EA013970B1 - Антитела к плацентарному фактору роста и способы их применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам, нацеленным на плацентарный фактор роста (PLGF), и их фрагментам и производным, более конкретно, к гуманизированным антителам и их фрагментам для применения в лечении и/или профилактике патологического ангиогенеза.

Description

Настоящее изобретение относится к новым антителам и их фрагментам и производным, в частности, пригодным для ингибирования ангиогенеза при патологических состояниях. Изобретение также относится к линиям клеток, продуцирующим специфические антитела. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела, фрагменты и/или производные по изобретению, и относится к способам профилактики и лечения ангиогенеза и/или сосудистого кровотечения там, где они являются нежелательными как, например, при формировании опухоли, заболеваниях глаза, легочной гипертензии и воспалительных расстройствах, и способам профилактики и лечения костных нарушений, таких как остеопороз.

Предпосылки изобретения

Патологическое формирование кровеносных сосудов вносит вклад в патогенез множества заболеваний с высокой заболеваемостью и смертностью. Выявление механизмов, лежащих в основе роста сосудов, могло бы позволить разработать терапевтические стратегии для стимулирования роста сосудов в ишемизированных тканях или для подавления их образования в опухолях. В недавних исследованиях по направленному воздействию на гены в эмбрионах идентифицировали некоторые механизмы, вовлеченные в начальное формирование эндотелиальных каналов (ангиогенез) и их последующее созревание посредством покрытия гладкомышечными клетками (артериогенез). Появляются данные о том, что разные молекулярные механизмы могут опосредовать рост кровеносных сосудов при патологических состояниях, но молекулярные участники остаются в значительной степени неизвестными.

Установлено, что фактор роста эндотелия сосудов (УБОР) вовлечен в развитие и патологический рост сосудистой сети (Реггага N. е! а1, 1999, Сигг. Тор. МюгоЬю1. 1ттипо1. 237, 1-30). Более того, также показано, что плацентарный фактор роста (Р1СЕ), гомолог УЕСЕ, является специфическим модулятором УЕСЕ при многих патологических состояниях, таких как ишемическая ретинопатия, образование опухолей, воспалительные расстройства и отек. Показано, что мыши Р1СЕ^-/- обладают нарушенным ангиогенезом и артериогенезом при заболевании (СагтеНе! Р. е! а1., 2000, 1. Ра!1о1. 190, 387-405), в то время как физиологический ангиогенез у нормальных здоровых животных остается незатронутым. Таким образом, ингибиторы Р1СЕ обладают огромным потенциалом для лечения заболеваний, при которых ангиогенез или артериогенез вносят вклад в патогенез заболевания.

В данной области известны ингибиторы Р1СЕ, такие как козьи поликлональные антитела против Р1СЕ человека (Κ.&Ό РйагтасеийсаН, ЛЬищбоп. иК) и куриные поликлональные антитела (Саззтапп е! а1., 1990, ЕазеЬ 1. 4, 2528). Эти антитела применяют для исследований с помощью вестерн-блоттинга, гистохимии и иммунопреципитации. В XVО 01/85796 описано применение ингибиторов Р1СЕ, включая моноклональные анти-Р1СЕ антитела, для лечения или профилактики заболеваний, таких как образование опухолей. Более конкретно, описано получение мышиных моноклональных антител, которые полностью ингибируют связывание Р1СЕ-2 мыши со своим рецептором Е1!-1, где антитело МаЬ-РЬ5П11 отобрано, как обладающее наиболее эффективной ингибиторной активностью. Описано применение антител в моделях патологического ангиогенеза на животных.

Антитела, полученные у животных, обладают характеристиками, которые могут значительно ограничивать их применение для лечения человека. Как чужеродные белки, они могут вызывать ответ на иммуноглобулины, (который для мышиных антител обозначают как человеческие антитела против мыши или НАМА), который снижает или нейтрализует их терапевтическую эффективность и/или провоцирует аллергические или гиперчувствительные реакции у пациентов, как показано в 1аГГег8 е! а1., 1986 (Тгапзр1ап!а!юп 1986 41:572). В то время как применение человеческих моноклональных антител могло бы разрешить это ограничение, оказалось трудным получить большие количества человеческих антител против человека с помощью общепринятой технологии гибридом. Таким образом, в данной области применили рекомбинантную технологию для конструирования гуманизированных антител, которые сохраняют высокую аффинность связывания моноклональных антител животного происхождения, таких как мышиные, но обладают пониженной иммуногенностью у человека. В частности, предложены химерные антитела, у которых вариабельную область (У) не относящихся к человеку антител соединяли с константной (С) областью антител человека. Способы получения таких химерных иммуноглобулинов подробно описаны в патенте США 5770198. В других попытках снизить иммуногенность мышиных антител, на антитела человека переносили только область, определяющую комплементарность (СЭЯ), т.е. области гипервариабельности в У-областях, а не полный У-домен. Такие гуманизированные антитела известны как СЭЯ-привитые антитела. Конструирование СЭЯ-привитых антител, распознающих более сложные антигены, дало в результате антитела, обладающие активностью связывания значительно более низкой, чем у нативных негуманизированных антител. Во многих случаях показано, что единственного введения СЭЯ, не относящихся к человеку, в остов человеческих антител недостаточно для сохранения полной активности связывания. Несмотря на то, что для идентификации ключевых аминокислот, рассматриваемых в конструировании гуманизированных антител, требуется усложненная компьютерная модель мышиных антител, представляющих интерес и для такого конструирования предложены общие теоретические принципы, во всех случаях способ необходимо адаптировать и оптимизировать для конкретных не относящихся к человеку антител, представляющих интерес.

- 1 013970

Следовательно, сохраняется потребность в (моноклональных) антителах, которые оптимально ингибируют связывание Р1СР человека со своим рецептором. Более того, такие антитела также должны являться неиммуногенными в том смысле, что они не могут вызывать НАМА (или обладают небольшой склонностью к этому).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам и их производным, нацеленным на Р1СР и способным ингибировать связывание Р1СР со своим рецептором. Настоящие лиганды являются первыми, для которых показали ингибирование Р1СР человека при патологическом состоянии ίη νίνο. Более конкретно, антитела и их производные согласно настоящему изобретению способны уменьшать размер опухоли и васкуляризацию ткани опухоли человека ίη νίνο. Антитела по настоящему изобретению предоставляют альтернативу антиангиогенным способам лечения, нацеленным на используемый в настоящее время УЕСР, с тем важным преимуществом, что побочные эффекты, вызываемые ингибированием физиологического ангиогенеза, связанные с данными способами лечения, значительно снижены.

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, в частности моноклональным антителам, их фрагментам или производным, включая гуманизированные антитела и фрагменты антител, которые связываются с тем же эпитопом Р1СР, что и антитела, обозначенные здесь как 1603.

Первой целью настоящего изобретения является предоставление новых моноклональных антител, способных связываться с Р1СР и обладающих способностью ингибировать функционирование Р1СР, более конкретно, антител, отличающихся тем, что их вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность 8ЕО ΙΌ N0:2 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно 95% идентичностью последовательности с ней в пределах областей СОЯ, и/или тем, что их вариабельная область легкой цепи содержит последовательность 8Е0 ГО N0:4 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ней в пределах областей СОК., как, например, антитело 1603 или его производные. Дополнительно или альтернативно, в другом варианте осуществления, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обладают идентичностью последовательности в вариабельных областях тяжелой и/или легкой цепей за пределами областей СОК, которые по меньшей мере на 70%, в частности, по меньшей мере на 80%, более конкретно по меньшей мере на 90%, наиболее конкретно по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4, соответственно.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения, антитело является гуманизированным антителом, более конкретно, гибридным антителом, наиболее конкретно, мышиным/человеческим гибридным антителом, более конкретно, гибридным мышиным 16О3/человеческим 1дС1к или 1дС4к. Альтернативно, гуманизированное антитело является тем, которое содержит области СОК мышиного антитела 1603 по настоящему изобретению, способные связываться с Р1СР, встроенные в остов человеческих антител.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к антигенсвязывающим фрагментам мышиного антитела 1603 или его производным, таким как его гуманизированное антитело, такие как, в качестве неограничивающих примеров, РаЬ, РаЬ' или Р(аЬ')₂, сочетание по меньшей мере двух определяющих комплементарность областей (СОК), растворимая или заякоренная в мембране одноцепочечная вариабельная область, или одиночный вариабельный домен. Конкретные варианты осуществления таких антигенсвязывающих фрагментов включают фрагменты, которые содержат по меньшей мере две СОК 1603 или их производные, или, более конкретно, по меньшей мере две СОК, выбранные из группы, состоящей из 8 ЕС) ГО N0:17 (СУТРТОУУ), 8 ЕС) ГО N0:18 (1УРС8СЭТ), 8 ЕС) ГО N0:19 (УК08РРРОУ), 8ЕС) ГО N0:20 (С)8ЕЕ\8С\1КК81^;). 8ЕС) ГО N0:21 (№А8) и 8ЕС) ГО N0:22 (ΚΟ8ΥΗΕΕΤ). или которые содержат по меньшей мере две последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ними. Конкретный вариант осуществления изобретения относится к предоставлению одноцепочечных вариабельных фрагментов (ксРу) мышиного антитела 1603 и гуманизированных δοΕν, которые способны ингибировать активность Р1СР. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к хсРу, содержащим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:24 или 8Е0 ГО N0:26, или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ней в пределах СОК, способных связываться с Р1СР.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление линий клеток, продуцирующих моноклональные антитела по настоящему изобретению, более конкретно, линии клеток 1603, которая продуцирует антитело 1603, а также других линий клеток, которые способны продуцировать антигенсвязывающие молекулы, происходящие из 1603 или его фрагментов, например, в результате рекомбинантной технологии.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для профилактики или лечения (нежелательного) ангиогенеза при патологических состояниях или нару

