DE60118186T2 - Verwendung von inhibitoren des plazenta wachstumsfactors für die behandlung einer pathologischen angiogenese, pathologischen arteriogenese, entzündung, tumorbildung und/oder gefässdurchlässigkeit (ödem) - Google Patents

Verwendung von inhibitoren des plazenta wachstumsfactors für die behandlung einer pathologischen angiogenese, pathologischen arteriogenese, entzündung, tumorbildung und/oder gefässdurchlässigkeit (ödem) Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der pathologischen Angiogenese und Arteriogenese. Insbesondere beschreibt die Erfindung einen stressinduzierten Phänotyp bei einer transgenen Maus (PLGF-/-), die keinen Placenta-Wachstumsfaktor (PLGF) produziert und eine gestörte Gefäßendothel-Wachstumsfaktor-(VEGF-) abhängige Reaktion zeigt. Es wird aufgedeckt, dass eine PLGF-Defizienz einen negativen Einfluss auf verschiedene pathologische Vorgänge von Angiogenese, Arteriogenese und Gefäßdurchlässigkeit hat, die ischämische Retinopathie, Tumorbildung, Lungenhypertonie, Gefäßdurchlässigkeit (Ödembildung) und entzündliche Störungen umfassen. Somit betrifft die Erfindung Moleküle, die die Bindung von PLGF an seinen Rezeptor (VEGFR-1) hemmen, wie monoklonale Antikörper. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieser Moleküle zur Behandlung der letzteren pathologischen Vorgänge.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine anomale Blutgefäßbildung trägt zur Pathogenese zahlreicher Erkrankungen mit hoher Morbidität und Mortalität bei. Eine Erhellung der Mechanismen, die dem Gefäßwachstum zugrunde liegen, könnte die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Stimulation des Gefäßwachstums in ischämischen Geweben oder zur Unterdrückung ihrer Bildung in Tumoren ermöglichen. Neuere Gentargeting-Studien in Embryonen haben einige der Mechanismen identifiziert, die an der anfänglichen Bildung von Endothelkanälen (Angiogenese) und ihrer anschließenden Reifung durch Bedecken mit glatten Muskelzellen (Arteriogenese) beteiligt sind. Es gibt zunehmend Hinweise, dass ganz bestimmte molekulare Mechanismen das Wachstum von Blutgefäßen während pathologischer Zustände vermitteln, aber die molekularen Mitspieler bleiben größtenteils unbekannt. Man hat den Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) bei der Entwicklung und dem pathologischen Wachstum der Vaskulatur impliziert (Ferrara N. et al., 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30). Eine Defizienz in einem einzigen VEGF-Allel bewirkt fatale Gefäßdefekte (Carmeliet P. et al., 1996, Nature 380, 435-439 und Ferrara N. et al., 1996, Nature 380, 439-442), wohingegen eine Unterdrückung von VEGF im Neugeborenen oder die Expression einer einzigen VEGF120-Isoform zu gestörtem Gefäßwachstum führt (Gerber H.P. et al., 1999, Development 126, 1149-1159 und Carmeliet P. et al., 1999, Nat Med 5, 495-502). Beim Erwachsenen beeinflusst VEGF das Gefäßwachstum während der Reproduktion, Wundheilung und maligner und entzündlicher Störungen (Ferrara N. et al., 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30). VEGF wird zurzeit im Hinblick auf die therapeutische Angiogenese im ischämischen Herzen und in der ischämischen Gliedmaße getestet, aber anfängliche klinische Versuche führten sowohl zu vielversprechenden als auch enttäuschenden Ergebnissen (Isner J.M. et al., 1999, J Clin Invest 103, 1231-1236). Eine herausragende Frage ist, ob VEGF in der Lage ist, die Reifung von Gefäßen mit einer Decke aus glatten Muskeln (Arteriogenese) zu stimulieren. Nackte Endothelkanäle bleiben gegenüber traumatischen Verletzungen verletzlich, bilden sich bei Sauerstoffänderungen zurück und besitzen keine vasomotorische Kontrolle, um Veränderungen in der Gewebeperfusion auszugleichen (Benjamin L.E. et al., 1998, Development 125, 1591-1598). Bei einigen Erkrankungen, wie Lungenhypertonie, ist übermäßige Arteriogenese ein unerwünschtes und schlecht kontrollierbares Phänomen. Bei Lungenhypertonie kommt es zu einer Remodellierung der Lungenvaskulatur, weil vaskuläre glatte Muskelzellen proliferieren und distal um die terminalen Arteriolen wandern, wodurch sich der Lungengefäßwiderstand erhöht. Ein anderer Aspekt von VEGF ist, dass dieses Molekül die Permeabilität und das Wachstum adulter ruhender Gefäße beeinflusst. Im normalen Serum sind keine nachweisbaren Mengen an VEGF vorhanden, aber unter pathologischen Bedingungen, wie Krebs und entzündlichen Erkrankungen, wird VEGF stark nach oben reguliert und vermittelt die Bildung unerwünschter Ödeme. Ödembildung ist auch ein wichtiges klinisches Problem in Verbindung mit mehreren Tumoren und führt zu Aszites in Peritonealtumoren, Pleuritis bei Lungenkrebs und Hirnödem bei Hirntumoren (was möglicherweise zu fataler intrakranialer Hypertonie führt) und erleichtert oft die Tumormetastasierung. Gefäßverschluss und Ödem sind wichtige pathogene Mechanismen bei Asthma, Hirninfarktausbreitung nach Schlaganfall, peritonealer Sklerose nach Dialyse oder Abdomeneingriffen usw... Andere VEGF- Homologe wurden identifiziert, aber ihre Rolle bei Angiogenese und Arteriogenese bleibt unklar.
  • Ein interessantes Homolog von VEGF ist Placenta-Wachstumsfaktor (PLGF), aber seine Rolle bei Gefäßwachstum und Pathogenese ist schlecht untersucht (Persico M.G. et al., 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 31-40). Das US-Patent 5.919.899 beschreibt PLGF und seine Verwendung bei der Behandlung von entzündlichen Störungen, Wunden und Geschwüren. Donnini et al. (J. Pathol 189, 66, 1999) haben eine Korrelation zwischen der Hochregulation von PLGF und humanen Meningiomen beobachtet, aber es ist deutlich, dass es keinerlei Hinweis gibt, dass PLGF eine Rolle bei der Tumorbildung besitzt. Die Rolle von PLGF bei Ödem wurde von Monsky et al. (Cancer Res. 59, 4129, 1999) untersucht, aber es konnte keine In-vivo-Rolle für PLGF bei der Ödembildung während pathologischer Prozesse bei mehreren Maus- und Humantumoren gefunden werden. Man kennt im Stand der Technik keine Inhibitoren für PLGF, mit Ausnahme eines polyklonalen Ziegenantikörpers gegen humanen PLGF (R&D Pharmaceuticals, Abingdon, GB) und eines polyklonalen Huhnantikörpers (Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528). Diese Antikörper werden für Western-Blot-, Histochemie- und Immunpräziptitationsstudien verwendet. Ziche et al. (1997, Lab Invest 76(4):517-531) beschreiben die Verwendung eines inhibitorischen Anti-PLGF-Antikörpers zur Blockierung der PLGF-induzierten Angiogenese in In-vivo-Assays. Die Rolle des PLGF-Rezeptors (= VEGFR-1) bei der Endothelzellbiologie blieb ebenfalls im Verborgenen (Sawano A. et al., 1996, Cell Growth Differ 7, 213-221 und Clauss M. et al., 1996, J Biol Chem 271, 17629-17634). Gentargeting-Studien ergaben widersprüchliche Ergebnisse über die Rolle von VEGFR-1 entweder als möglicher Signalgebungsrezeptor (was durch die Gefäßdefekte bei VEGFR-1-defizienten Embryonen nahegelegt wird (Fong G.H. et al., 1999, Development 126, 3015-3025)) oder als inerte Bindungsstelle – einen "Abfluss" – für VEGF, der die Verfügbarkeit von VEGF für den angiogenen VEGFR-2 reguliert (was durch die normale Gefäßentwicklung bei Mäusen, die einen verkürzten VEGFR-1 exprimieren, dem die Tyrosinkinase-Domäne fehlt, nahegelegt wird (Hiratsuka S. et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 9349-9354)).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den überraschenden Befund, dass PLGF ein spezifischer Modulator von VEGF bei einer Mehrzahl an pathologischen Zuständen ist, wie ischämischer Retinopathie, Tumorigenese, entzündlichen Störungen, Wundheilung, Ödem und Lungenhypertonie. Dieser Befund hat Implikationen für die Hemmung von Gefäßdurchlässigkeit (Ödembildung), entzündlichen Störungen, Tumorbildung, pathologischer Angiogenese und die Prävention von Lungenhypertonie, die während pathologischer Arteriogenese auftritt.
  • Aufgaben der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zielt auf die Bereitstellung von Forschungswerkzeugen und Therapeutika für Patienten, die an pathologischer Angiogenese, pathologischer Arteriogenese und Ödembildung leiden. Insbesondere zielt die Erfindung auf die Bereitstellung von Molekülen, wie Antikörpern, die die Aktivität von PLGF blockieren können. Die Erfindung zielt ferner auf die Verwendung dieser Moleküle zur Behandlung oder Prävention von Lungenhypertonie, Krebs, Ödem, ischämischer Retinopathie und entzündlichen Störungen, ist aber nicht darauf beschränkt. Anders gesagt, zielt die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung von Therapeutika oder eines Medikaments, die/das zur Behandlung von Lungenhypertonie, Tumorbildung, Ödem, ischämischer Retinopathie oder entzündlichen Störungen verwendet werden kann/können.
  • Insbesondere, betrifft die Erfindung die Verwendung eines Angiogeneseinhibitors, der aus einem Antikörper oder einem Fragment davon besteht, der/das spezifisch an Placenta-Wachstumsfaktor bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, Erkrankungen des Auges, Lungenhypertonie, Entzündung und Ödem. Die Erfindung ist von besonderem Interesse zur Behandlung einer Erkrankung des Auges, die eine Retinopathie oder eine choroidale intraokulare Störung ist oder bei der es sich um ischämische Retinopathie handelt. Ganz besonders stellt die Erfindung die therapeutische Verwendung eines Inhibitors von PLGF bereit, der ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist, wie ein muriner monoklonaler Antikörper, der humanisiert werden kann. Nach einer besonderen Ausführungsform. Besondere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die therapeutische Verwendung eines Fragments eines PLGF-hemmenden Antikörpers, wie eines Fab-, F(ab)'2- oder scFv-Fragments.
  • Figurlegenden
  • 1: Rolle von PLGF beim pathologischen Gefäßwachstum.
