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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Antagonisten des Plazenta-Wachtumsfaktors und
der Signalübertragung
hiervon, pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Antagonisten
enthalten, und die Verwendung von Antagonisten zur Prophylaxe von
Knochenschwund oder Knochenmasse und zur Verstärkung der Knochenheilung, einschließlich der
Behandlung von Zuständen
mit niedriger Knochenmasse und/oder Knochendefekten bei Wirbeltieren,
und insbesondere Säugern,
einschließlich
Menschen.
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Hintergrund der Erfindung
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Osteoporose
ist eine systemische Skeletterkrankung, die durch eine niedrige
Knochenmasse und Zerstörung
des Knochengewebes, und als Folge davon erhöhte Knochenbrüchigkeit
und Anfälligkeit
für Brüche, gekennzeichnet
ist. In den Vereinigten Staaten betrifft der Zustand mehr als 25
Millionen Menschen und verursacht jährlich mehr als 1,3 Millionen
Brüche,
einschließlich
500.000 Wirbelsäulen-,
250.000 Hüft-
und 240.000 Handgelenkbrüche
pro Jahr. Hüftbrüche stellen
die schwerste Folge von Osteoporose dar, bei der 5-20 % aller Patienten
innerhalb eines Jahres sterben und über 50 % aller Überlebenden
arbeitsunfähig
werden. Bei Älteren
ist das Risiko für
Osteoporose am höchsten
und daher wird prognostiziert, dass sich das Problem mit dem zunehmenden
Alter der Bevölkerung
signifikant erhöht.
Das Auftreten von Brüchen
weltweit in den nächsten
60 Jahren wird auf einen Anstieg auf um das Dreifache hochgerechnet
und eine Studie schätzte, dass
es 2050 weltweit 4,5 Millionen Hüftbrüche geben
wird. Frauen besitzen ein größeres Risiko
für Osteoporose
als Männer.
Frauen erleben in den fünf
Jahren nach der Menopause einen stark beschleunigten Knochenschwund.
Andere Faktoren, die das Risiko erhöhen, sind Rauchen, Alkoholmissbrauch,
eine sitzende Lebensweise und geringe Calciumaufnahme. Derzeit gibt
es zwei Haupttypen einer pharmazeutischen Therapie zur Behandlung
von Osteoporose. Der erste ist die Verwendung von anti-resorptiven
Verbindungen zur Senkung der Resorption von Knochengewebe. Östrogen
ist ein Beispiel für
ein anti-resorptives Mittel. Es ist bekannt, dass Östrogen
Brüche
verringert. Daneben berichten Black et al. in der
EP 0605193 A1 , dass Östrogen,
insbesondere wenn es oral verabreicht wird, die Plasmaspiegel von
LDL senkt und die der guten Lipoproteine mit hoher Dichte (HDLs)
erhöht.
Bei einem etablierten osteoporotischen Skelett konnte Östrogen
jedoch den Zustand der Knochen nicht wieder auf den eines jungen
Erwachsenen zurücksetzen.
Eine Langzeittherapie mit Östrogen
wird zudem jedoch mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung
gebracht, einschließlich
eines erhöhten
Risikos für
Gebärmutterkrebs,
Endometriumkarzinom und möglicherweise
Brustkrebs, weshalb eine Behandlung bei vielen Frauen vermieden
wird. Die signifikanten, unerwünschten
Effekte, die mit einer Östrogentherapie
in Zusammenhang gebracht werden, bestätigen den Bedarf nach der Entwicklung
alternativer Therapien für
Osteoporose, die die gewünschte
Wirkung auf LDL im Serum haben, jedoch keine unerwünschten
Effekte bewirken. Ein zweiter Typ einer pharmazeutischen Therapie
für die
Behandlung von Osteoporose ist die Verwendung von Anabolika zur
Förderung
der Knochenbildung und zur Erhöhung
der Knochenmasse. Obwohl es verschiedene Osteoporosetherapien gibt,
bestehen ein andauernder Bedarf und eine fortdauernde Suche in diesem
Gebiet der Wissenschaft nach alternativen Osteoporosetherapien.
Daneben besteht ein Bedarf nach Therapien zur Heilung von Knochenbrüchen. Es
besteht auch ein Bedarf nach einer Therapie, die das Nachwachsen
von Knochen in Skelettbereiche hinein, in denen Defekte auftreten,
wie beispielsweise Defekte, die von zum Beispiel Tumoren im Knochen
verursacht werden oder von diesen produziert werden, begünstigen
kann. Des Weiteren besteht ein Bedarf nach einer sichereren Therapie
mit weniger Nebenwirkungen. In der Wissenschaft wurden mehrere Studien
auf die Mechanismen der Aktivierung von Osteoklasten gerichtet.
Beispielsweise haben Niida et al. (1999) gezeigt, dass der vaskuläre endotheliale
Wachstumsfaktor (VEGF) eine positive Aktivität auf die Anregung von Osteoklasten
hat. Ein interessantes Homologon von VEGF ist der Plazenta-Wachstumsfaktor
(PlGF), seine Rolle in Knochen wurde jedoch nur wenig untersucht
(Persico M.G. et al., 1999, Curr., Top. Microbiol. Immunol. 237,
31-40). Das U.S. Patent Nr. 5,919,899 beschreibt PlGF und dessen
Verwendung zur Behandlung von Entzündungserkrankungen, Wunden
und Geschwüren.
Mehrere Inhibitoren der Signalgabe an PlGF, wie beispielsweise Antikörper und
tetramere Peptide, sind in der Wissenschaft bekant und in der WO
01/85796 offenbart, während
Carmeliet et al., Nature medicine, Mai 2001, Ausgabe 7, Nummer 5,
S. 575-583 auch neutralisierende anti-PLGF-Antikörper offenbaren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Erkenntnis, dass Antagonisten
von PlGF zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung von
Knochenresorptionserkrankungen, wie beispielsweise Osteoporose,
verwendet werden können.
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Ziele und ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Medikament zur Behandlung
von Osteoporose in höheren
Säugern,
die eine verringerte Mineraldichte des kortikalen Knochens aufweisen,
und zur Prophylaxe von Osteoporose infolge der verringerten Mineraldichte
des kortikalen Knochens bei diesen Säugern bereitzustellen. Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist, pharmazeutische Zusammensetzungen,
die zum Erreichen des vorher genannten Ziels von Nutzen sind, bereitzustellen.
In unseren vorhergehenden Studien wurde das PlGF-Gen durch homologe
Rekombination in embryonalen Stamm-(ES-) zelten in dem Mausgenom
inaktiviert (Carmeliet P., 2000, J. Pathol. 190, 387-405, Carmeliet
P., 1999, Curr. Interv. Cardiol. Reports 1, 322-335 und Carmeliet
P. und Collen D., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237, 133-158).
PlGF (PlGF-/-) defiziente Mäuse sind
lebensfähig
und fruchtbar und zeigen keine offensichtlichen Knochendefekte.