- 2 013970 шениях у млекопитающих, или для профилактики или лечения резорбции кости, которая содержит антитело против Ρ1ΟΕ, которое является 16Ό3 или фрагментом или производным, более конкретно, гуманизированной версией 16Ό3 или его антигенсвязывающим фрагментом в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Конкретный вариант осуществления изобретения является фармацевтической композицией, которая содержит антигенсвязывающий фрагмент 16Ό3 или его производное, которое выбрано из группы, состоящей из РаЬ, РаЬ' или Е(аЬ')₂, растворимой или заякоренной в мембране одноцепочечной вариабельной части или одиночного вариабельного домена. Наиболее конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающий фрагмент, который содержит по меньшей мере две СЭР. выбранные из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:17 (ΟΥΤΕΤΌΥΥ), 8ЕО ГО N0:18 (ΙΥΡΟ8ΟΝΤ), 8ЕО ГО N0:19 (νΚΌδΡΡΡΌΥ), 8ЕО ГО N0:20 (Р8ЬЬ№6МКК8Е), 8ЕО ГО N0:21 (^Л8) и 8ЕО ГО N0:22 (ΚΟ8ΥΙ11 .ΕΤ), или по меньшей мере две СОК, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с двумя разными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:17-22. Конкретный вариант осуществления этих композиций относится к фармацевтическим композициям, содержащим зсЕу антитела 16Ό3 по изобретению, более конкретно, содержащим зсЕУ, который содержит по меньшей мере две СОК, выбранные из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:17 (ΟΥΤΕΤΌΥΥ), 8Е0 ГО N0:18 ΟΥΡΟδΟ^), 8ЕО ΙΌ N0:19 (νΚΌδΡΡΡΌΥ), 8ЕО ΙΌ N0:20 (Р8ЬЬ№ОМКК8Е), 8ЕО ΙΌ N0:21 (^Ά8) и 8Е0 ГО N0:22 (Κ08ΥΗΕΕΤ) или по меньшей мере две последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с двумя разными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:17-22, как, например, зсЕу, содержащий 8Е0 ГО N0:24. Наиболее конкретно, фармацевтическая композиция содержит гуманизированный 8сЕу 16Ό3, такой как, в качестве неограничивающих примеров, гуманизированный зсЕу, содержащий 8Е0 ГО N0:26 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ней в пределах СОК, способной связываться с Ρ10Ε.

В еще одном конкретном варианте осуществления фармацевтической композиции согласно изобретению терапевтически эффективное количество другого антиангиогенного средства включено в дополнение к антигенсвязывающей молекуле, способной связываться с Ρ10Ε по изобретению. Наиболее конкретно, в связи с этим предусмотрены антиангиогенные средства, такие как ингибиторы УЕСЕ и ЬЕОЕ, наиболее конкретно, анти-УЕОЕ антитела.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигенсвязывающие фрагменты антител, связывающихся с описанным здесь Ρ10Ε, более конкретно, нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей 16Ό3, продуцируемого линией клеток 16Ό3. Наиболее конкретно, предусмотрена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельные области 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4. Кроме того, полинуклеотидные последовательности, кодирующие антигенсвязывающие фрагменты, содержащие по меньшей мере две СОК 16Ό3, более конкретно, полинуклеотиды, кодирующие, по меньшей мере, две СОК, выбранные из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:17 (ΟΥΤΕΤΌΥΥ), 8ЕО ГО N0:18 (ОТ080КГ), 8ЕО ГО N0:19 (νΗΕ8ΡΕΕΕΥ) , 8ЕО ΙΌ N0:20 (Р8ЬЬ№ОМКК8Е), 8ЕО ΙΌ N0:21 (^Л8) и 8ЕО ГО N0:22 (Κ08ΥΗΕΕΤ), или кодирующие последовательности, содержащие по меньшей мере две СОК, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с 8Е0 ГО N0:17-22. Конкретные варианты осуществления нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению предоставлены в 8Е0 ГО N0:1, 3, 5 и 6. Другие конкретные варианты осуществления включают нуклеотидные последовательности, кодирующие 8сЕу 16Ό3 и его гуманизированные версии, наиболее конкретно, последовательность 8Е0 ГО N0:23 и 8Е0 ГО N0:25, и последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ними, наиболее конкретно, в пределах областей, кодирующих области СОК 8сЕу. Однако будет принято во внимание, что существует множество нуклеотидных последовательностей, которые попадают в объем настоящего изобретения в результате вырожденности генетического кода.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения и/или профилактики нежелательного (или патологического) ангиогенеза при патологическом состоянии у млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества активного ингредиента, который является антителом 16Ό3 по настоящему изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, наиболее конкретно, 8сЕу, как здесь описано. В частности, подходящими для способов по настоящему изобретению являются гуманизированные антитела и фрагменты антител, такие как зсЕу 16Ό3 или их производные. Конкретный вариант осуществления способа по изобретению относится к лечению и/или профилактике патологических состояний, таких как, в качестве неограничивающих примеров, рак, воспале

- 3 013970 ние, заболевания глаза, легочная гипертензия и сосудистое кровотечение. Конкретной целью настоящего изобретения является предоставление эффективного и безопасного лечения (т.е. без побочных эффектов) патологического ангиогенеза, более конкретно, при росте опухоли, воспалении, заболеваниях глаза или сосудистом кровотечении у млекопитающих, более конкретно, у человека. Наиболее конкретно, способ по настоящему изобретению пригоден для лечения и/или профилактики солидных опухолей, более конкретно, для лечения и/или профилактики рака толстой кишки, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланом.

Другие применения антител и антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению относятся к иммунологическому детектированию РЮР в образцах из человека в качестве меченых направляющих групп в способах диагностики и для скрининга соединений с дополнительным эффектом ингибирования РЮР при лечении рака.

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии новых лигандов, а именно, новых мышиных и гуманизированных моноклональных антител и их фрагментов, производных и гомологов, которые очень эффективно ингибируют РЮР. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к лигандам, способным уменьшать рост опухоли, наиболее конкретно, способных уменьшать размер опухоли на 20-50%.

Краткое описание чертежей

Следующее описание, не предполагающее ограничение изобретения описанными здесь конкретными вариантами осуществления, можно понять в связи с сопроводительными фигурами, приведенными здесь в качестве ссылки, в которых:

фиг. 1 - связывание антитела 16Ό3 (А) или гуманизированного антитела 16Ό3 (1ш16Э3) (В) с РЮР-2 человека (полученного в Р1сЫа) в анализе ЕЬ18А в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

фиг. 2 - ингибирование связывания РЮР-2 с рецептором Р11-1 человека с помощью антитела 16Ό3 (квадраты) или гуманизированного антитела 16Ό3 (треугольники) в анализе ЕЫ8А в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

фиг. 3 - результаты экспериментов на В1асоге, где гйиРЮР-2 иммобилизован на чипе СМ5 для изучения ингибирующей способности антитела 16Ό3 и его РаЬ-фрагмента, тестируемых в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

фиг. 4 - моноклональное антитело 16Ό3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы ЭапС человека. Лечение мышей пи/пи с опухолями приблизительно 60 мм³ с помощью антиЧРА (контрольный 1дС) (1С8; 50 мг/кг массы тела; п=10), анти-ЬРЮР 16Ό3 (анти-ЬРЮР) (50 мг/кг массы тела; п=10), анти-шРЮР (РЕ5О11Э4 (полученных, как описано в \νϋ 01/85796; 50 мг/кг массы тела; п=10), сочетания анти-ЬРЮР 16Ό3 и анти-шРЮР РЬ5П1Ш4 (антиЬРЮР/анти-шРЮР)(каждое 25 мг/кг массы тела; п=10) и носителя (п=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. (А) Размер опухоли; (В) масса опухоли на 18 сутки после инокуляции опухоли;

фиг. 5 - моноклональное антитело 16Ό3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы ЭапС человека дозозависимым образом. Лечение мышей пи/пи с опухолями приблизительно 60 мм³ с помощью анти-ЬРЮР 16Ό3 (50 мг/кг = 1000 мкг/С, 37,5 мг/кг = 750 мкг''/''Ό, 25 мг/кг = 500 мкг/Е, 12,5 мг/кг = 250 мкг/Р; п=10 для каждой концентрации), контрольного 1дС (1С8/В; 50 мг/кг) и носителя/А (п=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А: Изменение среднего размера опухоли после инокуляции опухолевых клеток; В: средний размер опухоли на 20 сутки;