  • a, PLGF – von adulten ruhenden Endothelzellen (EC) konstitutiv produziert – ist für die Aufrechterhaltung der adulten ruhenden Vaskulatur nicht wesentlich, wahrscheinlich weil er in Gegenwart einer minimalen VEGF-Expression unwirksam ist. Wenn die Expression von VEGF während Ischämie, Entzündung (Makrophagen: Mϕ) oder Malignität (Tumorzellen) nach oben reguliert wird, verstärkt PLGF die Reaktion von Endothel- und glatten Muskelzellen (SMC) auf VEGF, was zu verstärkter Angiogenese, Gefäßpermeabilität und Arteriogenese führt. PLGF kann auf autokrine Weise auf Endothelglatte Muskel- und Entzündungszellen wirken, wird aber auch durch nahegelegene Tumorzellen, ischämische Kardiomyozyten usw. produziert. b, In Abwesenheit von PLGF werden Gefäße während der Entwicklung normal gebildet, reagieren aber weniger auf VEGF während pathologischer Bedingungen.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bei früheren Studien wurde das PLGF-Gen im Mausgenom über homologe Rekombination in embryonalen Stamm- (ES-) zellen inaktiviert (Carmeliet P., 2000, J. Pathol. 190, 387-405, Carmeliet P., 1999, Curr. Interv. Cardio. Reports 1, 322-335 und Carmeliet P. und Collen D., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237, 133-158). PLGF- (PLGF–/–-) defiziente Mäuse sind lebensfähig und fertil, zeigten aber keine spontanen Gefäßdefekte. Bei der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass das Wachstum von Endothelkanälen (Angiogenese), die Gefäßreifung durch glatte Muskelzellen (Arteriogenese) und die Gefäßpermeabilität bei adulten PLGF–/–-Mäusen während einer Viehzahl an Zuständen, bei denen pathologische Angiogenese und Ödembildung auftreten, signifikant gestört sind. Die letzteren Bedingungen umfassen ischämische Retinopathie, Tumorbildung, Lungenhypertonie, Ödem und Entzündung, von denen auch bekannt ist, dass VEGF daran beteiligt ist. Unter einem anderen Aspekt der Erfindung wird gezeigt, dass die Rolle von PLGF nicht nur auf die Bildung unreifer Kapillaren beschränkt ist, sondern auch die Reifung/Stabilisierung neu gebildeter Gefäße über die Stimulation ihrer Bedeckung mit glatten Muskelzellen (Arteriogenese) beinhaltet, eine therapeutische Voraussetzung für eine funktionelle und nachhaltige Angiogenese, aber eine unerwünschte Wirkung der pathologischen Arteriogenese, wie im Fall der Lungenhypertonie.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung bei einer Ausführungsform Moleküle, die eine Region umfassen, die spezifisch an Placenta-Wachstumsfaktor binden kann, und diese Moleküle können die durch Placenta-Wachstumsfaktor induzierte pathologische Angiogenese, Gefäßdurchlässigkeit (Ödem), Lungenhypertonie, Tumorbildung und/oder entzündliche Störungen unterdrücken oder verhindern. Mit "Unterdrückung" ist gemeint, dass eine Unterdrückung zu mindestens 20%, 30%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder sogar 100% auftreten kann. Die Erfindung betrifft Antagonisten von PLGF, wie Anti-PLGF-Antikörper und von diesen stammende funktionelle Fragmente, die sämtlich in der Lage sind, die VEGFR-1-Signalübertragung durch PLGF zu stören oder zu hemmen. Unter PLGF werden auch dessen Isoformen, die infolge von alternativem Spleißen auftreten, sowie dessen allelische Varianten verstanden. Infolge von alternativem Spleißen wurden drei PLGF-RNAs, die die monomeren humanen PLGF-1-, PLGF-2- und PLGF-3-Isoformen-Vorläufer mit 149, 179 bzw. 219 Aminosäureresten codieren, beschrieben. In normalen Geweben der Maus wurde nur eine Maus-PLGF-mRNA identifiziert, die das Äquivalent von humanem PLGF-2 codiert.
  • Bei einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung einen murinen monoklonalen Antikörper gegen PLGF bereit. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist der murine monoklonale Antikörper Mab-PL5D11. Dieser monoklonale Antikörper ist im Department of Transgene Technology and Gene Therapy, UZ Gasthuisberg, Herestraat 49, B-3000 Leuven erhältlich.
  • Der Begriff "Antikörper" betrifft einen Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er spezifisch gegen PLGF oder ein funktionelles Derivat davon gerichtet ist, wobei die Antikörper bevorzugt monoklonale Antikörper sind; oder ein antigenbindendes Fragment davon des F(ab')2-, F(ab)- oder einkettigen Fv-Typs oder jeder Typ des davon stammenden rekombinanten Antikörpers. Diese erfindungsgemäßen Antikörper, die spezifische polyklonale Antiseren umfassen, die gegen PLGF oder ein funktionelles Derivat davon hergestellt werden, besitzen keine Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können zum Beispiel durch jedes Hybridom produziert werden, das gemäß herkömmlicher Verfahren aus Milzzellen eines Tiers, insbesondere einer Maus oder Ratte, die gegen PLGF oder ein funktionelles Derivat davon immunisiert wurde, und Zellen einer Myelomzelllinie hergestellt und anhand der Fähigkeit des Hybridoms, die PLGF erkennenden monoklonalen Antikörper oder ein funktionelles Derivat davon, die ursprünglich zur Immunisierung der Tiere verwendet wurden, zu erkennen, selektiert werden kann. Die monoklonalen Antikörper nach dieser Ausführungsform der Erfindung können humanisierte Versionen der monoklonalen Maus-Antikörper sein, die mittels DNA-Rekombinationstechnologie ausgehend von den Maus- oder humanen genomischen DNA-Sequenzen, die die H- und L-Ketten codieren, oder von cDNA-Klonen, die die H- und L-Ketten codieren, hergestellt werden. Alternativ können die monoklonalen Antikörper nach dieser Ausführungsform der Erfindung humane monoklonale Antikörper sein. Solche humanen monoklonalen Antikörper werden beispielsweise mithilfe einer Repopulation von Mäusen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID-Mäusen) mit humanem Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL), wie in WO9960846 (PCT/EP99/03605) beschrieben, oder unter Verwendung transgener nicht-humaner Tiere, die humane Antikörper produzieren können, wie im US-Patent 5,545,806 beschrieben, hergestellt. Auch von diesen monoklonalen Antikörpern stammende Fragmente, wie Fab, F(ab)'2 und ssFv ("single chain variable fragment"), bilden unter der Voraussetzung, dass sie die ursprünglichen Bindungseigenschaften beibehalten haben, einen Teil der vorliegenden Erfindung. Solche Fragmente werden zum Beispiel üblicherweise durch enzymatische Spaltung der Antikörper mit Papain, Pepsin oder anderen Proteasen erzeugt. Es ist dem Fachmann bekannt, dass monoklonale Antikörper oder Fragmente davon für verschiedene Verwendungen modifiziert werden können. Die von der Erfindung umfassten Antikörper können durch eine geeignete Markierung des enzymatischen, fluoreszenten oder radiaktiven Typs markiert werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die vorstehend beschriebenen Moleküle als Medikament zur Behandlung pathologischer Zustände der Angiogenese und/oder Arteriogenese und/oder Ödembildung verwendet werden.
  • "Ödem" ist ein Zustand, der durch Gefäßdurchlässigkeit hervorgerufen wird. Vasodilatation und erhöhte Permeabilität während einer Entzündung können vorwiegende pathogenetische Mechanismen sein. Zum Beispiel trägt ein Ödem zur Infarktausbreitung nach einem Schlaganfall bei und kann eine lebensbedrohenden intrakraniale Hypertonie bei Krebspatienten hervorrufen. Ferner begünstigt die Extravasation von Plasmaproteinen die metastatische Ausbreitung okkulter Tumoren, und ein Atemwegsverschluss kann zu fatalen Asthmaattacken führen. Die erhöhte Gefäßdurchlässigkeit, die während einer Entzündung auftritt, kann zu Atemnot, Aszites, Peritonealsklerose (bei Dialysepatienten), Adhäsionsbildung (Abdomenoperationen) und metastatischer Ausbreitung führen. Mit "Angiogenese" ist ein grundlegender Vorgang gemeint, durch den neue Blutgefäße gebildet werden. Der primäre Angiogenesezeitraum bei Menschen findet in den ersten drei Monaten der Embryonalentwicklung statt, aber Angiogenese tritt auch als normaler physiologischer Prozess während Zeiträumen des Gewebswachstums, wie einer Zunahme von Muskel oder Fett, sowie während des Menstruationszyklus und der Schwangerschaft auf. Der Begriff "pathologische Angiogenese" betrifft die Bildung und das Wachstum von Blutgefäßen bei der Erhaltung und dem Voranschreiten mehrerer Erkrankungszustände. In Blutgefäßen (Atherosklerose, Hämangiom, Hämangioendotheliom), Knochen und Gelenken (rheumatoide Arthritis, Synovitis, Knochen- und Knorpelzerstörung, Osteomyelitis, Pannuswachstum, Osteophytenbildung, Neoplasmen und Metastasen), Haut (Warzen, pyogene Granulome, Haarwachstum, Kaposi-Sarkom, Narbenkeloide, allergische Ödeme, Neoplasmen), Leber, Niere, Lunge, Ohr und anderen Epithelien (entzündliche und infektiöse Prozesse (einschließlich Hepatitis, Glomerulonephritis, Pneumonie), Asthma, Nasenpolypen, Otitis, Transplantation, Leberregeneration, Neoplasmen und Metastasen), Uterus, Ovar und Placenta (dysfunktionelle Uterusblutung (aufgrund intrauteriner Kontrazeptionsvorrichtungen), Bildung von Follikelzysten, Ovarhyperstimulationssyndrom, Endometriose, Neoplasmen), Hirn, Nerven und Auge (Frühgeburtsretinopathie, diabetische Retinopathie, choroidale und andere intraokulare Störungen, Leukomalazie, Neoplasmen und Metastasen), Herz und Skelettmuskel aufgrund von Arbeitsüberlastung, adipösem Gewebe (Fettleibigkeit), endokrinen Organen (Thyroiditis, Schilddrüsenvergrößerung, Pankreastransplantation), Hämatopoese (AIDS (Kaposi)), hämatologische Malignitäten (Leukämien usw.), Lymphgefäßen (Tumormetastasen, lymphoproliferative Störungen). Mit "ischämischen Erkrankungen der Retina" ist gemeint, dass die Blut- und Sauerstoffzufuhr der Retina verringert ist, die peripheren Abschnitte der Retina ihre Nahrungsquelle verlieren und ihre richtige Funktion einstellen. Übliche Erkrankungen, die zu Retinopathie führen, sind diabetische Retinopathie, Verschluss der zentralen Retinavene, Stenose der Carotis-Arterie und Sichelzellretinopathie. Diabetische Retinopathie ist eine Hauptursache von Sehverlust bei diabetischen Patienten. In der ischämischen Retina tritt das Wachstum neuer Blutgefäße (Neuvaskularisation) auf. Diese Gefäße wachsen of auf der Oberfläche der Retina, am Nervus opticus oder vor dem Auge auf der Iris. Die neuen Gefäße können den Strom der notwendigen Nährstoffe nicht ersetzen und statt dessen viele Probleme verursachen, wie Glaskörperhämorrhagie, Retinaablösung und unkontrolliertes Glaukom. Diese Probleme treten auf, weil die neuen Gefäß fragil und zu Blutungen neigen. Wenn sie in ihren Frühstadien entdeckt wird, kann die proliferative diabetische Retinopathie manchmal mit panretinaler Photokoagulation aufgehalten werden. In einigen Fällen ist jedoch eine Glaskörperektomie die einzige Möglichkeit.
