대표적인 원발성 상피 세포 암에는 유방, 전립선, 폐, 방광, 자궁, 난소, 뇌, 두경부, 식도, 췌장암, 위암, 배아 세포 및 직장결장 암이 포함된다.
특히 중요한 RANK 양성-종양 질환은 유방암, 췌장암, 위암, 식도암, 신장 세포 암종, 폐 암종, 결장/직장/직장결장 암, 흑색종, 전립선암, 두경부암 또는 기타 RANK-양성 종양체가 있다.
혈액암 중에는 백혈병, 림프종 또는 골수종이 있다.
백혈병을 앓고 있는 환자는 특히 본원에 기술되는 바와 같은 항-RANKL 치료로부터 이익을 얻을 수 있는데, 이는 백혈병 세포로의 RANK 시그널링이, 예를 들어, 이들의 증식성 잠재력을 증진시키고/시키거나, 예를 들어, 화학요법 및/또는 키나아제 억제제로의 항암 치료적 중재에 대한 내성을 변경시키기 때문이다.
암 및 원발 종양으로 치료받는 환자는 종종 암과 관련된 최소 잔류 질환을 보유한다. 즉, 환자가 치료에 반응하여 질병의 완전한 완화를 임상적 조치로 가질 수 있다고 하더라도, 파괴를 피한 소량의 암세포가 남아있을 수 있다. 이러한 잔여 집단의 유형과 크기는 환자의 지속적인 치료를 위한 중요한 예후 인자이다.
특정 실시양태에서, 환자는 1차 암 치료 (예를 들어, 화학요법, 방사선요법 및/또는 수술) 후에 최소 잔류 질환을 갖는다. 본원에 기재된 바와 같은 길항제는 특히 최소 잔류 질환을 치료하기 위한 세포감소 요법 또는 다른 치료적 중재와 함께, 및/또는 유지 요법, 예를 들어, 또 다른 암 치료의 중지 후 지연된 또는 연장된 요법으로 조합될 것이다. 또한, 길항제는 암 또는 종양의 재-성장 또는 재발, 또는 전이성 질환에서의 전이 형성의 재발을, 예를 들어, 적어도 1개월 이상 지연시킬 것이다.
특정 전이성 종양 세포는 원거리 기관의 전이 형성을 유발하는 순환하는 프리전이성 종양 세포 응집체를 발달시키는 경향이 있는 파종성 종양 세포이다. 놀랍게도, RANK-양성 종양 세포의 파종이 순환하는 RANKL-양성 혈소판과 함께 응집될 수 있고 이러한 응집체는 전이 형성을 유도한다는 것을 밝혀냈다. 활성화된 혈소판은 pRANKL을 상향 조절하여 종양 세포에서 RANK를 자극함으로써 프리전이성이 되게 할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 유리하게 치료되는 암 환자는 주로 혈관을 통해서, 림프는 통하지 않거나 적게 통해, 전이하는 종양 질환 또는 암을 앓는다.
혈소판-암세포 응집체는 프로전이성, 또는, 특히 pRANKL을 발현하도록 혈소판을 활성화시켰을 때의, 전이의 프리형태 (preform)로 이해된다. 이러한 프리형태는, 응집체가 순환물 중에 존재하고 원거리 기관에서 전이와 같이 보다 큰 매쓰로서 성장하지 않았기 때문에, 전이와는 상이하다. 이 점에서, 프로전이성 혈소판-암세포 응집체는 RANK-양성 신생물 질환의 일 양태로 간주된다.
본원에서 사용된 용어 "파종성 종양 세포"는 주로 종양이 있는 환자의 순환물에서 발견되는 종양 세포를 의미한다. 비록 이 용어는 일반적으로는 종양의 대부분이 순환물에서 발견되는 혈액 종양을 포함하지 않지만, 용어 "파종성 종양 세포"는 혈액 암을 앓는 환자에서의 (프리)전이성 종양 세포를 또한 포함한다. 혈액 암은 혈소판과 암세포와의 접촉을 유도하여, 선택적으로, 일단 전이가 진행되면, 순환물 중에 혈소판-암세포 접촉 응집체를 파종시킬 수 있다. 혈액암 세포는 림프 또는 혈관의 벽을 투과할 능력을 얻고, 그 후 종양 세포의 신체 내 다른 부위 및 조직으로의 순환 (파종)과 같이 혈류를 통해 순환하여, 종국적으로는 전이성 또는 이차적 종양 임플란트로 알려진 임상적으로 검출가능한 종양을 형성할 수 있다. 또한, pRANKL-RANK 시그널링은 혈액 암 질환 진행을 유발할 수 있다.