фиг. 6 - моноклональное антитело 16Ό3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли молочной железы МОА-МВ человека. Лечение мышей пи/пи с опухолями приблизительно 60 мм³ с помощью анти-ЬРЮР 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10) или носителя три раза в неделю в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А: масса опухоли и В: объем опухоли, как определяли на 32 сутки после инокуляции;

фиг. 7 - моноклональное антитело 16Ό3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли толстой кишки ЬОУО человека. Лечение мышей пи/пи с опухолями приблизительно 60 мм³ с помощью анти-ЬРЮР 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10) или носителя три раза в неделю в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А: масса опухоли и В: объем опухоли, как определяли на 30 сутки после инокуляции;

фиг. 8 - Моноклональное антитело 16Ό3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли меланомы Ме12а человека. Лечение мышей пи/пи с опухолями приблизительно 60 мм³ с помощью анти-ЬРЮР 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10) или носителя три раза в неделю в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Масса опухоли, как определяли на 53 сутки после инокуляции;

фиг. 9 - моноклональное антитело 16Ό3 предотвращает снижение массы тела на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы ИапС человека. Лечение мышей пи/пи с опухолями

- 4 013970 приблизительно 60 мм³ с помощью анти-1Р1СЕ 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10), контрольного 1дС. сочетания анти-1Р1СЕ и анти-тРЮЕ (каждое 25 мг/кг массы тела; п=10) и носителя (п=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Массу опухоли вычитали из массы тела перед вычислением процентной доли снижения массы тела. Светлые столбики: масса тела на первые сутки лечения; темные столбики: масса тела на последние сутки лечения;

фиг. 10 - моноклональное антитело 16Ό3 и авастин обладают дополнительным эффектом на ингибирование роста опухоли на подкожной опухоли поджелудочной железы ЭапС человека. Лечение мышей пи/пи с опухолями приблизительно 60 мм³ с помощью анти-1Р1СЕ 16Ό3 (37.5 мг/кг. 25 мг/кг. 12.5 мг/кг массы тела; п=10 для каждой концентрации). контрольным 1дС (1С8; 50 мг/кг). авастином (15 мг/кг и 5 мг/кг массы тела. внутрибрюшинно два раза в неделю. п=10 для каждой) и сочетанием анти-1Р1СЕ (12.5 мг/кг массы тела) и авастина (5 мг/кг массы тела; п=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей умерщвляли после 20 суток инокуляции опухоли. и определяли объем опухоли;

фиг. 11 - нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных частей мышиного антитела 16Ό3 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А. Нуклеотидная последовательность. кодирующая вариабельную часть тяжелой цепи; В. Нуклеотидная последовательность. кодирующая вариабельную часть легкой цепи; С. Аминокислотная последовательность вариабельной части тяжелой цепи; Ό. Аминокислотная последовательность вариабельной части легкой цепи. Подчеркнуты нуклеотиды или аминокислоты. которые можно модифицировать для целей гуманизации согласно одному из вариантов осуществления изобретения;

фиг. 12 - нуклеотидные и аминокислотные последовательности гуманизированных вариабельных частей 16Ό3 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А. Нуклеотидная последовательность. кодирующая гуманизированную вариабельную часть тяжелой цепи; В. Нуклеотидная последовательность. кодирующая гуманизированную вариабельную часть легкой цепи; С. Аминокислотная последовательность гуманизированной вариабельной части тяжелой цепи; Ό. Аминокислотная последовательность гуманизированной вариабельной части легкой цепи. Подчеркнуты нуклеотиды или аминокислоты. модифицированные для целей гуманизации;

фиг. 13 - изображение вектора для экспрессии гуманизированных 16Ό3 δοΕν в клетках 293;

фиг. 14 - А: Связывание 8εΕν16Ό3 и гуманизированных 5сЕу16Э3 с Р1СЕ; В: Ингибирование связывания 1шР1СЕ-2 со своим рецептором 1шР11-1 с помощью ^Εν16Ό3 и гуманизированных ^Εν16Ό3 (В);

фиг. 15 - А: Аминокислотная последовательность 5сРу мышиного антитела 16Ό3; В: Аминокислотная последовательность гуманизированного 5сРу антитела 16Ό3. Подчеркнуты области за пределами вариабельной области тяжелой и легкой цепей;

фиг. 16 - Изображение вектора для экспрессии гуманизированного 16Ό3 РаЬ в клетках 293 в соответствии с вариантом осуществления изобретения;

фиг. 17 - А: Связывание гуманизированного РаЬ16И3 с 1иР1СЕ в анализе ЕЫ8А в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; В: Ингибирование связывания 1шР1СР-2 со своим рецептором 1шЕ11-1 с помощью гуманизированного ЕаЬ16И3.

Определения

Термин 16Ό3. как применяют здесь. относится к моноклональному антителу против Р1СЕ. продуцируемому линией клеток. депонированных в ВССМ/ЬМВР под номером ЬМВР 6399СВ.

Термин фрагмент антитела относится к компоненту части молекулы антитела. который один или в сочетании с другими фрагментами способен связываться с антигеном. против которого получено соответствующее антитело. Типичными фрагментами антитела являются ЕаЬ. ЕаЬ'. Е(аЬ')₂. Εν или зсРу. которые часто сохраняют аффинность к антигену. которая сравнима с полным антителом. Фрагменты меньшего размера содержат определяющие комплементарность области или СИР. такие как СИР1. СИР2 и СИР3 тяжелой или легкой цепи и/или двух или более их сочетаний.

Термин производное применяют здесь для обозначения антигенсвязывающей молекулы. которая соответствует модификации исходного антитела (например того. которое продуцируется гибридомной линией клеток) или его фрагмента. без значительного нарушения связывания с антигеном. Типичные модификации включают модификации аминокислотной последовательности исходного антитела или модификации функциональных групп. присутствующих в аминокислотной последовательности. например. в контексте гуманизации. для связывания антитела или его фрагмента с другими молекулами. такими как метки или бусы. или для модификации гликозилирования. Таким образом. производные включают в себя в качестве неограничивающих примеров гуманизированные антитела. гибридные антитела. антитела или другие антигенсвязывающие молекулы. которые получены посредством пересадки или введения одной или нескольких вариабельных областей и/или СИР исходного антитела на остов другого антитела или фрагмента из того же или другого вида. Производные антитела содержат альтернативные структуры одной или нескольких СИР антитела. что дает антигенсвязывающую молекулу. такую как синтетический полипептид.

Гуманизированное антитело или фрагмент антитела. как применяют здесь. относится к молекуле

- 5 013970 антитела или его фрагменту, в которых, по сравнению с исходным антителом, аминокислоты замещены для того, чтобы иметь большее сходство с антителом человека. Большинство этих замещений будут находиться в остове антитела или фрагмента антитела, т.е. в областях, которые не связываются с антигеном. Однако предусмотрено, что в пределах СЭК. также можно заместить аминокислоты, которые не принимают или, скорее всего, не принимают участие в связывании с антигеном.

Реконструированное антитело или фрагмент антитела или гибридное антитело, как применяют здесь, относится к антителу, которое содержит части по меньшей мере двух разных антител, которые могут, не обязательно, происходить из того же или различных видов. Как правило, гибридное антитело человека может представлять собой человеческую константную область одного антитела, связанную с гуманизированной вариабельной областью другого антитела (которые направлены против интересующего антигена), или остов человеческого антитела из одного антитела, в котором аминокислотные последовательности в антигенсвязывающих областях замещены последовательностями другого антитела, например, антитела, не относящегося к человеку, направленного против интересующего антигена человека. Более конкретно, антигенсвязывающие области одного (обычно не относящихся к человеку) антитела, обладающие аффинностью к интересующему антигену, такие как одна или несколько СОК или их вариабельные области или части, вводят в остов другого (обычно человеческого) антитела (например, СПКпривитых антител).

Термин гомология или гомологичный, как применяют здесь со ссылкой на две или более антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, относится к способности антигенсвязывающих молекул связываться с одним и тем же антигеном, более конкретно, с одним и тем же эпитопом. Способность двух антигенсвязывающих молекул связываться с одним и тем же эпитопом можно оценить определением того, могут ли антигенсвязывающие молекулы конкурировать друг с другом за связывание с одним и тем же антигеном, например, в конкурентно-связывающем анализе. Связывание с антигеном гомологичных антигенсвязывающих молекул должно осуществляться со сходной специфичностью.

Идентичность последовательности двух последовательностей, как применяют здесь, относится к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на количество нуклеотидов или аминокислот в более коротких последовательностях при выравнивании двух последовательностей. Предпочтительно указанная идентичность последовательностей выше чем 70-80%, предпочтительно 81-85%, более предпочтительно 86-90%, особенно предпочтительно 91-95%, наиболее предпочтительно 96-100%, более конкретно, является 100%. Ввиду, как правило, ограниченного вклада остова вариабельных областей в связывание с антигеном, идентичность последовательности чаще всего определяют здесь по отношению к последовательности в определяющих комплементарность областях или СЭК, т.е. по отношению к кодирующим нуклеотидным последовательностям и аминокислотным последовательностям, которые образуют СЭК. Таким образом, когда последовательность, как определяют, обладает, например, 80% идентичностью последовательности на протяжении специфической последовательности в пределах СЭК, это предназначено для определения идентичности последовательностей между двумя последовательностями только по отношению к последовательностям, образующим СПК.