In der vorliegenden Erfindung wird jedoch in einer sorgfältigen Untersuchung
der Knochenhistomorphometrie, des Knochen-Remodelling und der biochemischen
Analyse dieser PlGF-KO-Mäuse
gezeigt, dass PlGF eine unerwartete Rolle in dem Prozess der Knochenresorption
spielt. Es wird gezeigt, dass PlGF-Defizienz zu verringerter Knochenresorption,
geringem Knochen-Turnover und erhöhter trabekulärer Knochenmasse
führt.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur Prophylaxe
oder Hemmung von Knochenschwund oder Knochenmasse in einem Lebewesen,
insbesondere bei Säugern,
einschließlich
Menschen, durch Hemmen, vorzugsweise lokoregionales Hemmen, der
Expression von PlGF. Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren
zur Prophylaxe oder Hemmung von Knochenschwund oder Knochenmasse
in einem Lebewesen, insbesondere Säugern, einschließlich Menschen,
durch Hemmen des VEGFR-1/PlGF-Signalgabewegs.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt des Weiteren, dass PlGF-Antagonisten
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knochenerkrankungen
und insbesondere zur Behandlung von Zuständen, bei denen eine verstärkte Knochenresorption
auftritt, wie beispielsweise Osteoporose, verwendet werden können.
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung daher die Verwendung von Antagonisten
von PlGF für
die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knochenresorptionserkrankungen
bereit. Antagonisten von PlGF können
die Knochenresorption bei diesen Knochenresorptionserkrankungen
unterdrücken.
In einer bestimmten Ausführungsform
ist die Knochenresorptionserkrankung Osteoporose. Unter „Unterdrückung" ist zu verstehen,
dass die Unterdrückung
der Knochenresorption zu mindestens 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %,
70 %, 80 %, 90 % oder sogar 100 % erfolgt. Die Erfindung betrifft
insbesondere die Verwendung von Molekülen (Antagonisten) zum Neutralisieren
der Aktivität
von PlGF, indem sie dessen Synthese, Translation, Dimerisierung,
Rezeptorbindung und/oder die über
die Rezeptorbindung vermittelten Signalübertragung behindern. Die Erfindung
ist auf anti-PlGF-Antikörper
und davon stammende funktionelle Fragmente gerichtet, die in der
Lage sind, die VEGFR-1-Signalübertragung
zu behindern und/oder zu hemmen. Mit Synthese ist die Transkription
von PlGF gemeint. Unter PlGF sind auch dessen Isoformen, die infolge
alternativen Spleißens auftreten,
und dessen Allelvarianten zu verstehen. Als Folge von alternativem
Spleißen
wurden drei PlGF-RNAs beschrieben, die für die monomeren, humanen PlGF-1-,
PlGF-2- und PlGF-3-Isoform-Vorläufer, die
149, 179 bzw. 219 Aminosäurereste
enthalten, codieren (Cao Y. et al., J. Biol. Chem., 1996; 271: 3154-3162
und Cao Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 235:493-498).
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In
normalen Mausgeweben wurde nur eine murine PlGF-mRNA, die für das Äquivalent
von humanem PlGF-2 codiert, identifiziert.
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Um
die Aktivität
der Gens oder des Genprodukts von PLGF oder dessen Rezeptor VEGFR-1
zu hemmen, sind spezielle Techniken verfügbar, die auf das Protein-Target
gerichtet sind. Die Proteinfunktion von PLGF kann durch Antikörper verändert oder
gehemmt werden. Die „hemmende
Aktivität" bezieht sich auf
das Protein, das erzeugt wird, wie zum Beispiel PLGF oder dessen
Rezeptor, in dieser Erfindung vorzugsweise den VEGFR-1-Rezeptor. Die Hemmung
der Aktivität
führt zu
einer verminderten Wechselwirkung (z.B. im Fall von PLGF mit dem
VEGFR-1 mit dessen Rezeptor und einer Hemmung der Signalübertragung).
Die Hemmung beträgt
mindestens 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder noch
mehr.
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Aufgrund
der Selektion von Klonen und ihrer Funktion in der Reifung des Immunsystems
können
Antikörper
als spezifische Liganden zur Bindung von Proteinen speziell auf
nahezu jedes vorliegende Protein zugeschnitten werden. Antikörper, die
gegen spezifische Proteine gerichtet wurden, haben viele technologische Fortschritte
im Bereich der Molekularbiologie, einschließlich der modernen Immunchemie,
ermöglicht
(Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988)). In einer bestimmten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein muriner monoklonaler Antikörper gegen
PlGF, der in der WO 01/85796 offenbart ist, zur Herstellung eines
Medikaments zur Behandlung von Knochenresorptionserkrankungen verwendet.
Der Begriff ,ein Antikörper' oder ,Antikörper' bezeichnet einen
Antikörper,
der dadurch gekennzeichnet ist, dass er spezifisch gegen PlGF oder
irgendein funktionelles Derivat davon gerichtet ist, wobei diese
Antikörper
vorzugsweise monoklonale Antikörper
sind; oder ein Antigen bindendes Fragment davon vom Typ F(ab')2,
F(ab) oder Einzelketten-Fv oder von irgendeinem Typ eines davon
stammenden rekombinanten Antikörpers.
Diese Antikörper,
einschließlich
spezifischer polyklonaler Antiseren, die gegen PlGF oder irgendein
funktionelles Derivat davon zubereitet wurden, weisen vorzugsweise keine
Kreuzreaktivität
mit anderen Proteinen auf.
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Monoklonale
Antikörper
können
zum Beispiel von irgendeinem Hybridom produziert werden, das entsprechend
klassischen Verfahren aus Milzzellen eines Tieres, insbesondere
einer gegen PlGF oder irgendein funktionelles Derivat davon immunisierten
Maus oder Ratte, und aus Zellen einer Myelomzelllinie ausgebildet werden
kann und infolge der Fähigkeit
des Hybridoms, monoklonale Antikörper,
die PlGF oder irgendein funktionelles Derivat davon, die anfänglich zur
Immunisierung der Tiere verwendet wurden, zu erkennen, ausgewählt werden
kann.
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Verschiedene
anti-PlGF-Antikörper
sind in der Wissenschaft öffentlich
zugänglich.