본원에서 혈소판-암세포 응집체와 관련하여 사용되는 용어 "프로전이성"은 다음과 같은 방식으로 이해된다. 암 또는 종양 세포 및/또는 혈소판은, 응집 및 이어 RANKL-양성 혈소판의 RANK-양성 종양 세포에 대한 결합, 및 RANK-RANKL 시그널링의 개시 경향 때문에, 프로전이성, 즉 전이를 촉진할 수 있다. 이러한 전이-촉진 효과의 기초를 이루는 분자 기작이 아직 잘 정의되지는 않았지만, 암세포와 종양 미세환경의 다양한 성분간의 상호적 상호작용이 암 진행 및 전이에 영향을 끼친다. 암-혈소판 또는 종양-혈소판 크로스-토크 (cross-talk) 경로의 확인 및 이해가 초기 단계의 전이를 방지하기 위한 pRANKL 표적화 요법 개발을 이끌어 개선된 환자 결과를 초래할 수 있다.
"프리전이성 병변"은 전이-촉진 미세환경 (프리-전이성 니치)를 생성하는 암 파종의 초기 세포 및 분자 이벤트로 특징지어지는 전구체 병변으로 이해된다. 놀랍게도, 종양 세포 파종이 혈소판, 특히 pRANKL을 발현하는 활성화된 혈소판의 소집시 전이를 일으킨다는 것을 밝혀내었다. 혈액 혈소판과의 상호작용, 선택적으로 검출가능한 (프로전이성) 혈소판-암세포 응집체의 형성을 통해, 미세환경에서 RANK-RANKL 시그널링시, 암세포는 프리-전이성이 되고, 이로써 전이가 되기 전에 이의 외형 또는 특성이 변화된다. 따라서, pRANKL은 프리전이성 병변이거나 그렇지 않은 세포를 구별하는 특징으로 간주된다. 따라서, pRANKL은 초기에 전이를 검출하고 전이를 방지하기 위한 전이 예방의 새로운 표적물 또는 접근법이다.
프로전이성 혈소판-암세포 응집체를 감소시킴으로써 기관-특이적 전이 형성의 위험이 크게 감소된다. 특히 이것은 내장 또는 중피 전이 또는 간, 폐, 골, 장, 피부, 근육, 비장, 뇌 또는 신장과 같은 표적 기관을 언급하며, 많은 경우 골 이외의 부위를 표적한다. 내장 전이는 특히 신체의 내부 기관인 내장에서의 전이, 특히 흉부, 예를 들어, 가슴 또는 폐 또는 복부, 예를 들어, 간, 췌장 또는 장 내에서의 전이를 지칭한다. 중피 전이는 중피, 예를 들어, 흉막 및 복막 내에서 또는 이들에서의 암세포의 성장을 지칭한다. 특히, 중피 전이는, 예를 들어, 전이에 의해 초래된 병에 걸린 중피의 염증 반응 및/또는 증가된 투과성에 기인하여, 중막에 의해 둘러싸인 강 내에 유체, 특히 흉막 및/또는 복부 삼출물의 축적을 이끌 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "전이성 잠재력"은 최소 잔류 질환, 전이성 질환의 재발, 전이성 암의 신속한 진행 잠재력, 또는 전이성 암이 표준 요법, 예를 들어, 화학요법 및/또는 면역요법에 대해 내성을 나타내는 잠재력을 의미한다.
증가된 또는 높은 전이 잠재성은 원거리 전이 또는 다수 부위 또는 기관으로의 전이, 또는 국소적, 조직 특이적, 기관-특이적, 부위-특이적 전이를 형성할 성향을 나타낸다. 높은 전이 잠재력은 파종되는 종양 세포의 비교적 높은 부하가 순환물 중에서 측정되는 암 환자에서 나타난다. 특히, 암 환자의 말초 혈액 샘플은, 기준 값과 비교하여, pRANKL 또는 sRANKL 또는 mRANKL 중 임의의 것, 또는 암세포 및 혈소판의 복합체 (conglomerate)의 증가된 수를 포함할 것이다. 높은 전이 잠재력을 갖는 세포주의 예로는 MDA-MB-231 (예를 들어, ATCC (Manassas, Virginia)에서 입수할 수 있는, Her2/neu 양성 유방암 환자의 전이 부위에서 유래된 유방 암종 세포주), 또는 SK-Mel-5 (예를 들어, ATCC (Manassas, Virginia)에서 입수할 수 있는, 악성 흑색종 환자의 전이 부위로부터 유래된 흑색종 세포주)가 있다.