Термин РЮБ применяют здесь для обозначения плацентарного фактора роста. РЮР, как обнаружили, в основном существует в виде двух сплайсированных вариантов или изоформ, РЮБ-1 из 149 аминокислот и РЮБ-2 из 170 аминокислот, который содержит вставку из 21 аминокислоты в С-концевой области, но также обнаружены другие изоформы.

Термин ингибиторный при ссылке на антитело к РЮБ или его фрагмент или производное применяют, чтобы указать, что антитело, фрагмент или производное способны ингибировать связывание РЮБ со своим рецептором БИ-1.

Подробное описание

Настоящее изобретение будет описано со ссылкой на определенные варианты осуществления и на определенные фигуры, но настоящее изобретение этим не ограничено, а ограничено только формулой изобретения.

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, в частности, моноклональным антителам, их фрагментам или производным, которые связываются с тем же эпитопом РЮБ, что и антитело, обозначенное здесь как антитело 16Ό3. Антитело 16Ό3, продуцируемое линией клеток ЬМВР 6399СВ, вырабатывается против РЮБ человеческого происхождения и связывает РЮБ человека (обе изоформы РЮБ-1 и РЮБ-2). Антитело 16Ό3 ингибирует связывание РЮБ человека со своим рецептором Д1-1, ингибируя активность РЮБ. Само антитело 16Ό3 и его фрагменты или производные, а также нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело, фрагменты или производные, можно, таким образом, применять для ингибирования РЮБ как в терапевтическом контексте, так и на модели у животных для целей тестирования или скрининга. Альтернативно, антитело можно применять для детектирования и/или определения количества РЮБ или ίη νίνο, ех νίνο или ίη νίίτο. Таким образом, настоящее изобретение относится к разным применениям антигенсвязывающих молекул по изобретению и нуклеотидных последовательностей, кодирующих их. Изобретение, далее, относится к способам получения антигенсвя

- 6 013970 зывающих молекул по изобретению и к линиям клеток, способных продуцировать эти антигенсвязывающие молекулы.

Первый аспект настоящего изобретения относится к линиям клеток, продуцирующим антигенсвязывающие молекулы по изобретению, более конкретно, линиям клеток, продуцирующим моноклональные антитела, способные связываться с тем же антигеном, что и 16Ό3 или их фрагменты или производные. Конкретный вариант осуществления этого аспекта изобретения представляет собой гибридомную линию клеток, также обозначаемую как линия клеток 16Ό3, которая продуцирует моноклональное антитело 16Ό3 и которая депонирована в ВССМ/ЬМВР (Ве1щаг1 Соотйша1ей Сойесйоик о! М1стоогдаикпъ/РЕтший Со11ес1юи ЬаЬога1огшт уоот Мо1еси1ште Вю1още, Ишуегайу о! Сйеи! К.Ь. Ьейедаисккйаа! 35, В-9000 Сйеи1, ВЕ Ьу ТкотЬ-Х ои Матсй 29^4Ь, 2005) под инвентарным номером ЬМВР 6399СВ. Настоящее изобретение, далее, относится к линиям клеток, продуцирующим моноклональные антитела, происходящие из моноклонального антитела 16Ό3. Такие линии клеток можно получить модификацией последовательности, кодирующей моноклональное антитело 16Ό3, наиболее конкретно, кодирующей последовательности, кодирующей несвязывающие антиген области 16Ό3. Здесь описаны способы для определения природы модификаций, которые следует получить, и примеры подходящих модификаций.

Второй аспект изобретения относится к антигенсвязывающим молекулам, способным связываться с тем же антигеном, что и антитело 16Ό3. Более конкретно, изобретение относится к антителу, обозначенному 16Ό3, продуцируемому линией клеток 16Ό3, описанной выше, и их гомологам, фрагментам и производным, способным к связыванию с РЮБ и ингибированию активности РЮБ.

Таким образом, конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу против РЮБ человека, моноклональному антителу 16Ό3, как те, которые продуцирует линия клеток ЬМВР 6399СВ, и фрагментам этого антитела. Моноклональное антитело 16Ό3 характеризуется аминокислотной последовательностью вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, как описано в 8ЕС ΙΌ N0:2 и 8Е0 ΙΌ N0:4, соответственно.

Согласно конкретному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к фрагментам, более конкретно, антигенсвязывающим фрагментам антитела 16Ό3. Такие фрагменты включают в себя в качестве неограничивающих примеров БаЬ, БаЬ', Б(аЬ')₂, СЭЯ, пептиды с последовательностью части антитела или его СЭЯ, одиночные вариабельные домены и их сочетания. Фрагменты БаЬ, БаЬ' и Б(аЬ')₂ можно получить протеолитическим расщеплением моноклональных антител с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как описанные в 81аттог111 е1 а1., НаийЬоок о! ЕхрептегИа1 1ттиио1оду (1978), уо1. 1 сйар1ег 8 (В1аскхте11 8с1еи1Шс РиЫюайоиз). Такие фрагменты, которые сохраняют способность связываться с антигеном, утратили ряд свойств родительских антител, таких как активация комплемента или способность связываться с рецепторами Бс-гамма. Более конкретно, настоящее изобретение относится к фрагментам, содержащим вариабельные области тяжелых и легких цепей 16Ό3, соответствующих 8Е0 ΙΌ N0:2 и 8Е0 ΙΌ NΟ:4,-соответственно. Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к фрагментам, содержащим определяющие комплементарность области (СЭЯ) 16Ό3 и их производные. Два чаще всего используемых способа идентификации СЭЯ представляют собой 1МСТ и КАВАТ, и фрагменты, содержащие более одной СОЯ любого типа из 16Ό3, предусмотрены в контексте изобретения, а также производные 16Ό3, содержащие эти фрагменты или СЭЯ. Согласно идентификации СЭЯ с помощью 1МСТ, области СЭЯ внутри вариабельных областей 16Ό3 соответствуют 8Е0 ΙΌ N0:17 (СУТБТЭУУ), 8Е0 ΙΌ N0:18 (1УРС8СКТ), 8Е0 ΙΌ N0:19 (УЯП8РББЭУ), 8Е0 ΙΌ N0:20 (О8ЕЕХ8СМЯК8Е), 8Е0 ΙΌ N0:21 (УА8) и 8Е0 ΙΌ N0:22 (К08УНЬБТ). Таким образом, настоящее изобретение относится к фрагментам антитела 16Ό3, содержащим одну или несколько СЭЯ 16Ό3, как представлено на 8Е0 ΙΌ Х0:17-8ЕС ΙΌ N0:22.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к фрагментам 16Ό3, которые являются растворимыми или заякоренными в мембране одноцепочечными вариабельными частями 16Ό3. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (ксБу) является генетически сконструированным фрагментом антитела, который обычно состоит из вариабельной тяжелой цепи (УН) и легкой цепи (УБ) иммуноглобулина, или его частей, соединенных вместе гибким пептидным линкером. Необязательно, ксБу содержат области СЭЯ антитела, представляющего интерес и каркасные области другого антитела. Аминокислотная последовательность областей каркаса ксБу и/или СЭЯ, необязательно гуманизирована для снижения антигенности для применения в качестве лекарственного средства у людей. Изобретение относится к ксБу 16Ό3 и его гуманизированной версии, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:24 и 8Е0 ΙΌ N0:26, соответственно. Способы получения одноцепочечных вариабельных частей антител известны специалисту и описаны здесь в примере 6. Например, способ может включать амплификацию последовательностей ДНК вариабельных частей тяжелых и легких цепей человека в отдельных реакциях и клонирование с последующей вставкой линкерной последовательности из пятнадцати аминокислот, например (С1у4 8ет)3, между УН и УЪ с помощью двустадийной полимеразной цепной реакции (РСЯ) (см., например, П1ейеиЬасй аий ЭуеЫег, РСЯ Рптег, а 1аЬота1оту таииа1 (1995), Со1й 8ртшд НатЬоит Рге§8, Р1аш\зе\\·, ИУ, И8А). Полученный фрагмент можно затем вставить в подходящий вектор для экспрессии одноцепочечного вариабельного фрагмента в виде растворимого или экспонированного на фаге полипептида. Этого можно достичь способами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как описано в С1Ш1аий е1

- 7 013970 а1., Т188ие Лпйдепз (1996). 47:1-20.

Настоящее изобретение также относится к фрагментам 16Ό3, которые являются антигенсвязывающими пептидами, характерными для гипервариабельных областей антитела 16Ό3 или их сочетаний. Такие пептиды можно получить синтезом с использованием прикладного синтезатора биосистем, например, синтезатора полипептидов, такого как модель 9050, доступная от МтШдеп (И8Л) или модель сходного уровня техники.