  • Unter dem Begriff "Lungenhypertonie" wird eine Störung verstanden, bei der der Blutdruck in den Lungenarterien anomal hoch ist. In Abwesenheit anderer Erkrankungen des Herzens oder der Lungen wird sie als primäre Lungenhypertonie bezeichnet. Eine diffuse Verengung der Lungenarteriolen tritt infolge von pathologischer Arteriogenese auf, gefolgt von Lungenhypertonie als Reaktion auf den erhöhten Widerstand gegen den Blutfluss. Die Inzidenz beträgt 8 von 100000 Menschen. Lungenhypertonie kann jedoch auch als Komplikation von chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen (Chronic Obstructive Pulmonary Diseases, COPD), wie Emphysem, chronischer Bronchitis oder diffuser interstitieller Fibrose, und bei Patienten mit asthmatiformen COPD auftreten. Die Inzidenz von COPD beträgt etwa 5 von 10000 Menschen.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die oben beschriebenen Moleküle zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündung und, genauer gesagt, entzündlichen Störungen verwendet werden. "Entzündung", wie hier verwendet, bedeutet die lokale Reaktion auf eine Verletzung lebender Gewebe, insbesondere die lokale Reaktion der kleinen Blutgefäße, ihres Inhalts und ihrer anhängenden Strukturen. Die Passage von Blutbestandteilen durch die Gefäßwände in die Gewebe ist der entscheidende Vorgang bei einer Entzündung, und die so gebildete Gewebeansammlung wird als Exsudate oder Ödem bezeichnet. Jedes schädliche Verfahren, das lebendes Gewebe schädigt – Infektion mit Bakterien, übermäßige Hitze, Kälte, mechanische Verletzung, wie Quetschen, Säuren, Alkalis, Bestrahlung oder Infektion mit Viren, kann ungeachtet des beteiligten Organs oder Gewebes eine Entzündung hervorrufen. Es sollte selbstverständlich sein, dass Erkrankungen von Tieren und Menschen, die als "entzündliche Erkrankungen" klassifiziert werden, und Gewebsreaktion, die von Verbrennungen bis Pneumonie, Lepra, Tuberkulose und rheumatoider Arthritis reichen, sämtlich "Entzündungen" sind.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die vorstehend beschriebenen Moleküle zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorbildung verwendet werden. Mit "Tumor" ist eine Masse von anomalem Gewebe gemeint, die ohne offensichtlichen Grund aus bereits existierenden Körperzellen entsteht, keine zweckdienliche Funktion hat und durch eine Neigung zu autonomem und uneingeschränktem Wachstum gekennzeichnet ist. Tumoren sind recht verschieden von entzündlichen oder anderen Anschwellungen, weil die Zellen in Tumoren in ihrem Aussehen und anderen Eigenschaften anomal sind. Anomale Zellen – des Typs die gewöhnlich Tumoren bilden – unterscheiden sich von normalen Zellen dadurch, dass sie einer der folgenden Veränderungen unterlagen: (1) Hypertrophie oder eine Zunahme der Größe von Einzelzellen; dieses Merkmal wird gelegentlich in Tumoren gefunden, tritt aber üblicherweise unter anderen Bedingungen auf; (2) Hyperplasie oder Zunahme der Anzahl an Zellen in einer gegebenen Zone; unter bestimmten Umständen kann sie das einzige Kriterium der Tumorbildung darstellen; (3) Anaplasie oder Rückbildung der physikalischen Merkmale einer Zelle zu einem primitiveren oder undifferenzierteren Typ; dies ist ein praktisch konstantes Merkmal maligner Tumoren, obwohl es unter bestimmten Umständen sowohl bei Gesundheit als auch Krankheit auftritt. Unter gewissen Umständen sehen die Zellen eines Tumors wie normale, getreue Nachbildungen ihrer Parentaltypen aus; die Unterschiede zwischen ihnen und normalen Körperzellen sind schwierig auszumachen. Solche Tumoren sind auch oft gutartig. Andere Tumoren bestehen aus Zellen, die hinsichtlich Größe, Gestalt und Struktur verschieden von normalen adulten Typen aussehen: Sie gehören gewöhnlich zu Tumoren, die bösartig sind. Solche Zellen können eine bizarre Form haben oder auf gestörte Weise angeordnet sein. In extremeren Fällen werden die Zellen maligner Tumoren als primitiv oder undifferenziert beschrieben, weil sie das Aussehen und die Funktionen des besonderen Typs der (normalen) spezialisierten Zelle, die ihr Vorläufer war, verloren haben. In der Regel kann ein maligner Tumor umso schneller wachsen, je weniger differenziert seine Zellen sind. Malignität betrifft die Fähigkeit eines Tumors, schließlich den Tod zu bewirken. Jeder Tumor, ob vom gutartigen oder malignen Typ, kann durch lokale Wirkungen den Tod hervorrufen, wenn er "geeignet" lokalisiert ist. Die übliche und spezifischere Definition von Malignität impliziert eine inhärente Neigung der Tumorzellen zur Metastasierung (breitflächigen Einwanderung in den Körper und Zerstreuung durch subtile Maßnahmen) und zur abschließenden Tötung des Patienten, wenn nicht alle malignen Zellen ausgerottet werden können. Somit ist Metastasierung das herausragende Merkmal von Malignität. Metastasierung ist die Neigung von Tumorzellen, von ihrer Ursprungsstelle durch das Kreislaufsystem und andere Kanäle weggetragen zu werden, was schließlich diese Zellen in praktisch jedem Gewebe und Organ des Körpers etablieren kann. Dagegen bleiben die Zellen eines benignen Tumors unveränderlich miteinander in Kontakt in einer festen Masse mit dem Zentrum an der Ursprungsstelle. Aufgrund der physikalischen Kontinuität benigner Tumorzellen können sie operativ vollständig entfernt werden, wenn die Stelle geeignet ist. Aber die Zerstreuung maligner Zellen, die jeweils individuell (durch Zellteilung) die Fähigkeit zur Bildung neuer Massen von Zellen (neuer Tumoren) an neuen und entfernten Stellen besitzen, schließt eine vollständige Ausrottung durch ein einziges operatives Verfahren in allen außer dem frühesten Wachstumszeitraum aus. Ein benigner Tumor kann einer malignen Transformation unterliegen, aber die Ursache für eine solche Veränderung ist unbekannt. Es ist auch möglich, dass ein maligner Tumor ruhend bleibt und klinisch für lange Zeit einen benignen vortäuscht. Alle benignen Tumoren neigen dazu, an der Ursprungsstelle lokalisiert zu bleiben. Viele benigne Tumoren sind eingekapselt. Die Kapsel besteht aus Bindegewebe, das von den Strukturen stammt, die den Tumor unmittelbar umgeben. Gut eingekapselte Tumoren sind nicht an ihren umgebenden Geweben verankert. Diese gutartigen Tumoren vergrößern sich durch Zusammenwachsen, Wegstoßen der benachbarten Gewebe, ohne sie innig zu beteiligen. Zu den Haupttypen benigner Tumoren gehören die Folgenden: Lipome, die aus Fettzellen bestehen; Angiome, die aus Blut- oder Lymphgefäßen bestehen; Osteome, die aus Knochen entstehen; Chondrome, die aus Knorpel entstehen; und Adenome, die aus Drüsen entstehen. Beispiele für maligne Tumoren umfassen Karzinome (treten in Epithelgeweben auf, die den Körper bedecken, (der Haut) und die inneren Höhlungsstrukturen von Organen (wie der Brust, des Atem- und Gastrointestinaltrakts, der endokrinen Drüsen und des Urogenitalsystems) auskleiden), Sarkome entwickeln sich in Bindegeweben, einschließlich Fasergeweben, adipösen (Fett-) Geweben, Muskel, Blutgefäßen, Knochen und Knorpel. Ein Krebs kann sich auch sowohl in Epithel- als auch Bindegewebe entwickeln und wird als Karzinosarkom bezeichnet. Krebserkrankungen der blutbildenden Gewebe (wie Leukämien und Lymphome), Tumoren von Nervengeweben (einschließlich des Hirns) und Melanom (ein Krebs der pigmentierten Hautzellen) werden getrennt klassifiziert.
  • Bei einer spezifischen Ausführungsform sollte selbstverständlich sein, dass das erfindungsgemäße Therapieverfahren gegen Tumoren auch in Kombination mit anderer im Stand der Technik bekannter Tumortherapie verwendet werden kann, wie Bestrahlung, Chemotherapie oder Operation.
  • Der Begriff "Medikament zur Behandlung" bezeichnet eine Zusammensetzung, die Moleküle, wie oben beschrieben, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten (wobei beide Ausdrücke austauschbar verwendet werden können) umfasst, zur Behandlung von Erkrankungen, wie vorstehend genannt. Geeignete, dem Fachmann bekannte Träger oder Excipienten sind Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung, Hanks-Lösung, fixierte Öle, Ethyloleat, 5% Dextrose in Kochsalzlösung, Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität verstärken, Puffer und Konservierungsmittel.
  • Andere geeignete Träger umfassen jeden Träger, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern, die für den Patienten, der die Zusammensetzung erhält, schädlich sind, induziert, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren und Aminosäure-Copolymere. Das "Medikament" kann durch jedes geeignete Verfahren innerhalb der Kenntnis des Fachmanns verabreicht werden. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral. Bei der parenteralen Verabreichung wird das erfindungsgemäße Medikament in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform, wie einer Lösung, Suspension oder Emulsion, in Verbindung mit den pharmazeutisch verträglichen Excipienten, wie oben definiert, formuliert. Die Dosierung und die Verabreichungsweise hängen jedoch vom Patienten ab. Gewöhnlich wird das Medikament derart verabreicht, dass das erfindungsgemäße Protein, Polypeptid, Peptid in einer Dosis zwischen 1 μg/kg und 10 mg/kg, stärker bevorzugt zwischen 10 μg/kg und 5 mg/kg, am stärksten bevorzugt zwischen 0,1 und 2 mg/kg verabreicht wird. Vorzugsweise wird es als Bolusdosis verabreicht. Eine kontinuierliche Infusion kann ebenfalls verwendet werden und beihaltet die kontinuierliche subkutane Zufuhr über eine osmotische Minipumpe. In diesem Fall kann das Medikament in einer Dosis zwischen 5 und 20 μg/kg/Minute, stärker bevorzugt zwischen 7 und 15 μg/kg/Minute infundiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform können Antikörper oder funktionelle Fragmente davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der obengenannten Störungen verwendet werden. Nicht-beschränkende Beispiele sind der kommerziell erhältliche polyklonale Ziegenantikörper von R&D Pharmaceuticals, Abingdon, GB, oder der polyklonale Huhnantikörper (Gassmann et al., 1990, Faseb J. 4, 2528). Vorzugsweise sind diese Antikörper humanisiert (Raderet et al., 2000, 7. Biol. Chem. 275, 13668), und stärker bevorzugt werden humane Antikörper als Medikament verwendet.
  • Ein Molekül zur Hemmung der Aktivität von PLGF, wie oben beschrieben, kann in Kombination mit einem Molekül zur Hemmung der Aktivität von VEGF in den gleichen Hemmspiegeln, wie vorstehend für PLGF beschreiben, verwendet werden. Tatsächlich wurde gefunden, dass PLGF an Stellen angiogen wirkt, an denen die VEGF-Spiegel erhöht sind.