대조적으로, 낮은 전이 잠재성은 낮은 전이 속도 또는 비-전이성 종양을 나타낸다. 낮은 전이 잠재성의 RANK-양성 암은 단지 순환물 중 종양 세포의 수가 적거나 제한적일 때만 나타날 것이다. 특히, 암 환자의 말초 혈액 샘플은 단지 적거나 제한된 수의 pRANKL을 발현하는 검출가능한 혈소판, 또는 pRANK, 또는 종양 세포 및 혈소판의 집합체를 포함할 것이다. 낮은 전이 잠재성 세포주에 대한 예에는, MCF-7 (예를 들어, ATCC (Manassas, Virginia)에서 입수할 수 있는, Her2/neu 양성 유방암 환자의 전이 부위에서 유래된 유방 암종 세포주) 또는 SK-BR-3 (예를 들어, ATCC (Manassas, Virginia)에서 입수할 수 있는, Her2/neu 양성 유방암 환자의 전이 부위에서 유래된 유방 암종 세포주)가 있다.
파종성 종양 세포를 분석하고 생체내 및 시험관내에서 전이 잠재성을 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 pRANKL 발현의 특이적인 측정에 의해, 또는 프리전이성 병변, 특히 혈액 샘플 또는 이의 혈소판 함유 분획 중 프로전이성 혈소판-암세포 응집체의 수준을 측정함으로써 개선될 수 있다.
본원에서 추가로 기술된 바와 같이 전이 잠재력을 예측하는 방법에 기초한 예후 분석은, 환자가 제제, 예를 들어, 효능제, 길항제, 펩타이드모방제, 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 암 또는 전이성 질환과 같은 암과 관련된 다른 질환을 치료하기 위한 다른 약물 후보 물질로 적절히 치료될 수 있는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 분석은 피험자가 화학요법제와 함께 투여되어야 하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "환자"는 온혈 동물, 특히 인간을 지칭한다. 특히, 본 발명의 의학 용도 포맷 또는 각각의 치료 방법은 암, 종양 또는 전이성 질환의 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 적용된다. 환자는 초기 단계 또는 후기 단계의 질병을 앓고 있거나, 달리는, 예를 들어, 유전적 소인에 의해 이러한 질병의 경향을 갖는 환자일 수 있다.
본원에 기재된 "약제학적 조성물"이란 용어는 인간에게 투여하기에 적합한 조성물, 즉 약제학적으로 허용가능한 성분을 함유하는 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 활성 화합물 또는 그의 염을 담체, 희석제 또는 약제학적 부형제, 예를 들어 완충제 또는 긴장성 조절제와 함께 포함한다.
본 발명의 길항제는 특히 약제학적 조성물로 제공된다. 저장을 위해 제조된 안정한 약제학적 조성물이 고려된다. 특정 실시양태에서, 바람직한 정도의 순도를 갖는 제제는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합되고, 동결 건조 제제, 수용액 또는 수중유 에멀젼으로서 제공된다. 전형적으로, 이러한 조성물은 허용가능한 약제학적 실시에 의해 공지되고 요구되는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다 (참조: Remintons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co). 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로오스 용액과 같은 멸균된 담체가 포함되며, 임의로 5 내지 8 범위의 pH로 적합한 완충액으로 완충될 수 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제제는 멸균이어야 한다. 이것은 멸균 여과막 또는 다른 적절한 방법을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원에 기재된 바와 같은 사용을 위한 제제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 특히 전신 경로에 의해 또는 비경구 투여에 의해, 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 경로 및 경구, 비강내, 귀내 (intraotically), 경피, 점막, 국소적 (예: 겔, 고약, 로션, 크림 등), 복강내, 근육내, 폐내, 질, 비경구적, 직장 또는 안내로 투여될 수 있다. 예시적인 제형은, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액과 같은 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 적합한 것들을 포함한다.
특히, 예를 들어, 정맥내 주입 또는 볼루스 주사와 같은, 정맥내 투여가 바람직하다. Denosumab은 피하 경로로 투여되는 것으로 알려져 있다. pRANKL 표적화의 새로운 지시에서, Denosumab 제제는 특히 순환 시 장기간 이용 가능하도록 투여될 것이므로, 피하 경로는 특히 덜 바람직하거나 회피된다.
본 발명은 치료학적 유효량의 길항제를 활성 물질로서 함유하는 약제학적 제제를 포한한다.