Dies sind anti-humanes PlGF-Antikörper, die von Genex BioScience
Inc. (GEA8020-1 200 und GEA8020-2) und Alexis Corporation erhältlich sind.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
zum Zubereiten monoklonaler Antikörper gegen humanes PLGF ist beispielsweise
die folgende:
Ein rekombinantes humanes PLGF-Fusionsprotein,
das aus den von PLGF oder einem Fragment davon codierenden Aminosäuren besteht,
wird an Glutathion-S-Transferase (GST) gekoppelt und in Escherichia
coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie auf immobilisiertem
Glutathion (Amersham Biosciences) gereinigt. Rekombinantes humanes
PLGF ist auch bei R & D
Systems Inc. 614 McKinley Place N. E. Minneapolis, MN 55413, USA
erhältlich.
(264-PG-010, 264-PG-010/CF, 264-PG-050 oder 264-PG-050/CF), bei
Research Diagnostics Inc., Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836,
USA (rekombinantes humanes PlGF-1: Kat.-Nr. RDI-300-015 & Kat.-Nr. RDI-300-016
und rekombinantes humanes PLGF-2: Kat.-Nr. RDI-300-019) oder bei ALEXIS
Corporation, CH-4415, Lausen, Schweiz (Plazenta-Wachstumsfaktor-2
(human) (rekombinant) Kat.-Nr. RLT-300-020). Rekombinantes humanes
PLGF wird mit einer gleichen Menge eines Hilfsstoffes vermischt
und die erhaltene Mischung wird dann in einer Menge, die einer Menge
an PLGF von 100 μg
pro 1 Maus entspricht subcutan männlichen
Balb/c-Mäusen
(zu Beginn der Immunisierung 8 Wochen alt) verabreicht (Grundimmunisierung
= „Priming"). Nach ungefähr 21 Tagen
kann die Immunisierung durch subcutane Verabreichung in der gleichen
Weise, wie oben beschrieben ist, durchgeführt werden (Boosterimmunisierung).
Nach 19 oder 30 Tagen nach der Booster-Immunisierung können den
Mäusen
200 μl einer
Zubereitung, die durch Verdünnen
von humanem PLGF mit PBS (phospatgepufferter, physiologischer Kochsalzlösung) auf
eine Konzentration von 250 μg/ml
erhalten wurde, in die Schwanzvene verabreicht werden (finale Immunisierung).
Ungefähr
drei Tage nach der finalen Immunisierung muss die Milz aus jeder
Maus herausgeschnitten werden und in einzelne Zellen zerlegt werden.
Anschließend
sollten die Milzzellen mit einem geeigneten Medium z.B. DMEM-Medium,
gewaschen werden. Zum anderen müssen
geeignete Maus-Myelomzellen
(z.B. Sp2/0-Ag14) in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt
werden und mit einem geeigneten Medium, z.B. DMEM-Medium, gewaschen
werden. Die Milzzellen und die Maus-Myelomzellen müssen in
einem Plastikröhrchen
in einem Zellzahlverhältnis
von 10:1 ausreichend miteinander vermischt werden und anschließend 50
% (w/v) Polyethylenglykol (PEG, z.B. von Boehringer Mannheim, mittleres
Molekulargewicht: 4000) dazugegeben werden, damit in 7 Minuten bei
37 °C eine
Zellfusion durchgeführt
wird. Nach Entfernen der Lösung
als Überstand
(z.B. durch Zentrifugation), wird der Rückstand mit HAT-Medium (10
% fötales
Rinderserum enthaltendes, mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin
versetztes DMEM-Medium) versetzt. Der Rückstand muss suspendiert werden,
so dass eine Konzentration der Milzzellen von ungefähr 5×106 Zellen/ml erhalten wird. Diese Zellsuspension
kann dann dispensiert werden und in Plastikplatten mit 96 Vertiefungen
geschüttet
werden, so dass eine Vertiefung ungefähr 100 μl der Suspension enthält und anschließend erfolgt
die Kultivierung bei 37 °C
unter 5 % Kohlenstoffdioxid. Das HAT-Medium muss aufgefüllt werden; zum Beispiel in
einer Menge von 50 μl/Vertiefung
an Tag 2 und Tag 5. Danach kann die Hälfte des Volumens des Mediums
jeden 3. oder 4. Tag entsprechend der Proliferation der Hybridome
ausgetauscht werden.
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Screening
und Klonierung der Hybridome: Hybridome, die den erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
produzieren, müssen
gescreent werden. Dies muss unter Verwendung der hemmenden Aktivität des monoklonalen
Antikörpers
auf die physiologische Aktivität
von PLGF, als Index, durchgeführt
werden. Hybridome, die monoklonale Antikörper, die eine Reaktivität mit PLGFs
zeigen, produzierten, müssen
dann aus den selektierten Klonen ausgewählt werden. Die erhaltenen
Hybridome müssen
dann in ein geeignetes Medium, zum Beispiel HT-Medium, das HAT-Medium
entspricht, außer
dass Aminopterin aus dem HAT-Medium entfernt wurde, überführt werden
und weiter kultiviert werden. Die Klonierung kann zweifach gemäß dem Verfahren
der limitierten Verdünnung,
mit welchem stabile Hybridome erhältlich sind, durchgeführt werden.
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Produktion
und Reinigung der monoklonalen Antikörper: 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan
(z.B. Pristan von Sigma, 0,5 ml) kann intraperitoneal in weibliche
Balb/c-Mäuse
(in einem Alter von 6 bis 8 Wochen nach der Geburt) injiziert werden.
Nach 10 bis 20 Tagen können
Zellen von Klonen (1×106 bis 107 Zellen)
in PBS suspendiert werden und intraperitoneal in die Mäuse eingeimpft
werden. Nach 7 bis 10 Tagen können
die Mäuse
getötet
werden und einer Operation des Abdomens unterzogen werden, aus dem
die darin produzierte die Aszitesflüssigkeit gesammelt wird. Die
Aszitesflüssigkeit
kann zentrifugiert werden, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen
und ein Überstand
wurde wiedergewonnen und bis zur Reinigung bei –20 °C gelagert. Aus dem oben beschriebenen Überstand
der Aszitesflüssigkeit
kann dann unter Verwenden des Hi-Trap Protein-A Antikörper-Reinigungskits
(erhältlich
bei Pharmacia, Roosendaal, Niederlande) IgG gereinigt werden. Und
zwar kann zu der Aszitesflüssigkeit
(2 ml) Lösung
A (1,5 M Glycin, 3 M NaCl, pH 8,9, 8 ml) gegeben werden und mit
einem Filter zur Filtration mit einer Porengröße von 45 μm (Millipore) filtriert werden.