Другой вариант осуществления изобретения относится к производным антитела 16Ό3 или их фрагментам. Более конкретно, изобретение относится к антителам, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, как показано на 8ЕО ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4, соответственно, но константные области которых отличаются от константных областей 16Ό3. Дополнительно или альтернативно, производные антитела 16Ό3 по настоящему изобретению содержат,, по меньшей мере, две СИЯ 16Ό3, как представлено на 8ЕО ГО N0:17 (ΟΥΤΕΤΌΥΥ) , 8ЕО ГО N0:18 (ΙΥΡΟ8ΟΝΤ), 8ЕО ГО N0:19 (νΚΌδΡΕΕΌΥ), 8ЕО ГО N0:20 (рЗЬЬ^бМЯКЗЕ), 8ЕО ГО N0:21 (№А8) и 8ЕО ГО N0:22 (КОБУНБЕТ). в то время как каркасные области между СИЯ и/или константные области отличаются.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения производные антитела 16Ό3 или их фрагменты предоставлены обладающими по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с вариабельной областью тяжелой и легкой цепи 16Ό3, представленной на 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4, соответственно. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к производным антитела 16Ό3 или его фрагментам, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и/или область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности к 8Е0 ГО N0:2 и 8Е0 ГО N0:4, соответственно, в пределах области СИЯ. Идентичность последовательности внутри каркасных областей может составлять, без ограничения, менее 80%. Также предусмотрены производные, содержащие по меньшей мере две СЭЯ, которые обладают по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с последовательностями 8Е0 ГО N0:17-22, соответственно.

Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к производному 8сЕу 16Ό3, содержащему последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с 8Е0 ГО N0:24, и последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с 8Е0 ГО N0:26, наиболее конкретно внутри области СЭЯ.

Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к производным 16Ό3 или их фрагментам, которые являются гуманизированными. Такие гуманизированные производные 16Ό3 являются гомологами в том, что они сохраняют аффинность связывания с Р10Е. Согласно конкретному варианту осуществления гуманизированные производные 16Ό3 также сохраняют способность ингибировать активность Р10Е. Гуманизации антител, не относящихся к человеку, достигают заменой одной или нескольких аминокислот в остове антитела, т.е. тех аминокислот, которые не вовлечены в связывание антитела с антигеном, чтобы иметь большее сходство с остовом антитела человека. Предусмотрены разные типы или уровни гуманизации. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к антителам или фрагментам, в которых целые области, более конкретно, константная(ые) область(и) антитела, не относящегося к человеку, или фрагмента заменена(ы) константной(ыми) областью(ями) антитела человека для того, чтобы получить химерные (например, человеческие/мышиные) антитела или фрагменты. Другие конкретные варианты осуществления являются антителами, в которых антигенсвязывающие аминокислоты (например, две или более СИЯ) антитела против РЮЕ, не относящегося к человеку, введены в остов антитела человека (например, СЭЕ-привитые антитела). Способы соединения области, определяющей комплементарность связывания (СИЯ), из не относящегося к человеку моноклонального антитела с каркасными областями человека, в частности, константной С-областью гена человека - известны специалисту, как, например, описанные 1опез е1 а1. в №1ите (1986) 321:522 или Я1ес1тапп в N11иге (1988) 332:323. Альтернативно, также предусмотрена замена более ограниченного количества аминокислот не относящихся к человеку анти-РЮЕ антител по изобретению. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к антителам, содержащим гуманизированные вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи фиг. 9, или их частям и антителам, содержащим по меньшей мере две, более конкретно, три-пять, наиболее конкретно, все шесть СИЯ 8Е0 ГО N0:17-8Е^ ГО N0:22. Другие варианты осуществления изобретения относятся к гуманизированным антителам, содержащим вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с 8Е0 ГО N0:6 и 8Е0 ГО N0:8, соответственно. Альтернативно, настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, содержащим по меньшей мере две, более конкретно,

- 8 013970 три-пять, наиболее конкретно, шесть СЭЕ. обладающих по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере, 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с 8ЕО ΙΌ N0:17-22, соответственно.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к. гуманизированным и/или химерным или гибридным антителам, полученным из мышиного антитела 16Ό3. В конкретном варианте осуществления конкретные аминокислоты мышиного антитела 16Ό3 изменены мутацией для удаления иммуногенных аминокислот. Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, содержащим аминокислотную последовательность вариабельной части тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, где изменены одна или несколько из следующих аминокислот: 12У, Р9А, К40А и/или Т111И. Дополнительно или альтернативно, гуманизированные антитела, полученные из антитела 16Ό3, являются антигенсвязывающими молекулами, содержащими аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:4, где изменены, одна или несколько из следующих аминокислот: 85Т, 89Ό, Α15^. К18Я, Ε22Ν и/или Е89У. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления, изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, содержащим как аминокислотную последовательность вариабельной части тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, где изменены одна или несколько из следующих аминокислот: 12У, Р9А, К40А и/или Т11Ш, так и аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0:4, где изменены одна или несколько из следующих аминокислот: 85Т, 89Ό, Α15^. К18Я, Κ.22N и/или Е89У.

В другом варианте осуществления антитело является дополнительно гуманизированным в том, что (гуманизированные) вариабельные легкая и/или тяжелая цепи мышиного антитела 16Ό3 встроены в каркас иммуноглобулина человека или соединены с константной областью антитела человека, более конкретно, с константной областью 1дС человека. В частности, подходящими в связи с этим 1дО являются 1§С1к (1дО1-каппа), которые способны активировать естественные киллерные клетки в организме. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение, таким образом, относится к гибридным Ни16Э3 - 1дС1К. Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения является гибридными Ни16Э3 - гибридными 1дО4к. 1дО-антитела человека (и, таким образом, также гибридные антитела, полученные с использованием остова и/или константных областей 1дО человека) обладают увеличенным временем полужизни, таким образом, обеспечивая очень стабильные уровни в плазме и давая возможность существенно уменьшить частоту введения. Далее, применение гуманизированных антител или производных несет минимальный риск вызывания иммунных ответов.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антигенсвязывающим молекулам, которые гомологичны антителу 16Ό3 или их фрагментам, т.е. антигенсвязывающим молекулам, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело 16Ό3. В одном из вариантов осуществления гомологичные антигенсвязывающие молекулы получают специально иммунизацией животных, более конкретно, мыши, например, инъекцией РЮР мышам и затем слиянием лимфоцитов селезенки с линией клеток миеломы мыши, с последующей идентификацией культур клеток, продуцирующих анти-Р10Р антитела (например, скринингом на связывание с РЮР), и их клонированием. Необязательно, дальнейшую селекцию антител осуществляют на основе реактивности по отношению к эпитопу для 16Ό3, или конкуренции с антителом 16Ό3 или его фрагментом.

Еще один аспект изобретения, таким образом, относится к способам получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Эти способы включают в себя в качестве неограничивающих примеров способы гуманизации антитела 16Ό3, как представлено здесь в разделе примеров.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к предоставлению нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, наиболее конкретно, их антигенсвязывающие области. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к нуклеотидным последовательностям, кодирующим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, определяемыми 8Е0 ΙΌ N0:2 и 8Е0 ΙΌ N0:4, соответственно, как, например, в качестве неограничивающих примеров, нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:3, соответствующие последовательностям линии клеток 16Ό3, кодирующим область тяжелой и легкой цепей антитела 16Ό3. Также в контексте настоящего изобретения представлены нуклеотидные последовательности, которые кодируют одну или несколько областей СЭЯ моноклонального антитела 16Ό3, как идентифицированные на 8Е0 ΙΌ N0:17-22. Конкретные варианты осуществления изобретения включают последовательность, кодирующую 5сЕу и гуманизированный 5сЕу 16Ό3, как, например, в качестве неограничивающих примеров, 8Е0 ΙΌ N0:23 и 8Е0 ΙΌ N0:25, соответственно. Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим описанные здесь производные 16Ό3 и их фрагменты. Настоящее изобретение также относится к зондам и праймерам, способным специфически гибридизоваться с указанными выше нуклеотидными последовательностями, как, например, в качестве неограничивающих примеров, праймерам, описанным в разделе примеров.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые комплементарны последовательностям, кодирующим описанные здесь моноклональные антитела, их фрагменты или производные.

- 9 013970

Еще один аспект настоящего изобретения относится к терапевтическому применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства. В этом отношении, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим одну или несколько антигенсвязывающих молекул по изобретению, для профилактики или лечения заболеваний или расстройств, в которых ангиогенез вносит вклад в патологию заболевания или расстройства. Следовательно, способы лечения и/или профилактики заболеваний, в которых ангиогенез вносит вклад в патологию заболевания или расстройства, включают введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей одну или несколько описанных здесь антигенсвязывающих молекул.

При таких заболеваниях ангиогенез также обозначают как патологический ангиогенез. Примеры такого патологического ангиогенеза включают ангиогенез, наблюдаемый при патологии кровеносных сосудов (атеросклероз, гемангиома, гемангиоэндотелиома), кости и суставов (ревматоидный артрит, синовиит, костно-хрящевая деструкция, остеомиелит, образование паннуса, образование остеофитов, новообразования и метастазы), кожи (бородавки, пиогенные гранулемы, рост волос, саркома Капоши, келоидные рубцы, аллергический отек, новообразования), печени, почек, легких, уха и других эпителиев (воспалительные и инфекционные процессы, включая гепатит, гломерулонефрит, пневмонию, астму, назальные полипы, отит и трансплантацию, регенерация, новообразования и метастазы в этих органах), при определенных патологиях матки, яичника и плаценты (дисфункциональное маточное кровотечение, например, вследствие внутриматочных противозачаточных устройств, образования фолликулярных кист, синдрома гиперстимуляции яичников, эндометриоза, новообразований), патологий мозга или нервов (новообразования и метастазы), определенных повреждений сердечной и скелетной мускулатуры (например, вследствие работы с перегрузкой), патологических состояний жировой ткани (ожирение) и эндокринных органов (тиреоидит, увеличение щитовидной железы, пересадка поджелудочной железы).