  • PLGF-Promotorpolymorphismen können zur Identifikation von Patienten mit einer Prädisposition für die Erlangung von pathologischer Angiogenese, Gefäßdurchlässigkeit (Ödem), Lungenhypertonie, Tumorbildung und/oder entzündlichen Störungen verwendet werden. Tatsächlich kann erwartet werden, dass Promotorpolymorphismen zu viel höheren oder viel niedrigeren Spiegeln von PLGF führen können. Folglich können höhere PLGF-Spiegel zu einer Prädisposition für die Erlangung von pathologischer Angiogenese, Gefäßdurchlässigkeit (Ödem), Lungenhypertonie, Tumorbildung und/oder entzündlichen Störungen führen, während viel niedrigere Spiegel von PLGF zu einem Schutz vor der Erlangung von pathologischer Angiogenese, Gefäßdurchlässigkeit (Ödem), Lungenhypertonie, Tumorbildung und/oder entzündlichen Störungen führen können.
  • Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung wird anhand der folgenden veranschaulichenden Beispiele erhalten. Sämtliche offenbarten Ausgangsmaterialien und Reagenzien sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich oder können unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden.
  • Beispiele
  • 1. Gestörte pathologische Angiogenese bei PLGF–/–-Mäusen
  • Bei mehreren pathologischen Zuständen, insbesondere in Verbindung mit einer erhöhten VEGF-Expression, war die Bildung neuer, mit Endothel ausgekleideter Kanäle (Angiogenese) bei PLGF–/–-Mäusen signifikant gestört. Auch das Wachstum und die Angiogenese von embryonalen Stammzellen (ES) stammender Tumoren, die bekanntlich durch VEGF vermittelt werden (Ferrara N. et al., 1996, Nature 380, 439-442), war von PLGF abhängig. Tatsächlich wogen von ES-Zellen stammende PLGF+/+-Tumoren, die innerhalb von vier Wochen nach subkutaner Überimpfung in nu/nu-PLGF+/+-Mäusen erhalten wurden, 4 ± 1 g (n = 8) und erschienen hämorrhagisch und bluteten reichlich (7 von 8 Tumoren). Dagegen wogen PLGF–/–-Tumoren in nu/nu-PLGF–/–-Wirten nur 1,0 ± 0,3 g (n = 8) und waren homogen weiß bei minimaler Blutung (5 von 7 Tumoren). Wachstum und Vaskularisierung waren in PLGF–/–-Tumoren im gleichen Grad verringert wie in VEGF–/–-Tumoren. PLGF+/+- und PLGF–/–-Tumoren enthielten vergleichbare Gefäßdichten von Endothelschnüren und Kapillaren (Durchmesser < 8 μm). Verglichen mit PLGF+/+- Tumoren enthielten PLGF–/–-Tumoren jedoch weniger Gefäße mittlerer oder großer Größe. In einer früheren Studie zeigten wir, dass die Bildung mittlerer und großer Gefäße von VEGF abhängt (Carmeliet P. et al., 1998, Nature 394, 485-490). Die Angiogenese von PLGF+/+-Tumoren in nu/nu-PLGF–/–-Mäusen oder von PLGF–/–-Tumoren in nu/nu-PLGF+/+-Mäusen war mit derjenigen von PLGF+/+-Tumoren in nu/nu-PLGF+/+-Mäusen vergleichbar, was zeigt, dass die Produktion von PLGF entweder durch Tumor- oder durch vom Wirt stammendes Gewebe den Phänotyp retten konnte. Die VEGF-Transkriptspiegel waren bei beiden Genotypen vergleichbar (VEGF/103 HPRT-mRNA-Moleküle: 280 ± 20 in PLGF+/+-Tumoren gegenüber 320 ± 50 in PLGF–/–-Tumoren; p = NS) und wurden in epithelialen und mesenchymalen Zellen in den gesamten PLGF+/+-Tumoren exprimiert, wohingegen PLGF in Endothelzellen kleiner und großer Gefäße exprimiert wurde (In-situ-Hybridisierung). Die Expression von VEGF-B und VEGF-C war ebenfalls vergleichbar.
  • Das Aussetzen neugeborener Mäuse gegenüber 80% Sauerstoff von P7 bis P12 bewirkte einen Kapillarausfall in der Retina aufgrund einer verringerten VEGF-Expression (VEGF/103 HPRT-mRNA-Moleküle in PLGF+/+-Retinae: 270 ± 40 in P7 bei Normoxie gegenüber 100 ± 10 in P12 bei Hyperoxie; p < 0,05 gegenüber P7; n = 5) (Alon T. et al., 1995, Nat Med 1, 1024-1028). Nach Wiedereinsetzen von Raumluft in P12 reguliert die Retinaischämie die VEGF-Expression nach oben (VEGF/103 HPRT-mRNA-Moleküle: 390 ± 50 in P13, p < 0,05 gegenüber P7; und 165 ± 50 in P17; n = 5), wodurch Venendilatation, Arterienwindung und Kapillarwachstum in der Glaskammer von P17 an induziert werden (Kern T.S. et al., 1996, Arch Ophthalmol 114, 986-990). Die Rolle von PLGF bei ischämischer Retinopathie bleibt unbekannt. Die PLGF-Transkriptspiegel (PLGF/103 HPRT-mRNA-Moleküle) betrugen 40 ± 10 in P7 (Normoxie), 10 ± 2 in P12 (Hyperoxie), 90 ± 10 in P 13 (Rückkehr zur Normoxie) und 12 ± 2 in P17. Trotz einer vergleichbaren Retinagefäßentwicklung während Normoxie und eines vergleichbaren Kapillarausfalls während Hyperoxie (P12) bei beiden Genotypen, entwickelten PLGF–/–-Mäuse∼75% weniger und signifikant kleinere neuvaskularisierte Glaskörperbüschel in P17 als PLGF+/+-Mäuse (Endothelzellen pro Abschnitt: 10 ± 2 bei PLGF–/–-Mäusen gegenüber 48 ± 4 bei PLGF+/+-Mäusen; n = 6; p < 0,05). Zusätzlich zeigten PLGF–/–-Mäuse eine verringerte Venendilatation (semiquantitative Dilatationsbewertung, siehe Verfahren: 0,9 ± 0,05 bei PLGF–/–-Mäusen gegenüber 1,7 ± 0,03 bei PLGF+/+-Mäusen; p < 0,05) und Arterienwindung (Windungsbewertung: 0,8 ± 0,05 bei PLGF–/–-Mäusen gegenüber 2,3 ± 0,2 bei PLGF+/+-Mäusen; p < 0,05).
  • 2. Verringerte Gefäßpermeabilität bei PLGF–/–-Mäusen
  • Gefäßpermeabilität, ein charakteristisches Merkmal von VEGF (Ferrara N. et al., 1999, Curr Top Microbiol Immunol 237, 1-30), war bei PLGF–/–-Mäusen verglichen mit PLGF+/+-Mäusen folgerichtig verringert. Man hat VEGF zuvor bei der Gefäßpermeabilität der Haut impliziert (Brown L.F. et al., 1995, J Immunol 154, 2801-2807), aber die Rolle von PLGF bleibt unbestimmt. Mehrere Modelle wurden verwendet: (i) Intradermale Injektion von 1,3 oder 10 ng VEGF165 induzierte weniger Extravasation von Evans-Blau bei PLGF–/–-Mäusen als bei PLGF+/+-Mäusen (Miles-Test). (ii) Hautsensibilisierung mit Ovalbumin verursachte weniger Extravasation von Plasma bei PLGF–/–-Mäusen als bei PLGF+/+-Mäusen (Casals-Stenzel J. et al., 1987, Immunopharmacology 13, 177-183) (Arthus-Reaktion: 12 ± 1 μl extravasiertes Plasma nach Vehikel gegenüber 130 ± 5 μl Plasma nach Ovalbumin bei PLGF+/+-Mäusen; p < 0,05; n = 12 verglichen mit 11 ± 1 μl Plasma nach Vehikel gegenüber 13 ± 1 μl Plasma nach Ovalbumin bei PLGF–/–-Mäusen; p = NS; n = 12). (iii) Die Plasmaextravasation bei normalen Hautgefäßen war bei beiden Genotypen ähnlich (mg Plasma × 105/min.mg Gewebe: 35 ± 5 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 35 ± 4 bei PLGF–/–-Mäusen; p = NS; n = 7), stieg aber signifikant mehr bei PLGF+/+- als bei PLGF–/–-Mäusen nach Hautverletzung (60 ± 4 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 40 ± 4 PLGF–/–-Mäusen; p < 0,05; n = 10). Somit erhöhte PLGF spezifisch die Gefäßpermeabilität als Reaktion auf VEGF, aber nicht auf Histamin.
  • 3. Gestörte pathologische Arteriogenese bei PLGF–/–-Mäusen
  • Die Heilung von Hautverletzungen wird durch Einwachsen von Gefäßen vermittelt, die ursprünglich aus Endothelzellen bestehen (Angiogenese) und anschließend von glatten Muskelzellen umgeben werden (Arteriogenese). Man hat VEGF beim Kapillarwachstum während der Hautheilung impliziert (Detmar M. et al., 1998, J Invest Dermatol 111, 1-6), aber die Rolle von PLGF bleibt unbekannt. Die Heilung von Hautschnitten war bei PLGF–/– – verglichen mit PLGF+/+-Mäusen leicht verzögert. Beide Genotypen enthielten vergleichbare Dichten an Thrombomodulin-gefärbten Gefäßen in unverletzter Haut (Gefäße/mm2: 240 ± 80 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 200 ± 80 bei PLGF–/–-Mäusen; p = NS; n = 5). Die Anfärbung von α-Aktin aus glatter Muskulatur zeigte eine vergleichbare Dichte von Gefäßen (i), die nicht von wenigen glatten Muskelzellen bedeckt oder umgeben waren (Gefäße/mm2: 58 ± 14 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 40 ± 12 bei PLGF–/–-Mäusen; p = NS; n = 5), und (ii), die vollständig von mindestens einer glatten Muskelzellschicht bedeckt waren (Gefäße/mm2: 15 ± 5 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 19 ± 1 bei PLGF–/–-Mäusen; p = NS; n = 5). Innerhalb von vier Tagen nach Verletzung wurden PLGF in Endothelzellen exprimiert, und PLGF und VEGF waren in PLGF+/+-Keratinozyten in der hyperplastischen Epidermis am Wundenrand nach oben reguliert, wo sich neue Gefäße bildeten (In-situ-Hybridisierung, nicht gezeigt). Beide Stämme wiesen vergleichbares Einwachsen von Gefäßen in die Wundenregion auf (Thrombomodulin-gefärbte Gefäße/mm2: 240 ± 50 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 180 ± 50 bei PLGF–/–-Mäusen; n = 5; p = NS). Beide Genotypen unterschieden sich jedoch in dem Grad, in dem die neuen Gefäße mit SMA-positiven glatten Muskelzellen bedeckt waren. Die Anzahl an Gefäßen, die nicht oder unvollständig von glatten Muskelzellen bedeckt waren, betrug 40 ± 7 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 84 ± 13 bei PLGF–/–-Mäusen (p < 0,05; n = 5), wohingegen die Anzahl an Gefäßen, die vollständig durch mindestens eine glatte Muskelzellschicht bedeckt waren, 75 ± 18 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 30 ± 10 bei PLGF–/–-Mäusen betrug (p < 0,05). Somit stört ein Mangel an PLGF die Bedeckung neuer Endothelkanäle mit glatten Muskelzellen.