Danach kann das erhaltene Filtrat auf eine mit Protein Sepharose
HP geladene Säule
(Säulenvolumen:
1 ml) (hergestellt von Pharmacia), die ausreichend mit Lösung A äquillibriert
wurde, aufgebracht werden und die Säule muss mit Lösung A in
einer Menge des 10-fachen Säulenvolumens
gewaschen werden. Anschließend
kann eine IgG-Fraktion mit Lösung
B (0,1 M Glycin, pH 2,8) in einer Menge des 10-fachen Säulenvolumens
eluiert werden. Die eluierte IgG-Fraktion kann gegen PBS dialysiert
werden. Bei den monoklonalen Antikörpern kann unter Verwenden
der vorher erhaltenen, gereinigten Antikörper mit Hilfe eines kommerziell
erhältlichen
Kits zur Bestimmung der Subklasse (Subclass-Determining Kit, Handelsname:
MonoAb-IDEIA Kit A, hergestellt von Zymed) auf ihre IgG-Subklasse
bestimmt werden. Dieses Verfahren basiert auf dem ELISA-Verfahren.
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Die
hemmenden Aktivitäten
der monoklonalen Antikörper
können
auf vollständige
Hemmung der Bindung von rPlGF an dessen VEGFR-1-Rezeptor getestet
werden. Dies kann zum Beispiel in einem immunofunktionellen ELISA
gemessen werden, bei dem Platten mit 96 Vertiefungen mit 100 μl eines 1 μg/l rmFlt-1/Fc-chimären Antikörpers über Nacht
bei Raumtemperatur in PBS beschichtet werden. Nach Blockieren für 1 Stunde
mit 1 % BSA in PBS werden dann 100 μl einer Mischung aus 70 μl Hybridommedium,
das mit 70 μl
rekombinantem mPlGF-2 mit 10 ng/ml für 2 Stunden bei Raumtemperatur
vorinkubiert worden war, auf die Platte aufgebracht. Ein Standard
von rmPlGF-2 zwischen 20 ng/ml und 156 pg/ml kann enthalten sein
(verdünnt
in PBS-Tween BSA-EDTA). Die Platten können dann 1 Stunde lang bei
37 °C und
1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert werden, 5 mal mit PBS-Tween
gewaschen werden und 100 μl
biotinylierter Ziege-anti-Maus-PlGF-2 mit 200 ng/ml kann für 2 Stunden
bei Raumtemperatur aufgebracht werden. Nach 5-maligem Waschen mit
PBS-Tween können
100 μl Avidin-HRP-Konjugat
(Vectastorin ABC-Kit) für
1 Stunde bei Raumtemperatur aufgebracht werden. Nach 5-maligem Waschen
mit PBS-Tween kann
die Platte mit 90 μl o-Phenylendiamin
in Citratphosphatpuffer pH 5,0 30 Minuten lang entwickelt und bei
490 nm gemessen werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch hemmende Antikörperliganden bereit, die an
PlGF binden können.
Ein solcher Ligand sollte insbesondere ein spezifisches, auf PLGF
lokalisiertes Epitop erkennen können. Die
vorliegende Erfindung betrifft zum Beispiel Liganden des vorher
genannten Typs, die von einem monoklonalen Antikörper stammen, der durch absichtliche
Immunisierung in Tieren produziert wurde. Die vorliegende Erfindung
stellt auch ein Antigen bindendes Fab-Fragment, oder ein homologes
Derivat eines solchen Fragments bereit, das durch proteolytischen
Verdau des monoklonalen Antikörpers
durch Papain unter Verwenden von im Stand der Technik allgemein
bekannten Verfahren erhalten werden kann. Um die Immunogenität des murinen
monoklonalen anti-PlGF-Antikörpers
zu verringern, schließt
die vorliegende Erfindung auch die Konstruktion eines chimären Antikörpers, vorzugsweise
eines Einzelketten-Variable-Domäne-Antikörpers, bei
dem die variable Region des murinen Antikörpers mit einer konstanten
Region eines humanen Antikörpers
kombiniert wird, eines so genannten humanisierten monoklonalen Antikörpers, ein.
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Die
in Tieren produzierten monoklonalen Antikörper können humanisiert werden, indem
beispielsweise die bindende komplementaritätsbestimmende Region (complementarity
determining region, „CDR") aus dem nicht-humanen
monoklonalen Antikörpers
mit humanen Framework-Regionen – insbesondere
der konstanten C-Region des humanen Gens – wie es beispielsweise bei
Jones et al. in Nature (1986) 321:522 oder Riechmann in Nature (1988)
332:323 offenbart ist, assoziiert oder in anderer Weise hybridisiert
wird.
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Die
monoklonalen Antikörper
können
humanisierte Versionen der murinen monoklonalen Antikörper sein,
die mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wurden,
und von den murinen und/oder humanen genomischen DNA-Sequenzen,
die für
die H- und L-Ketten klonieren, oder von cDNA-Klonen, die für die H-
und L-Ketten codieren, abweichen. Alternativ dazu können die
monoklonalen Antikörper
humane monoklonale Antikörper
sein. Solche humanen monoklonalen Antikörper werden zum Beispiel mit
Hilfe von Mäuse
mit schwerer kombinierter Immunschwäche (SCID) neu besiedelnden,
humanen Lymphozyten aus peripherem Blut (peripheral blood lymphocytes,
PBL), wie in der PCT/EP 99/03605 beschrieben ist, oder unter Verwenden transgener,
nicht-menschlicher Tiere, die humane Antikörper produzieren können, wie
im U.S. Patent Nr. 5,545,806 beschrieben ist, hergestellt. Auch
Fragmente, die von diesen monoklonalen Antikörpern stammen, wie zum Beispiel
Fab, F(ab')2 und ssFv („Einzelketten-Variables-Fragment"), unter der Voraussetzung,
dass sie die ursprünglichen
Bindungseigenschaften beibehalten, sind Teil der vorliegenden Erfindung.