본원에 기재된 바와 같은 길항제의 "유효량" 또는 "충분한 양"이라는 용어 중 임의의 것과 상호교환적으로 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 피험자에게 투여시 임상적 결과를 포함하는 유익한 또는 바람직한 결과를 얻기에 충분한 양 또는 활성이며, 그러한 것으로서, 유효량 또는 그의 동의어는 적용되는 상황에 달려 있다. 질병과 관련하여, 치료학적 유효량의 약제는, 예를 들어, 전이성 질환을 예방 또는 치료하기 위해, 프리전이성 병변, 혈소판-암세포 응집체 또는 프로전이성 종양 세포 응집체의 하향 조절 또는 감소로부터 이익을 얻는 질환 또는 병증을 치료, 조절, 약화, 역전, 또는 영향을 끼치도록 사용될 수 있다. 유효량은 이러한 질병 또는 장애를 치료, 예방 또는 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. 이러한 양에 상응할 길항제의 양은 다양한 인자, 예를 들어, 소정의 약물 또는 화합물, 약제학적 제형, 투여 경로, 질병 또는 장애의 타입, 치료될 피험자 또는 호스트의 정체성 등에 따라 다르지만, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.
또한, 치료적 유효량의 길항제를 사용한 피험자 (암 환자)의 치료 또는 예방적 처방은 단일 투여로 구성되거나, 달리는 일련의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 길항제는 1년에 적어도 1회, 1/2년에 적어도 1회 또는 1개월에 적어도 1회 투여될 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 길항제는 소정의 치료를 위해 주당 약 1회 내지 약 매일 투여로 피험자에게 투여될 수 있다. 치료 기간의 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 질병의 중증도, 환자의 나이, 길항제의 농도 및 활성에 따라 달라진다. 치료 또는 예방에 사용되는 유효 투여량은 특정 치료 또는 예방 처방의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소될 수 있음을 이해할 것이다. 투약량의 변화는 당업계에 공지된 표준 진단 분석에 의해 결정되고 명백해질 수 있다. 경우에 따라 장기 투여가 필요할 수 있다.
비록 보다 높은 투여량이, 예를 들어, 급성 질환 또는 병증을 위해, 예를 들어, 외과적 중재를 준비중이거나 외과적 중재 직후에, 수술 후 1 내지 7일 이내에 치료를 개시할 때 필요할 수 있지만, 치료를 필요로 하는 인간 환자에게 제공되는 길항제의 치료적 유효량은 구체적으로 0.5-1000 ㎎, 바람직하게는 1-400 ㎎, 더욱 바람직하게는 300 ㎎ 이하, 200 ㎎ 이하, 100 ㎎ 이하 또는 10 ㎎ 이하의 범위 일 수 있다.
본원에서 사용된 "치료"라는 용어는 항상 예방 (즉, 질병 또는 질병 상태를 예방) 또는 치료 (즉, 질병 또는 질병 상태를 치료) 목적으로 환자를 치료하는 것을 지칭한다. 환자의 치료는 일반적으로 암의 경우 치료적일 것이다. 그러나, 예를 들어, RANK-RANKL 시그널링 효과에 의존적인, 질병 진행의 위험이 있거나 2차 질환 상태 또는 부반응을 일으킬 위험이 있는, 원발성 질환을 앓고 있는 환자의 경우,치료는 예방적일 수 있다. 이러한 예방을 위한 처치는 본원에서, 예를 들어, 치료학적 유효량을 사용하는, 치료 또는 요법으로도 지칭된다.
한 실시양태에서, 길항제는, 예를 들어, 질병 변경 단독요법으로, 환자에게 투여되는 유일한 치료학적 활성제이다.
다르게는, 길항제는, 이에 한정되는 것은 아닌 표준 치료제, 예를 들어, 악성 질환 치료를 위한 화학요법제를 포함하는 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다.
병용 요법으로서, 길항제는 혼합물로서 또는 하나 이상의 다른 치료 요법과 함께, 예를 들어, 병용 요법 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다.
길항제의 생물학적 성질은 세포, 조직 및 전체 유기체 실험으로 생체 외에서 특성화될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 약물은 종종 질병 또는 질병 모델에 대한 치료를 위한 약물의 효능을 측정하기 위해, 또는 약물의 약동학, 약력학, 독성, 및 다른 특성을 측정하기 위해, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함하지만 이에 한정되지 않는 동물에서 생체 내 시험된다. 동물은 질병 모델로 언급될 수 있다. 치료제는 종종 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스 및 트랜스제닉 마우스 (녹인 및 녹아웃 포함)를 포함하되 이에 국한되지 않는 마우스에서 시험된다. 이러한 실험은 적절한 반감기, 효과기 기능, 세포자멸 활성 및 IgG 억제 활성을 갖는 치료제로서 사용될 제제의 잠재력을 결정하기 위한 의미 있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는, 포유 동물이 시험에 사용할 수 있다. 예를 들어 인간과 유전적 유사성을 지니고 있기 때문에 영장류, 원숭이는 적절한 치료 모델이 될 수 있으므로 효능, 독성, 약동학, 약력학, 반감기 또는 제제의 기타 특성을 테스트하는 데 사용할 수 있다. 인간에서의 물질의 시험은 궁극적으로는 약물로서의 승인을 위해 요구되며, 이들 실험이 본원에서 고려된다. 따라서, 본 발명의 길항제는 동물 모델 또는 인간에서 시험하여 그들의 치료 효능, 독성, 면역 원성, 약동학 및/또는 다른 임상적 특성을 결정할 수 있다. Denosumab은, 비록 암세포와 혈소판 사이의 상호작용을 억제하는 항-pRANKL 효과는 놀라운 것으로 밝혀졌지만, 잘 정립된 생물학적 특성을 지닌 상업적으로 이용가능한 제품이다.