  • Lungenhypertonie aufgrund von hypoxieinduzierter Remodellierung der Lungenvaskulatur ist eine lebensbedrohende Komplikation der chronischen obstruktiven Lungenerkrankung (COPD). Obwohl VEGF in Lungen von Patienten mit COPD (Cool C.D. et al., 1999, Am J Pathol 155, 411-419) und hypoxischer Tiere stark nach oben reguliert ist (Christou H. et al., 1998, Am J Respir Cell Mol Biol 18, 768-776), ist seine Rolle bei diesem Vorgang nicht verstanden. Überraschenderweise ist keine Information über die Expression oder Rolle von PLGF verfügbar. Daher wurde adulte Mäuse für 4 Wochen einer Hypoxie (10% O2) ausgesetzt, weil dies zu Lungenhypertonie aufgrund einer verstärkten "Muskelarisierung" der Lungengefäße führt (Hales C.A. et al., 1983, Am Rev Respir Dis 128, 747-751). Das Verhältnis des rechten ventrikulären (RV) zum linken ventrikulären (LV) Gewicht – ein Maß für RV-Hypertrophie – war bei beiden Genotypen während Normoxie vergleichbar (32 ± 2% bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 33 ± 2% bei PLGF–/–-Mäusen; n = 4; p = NS), erhöhte sich signifikant nach Hypoxie bei PLGF+/+-Mäusen (48 ± 4%; n = 5; p < 0,05 gegenüber Normoxie), war aber durch Hypoxie bei PLGF–/–-Mäusen nur minimal beeinflusst (37 ± 2%; n = 6; p < 0,05 gegenüber Normoxie und gegenüber PLGF+/+). Bei der Lungengefäßremodellierung wurden signifikante genotypische Unterschiede beobachtet. Eine Elastinfärbung normoxischer Lungen zeigte, dass beide Genotypen eine vergleichbare Dichte an intraazinären dünnwandigen Arteriolen, die nur eine interne elastische Lamina (IEL) enthielten, oder dickwandigen Arteriolen, die eine intakte IEL und eine vollständige externe elastische Lamina (EEL) enthielten, besaßen (Tabelle 1). Dickwandige Arteriolen, die zwei intakte elastische Laminae über ihren gesamten Umfang enthielten, wurden bei beiden Genotypen nur gelegentlich entdeckt (Tabelle 1). Hypoxie bewirkte eine signifikante Gefäßremodellierung bei PLGF+/+-Mäusen, was zu einem größeren Anteil an dickwandigen Gefäßen mit einer partiellen oder vollständigen EEL auf Kosten dünnwandiger Gefäße mit nur einer einzelnen IEL führte (Tabelle 1). Dagegen war die Gefäßremodellierung bei PLGF–/–-Mäusen viel weniger signifikant und führte zu einem kleineren Anteil an dickwandigen Gefäßen mit vollständiger IEL und EEL (Tabelle 1). Immunfärbung von α-Aktin aus glatter Muskulatur (SMA) bestätigte, dass PLGF+/+-Mäuse nach Hypoxie signifikant mehr vollständig muskularisierte Arteriolen hatten als PLGF–/–-Mäusen (Tabelle 1). Der Schutz vor Lungenhypertonie bei PLGF–/–-Mäusen war weder auf eine verringerte Vasokonstriktionsreaktion (RV-Druck stieg um 31 ± 4% bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 34 ± 5% bei PLGF–/–-Mäusen als Reaktion auf 30 min 7% O2; p = NS) noch auf niedrigere Hämatokritspiegel zurückzuführen (48 ± 3% bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 53 ± 3% bei PLGF–/–-Mäusen; p = NS). Somit moduliert PLGF signifikant die Arterienremodellierung.
  • Tabelle 1: Lungengefäßremodellierung nach chronischer Hypoxie.
    Figure 00200001
  • Die Daten stellen die Anzahl (Durchschnitt ± SA von 5 Mäusen) von Gefäßen pro 103 Alveolen dar, die einen einzelne interne elastische Lamina (IEL), eine IEL plus eine unvollständige externe elastische Lamina (EEL) oder eine IEL plus eine vollständige EEL enthalten. Zusätzlich ist die Dichte von Gefäßen gezeigt, die nicht (fehlend), unvollständig oder vollständig von mit α-Aktin aus glatter Muskulatur angefärbten glatten Muskelzellen (SMC) umgeben waren. *: p < 0,05 gegenüber Normoxie (20% O2); #: p < 0,05 gegenüber PLGF+/+.
  • 4. Synergismus zwischen PLGF und VEGF
  • Die Proliferation und das Überleben von Endothelzellen als Reaktion auf VEGF wurden untersucht. VEGF165 stimulierte die Proliferation von PLGF+/+-Endothelzellen (Tabelle 2) und schützte sie vor Apoptose, die durch Serumverarmung (0,1% Serum) oder Supplementierung mit TNF-α (10 ng/ml) induziert wurde. Dagegen konnte VEGF165 nicht die Proliferation von PLGF–/–-Endothelzellen stimulieren oder diese gegen durch Serumverarmung oder TNF-α induzierte Apoptose schützen (Tabelle 2). PLGF selbst war für Endothelzellen jedes Genotyps weder mitogen noch anti-apoptotisch. Es beeinflusste ferner nicht die Reaktion von PLGF+/+-Endothelzellen auf VEGF (Tabelle 2), wahrscheinlich weil PLGF+/+-Endothelzellen bereits ausreichend PLGF produzierten (der variable Grad der PLGF-Produktion durch Endothelzellen und die relativen Mengen an VEGF, die unter den Kulturbedingungen vorhanden sind, können tatsächlich erklären, warum einige, aber nicht andere, zuvor in vitro eine angiogene Reaktion beobachtet haben). PLGF rettete jedoch die gestörte Proliferations- und Überlebensreaktion von PLGF–/–-Endothelzellen auf VEGF165 (Tabelle 2). Es wurde ferner gefunden, dass PLGF die mitogene Reaktion glatter Muskelzellen, von denen bekannt ist, dass sie VEGFR-1 und VEGFR-2 exprimieren (Grosskreutz C.L. et al., 1999, Microvasc Res 58, 128-136), auf VEGF moduliert. Tatsächlich stimulierte VEGF die Proliferation glatter PLGF+/+-, aber nicht PLGF–/–-Muskelzellen. PLGF, das selbst unwirksam ist, stellte die Reaktionsfähigkeit von PLGF–/–-Zellen auf VEGF wieder her. PLGF modulierte spezifisch die Aktivität von VEGF, weil PLGF–/–- und PLGF+/+-Zellen vergleichbare Reaktionen auf bFGF zeigten. Somit beeinflusste PLGF Endothel- und glatte Muskelzellen nur, wenn sie mit VEGF stimuliert wurden.
  • Der Mechanismus, von dem gefunden wurde, dass er eine Rolle bei der Synergie zwischen VEGF und PLGF spielt: (i) PLGF regulierte die Expression von VEGF nach oben, wie früher vorgeschlagen (Bottomley M.J. et al., 2000, Clin Exp Immunol 119, 182-188). Die Expression von VEGF durch PLGF–/–-Fibroblasten wurde durch PLGF erhöht (VEGF-Produktion pro 106 Zellen/ml/24 Std.: 180 ± 10 pg nach Behandlung mit Vehikel gegenüber 440 ± 10 pg nach Behandlung mit 100 ng/ml PLGF für 48 Std.; p < 0,05 gegenüber Vehikel). Ähnliche Ergebnisse wurden für PLGF+/+-Fibroblasten erhalten (VEGF-Produktion pro 106 Zellen/ml/24 Std.: 200 ± 8 pg nach Behandlung mit Vehikel gegenüber 430 ± 5 pg nach Behandlung mit 100 ng/ml PLGF für 48 Std.; p < 0,05 gegenüber Vehikel). Die Induktion der VEGF-Produktion durch PLGF war jedoch kleiner als die durch Hypoxie (1% O2) induzierte (ausgedrückt pro 106 Zellen/ml/24 Std.: 3200 ± 150 pg für PLGF+/+-Zellen; 2400 ± 150 pg für PLGF–/–-Zellen; p < 0,05 gegenüber Normoxie). Auch die VEGF-Immunreaktivität war bei PLGF+/+-Mäusen nach Behandlung mit 1,5 μg PLGF132/24 Std. erhöht.
  • Tabelle 2: Rolle von PLGF und VEGF bei der Endothelproliferation
    Figure 00220001
  • Die Daten stellen den Mittelwert ± SA von 9 bis 12 Experimenten das *: p < 0,05 gegenüber der Kontrolle (Vehikel). Keiner der Antikörper beeinflusste die Grundlinien-Endothelproliferation in Abwesenheit von VEGF (nicht gezeigt). Ab: polyklonales Antiserum; MoAb: monoklonale Antikörper; bFGF: basischer Fibroblastenwachstumsfaktor.
  • 5. PLGF moduliert spezifisch die Reaktionsfähigkeit auf VEGF
  • Weil VEGF eine Rolle bei den vorstehend genannten Phänotypen der Angiogenese, Arteriogenese und Permeabilität spielt, untersuchten wir, ob PLGF die Reaktionsfähigkeit auf VEGF bestimmte. Eine subkutane Implantation von Matrigel (Passaniti A. et al., 1992, Lab Invest 67, 519-528), das mit VEGF165 angereichert war, (VEGF165) induzierte eine starke angiogene Reaktion bei PLGF+/+-, aber nicht bei PLGF–/–-Mäusen (Hämoglobingehalt: 0,28 ± 0,02 g/dl bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 0,02 ± 0,02 g/dl bei PLGF–/–-Mäusen; n = 15; p < 0,05). Dagegen induzierte basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) bei beiden Genotypen eine ähnliche angiogene Reaktion (Hämoglobingehalt: 0,28 ± 0,02 g/dl PLGF+/+-Mäusen gegenüber 0,25 ± 0,02 g/dl bei PLGF–/–-Mäusen; n = 15; p = NS). Diese Beobachtungen wurden mittels histologischer Analyse und Immunfärbung von Endothelfaktor-VIII-verwandtem Antigen bestätigt.
  • Die verringerte Reaktion von PLGF–/–-Endothelzellen auf VEGF wurde unter Verwendung kultivierter primärer PLGF–/–-Endothelzellen bestätigt. VEGF165 (100 ng/ml) war chemotaktisch für PLGF+/+-, aber nicht für PLGF–/–-Endothelzellen, wohingegen beide Genotypen vergleichbar auf bFGF antworteten. PLGF (100 ng/ml) selbst war nicht chemotaktisch für Endothelzellen jedes Genotyps und beeinflusste die Reaktion von PLGF+/+-Endothelzellen auf VEGF nicht, wahrscheinlich weil Endothelzellen bereits viel PLGF produzieren. PLGF stellte jedoch die gestörte Wanderung von PLGF–/–-Endothelzellen als Reaktion auf VEGF165 völlig wieder her. PLGF verstärkte auch die chemotaktische Aktivität von VEGF auf glatte Muskelzellen, von denen bekannt ist, dass sie VEGFR-1 und VEGFR-2 exprimieren (Grosskreutz C.L. et al., 1999, Microvasc Res 58, 128-136). VEGF stimulierte die Wanderung von glatten PLGF+/+-, aber nicht von PLGF–/–-Muskelzellen, wohingegen bFGF glatte Muskelzellen beider Genotypen stimulierte. Ähnliche Wirkungen wurden für die SMC-Proliferation beobachtet. Obwohl PLGF allein die Zellen nicht stimulierte, rettete es die gestörte Reaktion glatter Muskelzellen auf VEGF. was weiter unterstreicht, dass PLGF für die biologische Aktivität von VEGF wesentlich ist. Somit bestimmt PLGF die Reaktion auf VEGF und verstärkt sie synergistisch.