Патологический ангиогенез может также вносить вклад в заболевания гематопоэза (СПИД, саркома Капоши), гематологические опухоли (лейкозы и т.п.).

При ряде заболеваний глаза патологический ангиогенез, как предполагают, является важным фактором, и, таким образом, предусмотрено лечение антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению. При «ишемических заболеваниях сетчатки» снижено снабжение сетчатки кровью и кислородом, периферические части сетчатки утрачивают источник питания и перестают нормально функционировать. Общими причинами ретинопатии являются окклюзия центральных вен сетчатки, стеноз сонной артерии, диабет (диабетическая ретинопатия) и анемия (серповидноклеточная ретинопатия). Ретинопатию также наблюдают у недоношенных детей (ретролентальная фиброплазия).

Диабетическая ретинопатия является главной причиной потери зрения у пациентов с диабетом. В ишемизированной сетчатке происходит образование новых кровеносных сосудов (неоваскуляризация). Эти сосуды часто образуются на поверхности сетчатки, у зрительного нерва или в передней части глаза на радужной оболочке. Новые сосуды не могут восстановить приток необходимых питательных веществ и, вместо этого, могут вызывать множество проблем, таких как кровоизлияние в стекловидное тело, отслоение сетчатки и неконтролируемая глаукома. Эти проблемы возникают вследствие того, что новые сосуды являются ломкими и склонными к кровотечению. При обнаружении на начальных стадиях пролиферативную диабетическую ретинопатию можно иногда остановить панретинальной фотокоагуляцией. Однако в некоторых случаях хирургическая витрэктомия является единственным средством выбора. Другие заболевания глаза, при которых ангиогенез, как предполагают, играет ключевую роль, представляют собой хориоидальные и другие внутриглазные расстройства, лейкомаляцию и новообразования, и метастазы. Хориоидальная неоваскуляризация представляет собой образование новых кровеносных сосудов, которые прорастают из сосудистой оболочки через разрыв мембраны Бруха в пигментный эпителий сетчатки (киЬ-КРЕ) или субретинальное пространство.

Локализация, характер роста и тип (1 или 2) СИУ зависят от возраста пациента и лежащего в основе заболевания. Кровотечение и образование экссудата происходят при дальнейшем росте, являясь причиной зрительных симптомов. Хориоидальная неоваскуляризация (СИУ) является главной причиной потери зрения. Подсчитано, что СИУ возникает в 5-10% близорукости и возникает практически при всех перфорациях сосудистой оболочки в ходе фазы излечения; большинство проходят спонтанно, но у 1530% пациентов СИУ может рецидивировать и приводить к геморрагическому или серозному отслоению желтого пятна с сопутствующей потерей зрения.

Термин «легочная гипертензия» относится к расстройству, при котором кровяное давление в легочных артериях является патологически высоким. В отсутствие других заболеваний сердца или легких ее называют первичной легочной гипертензией. Диффузное сужение легочных артериол возникает в результате патологического артериогенеза с последующей легочной гипертензией в качестве реакции на повышенное сопротивление кровотоку. Частота возникновения составляет 8 на 100000 человек. Однако легочная гипертензия может также возникать как осложнение хронических обструктивных заболеваний легких (СОРЭ), таких как эмфизема, хронический бронхит или диффузный интерстициальный фиброз, и у пациентов с астматическим СОРЭ. Частота возникновения СОРЭ составляет приблизительно 5 на

- 10 013970

10000 человек.

Еще одним примером заболевания, при котором ангиогенез вносит вклад в патологию заболевания и при котором предусмотрено лечение антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению, является группа воспалительных расстройств. Воспаление, как применяют здесь, означает местную неконтролируемую реакцию на повреждение (т.е. физическое, химическое или в результате инфекции) живых тканей, особенно местную реакцию небольших кровеносных сосудов, их содержимого и связанных с ними структур. Прохождение компонентов крови через стенки сосудов в ткани является отличительным признаком воспаления, и таким образом образующееся скопление в ткани называют экссудатом или отеком. Любой патологический процесс, который повреждает живую ткань, как, например, в качестве неограничивающих примеров, инфекция бактериями, перегрев, холод, механическое повреждение, такое как размозжение, кислоты, щелочи, излучение или инфекция вирусами может вызывать воспаление безотносительно к вовлеченному органу или ткани. Такие «воспалительные заболевания» включают реакции, варьирующие от ожогов до пневмонии, проказы, туберкулеза и ревматоидного артрита.

Образование спаек после операции (РОА) является частым хирургическим осложнением в гинекологической, тазовой и кардиологической хирургии. Хирургическое повреждение тканей часто вызывает образование постоянного рубца, который соединяет поврежденную ткань с другим органом. Таким образом, на месте такого повреждения внутренние ткани, которые в норме остаются разделенными, часто становятся соединенными друг с другом. Осложнения, возникающие в результате образования спаек, представляют собой непроходимость кишечника, непроходимость тонкой кишки, хроническую тазовую боль и бесплодие у женщин. Термин образование спаек в медицинском смысле относится к срастанию, процессу плотного соединения или объединения двух поверхностей или частей, например, объединение противоположных поверхностей раны или противоположных поверхностей брюшины. Также спайки во множественном числе, могут обозначать воспаленные связки, которые соединяют противоположные серозные поверхности. Термин спайка, как применяют здесь, также включает фибринозные спайки, которые представляют собой спайки, которые состоят из тонких нитей фибрина, возникающих из экссудата плазмы или лимфы, или экстравазации крови. Келоид, гладкое разрастание фибробластной ткани, которая возникает в области повреждения или иногда спонтанно, является также формой спайки. Показано, что ингибирование плацентарного фактора роста (Р1СЕ) приводит к примечательному подавлению постоперативного образования спаек (^003063904).

Более того, показано, что ингибирование Р10Е может оказывать благоприятное действие (\ЕО2004002524) при заболеваниях, отличающихся резорбцией кости, как, например, в качестве неограничивающих примеров, остеопороз.

Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, в особенности, подходят для лечения и/или профилактики роста опухоли и метастазов, заболеваний глаза, воспаления, образования спаек и легочной гипертензии.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения рака, такого как, в качестве неограничивающих примеров, рака молочной железы, легкого, предстательной железы, мозга, печени, поджелудочной железы, толстой кишки, почки, матки или костного мозга. Более конкретно, изобретение относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения солидных опухолей, таких как, в качестве неограничивающих примеров, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланом. Более конкретно, здесь представлены данные, которые показывают, что антитела по настоящему изобретению, в особенности, подходят для получения регрессии опухолей поджелудочной железы человека. Показано, что антитела по настоящему изобретению значительно уменьшают размер опухоли ίη νίνο; таким образом, показаны уменьшения размера вплоть до приблизительно 50%. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям для уменьшения размера опухоли по меньшей мере на 20%, более конкретно, по меньшей мере на 30%, наиболее конкретно, по меньшей мере на 50%.

Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в лечении или профилактике костных расстройств и, более конкретно, для лечения состояний, при которых происходит усиленная резорбция кости, такая как, например, остеопороз или остеомаляция.

Следовательно, настоящее изобретение относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения вышеупомянутых заболеваний.

Важный аспект настоящего изобретения состоит в том, что антитела, их фрагменты и производные дают возможность лечения и/или профилактики вышеупомянутых заболеваний без побочных эффектов, относимых на счет или ожидаемых от других антиангиогенных способов лечения, более конкретно, альтернативных способов лечения с использованием ангиогенных факторов, таких как УЕСЕ. Доклинические безопасные испытания рекомбинантных человеческих антител анти-УЕСЕ показали, еще в 1999, что ингибирование УЕСЕ приводит к ингибированию физиологического ангиогенеза, более конкретно, не

- 11 013970 оваскуляризации при росте костей в длину и формировании желтых тел (Куап е! а1., 1999 Τοχίοοίο^ίο ра11ю1оду 27(1):78-86) . В последних исследованиях описывают, что ингибиторы УЕСЕ вызывают регрессию сосудов в здоровой трахее и щитовидных железах, которая может приводить к органной дисфункции (Вайей е! а1., 2004 С1гс Кек 94:984-992; 1па1 е! а1., 2004 Ат. 1. Ра11ю1. 165:35-52) . Тем не менее, бевацизумаб, антитела против УЕСЕ человека, в настоящее время находится на рынке в качестве супрессора ангиогенеза, несмотря на наблюдаемые для него эффекты на заживление ран, кровяное давление и риск тромбоза, вследствие общей эффективности данного антиангиогенного способа регрессии опухолей. Антитела анти-Р1СЕ и производные по настоящему изобретению позволяют ингибировать нежелательный ангиогенез без этих наблюдаемых побочных эффектов на кровяное давление, заживление ран, риск тромбоза и регрессию сосудов в здоровых органах.

Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим, в качестве активного ингредиента, моноклональное антитело 16Ό3 или его фрагмент или производное, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит терапевтически эффективное количество одной или нескольких антигенсвязывающих молекул. Сходным образом, настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики, которые включают введение терапевтически эффективного количества одной или нескольких антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению.

Терапевтически эффективное количество, как применяют здесь, означает количество в диапазоне от приблизительно 0,5 мг на килограмм массы тела (мг/кг) до приблизительно 50 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг млекопитающего, подлежащего лечению. Следует принимать во внимание, что ввиду большого времени полужизни большинства человеческих антител 1дС антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, которые являются моноклональными антителами данного класса, обеспечат периодичность лечения, что вносит вклад в удобство для пациента.

Согласно еще одному аспекту изобретения предоставлены фармацевтические композиции, которые содержат антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению и другое антиангиогенное средство, а также способы лечения, включающие одновременное или последовательное введение антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и другого антиангиогенного средства. Действительно, для настоящего изобретения показан аддитивный эффект антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и других антиангиогенных средств, таких как антитела анти-УЕСЕ, на ингибирование роста опухоли. Более конкретно, показано, что сочетанное применение антитела 16Ό3 по настоящему изобретению и Ауак1т способно уменьшить размер опухоли вплоть до приблизительно 70%, в то время как повышенные дозировки или одного Ауакйп®, или анти-Р1СЕ антител не приводят к уменьшению размера опухоли более чем на 55% в тех же условиях. Другие подходящие антиангиогенные средства, а также их обычная дозировка в зависимости от класса, к которому они принадлежат, хорошо известны специалистам в данной области. Примеры антиангиогенных средств включают ингибиторы УЕСЕ, действующие непосредственно на УЕСЕ, такие как антитела, направленные против УЕСЕ, продаваемые под названием Ауакйп™, или действующие на рецепторы УЕСЕ. Антитела по настоящему изобретению дают возможность снизить дозировку, например, ингибирующих УЕСЕ антиангиогенных средств, о которых известно, что они вызывает ряд побочных эффектов, как описано выше.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать терапевтически эффективное количество других соединений/лекарственных средств, действующих на заболевание, подлежащее лечению, более конкретно, других соединений/лекарственных средств, эффективных при лечении роста опухоли, воспаления, заболеваний глаза и легочной гипертензии.

Подходящие фармацевтические носители для применения в фармацевтических композициях по изобретению описаны, например, в КеттДоп'к Рйагтасеийса1 Баепсек 16¹¹' еб. (1980), и их состав хорошо известен специалистам в данной области. Они включают все без исключения растворители, дисперсные среды, вещества для покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические вещества (такие как сахара или хлорид натрия) и т. п. Дополнительные ингредиенты можно включать для контроля продолжительности действия активного ингредиента моноклональных антител в композиции. Композиции с контролируемым высвобождением можно, таким образом, получать отбором подходящих полимерных носителей, таких как, например, сложные полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон, сополимеры этилен-винилацетата, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, сульфат протамина и т.п. Скорость высвобождения лекарственного средства и продолжительность действия можно также контролировать включением активного ингредиента моноклональных антител в частицы, например, микрокапсулы, из полимерного вещества, такого как гидрогели, полимолочная кислота, гидроксиметилцеллюлоза, полиметилметакрилат и другие вышеописанные полимеры. Такие способы включают системы доставки коллоидного лекарственного средства, такие как липосомы, микросферы, микроэмульсии, наночастицы, нанокапсулы и т. д. В зависимости от способа введения для фармацевтической композиции, содержащей активный ингредиент, могут потребоваться защитные покрытия. Фармацевтическая форма, пригодная для инъекционного примене

- 12 013970 ния, включает стерильные водные растворы или коллоидные растворы и стерильные порошки для ее экстратемпорального приготовления. Типичные носители, таким образом, включают биосовместимые водные буферы, этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и их смеси.

Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению можно вводить пациенту любыми способами, которые хорошо известны в данной области, т.е. перорально, интраназально, подкожно, внутримышечно, внутрикожно, внутривенно, внутриартериально, парентерально или через катетер.

Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению вводят с помощью генотерапии. Основанная на антителах генотерапия дает возможность преодолеть ряд потенциальных ограничений, связанных с введением антител, как например, крупномасштабное производство, биораспределение, быстрый клиренс крови и плохое удерживание моновалентных антител. Выработка ίη νίνο делает антитела менее иммуногенными и лучше переносимыми и дает эффективные и устойчивые уровни антигенсвязывающих молекул или их фрагментов. Более того, генетические способы дают возможность предоставить антигенсвязывающие молекулы с новыми функциями. Возможность выработки ίη νίνο и системной доставки моноклональных антител разными клетками/тканями показали с использованием переноса генов ίη νίνο вирусными векторами (Ре1едг1п с1 а1., 2004, Сепе Т11ег 4:347-356). Также показано уменьшение роста опухоли ίη νίίτο и ίη νίνο генной модификацией клеток фибросаркомы с помощью антител к ламинину с антиангиогенной активностью (8;·ιηζ е1 а1., 2001, Самсег Iттиηο1. ИптшюШег 50:557-565).

Таким образом, согласно этому варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеотидам, кодирующим антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в генотерапии при лечении заболеваний, отличающихся описанным здесь патологическим ангиогенезом. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи, определяемую 8ЕО ΙΌ N0:2, и/или нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область легкой цепи, определяемую 8Е0 ΙΌ N0:4, для применения в генотерапии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1 и/или 8Е0 ΙΌ N0:3, соответствующую последовательностям линии клеток 16Ό3, кодирующим область тяжелой и легкой цепей антитела 16Ό3. Также в контексте настоящего изобретения предоставлены композиции, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют одну или несколько областей СЭЯ моноклональных антител 16Ό3, как идентифицированные на 8Е0 ΙΌ N0:17-22. Конкретные варианты осуществления изобретения включают последовательность, кодирующую δοΕν и гуманизированный κοΕν 16Ό3, такую как, в качестве неограничивающих примеров, 8Е0 ΙΌ N0:23 и 8Е0 ΙΌ N0:25, соответственно.

Способ лечения и/или профилактики согласно изобретению может включать далее лечение или профилактику такого же состояния патологического ангиогенеза введением, предпочтительно последовательным введением пациенту терапевтически эффективного количества антиангиогенного или противоопухолевого средства, такого как вышеописанное, под заголовком фармацевтических композиций. «Последовательно», как применяют здесь, означает, что лиганд по настоящему изобретению и известное антиангиогенное средство вводят пациенту последовательно, а не одновременно.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по изобретению для иммунологического детектирования Р1СЕ в образцах из человека и в качестве компонентов наборов, пригодных для такого детектирования. Способы иммунологического детектирования антигена известны в данной области и включают в себя в качестве неограничивающих примеров ΞΙΑ. ЕЫ8А и Κ.ΙΑ, и иммуногистохимические способы. Связывание мышиных антител по настоящему изобретению с антигеном Р1СЕ можно детектировать опосредованно, например, с помощью меченых антител против мыши. Альтернативно, антитела или их фрагменты можно метить непосредственно. Конкретный вариант осуществления этого аспекта изобретения относится к применению антител против Р1СЕ и их антигенсвязывающих фрагментов в выявлении пациентов, восприимчивых к лечению с помощью анти-Р1СЕ. Это представляет особенный интерес при лечении рака.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в качестве диагностического средства. Показано в данной области, что в ряде патологических состояний усилена экспрессия Р1СЕ. Более конкретно, для ряда опухолей показана сверхэкспрессия Р1СЕ. Гуманизированные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению можно применять в диагностике этих патологических состояний, например, способами визуализации, в которых антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению метят и визуализируют ίη νίνο. В данной области известно множество меток для визуализации связывания антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению ίη νίνο, и они включают в себя в качестве неограничивающих примеров оптические (например, флуоресцентные), металлические и магнитные метки, для каждой из которых требуются специфические (радиация и) устройства для детектирования. Конкретный вариант осуществления этого аспекта изобретения относится к применению антител по изобретению в предсказании прогноза заболевания и выборе принятого лечения.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в моделях на животных при скрининге соединений для применения в соче

- 13 013970 тании с лечением анти-Р1СЕ. Такие модели включают в себя в качестве неограничивающих примеров модели опухолей, где исследуют рост и развитие опухолевых клеток человека на мышах пи/пи. Сочетанное введение соединения, подлежащего тестированию, и антител или фрагмента по настоящему изобретению дает возможность определить, обладает ли соединение аддитивным эффектом по сравнению с эффектом, наблюдаемым при введении одних антител или фрагментов по изобретению. Также, таким образом можно определить другие аспекты, такие как обратная эффективность или токсичность соединения в сочетании с антителами анти-РЮЕ.