본원에 기술된 RANKL-특이적 제제와 관련하여 용어 "특이적"은 이종 분자 집단에서 목적하는 동족체 리간드 (RANKL)를 결정짓는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 하에서, 예를 들어, 면역 분석 조건에서, 특정 표적물에 특이적으로 결합하는 제제는 샘플에 존재하는 다른 분자에 유의한 양으로 결합하지 않는다.
특정 결합 부위 또는 특정 제제는 전형적으로 표적물만을 인식하고 다른 표적물과는 교차 반응하지 않는다. 여전히, 특이적 결합 부위는 표적물의 하나 이상의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합할 수 있거나, 다른 관련 표적 항원, 예를 들어 상동체 또는 유사체에 교차-반응성일 수 있다.
특이적 결합은 결합이 표적물 정체, 고, 중 또는 저 결합 친화력 또는 결합능의 관점에서 선택적으로 선택된다는 것을 의미한다. 선택적 결합은 일반적으로 결합 상수 또는 결합 동역학이 적어도 10배 다르며, 바람직하게는 그 차이가 100배 이상, 보다 바람직하게는 1000배 이상인 경우에 달성된다.
본 명세서에서 "수술"로 지칭되는 용어 "외과적 중재"은 수술적 제거, 예를 들어, 종양, 특히 고형 종양과 같은 원발성 종양 및/또는 하나 이상의 전이의 전부 또는 일부를 포함하는 조직의 생검, 절제 또는 적출을 언급한다.
특정 예에 따라, 정지 또는 활성화된 혈소판에 의한 RANKL 발현의 효과를 폐 전이 마우스 모델에서 시험하였다. 인간 시스템에서 활성화된 혈소판은 비-활성화된 혈소판과 비교하여 보다 높은 수준에서 RANKL을 발현한다는 것을 알 수 있었다.
또 다른 예에 따르면, 인간 RANK 수용체 및 인간 IgG1의 Fc로 구성되고, 233P/L234V/L235A/△G236/A327G/A330S (Kabat, EU 지표에 따른 명명법)인, Fc 수용체 FcgammaRIIIa1, CD16에 대한 친화력을 감소시키는 포인트 돌연변이를 포함하는, RANK-Fc 융합 단백질이 사용되었다 (Schmiedel 등, 2013, Cancer Res. 73 (2): 683-94). 폐 전이 마우스 모델에서의 전이 형성에 대한 RANK-Fc 융합 단백질의 영향을 측정하였다. RANK-Fc 융합 단백질에 의한 RANKL의 중화는 거의 혈소판 결핍만큼 효과적인 것으로 나타났다.
더 많은 예들은 pRANKL이 혈소판에 의해 RANKL 음성 종양 세포로 전이됨으로써 종양 세포를 RANKL 양성으로 변형시키는 것을 보여줄 수 있다. 또한, pRANKL이 종양 세포에서 프로전이성 EMT 이벤트를 유도하고, 마트리겔 (matrigel)을 통한 종양 세포의 이동에 영향을 줄 수 있음을 입증할 수 있다. 거핵구와 혈소판에서 RANKL 발현을 조건적으로 녹아웃시킨 마우스 녹아웃 모델에서, 실제로 pRANKL이 프리전이성 병변을 유도하고, pRANKL 억제가 전이 형성을 억제하거나 감소시킨다는 것을 밝힐 수 있다.
전술한 설명은 다음의 실시 예를 참조하여 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이러한 예는 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 수행하는 방법을 대표하는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 폐 전이 마우스 모델에서 RANKL 트랜스펙션된 흑색종 세포에 의한 RANKL 발현
인간 RANKL로 트랜스펙션된 마우스 흑색종 B16-F10 세포 또는 모 (parent) 세포주를 폐 전이 마우스 모델에 사용하였다. 트랜스펙션된, RANKL-양성 세포의 적용은 모 세포 (대조군)에 비해 동물의 폐에 크게 전이 부하를 초래하였다 (도 1). 인간 RANKL이 마우스 RANK를 자극할 수 있다는 것이 알려져 있기 때문에 이 데이터는 RANKL-양성 종양 세포를 받은 마우스의 전이 부하가 종양 세포로의 RANK 시그널링의 증가로 인한 것임을 시사한다. 이것은 또한 주변분비 및/또는 자가분비 자극시 RANK-양성 종양 세포의 전이가 강화된다는 것을 나타낸 Jones 등 (2006)의 연구와 일치한다. 이 실험은 정상 상황에서 이용가능한 수준 이상으로 RANK 자극에 RANKL을 제공하면 전이 잠재력을 향상시킨다는 것을 증명한다. 이때 RANKL의 트랜스펙션은 pRANKL의 종양 세포로의 전달/이동을 모방한다.