  • 6. Die Hemmung von PLGF beseitigt Lungenhygiertonie
  • Wildtyp-Mäusen wurden verschiedene Konzentrationen eines murinen Anti-PLGF-Antikörpers injiziert (0 μg, 1 μg, 5 μg, 10 μg und 50 μg). Der murine Anti-PLGF-Antikörper wird in der PLGF–/–-Maus erzeugt. Nach 72 Stunden werden die Mäuse für 4 Wochen in eine dicht verschlossene Kammer unter normobarer Hypoxie (FiO2 10%) gesetzt. Nach 28 Tagen werden die Mäuse getötet und zur histologischen Analyse, wie im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben, verwendet. Die Kontrollmaus mit 0 μg Anti-PLGF-Antikörper entwickelt eine schwerwiegende hypoxieinduzierte Lungengefäßremodellierung. Der murine Anti-PLGF-Antikörper verhindert diese Lungengefäßremodellierung in sehr niedrigen Konzentrationen.
  • 7. Die Hemmung von PLGF verhindert Entzündung
  • Der Verschluss einer Zufuhrarterie ist eine häufige Komplikation von Atherosklerose oder Arterienrestenose und sperrt stromabwärts gelegene Gewebe von Sauerstoff und Nährstoffen ab. Eine gleichzeitige Vergrößerung bereits existierender Kollateralen aufgrund von Endothelaktivierung und Wachstum glatter Muskulatur (adaptive Arteriogenese) kann jedoch eine Restperfusion zu den ischämischen Regionen gestatten und eine Gewebenekrose in dem Gebiet der verschlossenen Arterie verhindern. Obwohl gezeigt wurde, dass eine Verabreichung von VEGF-Protein oder ein VEGF-Gentransfer das Kollateralenwachstum verbessern, bleibt die Rolle von endogenem VEGF kontrovers. PLGF wurde zuvor nicht bei diesem Vorgang impliziert. Makrophagen spielen eine Rolle bei der adaptiven Arteriogenese, aber die Rolle von PLGF bleibt unbekannt. Daher wurde die Rolle von Makrophagen bei der adaptiven Arteriogenese kollateraler Arteriolen nach Ligatur der Femurarterie untersucht. Es wurde gefunden, dass Mac3-positive Makrophagen – von denen bekannt ist, dass sie eine wesentliche Rolle beim Kollateralenwachstum spielen – am Endothel haften und drei Tage nach der Ligatur in und durch die Wand der Kollateralen infiltrieren. Es wurden jedoch mehr Kollateralen durch Mac3-positive Makrophagen bei PLGF+/+- als bei PLGF–/–-Mäusen infiltriert (45 von 66 PLGF+/+-Kollateralen gegenüber 29 von 67 PLGF–/–-Kollateralen; p < 0,05 mittels chi-Quadrat-Analyse; n = 5 Mäuse). Dies kann mit der bekannten Monozyten-Chemoattraktansaktivität von PLGF zusammenhängen. Tatsächlich infiltrierten bei Verwendung eines anderen Modells der Leukozytenanlockung (lokale Endotoxininjektion in die Fußsohle) dreimal mehr Leukozyten in PLGF+/+- als in PLGF–/–-Gefäße (CD45-positive Zellen/Gefäß: 5,2 ± 1 bei PLGF+/+-Mäusen gegenüber 1,5 ± 0,2 μm bei PLGF–/–-Mäusen; n = 5; p < 0,05). Makrophagen können das Kollateralenwachstum auch über die Produktion von PLGF modulieren (8 ± 2 PLGF/103 HPRT-mRNA-Moleküle; n = 5). Ein anderes Charakteristikum der adaptiven Arteriogenese ist die Extravasation von Fibronectin, das ein Gerüst für die Wanderung glatter Muskelzellen bereitstellt. Die Extravasation von Fibronectin war größer bei PIGF+/+- als bei PIGF–/–-Kollateralen, wie die zahlreicheren Kollateralgefäße zeigen, die von Fibronectin-immunreaktiven Ablagerungen umgeben sind (57 von 80 PPIGF+/+-Kollateralen gegenüber 21 von 83 PIGF–/–-Kollateralen; n = 5 Mäuse; p < 0,05 mittels chi-Quadrat). Die erhöhte Permeabilität von PIGF+/+-Kollateralen kann durch den Synergismus zwischen PLGF und VEGF, von dem bekannt ist, dass es von aktivierten Makrophagen freigesetzt wird, verursacht werden. Die VEGF-Spiegel in Thioglycolat-stimulierten peritonealen Makrophagen betrugen 200 ± 11 VEGF/103 HPRT-mRNA-Moleküle (n = 5). Somit ist PLGF für das Kollateralenwachstum wesentlich.
  • 8. Präparation monoklonaler Antikörper gegen PLGF
  • Weil eine PLGF-Defizienz den Phänotyp verschiedener pathologischer Vorgänge von Angiogenese, Arteriogenese und Gefäßdurchlässigkeit, umfassend ischämische Retinopathie, Tumorbildung, Lungenhypertonie, Gefäßdurchlässigkeit (Ödembildung) und entzündliche Störungen, verringert, können Moleküle, die die Bildung von PLGF oder die Bindung von PLGF an seinen Rezeptor (VEGFR-1) oder die durch PLGF eingeleitete Signalübertragung hemmen können, zur Behandlung der letzteren pathologischen Vorgänge nützlich sein. Monoklonale Antikörper gegen murines PLGF-2 wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Declerck P.J. et al. (1995) J. of Biol. Chem. 270, 8397), jedoch unter Verwendung von Mäusen mit inaktivierten PLGF-Genen hergestellt. Die Mäuse wurden durch sukutane Injektion von murinem PLGF-2 (R&D Systems) immunisiert. Insgesamt 120 Hybridome wurden produziert, von denen 15 eine 50%ige Hemmung zeigten, 38 eine 70%ige Hemmung zeigten und 5 eine vollständige Hemmung der Bindung von mPLGF-2 an seinen Rezeptor (Flt-1) ergaben. Dies wurde in einem immunfunktionalen ELISA gemessen, bei dem Platten mit 96 Vertiefungen mit 100 μl 1 μg/ml rmFlt-1/Fc-Chimäre über Nacht bei Raumtemperatur in PBS beschichtet wurden. Nach Blockieren für 1 Stunde mit 1% BSA in PBS wurden 100 μl einer Mischung von 70 μl Hybridom-Medium, das mit 70 μl rekombinantem mPLGF-2 zu 10 ng/ml für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert worden war, auf die Platte aufgebracht. Ein Standard von rmPLGF-2, der von 20 ng/ml bis 156 ng/ml reichte, (in PBS-Tween.BSA-EDTA verdünnt) wurde eingeschlossen. Die Platten wurden 1 Stunde bei 37°C und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, 5 Mal mit PBS-Tween gewaschen, und 100 μl 200 ng/ml biotinylierter Ziege-Anti-Maus-PLGF-2 wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 5-maligem Waschen mit PBS-Tween wurden 100 μl Avidin-HRP-Konjugat (Vectastorin-ABC-Kit) für 1 Stunde bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 5-maligem Waschen mit PBS-Tween wurde die Platte mit 90 μl o-Phenylendiamin in Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,0 für 30 Minuten entwickelt und bei 490 nm gemessen.
  • Die fünf positiven Klone (PL1H5, PL5D11, PL9F7, PL13F11, PL17A10) wurden subkloniert, gezüchtet und zur Produktion von Aszites in Mäuse (PLGF-Knock-out im Balb/c-Hintergrund) injiziert. Die monoklonalen Antikörper wurden an Protein-A-Sepharose gereinigt und erneut auf die Hemmung der Bindung von m-PLGF an Flt/Fc getestet. Die Ergebnisse (Tabelle 3) zeigen, dass Mab-P15D11 die Bindung von m-PLGF-2 an seinen Rezeptor deutlich hemmt. Dieser Mab wurde für die Bewertung im Ödemmodell (Senföl-Hautapplikation) ausgewählt.
  • Tabelle 3: Hemmung der Bindung von murinem PLGF-2 an murinen Flt-1 durch Anti-Maus-PLGF-2-Mab. Die Daten geben restlichen m-PLGF-2 in Prozent an.
    Figure 00270001
  • 9. Validierung der monoklonalen PLGF-Antikörper bei einem Senföl-Hautapplikationsmodell
  • Senföl wurde auf die Ohren von Swiss-Mäusen gestrichen, und die Extravasation von Evans-Blau wurde bestimmt. Antikörper wurden zu 300 μg/kg 30 Minuten vor der Injektion von Evans-Blau und der Applikation des Senföls intravenös injiziert. Kurz gesagt, werden 100 μl Testsubstanz über einen Jugularvenenkatheter injiziert, 30 min später gefolgt von einer intravenösen Injektion von 300 μl 0,5% Evans-Blau. Ein Ohr wird mit 0,1% Senföl bestrichen und 15 min später erneut bestrichen. Nach 30 min wird die Maus über den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung perfundiert, die 100 U/ml Heparin enthält, gefolgt von 3% Paraformaldehyd in Citratpuffer. Die Ohren werden amputiert, in kleine Segmente zerschnitten und über Nacht bei 55°C in Formamid extrahiert. Die Absorption der Extraktionsflüssigkeit wird bei 610 nm gemessen. Anti-PLGF-Antikörper, die die PLGF-Reaktion von Endothelzellen in Zellen blockierten (Tabelle 4), verringerten die Gefäßdurchlässigkeit bei der Applikation von Senföl auf die Ohren von Wildtyp-Mäusen (relative Absorptionseinheiten/Ohr: 13 ± 3 nach Mineralöl; 53 ± 7 nach Senföl plus Kontroll-IgGs; 26 ± 5 nach Senföl plus Anti-PLGF; n = 5; p < 0,05).