Solche Fragmente werden gewöhnlich
durch, zum Beispiel, enzymatischen Verdau der Antikörper mit
Papain, Pepsin oder anderen Proteasen erzeugt. Fachleuten ist allgemein
bekannt, dass monoklonale Antikörper,
oder Fragmente davon, für
verschiedene Zwecke modifiziert werden können. Die Antikörper können auch
mit einem geeigneten Marker eines enzymatischen, fluoreszierenden
oder radioaktiven Typs markiert werden.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
zum Zubereiten von F (ab')
2 oder monovalenten Fab-Fragmenten ist beispielsweise die folgende:
Um F(ab')2-Fragmente zuzubereiten, kann der monoklonale
Antikörper über Nacht
gegen einen 0,1 mol/l Citratpuffer (pH 3,5) dialysiert werden. Der
Antikörper
(200 Teile) wird dann durch Inkubation mit Pepsin (1 Teil) für 1 Stunde
bei 37 °C,
erhältlich
von Sigma (Saint-Louis, Missouri) verdaut. Anschließend wird
der Verdau durch Zugabe von 1 Volumen eines 1 M Tris-HCl-Puffers
(pH 9) auf 10 Volumina der Antikörper
gestoppt. Monovalente Fab-Fragmente können mit Papain-Verdau wie folgt
zubereitet werden: 1 Volumen eines 1 M Phosphatpuffers (pH 7,3)
wird zu 10 Volumina des monoklonalen Antikörpers gegeben, dann wird 1
Volumen Papain (Sigma) zu 25 Volumina des Phosphatpuffers, der den
monoklonalen Antikörper, 10
mmol/l L-Cystein-HCl
(Sigma) und 15 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure (im Folgenden als EDTA
bezeichnet) enthält,
gegeben. Nach der Inkubation für
3 Stunden bei 37 °C
wird der Verdau durch Zugabe einer finalen Konzentration von 30
mmol/l frisch zubereiteter Iodacetamidlösung (Sigma) gestoppt, wobei
die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Dunkelkammer
gelassen wird. Unter Verwenden von Protein A-Sepharose können sowohl die F(ab')2-
als auch die Fab-Fragmente von verunreinigendem, intaktem IgG und
Fc-Fragmenten weiter gereinigt werden. Die gereinigten Fragmente
können
schließlich
gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (im Folgenden als PBS
bezeichnet) dialysiert werden. Die Reinheit der Fragente kann mittels
Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt werden
und die Proteinkonzentration kann unter Verwenden des Bicinchoninsäure-Protein
Assay Reagent A (Pierce, Rockford, Illinois) gemessen werden.
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In
einer bestimmten Ausführungsform
sollte klar sein, dass das therapeutische Verfahren der vorliegenden
Erfindung zur Unterdrückung
der Knochenresorption auch in Kombination mit irgendeiner anderen,
im Stand der Technik zur Unterdrückung
einer verstärkten
Knochenresorption bekannten Therapie verwendet werden kann.
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Der
Begriff „Medikament
zur Behandlung von" bezeichnet
eine Zusammensetzung, die Moleküle
(Antagonisten), wie sie oben beschrieben sind, und einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
oder Hilfsstoff (beide Begriffe sind gegeneinander austauschbar)
umfasst, zur Behandlung von Erkrankungen, wie oben angegeben ist.
Geeignete, Fachleuten bekannte Träger oder Hilfsstoffe sind Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung, Hanks-Lösung, Fettöle, Ethyloleat,
5 % Dextrose in Kochsalzlösung,
Substanzen, die Isotonizität und
chemische Stabilität
verstärken,
Puffer und Konservierungsstoffe. Andere geeignete Träger schließen jeden
Träger
ein, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern induziert, die für das Individuum,
das die Zusammensetzung empfängt,
schädlich
sind, wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polylaktinsäuren, Polyglykolsäuren, polymere
Aminosäuren
und Aminosäure-Copolymere.
Das ,Medikament' kann über jedes
geeignete, Fachleuten bekannte Verfahren verabreicht werden. Der
bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral.
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Bei
der parenteralen Verabreichung wird das erfindungsgemäße Medikament
in einer Dosiseinheit in injizierbarer Form, wie beispielsweise
einer Lösung,
Suspension oder Emulsion in Verbindung mit den pharmazeutisch verträglichen
Hilfsstoffen, wie sie oben definiert sind, formuliert. Die Dosierung
und die An der Verabreichung werden jedoch vom Individuum abhängen. In
der Regel wird das Medikament so verabreicht, dass das erfindungsgemäße Protein,
Polypeptid, Peptid in einer Dosis zwischen 1 μg/kg und 10 mg/kg, besonders bevorzugt
zwischen 10 μg/kg
und 5 mg/kg und ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 2 mg/kg
gegeben wird. Vorzugsweise wird es als Bolusdosis gegeben. Es kann
auch kontinuierliche Infusion verwendet werden, was die kontinuierliche
subcutane Versorgung über
eine osmotische Minipumpe einschließt. In diesem Fall kann das
Medikament in einer Dosis zwischen 5 und 20 mg/kg/Minuten, besonders
bevorzugt zwischen 7 und 15 μg/kg/Minuten
infusioniert werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
Antikörper
oder funktionelle Fragmente davon für die Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung der oben angegebenen Erkrankungen verwendet werden.
Nicht einschränkende
Beispiele sind der polyklonale Ziege-Antikörper von R & D Pharmaceuticals, Abingdon, UK oder
der polyklonale Huhn-Antikörper (Gassmann
et al., 1990, Faseb J. 4, 2528). Vorzugsweise sind diese Antikörper humanisiert
(Rader et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 13668) und besonders bevorzugt
werden humane Antikörper
als Medikament verwendet.
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Die
vorliegende Erfindung hat nun gezeigt, dass eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines PLGF-Inhibitors und
eines VEGFR-1-Rezeptor-Antagonisten,
und einen pharmazeutisch wirksamen Träger umfasst, zur Verringerung
des Knochenschwunds oder der Knochenmasse und/oder zur Blockierung
oder Prophylaxe der Bildung von Osteoporose in einem Lebewesen verwendet
werden kann. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung kann der
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Lebewesens mit
Osteoporose oder dem Risiko zur Bildung von Osteoporose dienen.
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Wie
hierin verwendet, schließt
der Begriff „pharmazeutisch
verträglicher
Träger" jedes beliebige
und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische
Mittel, isotonische Mitte, die Absorption verzögernde Mittel und Ähnliche
ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen
ist im Stand der Technik allgemein bekannt. Außer wenn irgendein gewöhnliches
Medium oder Mittel nicht mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verträglich ist,
wird seine Verwendung in der therapeutischen Formulierung ansonsten
immer in Erwägung
gezogen. Ergänzende
Wirkbestandteile können
auch in die pharmazeutischen Formulierungen eingeschlossen werden.
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Für Fachleute
versteht sich von selbst, dass jede Art der Verabreichung, jedes
Vehikel oder jeder Träger,
die/der gewöhnlich
verwendet wird und bezogen auf den Wirkstoff inert ist, zur Zubereitung
und Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
verwendet werden kann. Veranschaulichende Beispiele für solche Verfahren,
Vehikel und Träger
sind zum Beispiel in Remington's
Pharmaceutical Sciences, 4. Ausgabe (1970) beschrieben, auf deren
Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird. Fachleuten,
denen die Grundsätze
der Erfindung dargelegt wurden, werden keine Schwierigkeiten bei
der Bestimmung geeigneter und passender Vehikel, Hilfsstoffe und
Träger
oder bei der Mischung der Wirkstoffe mit diesen zur Ausbildung der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen haben.
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Die
therapeutisch wirksame Menge des in der pharmazeutischen Zusammensetzung
der Erfindung einzuschließenden
Wirkstoffs hängt,
bei jedem Fall, von verschiedenen Faktoren, z.B. vom Typs, von der
Größe und dem
Zustand des zu behandelnden Patienten, der angestrebten Art der
Verabreichung, dem Vermögen des
Patienten, die angestrebte Dosierungsform aufzunehmen usw., ab.