실시예 2: 활성화된 혈소판(thrombocyte) 상의 pRANKL 발현
혈소판 (platelet)이 종양 전이를 촉진시키는 것으로 알려져 있으므로, 혈소판에서 잠재적 RANKL 표면 발현의 분석이 수행되었다. 정지 혈소판에서는 낮은 수준의 RANKL이 검출될 수 있었지만, 트롬빈을 사용한 혈소판 활성화 후에는 RANKL 표면 발현이 크게 나타났다 (도 2). 따라서, 종양 세포와 응집체의 형성 시에도 발생하는 혈소판의 활성화는 RANKL 발현의 신속한 상향 조절을 초래한다. 이 경우 상향 조절된 RANKL은 종양 세포 상의 RANK과 상호작용하고 RANK를 자극할 수 있다.
실시예 3: RANK-Fc 융합 단백질
인간 수용체 RANK의 세포외 분획 및 인간 면역 글로불린 G (hIgG1)을 함유하는 면역 수용체-Fc 융합 단백질을 제조하였다 (도 3). 융합 단백질은 생리 조건 하에서 Fc 부분의 CD16에 대한 결합을 막는 IgG1 부분의 아미노산 교환으로 인해 Fc 수용체 (FcxRIIIa, CD16)에 대해 현저히 감소된 친화성을 나타낸다 (233P/L234V/L235A/△G236/A327G/A330S, Armor 등, 1999, Schmiedel 등, 2013). 이 구조물은, Denosumab과는 대조적으로, 인간 및 마우스 RANKL 모두에 대해 결합을 나타내므로, RANKL 중화의 마우스 모델에 사용하기에 유용하다 (Bossen 등, J Biol Chem 281 (2): 13964-71; Kostenuik 등, J Bone Miner Res 24 (2): 182-95).
실시예 4: 폐 전이 모델에서 RANKL 중화의 효과
생체내에서 활성화 (예를 들어, 혈류에서 순환하는 종양 세포의 코팅 후) 시에 발현되는 pRANKL의 역할을 조사하기 위해, 흑색종 폐 전이 모델을 적용하였다. 모 흑색종 세포를 이 모델에서 생리학적 마우스 pRANKL의 역할을 특징짓기 위해 사용하였다. 이전 보고서와 일치하게 혈소판 고갈 시 전이수가 급격히 감소하였다. 흥미롭게도, RANK-Fc-KO 융합 단백질을 사용한 마우스 RANKL의 중화는 혈소판 고갈 시 얻은 결과와 비교할만한 낮은 전이 수치를 나타냈다 (도 4). 이러한 데이터는 전이가 pRANKL에 의해 매개되고 그 중화가 전이 형성을 방지할 수 있다는 사실을 가리킨다.
실시예 5: RANKL의 중화는 불멸화된 MCF10A 세포에서 혈소판-유도된 프로전이성 EMT 시그널링을 방지한다.
첫 번째 단계로 본 발명자들은 EMT 분석을 위한 고전적 모델인 MCF10A 세포 자체가 RANKL을 발현한다는 것을 배제하기 위해 정량적 실시간 PCR을 사용하였다. 이것은 종양-발현된 RANK의 자극이 혈소판과는 독립적으로 자가분비/주변분비 (autocrine/paracrine) 방식으로 일어나지 않았음을 확인하는 역할을 한다. 후속적으로, MCF10A 세포를 이전에 기술된 바와 같이 (Kopp 등, Cancer Res 69 (19): 7775-83; Placke 등 2012, Cancer Res 72 2): 440-8 및 Placke 등, 2012, 189 (1): 154-60), 혈액 내 종양 세포의 혈소판-코팅을 모방하기 위해 인간 혈소판과 함께 인큐베이션하였다. 혈소판-유래된 RANKL을 중화시키기 위해 Denosumab의 존재 또는 부재 하에 공동배양을 추가로 수행하였다. ZEB 및 NCadherin mRNA의 유도에 대한 정량적 실시간 PCR 분석은 혈소판의 존재가 MCF10A 세포에서 2개의 프로전이성 유전자의 발현을 유도한다는 것을 입증하였다. 이것은 Denosumab으로 RANKL을 차단함으로써 크게 감소되었으며, 이는 pRANKL이 응집체 형성시 종양 세포에 대한 혈소판의 프로전이 효과를 매개하고 pRANKL의 중화가 종양 세포의 전이 잠재력을 제한하는 역할을 할 수 있다는 분명한 증거를 제공한다.