  • Tabelle 4: Wirkung von Senföl auf die Evans-Blau-Extravasation
    Figure 00290001
  • 10. Isolation von PLGF-Inhibitoren durch Screening einer Tetrameren-Bank
  • Eine Tetrameren-Bank wurde hinsichtlich ihrer Fähigkeit, in ELISA-Assays die Bindung zwischen dem rekombinanten Maus-Placenta-Wachstumsfaktor 2 (mPLGF) [R&D Systems, Kat.-Nr. 645-PL] und dem rekombinanten Gefäßendothel-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (VEGF R1) Flt-1/Fc-Chimäre [R&D Systems, Kat.-Nr. 471-F1] zu hemmen, untersucht. Der ELISA-Assay wurde nach diesem Verfahren durchgeführt. Der Rezeptor wurde auf eine Mikrotiterplatte [Costar, Kat.-Nr. 3590] zu 1 μg/ml in 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl pH 7,5 (PBS), 100 μl/Vertiefung, für 16 Stunden bei Raumtemperatur aufgebracht. Die Vertiefungen wurden 5 Mal mit PBS, das 0,004% Tween enthielt, (PBS-T) gewaschen und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, 150 μl/Vertiefung, für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Die Platte wurde 5 Mal mit PBS-T gewaschen, und 100 μl PLGF, verdünnt auf 8 ng/ml in PBS pH 7,5, 0,1% BSA, 5 mM EDTA, 0,004% Tween (PBET), wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37°C und eine Stunde bei Raumtemperatur wurde die Platte erneut gewaschen, und biotinylierte Anti-PLGF-Antikörper [R&D Systems, Kat.-Nr. BAF 465) wurden zu 200 ng/ml in PBET, 100 μl/Vertiefung, hinzugefügt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde 5 Mal mit PBS-T gewaschen, 100 μl/Vertiefung einer Lösung, die ein Avidin-Biotin-System (Vectastatin Elite-ABC-Kit, Vector Laboratories, Kat.-Nr. PK 6100). Diese Lösung wurde durch Mischen eines Tropfens Lösung A und eines Tropfens Lösung B in 2,5 ml 50 mM Tris-HCl und Verdünnen dieser Mischung 1/100 in PBET hergestellt. Nach 1-stündiger Inkubation wurde die Platte wie oben gewaschen, und 90 μl/Vertiefung einer Lösung, die 1 mg/ml o-Phenylendiamin (OPD) in Citratpuffer pH 5 enthielt, wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 40 Minuten wurde die Entwicklungsreaktion durch Zugabe von 30 μl/Vertiefung 3 M Schwefelsäure gestoppt. Die Platte wurde bei 490 nm mit einem ELISA-Lesegerät gelesen. Um die inhibitorische Aktivität der Bank zu testen, wurde jeder Pool der Bank in Konkurrenz mit PLGF unter Verwendung eines 1000-fachen molaren Überschusses (1:1000, 1:2000 bedeutet einen 2000-fachen molaren Überschuss, 1:1500 bedeutet einen 1500-fachen molaren Überschuss usw.) zugegeben. Die Screening-Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00310002
  • Figure 00320001
  • Tabelle 5: 30 Pools von 900 verschiedenen tetrameren Peptiden wurden hinsichtlich der Möglichkeit gescreent, die Bindung von mPLGF2 an mVEGFR1 zu stören. Pool 4 in Tabelle 5 (mit D-Glu an der endständigen Position) hat deutlich eine inhibitorische Aktivität verglichen mit zwei Anti-PLGF-Antikörpern (R&D-mAb und ein im Haus hergestellter mAb), die die Bindung von mPLGF2 an mVEGFR1 stören.
  • Materialien und Verfahren
  • Modelle der Angiogenese
  • Eine morphometrische Analyse der myokardialen, renalen und retinalen Angiogenese bei neugeborenen Mäusen wurde durchgeführt wie beschrieben (Carmeliet P. et al., 1999, Nat Med 5, 495-502). Matrigel-Assay: Das Einwachsen von Kapillaren in Matrigel wurde durchgeführt wie beschrieben (Passaniti A. et al., 1992, Lab Invest 67, 519-528). Kurz gesagt, wurden 500 μl eiskaltes Matrigel, das Heparin (300 μg/ml) und VEGF (100 ng/ml) oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF; 100 ng/ml) enthielt, subkutan injiziert. Nach 7 Tagen wurde das Matrigelsediment mit den neuen Gefäßen zur Analyse der Neuvaskularisation zerteilt: Ein Teil wurde homogenisiert, um den Hämoglobingehalt unter Verwendung von Drabkin-Reagenz (Sigma, St Quentin Fallavier, Frankreich) zu bestimmen, wohingegen der andere Teil für die histologische Analyse in 1% Paraformaldehyd fixiert wurde. ES-Tumormodell: Für die von ES-Zellen stammende Tumorbildung wurden 5 × 106 ES-Zellen subkutan in PIGF+/+-Nu/Nu- oder PIGF–/–-Nu/Nu-Mäuse injiziert, die durch Kreuzen von PIGF+/–-Nu/Nu-Mäusen, wie beschrieben (Carmeliet P. et al., 1998, Nature 394, 485-490), erhalten wurden. Die Gefäßdichten wurden durch Zählen der Anzahl an Endothelschnüren und Kapillaren (Durchmesser < 8 μm), Gefäßen mittlerer Größe (Durchmesser 10-25 μm) oder großer Gefäße (Durchmesser > 30 μm) pro Feld (1,2 mm2) in 6 bis 8 zufallsgemäß ausgewählten optischen Feldern auf 3 bis 5 benachbarten Abschnitten (320 μm entfernt) pro Tumor unter Verwendung des Quantimet-Q600-Bildgebungssystems quantifiziert. Ischämische-Retina-Modell: Eine ischämische Retina wurde induziert, indem neugeborene P7-Mäuse für 5 Tage in einen Käfig mit hyperbarem (80%) Sauerstoff gesetzt wurden, wonach sie weitere 5 Tage zu normaler Raumluft zurück gesetzt wurden, wie beschrieben (Smith L.E. et al., 1994, Invest Ophthalmol Vis Sci 35, 101-111). Eine Fluoreszenz-Retina-Angiographie und Endothelzellzahlen an Retinaquerschnitten wurden bestimmt, wie beschrieben (Hammes H.P. et al., 1996, Nat Med 2, 529-533). Venendilatation und Arterienwindung wurden semiquantitativ auf einer Skala von 0-3 bewertet. Wundenmodelle: Die Gefäßremodellierung während der Heilung von Hautverletzungen wurde innerhalb von 4 Tagen nach einer Hautverletzung von 10 mm durch die volle Dicke auf dem Rücken der Maus, wie beschrieben (Frank S. et al., 1995, J. Biol Chem, 270, 12607-12613), analysiert. Die Wundheilung wurde durch tägliche Messungen der Breite der Wunde bewertet. Lungenhypertonie: Adulte Mäuse wurden für 4 Wochen unter normobarem Sauerstoff (FiO2 10%) in eine dicht verschlossene Kammer gesetzt, wie beschrieben (Hales C.A. et al., 1983, Am Rev Respir Dis 128, 747-751). Nach 28 Tagen wurden die Mäuse für Messungen des Hämatokrit unter Verwendung eines automatisierten Zellzählers (Abbott Cell-Dyn 1330 System, Abbott Park, IL) und zur histologischen Analyse verwendet. Die rechten ventrikulären Drücke (RVP) wurden an anästhetisierten beatmeten Mäusen (Natriumpentobarbital, 60 mg/kg, i.p.) durch transthorakale Punktion unter Verwendung von sehr zuverlässigen Druckmikromanometern (Millar) nach Inhalation eines Gasgemischs, das 20% O2 oder 7% O2 enthielt, gemessen. Für die Histologie wurden die Mäuse mit 1 % phosphatgepuffertem Paraformaldehyd bei 100 cm H2O-Druck über das Herz und bei 30 cm H2O-Druck durch die Luftröhre perfundiert. Die Sichtbarmachung der internen elastischen Lamina (IEL) und der externen elastischen Lamina (EEL) erfolgte unter Verwendung von Hart-Elastinfärbung. Eine hypoxieinduzierte Lungengefäßremodellierung wurde durch Zählen der Anzahl an nicht-muskularisierten (nur IEL) und teilweise (IEL plus unvollständige EEL) oder vollständig (IEL plus vollständige EEL) muskularisierten peripheren Gefäßen (die auf Atemwegsstrukturen distal der terminalen Broncheolen kartiert wurden) pro 100 Alveolen in Feldern, die 5 × 500 Alveolen enthielten, untersucht (Hales C.A. et al., 1983, Am Rev Respir Dis 128,747-751).
  • Gefäßpermeabilität
  • Arthus-Reaktion (allergeninduzierte Ödembildung in der Haut (Casals-Stenzel J. et al., 1987, Immunopharmacology 13, 177-183)): Mäuse wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von Kochsalzlösung (1 ml/kg), die Ovalbumin (40 μg/kg; Sigma, St Louis, MO) und Al(OH)3 (0,2 mg/ml; das 1 Stunde vor der Injektion zur Antigenlösung gegeben wurde) enthielt, an den Tagen 0 und 2 sensibilisiert. Die Gefäßdurchlässigkeit wurde 14 Tage nach der Präsensibilisierung durch Bestimmung der Menge an intravenös injiziertem 125I-Rinderserumalbumin (BSA) und Evans-Blau-Farbstoff quantifiziert, die an der Injektionsstelle in der Haut akkumulierten. Dazu wurde das Fell der dorsalen Haut anästhetisierter Mäuse geschoren, und 1,5 μCi/kg 125I-BSA (2,8 μCi/μg; NEN-Dupont, Frankreich), gemischt mit einer Lösung von Evans-Blau-Farbstoff in steriler Kochsalzlösung (15 mg/kg), wurde i.v. injiziert. Zehn Minuten später wurde Ovalbumin (100 ng/Stelle) an 4 intradermalen Stellen injiziert. Nach 60 min wurde der Grad an Gefäßdurchlässigkeit quantifiziert: (i) durch Messen des Durchmessers des ödematösen Flecks (der durch seine Färbung sichtbar gemacht wird) unter Verwendung eines Mikrometers; und (ii) durch Bestimmen der Menge an extravasiertem Plasmaprotein an jeder Hautstelle (ausgedrückt als μl extravasiertes Plasma) nach Standardisierung der 125I-cpm in der Haut (10-mm-Fleck) auf 125I-cpm in 1 μl Plasma. Miles-Test: Die Gefäßpermeabilität wurde unter Verwendung des Miles-Tests (McClure N., 1994, J Pharmacol Toxicol Methods) untersucht. Kurz gesagt, wurden Mäuse geschoren, ihnen wurden 50 μl einer Lösung, die 0,5% Evans-Blau in Kochsalzlösung enthielt, 45 Minuten vor der intradermalen Injektion von 20 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1, 3 oder 10 ng rekombinanten humanen VEGF165 enthielt, injiziert; Bilder wurden 45 min später aufgenommen. Hautheilung: Nach dem Scheren wurde ein standardisierter Hautschnitt von 15 mm durch die volle Dicke auf dem Rücken anästhetisierter Mäuse hergestellt, wobei darauf geachtet wurde, die darunter liegenden Muskeln nicht zu beschädigen. Die Extravasation von 125I-BSA (ausgedrückt als g Plasma/g Gewebe/min) wurde gemessen, wie beschrieben (Tilton R.G. et al., 1999, Invest Ophthalmol Vis Sci 40, 689-696).
  • In-vitro-Angiogenese-Tests
  • Endothelzell- und Matte Muskelzellkultur: Um Maus-Kapillarendothelzellen zu erhalten, wurden 500 μl eiskaltes Matrigel, das bFGF (100 ng/ml) und Heparin (100 μg/ml) enthielt, s.c. in anästhetisierte Mäuse injiziert. Nach 7 Tagen wurde das Matrigelsediment zerschnitten und unter Verwendung von 0,1% Typ-II-Kollagenase (Sigma, St Louis, Mo) enzymatisch dispergiert. Maus-Endothelzellen wurden routinemäßig in mit 0,1 % Gelatine beschichteten T75-Gefäßen in M131-Medium, das mit 5% MVGS (Gibco-BRL) angereichert war, gezüchtet. Glatte Muskelzellen aus Mausaorta wurden geerntet und kultiviert, wie beschrieben (Herbert J.M. et al., 1997, FEBS Lett 413, 401-404). Vor der Stimulation wurden die Zellen in Medium mit 0,5% Serum 24 Std. lang ausgehungert, wonach sie 24 Std. vor der Analyse der Gesamtzellzahl (Proliferation) oder der Anzahl an Zellen, die nach einer Kratzverletzung wanderten, (Migration) mit humanem VEGF165 und/oder murinem PLGF oder bFGF (alle von R&D, Abingdon, GB) stimuliert wurden.