Allgemein wird in jeder Dosierungsform eine Wirkstoffmenge eingeschlossen,
die ungefähr
0,1 bis ungefähr
250 mg/kg und vorzugsweise ungefähr
0,1 bis ungefähr
100 mg/kg bereitstellt.
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Die
Erfindung stellt somit Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die
zur Hemmung, Unterdrückung
oder Verbesserung von Knochenschwund oder Knochenmassenschwund in
Säugern,
einschließlich Menschen,
nützlich
sind. Die Erfindung ist für
menschliche und tierärztliche
Anwendungen geeignet. Es wurde gezeigt, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung
und das erfindungsgemäße Verfahren
besonders wirksam bei der Prophylaxe der Bildung von Osteoporose
sind. Es wird eine neue Klasse an pharmazeutischen Zusammensetzungen
und Verfahren zur Behandlung und zur Prophylaxe von Knochenschwund
und mit Knochenschwund in Zusammenhang stehenden Verletzungen und
Erkrankungen bereitgestellt.
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Eine
bevorzuge Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von Antagonisten
des Plazenta-Wachstumsfaktors zur Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung von Knochenresorptionserkrankungen, wobei diese Behandlung
von Knochenresorptionserkrankungen eine Unterdrückung der Knochenresorption
sein kann und diese Knochenresorption vorzugsweise Osteoporose ist.
Die Antagonisten, die die Aktivität des Plazenta-Wachstumsfaktors
hemmen oder unterdrücken,
sind Antikörper.
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Hinsichtlich
des Verfahrens zum Blockieren oder zur Prophylaxe von Osteoporose
in einem Lebewesen, sieht diese Erfindung vor, dass das Lebewesen
ein Mensch ist. Der Mensch kann ein Patient sein. Das Lebewesen
kann auch andere Säuger
einschließen;
Beispiele schließen
neben anderen Hunde, Katzen, Pferde, Nagetiere oder Schweine, Kaninchen
ein.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen noch deutlicher bevorzugte
Merkmale der Erfindung, sie sollen jedoch die Erfindung in keinster
Weise einschränken.
Alle Ausgangsmaterialien und Reagenzien, die unten offenbart sind,
sind Fachleuten bekannt und entweder kommerziell erhältlich oder
können
unter Verwenden allgemein bekannter Techniken zubereitet werden.
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Beispiele
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1. Untersuchung des Phänotyps der Knochen von PlGF-Knockout-Mäusen
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PlGF-defiziente
Mäuse wurden
bereits bei Carmeliet P. et al. (2001) Nature Medicine, 7:575-583
beschrieben.
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1.1 Knochenhistomorphometrie
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Die
Knochen wurden für
die Knochenhistomorphometrie, wie bereits beschrieben wurde, verabeitet (Daci
et al., J. Bone Miner. Res., 2000, 15: 1510-1516). In Kürze: Die
Knochen wurden nicht dekalzifiziert in Methylmethacrylat eingebettet
und mit einem Rotationsmikrotom (RM 2155, Leica, Heidelberg, Deutschland), das
mit einem 50° Wolframcarbid-Messer
ausgestattet war, wurden 4 μm
dicke Längsschnitte
abgeschnitten. Um den mineralisierten Knochen beurteilen zu können, wurden
die Schnitte gemäß Von Kossa
gefärbt.
Die Messungen wurden in einem standardisierten Bereich, der den
Hauptteil der proximalen Tibiametaphyse umfasste, unter Verwenden
eines Kontron-Bildanalysesystems
(Kontron Image Analyzing System; Kontron Electronics, KS 400 V 3.00,
Eching bei München,
Deutschland) durchgeführt.
Alle Parameter entsprechen den Empfehlungen des Histomorphometry
Nomenclature Committee of the American Society for Bone and Mineral Research
(Parfitt et al., J. Bone Miner. Res. 2:595-610, 1987). Für die Immunhistochemie
wurden die Knochen in 2 % Paraformaldehyd in PBS fixiert, in EDTA
dekalzifiziert und in Paraffin eingebettet. Die Knochenschnitte wurden
auf CD31 immungefärbt,
wie es beschrieben wurde.
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Ergebnisse:
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- • Im
Vergleich zu WT-Mäusen
wurde bei neugeborenen PlGF-defizienten Mäusen ein Anstieg von 18 % im Volumen
des trabekukären
Knochens in der proximalen Tibiametaphyse gemessen. Dieser Anstieg
wurde bei 12 Wochen alten, PlGF-defizienten Mäusen deutlicher (+ 42 %; p < 0,05).
- • Studien
des Knochenhistomorphometrie unter Verwendung von Calcein-Doppelmarkierung
belegten eine signifikante Abnahme von sowohl der Geschwindigkeit
der Mineralapposition (mineral apposition rate, MAR um 47 %) als
auch der Geschwindigkeit der Knochenbildung (bone formation rate
BFR um 61 %) bei 12 Wochen alten Knockout-Mäusen, wenn sie mit WT-Mäusen verglichen wurden.
- • Trotz
des deutlichen Anstiegs der trabekulären Knochenmasse wurden keine
Defekte in der Gefäßneubildung
bei 12 und 16 Wochen alten PlGF-/--Mäusen beobachtet.
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1.2 Knochenmineraldichte (bone mineral
density, BMD) und Anzeichen für
Knochenneubildung
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Die
trabekuläre
Knochenmineraldichte (BMD) wurde mittels peripherer quantitativer
Computertomographie (pQCT) (XCT-960M; Nordland Medical Systems Inc.)
in herausgeschnittenen Tibiae gemessen, wie es beschrieben wurde
(Dacio et al., siehe oben). Vier Querschnitte (einer kortikal an
der Mitte der Diaphyse und drei trabekulär an der proximalen Epiphyse)
wurden gescannt und die Daten wurden unter Verwenden eines Schwellenwerts
von 200 mg/cm3 analysiert, um Knochen auszuwählen und
Weichgewebe auszuschließen. Die
kortikalen und trabekulären
Knochen wurden durch die „konzentrische
Schale" voneinander
getrennt, wobei der innere Kern als trabekulärer Knochen definiert wurde.
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Ergebnisse:
die Analyse mittels pQCT zeigte, dass die trabekuläre Knochenmineraldichte
in 12 Wochen alten, PlGF-defizienten Mäusen erhöht war (+ 30 %, p < 0,05), wohingegen
die Parameter des kortikalen Knochens nur minimal betroffen waren.
Diese Beobachtungen bestätigten
die histomorphometrischen Daten.