실시예 6: RANKL의 중화는 불멸화된 MCF10A 세포의 혈소판-유도된 이동을 방지한다.
악성 세포의 이동 가능성은 전이 형성의 핵심이기 때문에, 혈소판-유도된 RANKL이 종양 세포 이동에도 영향을 끼치는지를 연구하였다. 이를 위해, MCF10A 세포를 트랜스웰 분석 시스템에 사용하였다. MCF10A 세포를 인간 혈소판과 함께 인큐베이션하여 트랜스웰 시스템의 상부 챔버에서 이소타입 대조군 또는 Denosumab의 존재 또는 부재하에 전술한 바와 같이 혈액에서 종양 세포의 혈소판 코팅을 모방하였다. 48시간 후, EGF 구배를 따라 하부 챔버로 이동한 세포의 수를 측정하였다. 본 발명자들은 혈소판의 존재가 이동된 세포의 수를 분명히 증가시켰으며, 이것은 혈소판 유래 RANKL이 Denosumab의 존재에 의해 중화될 때 크게 감소한다는 것을 관찰하였다. 이것은 pRANKL이 응집체 형성 시 악성 세포의 이동 잠재력 및 따라서 프로전이성 표현형을 증가시키고 pRANKL의 중화가 종양 세포의 전이 잠재력을 제한하는 역할을 할 수 있음을 입증한다 (도 7).
실시예 7: 혈소판-특이적 RANKL 녹아웃 마우스를 이용한 폐 전이 모델.
생체 내에서의 pRANKL의 역할을 더 조사하기 위해, B16-F10 흑색종 폐 전이 모델을 사용하였다. 혈소판-발현된 RANKL의 역할을 구체적으로 평가하기 위해, RANKL이 flox 부위 (이하 RANKL fl/fl로 지칭함)를 포함하는 129-Tnfsf11tm1.1 Caob/J 마우스 및 거핵세포/혈소판 특이적 재조합효소 (이하 Pf4cre로 지칭함)를 포함하는 C57BL/6-Tg(Pf4-cre)Q3Rsko/J 마우스를 사육하여 RANKL이 특이적으로 거핵세포/혈소판에서 녹아웃된 RANKL fl/fl Pf4 cre/+ 녹아웃 (ko) 마우스를 생성하였다. 혈소판-발현된 RANKL의 효과를 측정하기 위해, RANKL fl/fl Pf4 cre/+ 녹아웃 (ko) 마우스 또는 C57BL/6 대조군 마우스 (ctrl)에서 꼬리 정맥을 통해 B16-F10 흑색종 세포 (마우스 당 75,000개)를 주사하였다. 혈소판에서 RANKL의 결핍은 ctrl 군과 비교하여 ko에서 폐 전이의 수를 상당히 감소시켰다 (도 8). 이러한 데이터는 생체내에서의 전이 형성에 있어서 특이적인 pRANKL의 관여를 더욱 확인하고, pRANKL의 중화가 전이를 예방하는 역할을 할 수 있다는 본 발명자의 접근법을 뒷받침한다.
실시예 8: RANKL의 중화는 SK- Mel 흑색종 세포에서 혈소판-유도된 프로전이성 EMT 시그널 링을 방지한다.
불멸화된 MCF10A 세포로 얻은 결과를 확인하고 확장하기 위해, 본 발명자들은 악성 흑색종 세포주인 SK-Mel (ATCC)을 사용하였다. 유세포 분석은 악성 세포 자체가 RANKL을 발현한다는 것을 배제시켜 종양-발현된 RANK의 자극이 자가분비/주변분비 방식으로 일어나지 않고 오히려 혈소판에 의존적이라는 것을 확인하였다 (도 9A). 도 9B에 도시된 실험에서, SK-Mel 세포를 인간 혈소판과 함께 인큐베이션하여 전술한 바와 같이 혈액 중의 종양 세포의 혈소판 코팅을 모방하였다. 공동배양을 Denosumab (5 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 수행하여 혈소판-유래된 RANKL을 중화시켰다. 24 시간 후, ZEB mRNA의 유도에 대한 정량적 실시간 PCR 분석은, MCF10A 세포와 유사하게 혈소판의 존재가 이러한 프로전이성 유전자의 발현을 유도했으며, 이는 Denosumab으로 혈소판-유도된 RANKL을 차단함으로써 크게 감소됨을 입증하였다. 전이 형성/EMT에 관여하는 2개의 추가 유전자인 Twist 및 Vimentin의 발현 수준 분석에서도 유사한 효과가 관찰되었다. 이러한 분석은 도 5에 설명된 MCF10A 세포에서 얻은 결과를 확인하고 확장하며 실제로 pRANKL이 응집체 형성시 종양 세포에 대한 혈소판의 프로전이 효과를 매개하고 pRANKL의 중화가 종양 세포의 전이 잠재력 제한하는 역할을 한다는 추가 증거를 제공한다
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Claims (15)

  1. 혈액 중의 프리전이성 (premetastatic) 병변을 방지 또는 감소시키도록 암 환자를 치료하는데 사용하기 위한, 핵 인자 카파-B 리간드의 인간 혈소판-발현된 수용체 활성자 (pRANKL)를 인식하는 RANKL-특이적 길항제.