  • Synthese einer Tetramerenbank
  • Eine Tetramerenbank wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher 9-Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc-) derivatisierter Aminosäuren (Reinheit > 99%) synthetisiert. Alle Derivate sind in Tabelle 6 zusammen mit Katalognummern und Firmennamen (Lieferant), von denen sie bezogen wurden, aufgelistet.
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Tabelle 6: Liste von Bausteinen, die während der Peptidbankherstellung verwendet wurden.
    Figure 00370001
  • Die Bank wurde auf dem folgenden Gerüst aufgebaut (Fassina G. et al. (1996) J. Mol. Recogn. 9, 564, Marino M. et al. Nat. Biotechn. (1997) 18,735):
    Figure 00380001
    wobei G für die Aminosäure Glycin steht und K die Aminosäure L-Lysin darstellt, auf denen die drei Ebenen der Randomisierung durch Anwendung des Portionierungs-Mischverfahrens (Furka A. et al.(1991) Int. J. Pept. Protein. Res. 37,487, Lam K.S. (1991) Nature 354, 82) erzielt wurden. Die Gesamtzahl an erzeugten Peptiden (Nt) kann anhand der folgenden Formel berechnet werden: Nt = Bx wobei B die Anzahl an verwendeten Bausteinen (30) ist und x die Zahl der Randomisierung (3) ist.
  • a) Synthese des Gerüsts
  • Das ursprüngliche Grundgerüst wurde durch manuelle Festphasensynthese ausgehend von 419 mg Fmoc-Gly-derivatisierten 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure-Polystyrol-Harzen (PS-HMP) (Substitution 0,75 mmol/g, Novabiochem Kat.-Nr. 04-12-2053), entsprechend 314 μmol Glycin, auf die zwei aufeinanderfolgende Kupplungen mit Fmoc-L-Lys(Fmoc)OH (Chem-Impex Intl. Kat.-Nr. 01578) durchgeführt wurden, hergestellt. Das Harz wurde in eine 35-ml-Polypropylenkartusche, die mit einem Polypropylenseptum ausstattet war, (AllTech, Kat.-Nr. 210425) eingebracht und 3 Mal mit 4,0 ml N,N-Dimethylformamid (DMF, Peptidesynthesequalität, LabScan, Kat.-Nr. H6533) gewaschen. Zur Entfernung des Fmoc-Schutzes wurde das Harz für 15 Minuten mit 5,0 ml 20% Piperidin (BIOSOLVE LTD, Kat.-Nr. 16183301) in DMF behandelt und dann 3 Mal mit 4,0 ml DMF gewaschen. Zur Kupplung des ersten Lysins wurden 1,5 mmol Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH (0.87 g) in 6,0 ml DMF gelöst und dann durch Zugabe von 3,0 ml einer 0,5 M Lösung von 2-(1H-Benzotriazol-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU, > 99%, Chem-Impex Intl, Kat.-Nr. 02056) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt, SIGMA ALDRICH, Kat.-Nr. H2006) in DMF und 3,0 ml einer 1 M Lösung von Diisopropylethylamin (DIEA, SIGMA-ALDRICH, Kat.-Nr. D-3887) in DMF aktiviert. Nach 4-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf das Harz überführt und 30 Minuten gerührt. Um den Überschuss an Aminosäure zu entfernen, wurde das Harz 3 Mal mit 4,0 ml DMF gewaschen. Die Entfernung der Schutzgruppen von den Lysin-Fmoc-Gruppen wurde durch Behandeln des Harzes für 15 Minuten mit 5,0 ml 20% Piperidin in DMF 3-maliges Waschen mit 4,0 ml DMF, um den Überschuss an Reagenz zu entfernen, erzielt. Zum Kuppeln des zweiten Lysins wurden 3,0 mmol Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH (1,77 g) in 6,0 ml DMF gelöst und dann durch Zugabe von 6,0 ml einer 0,5 M Lösung von TBTU/HOBt in DMF und 6,0 ml DIEA in DMF aktiviert. Nach 4-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf das Harz überführt und 30 Minuten gerührt. Das Harz wurde dann 3 Mal mit 4,0 ml DMF gewaschen. Die endgültigen Fmoc-Gruppen wurden durch Behandlung mit 10,0 ml 20% Piperidin in DMF für 15 Minuten entfernt. Das Harz wurde den folgenden Waschschritten unterzogen:
    Figure 00400001
    • *Methanol (MeOH, LabScan, Kat.-Nr. A3513)
    • **Ethylether (Et2O, LabScan, Kat.-Nr. A3509E)
  • Das Harz wurde durch Aufbringen eines Stickstoffstroms getrocknet und dann gewogen. Das endgültige Gewicht betrug 442 g.
  • b) Aufbau der Bank
  • Die Bank wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens erzeugt:
  • b.1. – Harzaufspaltung in 30 gleiche Aliquote.
  • Das Harz wurde in ein skaliertes 50-ml-Polypropylenröhrchen überführt, und 35 ml DMF:DCM (2:3) (DCM, Dichloromethan, LabScan, Kat.-Nr. H6508L) wurden hinzugefügt. Die Suspension wurde gründlich gemischt, und Fraktionen von 1,0 ml wurden in 30 Polypropylenspritzen (3 ml), die mit Filtrationssepten am Boden ausgestattet waren, (Shimadzu Corp. Kat.-Nr. 292-05250-02) überführt. Das restliche Volumen der Suspension wurde mit DMF:DCM (2:3) auf 35 ml verdünnt, und erneut wurden 1,0-ml-Fraktionen in die Spritzen überführt. Das skalierte Röhrchen wurde erneut auf 30 ml aufgefüllt, und 1,0-ml-Aliquote wurden in die Spritzen verteilt. Die Spritzen wurden mittels Vakuum vom Boden geleert und die Harze einmal mit 1,0 ml DMF gewaschen. Die mit Zahlen von 1 bis 30 bezeichneten Spritzen enthielten eine gleiche Fraktion an Harz, die etwa 10 μmol Grundgerüst (40 μmol NH2-Gruppen) entsprach.
  • b.2. – Kupplung des ersten zufallsgemäßen Rests (Position 3).
  • Es wurden 0,75 M Stammlösungen der 30 (in Tabelle 5 aufgelisteten) Aminosäuren in DMF hergestellt und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt. Um Kupplungen und Entfernung von Schutzgruppen an Subbanken durchzuführen, wurde ab diesem Schritt ein PSSM8-8-Kanal-Peptidsynthesizer (Shimadzu Corp.) verwendet. Die Spritzen wurden in den Synthesizer überführt, und 267 μl (200 μmol) Aminosäure wurden in 2-ml-Polypropylenröhrchen (Eppendorf, Kat.-Nr. 24299) überführt. Das Instrument führt automatisch Aktivierungen, Acylierungen, Entfernung von Schutzgruppen und Waschschritte durch. Aktivierungen wurden unter Verwendung von 400 μl einer 0,5 M Lösung von TBTU/HOBt in DMF plus 400 μl einer 1 M Lösung von DIEA in DMF durchgeführt. Acylierungen wurden durch Mischen der Suspension für 30 Minuten mittels Hindurchperlen von Stickstoff vom Boden der Spritzen durchgeführt. Die Entfernung der Schutzgruppen erfolgte für 15 Minuten mit 0,9 ml 20% Piperidin/DMF, wobei Waschschritte mit 0,9 ml DMF (3 Mal, 2 Minuten) durchgeführt wurden.
  • In der ersten Runde wurden die Aminosäuren 1 bis 8 gekuppelt, in der zweiten Runde die Aminosäuren 9 bis 16, in der dritten Runde die Aminosäuren 17 bis 24 und die der letzten Runde die Aminosäuren 25 bis 30.
  • b.3. – Mischen und erneutes Aufspalten der Harze
  • Zu jeder Spritze wurden 500 μl DMF:DCM (2:3) hinzugefügt und die Harze durch leichtes Schwenken suspendiert. Die Suspensionen wurden aus den Spritzen entnommen, in einem (skalierten) 50-ml-Polypropylenröhrchen gesammelt und durch heftiges Schütteln gründlich gemischt. Nach Zugabe von DMF:DCM (2:3) bis zu einem Endvolumen von etwa 35 ml wurden 1,0-ml-Aliquots der Suspension erneut in die 30 Spritzen verteilt und die im Schritt 1 ("Harzaufspaltung in 30 gleiche Aliquote") beschriebenen Arbeitsgänge wiederholt. Am Ende wurden die Harze einmal mit 1,0 ml DMF gewaschen.
  • b.4 – Kupplung des zweiten zufallsgemäßen Rests (Position 2).
  • Alle im Schritt 2 ("Kupplung des ersten zufallsgemäßen Rests") beschriebenen Arbeitsschritte wurden wiederholt.
  • b.5 – Mischen und erneutes Aufspalten der Harze
  • Alle im Schritt 3 ("Mischen und erneutes Aufspalten. der Harze") beschriebenen Arbeitsschritte.
  • b.6 – Kupplung des dritten bekannten Rests (Position 1)
  • Alle im Schritt 2 ("Kupplung des ersten zufallsgemäßen Rests") beschriebenen Arbeitsschritte wurden wiederholt.
  • b.7 – Abschließende Waschschritte und Trocknen der Harze.
  • Die Harze wurden 3 Mal mit 1 ml DCM, 3 Mal mit 1 ml MeOH und 2 Mal mit 1 ml Et2O gewaschen. Die Harze wurden unter Vakuum getrocknet.
  • b.8 – Abspaltung.
  • Es wurden 30 ml eines Gemischs aus TFA-H2O-TIS (100:5:5, Vol./Vol./Vol.) (TIS, Triisopropylsilan, SIGMA ALDRICH Kat. Nr. 23,378-1) frisch hergestellt und 800 μl zu jeder Spritze gegeben. Nach 3-stündigem Vortexen wurden die Harze abfiltriert, wobei die saure Lösung direkt in 15-ml-Polypropylenröhrchen (mit Zahlen von 1 bis 30 bezeichnet), die 5 ml eiskaltes Et2O enthielten, gesammelt. Die weißen Niederschläge wurden durch Zentrifugation bei 3000 U/min für 10 Minuten abgetrennt und die organischen Lösungsmittel verworfen. Die Niederschläge wurden einmal mit 5 ml kaltem Et2O gewaschen und nach der Zentrifugation in 2,0 ml H2O/CH3CN/TFA 50:50:0,1 gelöst und lyophilisiert. 10 mg/ml-Stammlösungen der Peptidbanken in DMSO wurden hergestellt und in verschlossenen Gefäßen bei –80°C aufbewahrt.

Claims (6)

  1. Verwendung eines Angiogeneseinhibitors, bestehend aus einem Antikörper oder einem Fragment des Antikörpers, welcher bzw. welches spezifisch an den Placenta-Wachstumsfaktor bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, Augenerkrankungen, pulmonärer Hypertensie, von Entzündungen und Ödemen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Augenerkrankung eine Retinopathie oder eine choroidale intraokulare Erkrankung ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Augenerkrankung eine ischämische Retinopathie ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei der Antikörper ein muriner monoklonaler Antikörper ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das Fragment ein Fab-, F(ab)'2- oder scFv-Fragment ist.
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