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1.3 Biochemische Analyse
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Osteocalcin
im Serum wurde intern mittels RIA gemessen, wie vorher beschrieben
wurde (Bouillon et al., 1992, Clin. Chem. 38: 2055-2060). Kollagenquervernetzungen
wurden gemäß einem
vorher beschriebenen Test quantifiziert (Daci et al., siehe oben).
Die Serumspiegel von Osteocalcin, die bei verschieden alten, PlGF-defizienten
Mäusen
gemessen wurden, waren im Durchschnitt 30 % niedriger als bei WT-Mäusen (p < 0,05). Harnausscheidungen
von Kollagenquervernetzungen wurden in 12 Wochen alten Knockout-Mäusen um 26 % reduziert (p < 0,05).
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Diese
Daten zeigen, dass PlGF-Defizienz in Mäusen zu einer verminderten
Knochenresorption, geringerem Knochen-Turnover und einer erhöhten trabekulären Knochenmasse
führt,
was die wichtige Rolle von PlGF in dem Prozess der Knochenresorption
zeigt.
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2. Mausmodelle für Osteoporose
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A. Apolipoprotein E-defiziente Mäuse
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Ein
epidemiologischer Zusammenhang zwischen Osteoporose und kardiovaskulärer Erkrankung,
unabhängig
vom Alter, wurde vorgeschlagen. Die Grundlage für diesen Zusammenhang ist unbekannt.
Für Arteriosklerose
empfängliche
Mäuse,
die eine fettreiche Ernährung
erhielten, entwickeln Osteoporose, die sich in einem abnehmenden
Mineralgehalt in den Knochen und einer abnehmenden Knochenmineraldichte
widerspiegelt (Parhami et al., J. Bone Miner. Res. 2001, 16, 182-188).
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Apolipoprotein
E-defiziente (ApoE-/-) Mäuse wurden von Dr. J. Breslow
(The Rockefeller University, New York, USA) erhalten. Die Mäuse besaßen einen
gemischten genetischen Hintergrund aus 75 % C57BI/6 und 25 % 129SvJ.
Die Tiere wurden im Alter von 4 Wochen abgestillt und 1 Woche lang
mit normalem Futter versorgt und danach mit einer fettreichen/sehr
cholesterinreichen Nahrung gefüttert.
Um die Rolle von PlGF-Antagonisten zu untersuchen, wurde den ApoE-/--Mäusen
dreimal pro Woche intraperitoneal PlGF-Antikörper injiziert. Sowohl männliche
als auch weibliche, ApoE-defiziente Mäuse, die mit fettreicher/sehr
cholesterinreicher Nahrung gefüttert
wurden, zeigten eine Abnahme des trabekulären Gehalts um 37 % (p < 0,05) bzw. 12 %
und eine Abnahme der trabekulären
Dichte um 42 % (p < 0,05)
bzw. 15 %. Die Prophylaxe der Abnahme beider Parameter wird derzeit
in sowohl weiblichen als auch männlichen
Mäusen,
die PlGF-Antikörper (300 μ/ml) empfangen,
wie in der WO01/85796 offenbart ist, und unter Verwendung von kleiner Interferenz RNA
(RNAi) gegen die für
den PlGF-Liganden codierende mRNA und/oder gegen die für den Flt-1-Rezeptor codierende
mRNA untersucht.
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B. Mäusemodell
für durch
Entlastung induzierten Knochenschwund
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Die
physikalische Trägheit
trägt zur
Entwicklung von Osteoporose bei. Die Hypothese besagt, dass durch
Trägheit
induzierter Knochenschwund die Folge von abnehmender Knochenbildung
und verringertem Blutfluss und entsprechender Hypoxie ist (Dodd,
1999, Am. J. Physio. 277:C598-C602). Die physikalische Trägheit bei
einem Mäusemodell
kann durch ,die Entlastung eines hinteren Gliedmaßes' nachgeahmt werden. Die
Knochenhistomorphometrie und die Knochenmineraldichte wurden, wie
weiter oben beschrieben ist, gemessen. Die Histomorphometrie zeigt,
dass die Entlastung eines hinteren Gliedmaßes das Volumen des trabekulären Knochens
bei WT-Mäusen
signifikant um 50 % reduzierte, während diese Abnahme bei PlGF-null-Mäusen nur
20 % betrug (es ließ sich
kein signifikanter Unterschied in der Abnahme des Volumens des trabekulären Knochens
feststellen, wenn diese PlGF-null-Mäuse mit PlGF-null-Mäusen mit
vollständiger Aktivität verglichen
wurden). Die pQCT-Analyse zeigt vergleichbare Ergebnisse für die Knochenmineraldichte.
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PlGF-Defizienz
schützt
Mäuse somit
vor einem durch physikalische Aktivität induzierten Knochenschwund.
Dieses Modell wird derzeit mit und ohne Verabreichung von Antikörpern gegen
Flt-1 (offenbart in der WO01/85796) und unter Verwendung von kleiner
Interferenz-RNA (RNAi) gegen die für den PlGF-Liganden codierende
mRNA und/oder gegen die für
den Flt-1-Rezeptor codierende mRNA auf Wildtyp-Mäuse angewendet.
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3. Bildung und Funktion von Osteoklasten
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3.1 Tests für die Bildung und Funktion
von Osteoklasten
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Die
Bildung von Osteoklasten wurde unter Verwenden von Co-Kulturen aus
primären
Osteoblasten und Knochenmarkszellen, die mit 1,25-Dihydroxyvitamin
D3 behandelt wurden, untersucht. In Kürze: die
Markhöhle
der Tibiae von 6 bis 8 Wochen alten Mäusen wurde mit alpha-MEM gespült, die
Zellen mit Hilfe von Zentrifugation gesammelt und die nukleären Zellen
unter Verwenden von Türk-Lösung ausgezählt. Bei
den Co-Kultur-Versuchen wurden die primären Osteoblasten mit 2 × 104 Ze1len/Vertiefung in einer Kulturplatte
mit 48 Vertiefungen ausplattiert und 24 Stunden später wurden
die Knochenmarkszellen mit 105 nukleären Zellen/Vertiefung
dazugegeben. Die von den Knockout- oder WT-Mäusen stammenden primären Osteoblasten wurden
mit den entsprechenden Knochenmarkszellen co kultiviert. Die Co-Kulturen
wurden an Tag 1 und 3 mit 2 × 10–8 M
1,25-Vitamin-D3 oder einem Vehikel behandelt
und an Tag 6 gestoppt. Am Ende der Co-Kultivierungszeit wurden die
adhärenten
Zellen mit PBS gespült,
10 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd in PBS fixiert, 1 Minute lang
mit Ethanol-Aceton 50:50 (v/v) behandelt, an der Luft getrocknet
und auf TRAP gefärbt.