  2. 제1항에 있어서, pRANKL, 및 핵 인자 카파-B 리간드의 가용성 수용체 활성자(sRANKL) 및 핵 인자 카파-B 리간드의 막-결합 활성자(mRANKL) 중 하나 이상을 인식하는 교차-반응성인, 길항제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 길항제가 pRANKL에 결합하여, pRANKL이 파종성 암세포 상의 이의 수용체를 활성화시키는 것을 억제하는 것인, 길항제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제가 pRANKL 단량체 또는 다량체에 결합하고, 바람직하게는 혈소판 표면-결합된 pRANKL 또는 혈소판 표면으로부터 절단된 pRANKL과 복합체를 형성하는 것인, 길항제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리전이성 병변이 혈행성 (haematogenous)이고, 선택적으로 순환하는 활성화된 혈소판-암세포 응집체에 의해 측정되는 것인, 길항제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 환자는 최소 잔류 질환 및/또는 전이성 질환의 재발의 위험성이 있거나 이를 앓고 있고, 선택적으로 상기 환자는 혈액 샘플 중에 검출 가능한 수준의 순환하는 종양 세포를 갖는 것인, 길항제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상피 종양 및 중간엽 종양, 또는 내배엽, 중배엽 및/또는 외배엽 기원의 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 고형 종양, 또는 혈액-유래 암, 예를 들어 백혈병을 앓고 있는 것인, 길항제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 유방암, 췌장암, 위암, 식도암, 신장 세포 암종, 폐암종, 결장/직장/직장결장암, 흑색종, 전립선암, 두경부암 또는 백혈병을 앓고 있는 것인, 길항제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 종양의 적어도 일부를 제거하기 위한 외과적 중재 및/또는 방사선 조사를 받고 있는 환자이고, 상기 길항제는 네오애주번트 (neoadjuvant) 또는 애주번트 (adjuvant) 요법을 위해 투여되는 것인, 길항제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제가 항체, 항체 단편, 수용체-융합 단백질, 펩타이드, 소분자 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 길항제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제가 인간 또는 인간화된 항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 RANK-Fc 융합 단백질인, 길항제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제가 전신 투여에 의해, 바람직하게는 정맥내 주입 또는 볼루스 주사에 의해 치료적 유효량으로 환자에게 투여되는 것인, 길항제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 길항제가 애주번트 또는 네오애주번트 병용 요법, 바람직하게는 화학요법, 키나아제 억제제로의 요법 및/또는 면역 요법과 병용하여 환자에게 투여되는 것인, 길항제.
  14. 암 환자에서 프리전이성 병변의 예방 또는 치료에 효과적인 선도 후보제 확인 방법으로서, 상기 방법은 세포-기반 검정으로 하나 이상의 시험제를 스크리닝하는 것을 포함하며, 이는 하기 단계를 포함하는 것인, 방법:
    a) 암세포 배양물을 제공하는 단계;
    b) 상기 세포 배양물을 상기 시험제를 갖는 반응 혼합물 중에서 인간 혈소판과 접촉시키는 단계; 및
    c) 시험제가
    i) pRANKL에 의한 RANK 시그널링을 억제하고/하거나;
    ii) 암세포에 결합하는 혈소판의 수준을 감소시키는지를 검출하고,
    이로써 프리전이성 병변을 예방 또는 치료하기 위한 선도 후보제를 확인하는 단계.
  15. 암 환자의 전이 잠재성 예측 방법으로서,
    a) 말초 혈액 또는 그의 혈소판 함유 혈액 분획을 제공하는 단계;
    b) 상기 샘플에서 pRANKL 발현을 측정하고 기준 값과 비교하는 단계
    를 포함하고, 차이가 나는 발현은 프라전이성 병변 및 원거리 전이 발병의 증가된 잠재성을 나타내는 것인, 방법.
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