Die Zellen wurden bei Raumtemperatur in 0,1 M Natriumacetat, pH
5,0, das Naphthol As-MX-Phosphat und Fast Red Violet LB-Salz enthielt,
in der Gegenwart von 10 mM Natriumtartrat inkubiert. Die Anzahl
oder Größe an Zellen, die
positiv gefärbt
wurden und 3 oder mehr Nuclei enthielten, wurde bestimmt. Anti-PlGF-Antikörper wurden mit
einer Konzentration von 300 μg/ml
zu der Kultur gegeben (die Antikörper
sind in der WO01/85796 offenbart).
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Um
die resorbierende Aktivität
von Osteoklasten zu bestimmen, wurden PlGF-defiziente und WT-Osteoklasten in vitro
48 Stunden lang auf Dentinscheiben inkubiert und die resorbierte
Oberfläche
wurde auf die Anzahl an Osteoklasten korrigiert. Um die Rolle von
PlGF bei der Migration von Osteoklasten zu erforschen, wurden PlGF-defiziente
und WT-Osteoklasten
in der oberen Kammer von Kultureinsätzen mit Kollagengel beschichteten
Membranen kultiviert und ihre Migration zu der unteren Kammer bewertet.
Das Überleben
der Osteoklasten wurde durch Auszählen der Gesamtzahl an Osteoklasten
an verschiedenen Zeitpunkten eines 72-stündigen Zeitintervalls in Kulturen
von reifen, in vitro gebildeten Osteoklasten untersucht.
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Ergebnisse:
Die Gesamtanzahl an in den Knochenmark-Oestoblasten-Co-Kulturen
von PlGF-defizienten Mäusen
gebildeten Osteoklasten war im Vergleich zu WT-Co-Kulturen um 10
% (p < 0,05) verringert.
Wenn nur die größten Osteoklasten
ausgezählt
wurden, war ihre Zahl bei PlGF-defizienten Co-Kulturen um 50 % kleiner
als bei WT-Kulturen. Da neben war der Prozentsatz an Osteoklasten
mit mehr als 5 Nuclei signifikant verringert. Dass PlGF an der Bildung
von Osteoklasten beteiligt ist, indem es direkt auf die Osteoklasten-Vorläufer wirkt,
wurde ferner durch Untersuchen der Bildung von Osteoklasten in Kulturen
nicht-adhärenter Knochenmarkszellen,
die von den mit M-CSF und RANKL behandelten Knockout- und WT-Mäusen stammten,
gezeigt. Die Anzahl der in den von den Knockout-Mäusen
stammenden Zellkulturen gebildeten Osteoklasten war deutlich geringer
(42 ± 4,
n = 4 gegenüber
423 ± 15,
n = 4, p < 0,001)
als bei den WT-Kulturen.
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Größe der in
den WT-Knochemark-Osteoblast-Co-Kulturen gebildeten Osteoklasten:
(1)
ohne anti-PlGF-Antikörpern:
14260 μm2 und (2) mit anti-PlGF-Antikörpern (PI5D11
F10 en PI9F7D6 – offenbart
in der WO01/85796): 6150 μm2, p < 0,001.
Von Knockout oder Mäusen
stammende Osteoklasten resorbierten Dentin ähnlich, ohne dass ein Unterschied
zwischen den beiden Genotypen auftrat. Zwischen PlGF-defizienten
und WT-Osteoklasten (entsprechend 12,3+ 2,4 %, n = 3 gegenüber 13,9
1,7 %, n = 3) konnte kein Unterschied bezüglich ihrer Fähigkeit
zur Migration und Invasion in die Kollagenmatrix beobachtet werden.
Nach 48 Stunden wurde kein Unterschied im Überleben der PlGF-/- – und WT-Osteoklasten (entsprechend
71 ± 7
%, n = 3 gegenüber
70 ± 2
%, n = 3) beobachtet und ebenso auch zu keinem anderen untersuchten
Zeitpunkt (24 Stunden und 72 Stunden). Die Bildung von Osteoklasten
und insbesondere die Reifung von Osteoklasten-Vorläufern zu
großen
multinukleären,
TRAP-positiven Zellen wird durch PlGF beeinflusst, da eine PlGF-Defizienz oder geringe
PlGF-Spiegel zu einer verminderten Größe (und Anzahl) von Osteoklasten führen. Daneben
zeigen die vitro-Daten, dass die Aktivität von reifen Osteoklasten nicht
von einer PlGF-Defizienz beeinflusst wird.
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4. Test der Knochenresorption ex vivo
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Um
die Wirkung von PlGF auf die Bildung von Osteoklasten zu bestätigen, wurde
eine Knochenresorption ex vivo in Gegenwart oder Abwesenheit von
PlGF beurteilt. Eine Messung der Freisetzung von 45Ca
aus kultivierten Tibiae wurde so, wie vorher beschrieben wurde,
durchgeführt
(Engsig et al., 2000, J. Cell. Biol. 151, 87, 879-889). In Kürze: An
Tag 1 wurden schwangeren Weibchen (16 Tage nach dem Koitus) subcutan
100 μCi 45Ca injiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurden
die Tibiae isoliert und in mit Ascorbat, Glutamat und Albumin ergänzten Medien
kultiviert. Es wurde gezeigt, dass die Freisetzung von Ca in Organkulturen
embryonaler Röhrenknochen
bei PlGF-defizienten Explantaten signifikant verringert war.
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Die
Abwesenheit von PlGF reduziert somit deutlich die osteoklastische
Knochenresorption.
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Die
Freisetzung von Ca wird derzeit durch Zugabe von PlGF-Antagonisten
(PlGF-Antikörper und RNA-Intereferenz-Moleküle gegen
PlGF) gemessen.
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5. Bildung und Differenzierung von Osteoblasten
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Obwohl
die Daten zeigen, dass PlGF die Bildung von Osteoklasten beeinflusst,
wird eine Wirkung von PlGF auf die Bildung und Differenzierung von
Osteoblasten nicht ausgeschlossen. Daher untersuchten wir das Wachstum,
die Differenzierung und Mineralisierung osteogener Zellen in Kulturen
mesenchymaler Stammzellen, die von PlGF-defizienten und von WT-Mäusen stammten.
Eine cytochemische Färbung
der Mesenchymzellkulturen auf alle Kolonien, ALP und Matrixmineralisierung
zeigten, dass das Wachstum und die Differenzierung osteogener Zellen
bei PlGF-defizienten und WT-Mäusen ähnlich verlief,
was darauf hindeutet, dass eine PlGF-Defizienz nicht die Funktion
der Osteoblasten beeinflusst. Die Abnahme der Parameter der Knochenbildung,
die in vivo mit der größten Wahrscheinlichkeit
zu beobachten war, spiegelt das geringe Knochen-Turnover in PlGF-defizienten
Mäusen
wider. SEQUENZPROTOKOLL