Кроме описанного выше терапевтического применения, нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению, описанные выше, применимы в получении антител и других антигенсвязывающих фрагментов, например, рекомбинантными способами. Таким образом, настоящее изобретение далее относится к способам получения рекомбинантных антител и фрагментов антител, включая клонирование и манипуляцию с генами антител, получение 8сЕу и других антигенсвязывающих фрагментов с использованием описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Описание этих способов доступно в данной области. Кроме того, зонды, специфически гибридизующиеся с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению, можно применять для скрининга на экспрессию антител и фрагментов антител по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение далее описано с помощью следующих примеров, которые приведены только с иллюстративными целями.

Примеры

Пример 1. Получение и характеризация мышиных антител против РЮЕ человека (16Ό3)

1. Иммунизация мышей и слияние

Моноклональные антитела против РЮЕ человека получали по существу, как описано в Сайте апй МЮЮп (Сайте Е., М11к!еш С. Ртератайоп о£ топос1опа1 апйЬоФек: 81га1ец1ез апй ртосейитек. Ме!йой Епхуто1. 1981; 73:3-46). Вкратце, мышей с нокаутом Р1СЕ (Бийип е! а1. , 2002, Вюсйет Вюрйук Век. Сотт. 295 (2): 428-34, Сагтейе! е! а1., 2001, Ыа1. Мей. 7:575-593 или \УО 01/857 96) иммунизировали подкожной инъекцией 50 мкг рекомбинантного Р1СЕ-2 человека (продуцированного в РюЫа) в полном адъюванте Фрейнда, две недели спустя иммунизировали подкожной инъекцией 50 мкг рекомбинантного Р1СЕ человека в неполном адъюванте Фрейнда. Образцы крови (приблизительно 100 мкл) отбирали из хвостов . мышей после 10 суток. Сыворотки тестировали на антитела анти-йиРЮЕ посредством ЕЫ8Л с использованием планшетов для микротитрования, покрытых иммобилизованным Р1СЕ человека, использованием разведенных сывороток (от 1/500 до 1/8000) и козьих 1дС против мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (НКР), для мечения.

Спустя промежуток по меньшей мере 6 недель мышей (с высокими положительными ответами) повторно иммунизировали внутрибрюшинно 50 мкг рекомбинантного Р1СЕ человека в солевом растворе на 4 и 2 сутки перед слиянием клеток.

Клетки селезенки выделяли и подвергали слиянию с клетками миеломы 8р2/0-Лд14. После селекции на среде с гипоксантином, аминоптерином, тимидином положительные клоны отбирали с использованием супернатантов культур в ЕЫ8Л, как описано выше.

2. Очистка антител на Рто8ер νΑ ИЙта

Антитела очищали от супернатанта культуры клеток аффинной хроматографией на Рто8ер νΑ ИЙта (Мййроте) согласно описанию производителя. Вкратце, 150 мМ ЫаС1 добавляли к супернатанту и супернатант наносили на колонку Рто8ер νΑ ИЙта, которую предварительно уравновешивали РВ8. Колонку промывали РВ8 и связавшийся белок элюировали 0,1 М глицином рН 2,8. Элюированный белок диализовали ΟΝ против РВ8. Чистоту элюированного белка проверяли в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях посредством 8Э8-РЛСЕ.

3. Связывание 16Э3/йи16Э3 (полученного, как описано в примере 2) с Р1СЕ (см. фиг. 1)

Планшеты для ЕЬ18Л покрывали ΟΝ 1 мкг/мл йиРЮЕ-2 (РюЫа) в РВ8, 100 мкл/лунка, 4°С. После забивки 1% В8Л, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения 16Э3/1ш16Э3. 100 мкл/лунка, антитела оставляли связываться 1 ч, комнатная температура. Связавшиеся 16Ό3 детектировали козьими 1дС-НКР против человека или козьими 1дС-НКР против мыши (81дта), 100 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством ОРИ.

4. Ингибирование связывания Р1СЕ с рецептором йиЕ1!-1 (см. фиг. 2)

Планшеты для ЕЫ8Л покрывали ΟΝ 1 мкг/мл йиЕ1!-1 (К&И 8ук!етк), 200 мкл/лунка, ΟΝ, 4°С. После забивки 1% В8Л, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения 16И3/йи16П3, 100 мкл/лунка, и добавляли дополнительно 100 мкл/лунка йиРЮЕ-2. После инкубации 2 ч при комнатной температуре связавшийся Р1СЕ детектировали козьими анти-йиРЮЕ (К&И 8у8!етк), 180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура, с последующей инкубацией с КЛС-НКР (ΌΑΚΟ), 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством ΟР^.

5. Дальнейшая характеризация 16Ό3 и Еай 16Ό3 в экспериментах с В1асоге

Ингибирование: тйиРЮЕ-2 (РюЫа, ТХ) иммобилизовали на чипе СМ5 с использованием химии ЕИС/ΝΗδ (набор для присоединения аминов, В1асоге), давая 412 КИ. 16Ό3 впрыскивали с последующим впрыскиванием химерного гйиЕ1!-1/Ес (К&И 8ук!етк). Это также осуществляли с буфером вместо мыши

- 14 013970 ных антител. Их также впрыскивали в канал потока для отрицательного контроля, и эти величины уже вычли. Этот анализ осуществляли в фосфатном буфере при рН 9,6.

По сравнению с максимальным связыванием г1шЕ11-1 с гйиР1СБ-2, сигнал г1шЕ11-1 снижен, если сначала впрыскивают 16Ό3 или 16Э3ЕаЬ (фиг. 3).

6. Клонирование и секвенирование вариабельных областей 16Ό3 мыши

Выделение мРНК: мРНК гибридомных клеток 16Ό3 выделяли с использованием ОшскРгер™ Мюго ιηΡΝΛ РилйсаДоп Κίΐ (Атегзкат Вюзаепсез). Эту мРНК использовали для получения кДНК с использованием Б1Г81-81гапД с^NΑ 8упШе818 Κίΐ (ЛтегзИат Вюзшепсез) с праймера ρά(Ν)₆, присутствующего в наборе.

РСК: Последовательности вариабельных частей тяжелой и легкой цепи получили с помощью РСК с набора праймеров: 8 праймеров, начинающихся в лидерной последовательности, и 2 в константной области тяжелой цепи, 11 праймеров, начинающихся в лидерной последовательности, и 1 в константной области легкой цепи. Осуществляли 8 и 11 реакций РСК с разными сочетаниями праймеров.

Праймеры, используемые для тяжелой цепи антитела 16Ό3: МНУК35'-АТС СКА ТСС АСС ТСЕ АТС АТТ НТС-3' (8ЕО ГО N0:9) МНСК15'-СА8 АУМ САС ССС ССА СТС САТ АСА С-3' (8ЕО ГО N0:10)

Праймеры, используемые для легкой цеши антитела 16Ό3: МКУН35'-АТС КАС ТСА САК АСУ САС СТС ТТУ КТА-3' (8Ер ГО N0:11) МКСК15'-ССТ САС ТСС АТС СТС ССА АСА ТСС-3' (8ЕО ГО N0:12)

Протокол РСК: денатурация 10 мин 94°С, денатурация 30 с 94°С, отжиг 30 с 55°С, элонгация 1 мин 72°С, элонгация 5 мин 72°С, количество циклов 30.

Вырожденность последовательности 8Е0 ГО N0:9-11 указана с использованием общепринятых сокращений К=А или С, К=С или Т, А=А или Т, Н=А или С или Т, 8=С или С, У=С или Т, М=А или С.

Клонирование и секвенирование: продукты РСК наносили на агарозный гель, правильные полосы отбирали, очищали (01Ас.|шск* Се1 Ехйасйоп к11. 01адеп СтЬН) и клонировали в вектор рСК®4В1ип1Т0Р0®, поставляемый в 2его В1ип1® ТОРО® РСК С1ошпд Κίΐ Гог Зедиепсшд (1пу|1годеп™ 1йе 1ес11по1още8). Плазмидную ДНК получали с использованием Нщ11 Риге Р1азт1Д ЕокШоп Κίΐ (Коске О|адпо511с5 СтЬН), и вставки секвенировали с использованием обратных праймеров Т7 и М13 на АВ1 РК18М™ 310 (РЕ АррйеД Вю8у81ет8).

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела 16Ό3 показаны на 8Е0 ГО N0:1, 2, 3 и 4 (см. фиг. 11).

Пример 2. Получение и характеризация гуманизированных антител против Р1СБ человека (16Ό3)

1. Конструирование гуманизированных 16Ό3

Гуманизация вариабельных областей

Мутации: Получены следующие мутации для гуманизации вариабельных частей мышиного антитела 16Ό3:

Тяжелая цепь: Ι2Υ

Р9А

К4 0А

Т1иь

Легкая цепь: 35Т

39Ό

А15Ь

К18К

Κ22Ν

Ь89У

Мутации получены с использованием ОшскСйапде' Ми1П 8НеГО|гес1еД МШадепеАх Κίΐ (81га1адепе'‘). В 1 РСК могли использовать от 1 до 5 праймеров, содержащих мутации. После трансформации колонии отбирали, и ДНК секвенировали для определения клона с наибольшим количеством точечных мутаций. Этот клон отбирали для повторения этой процедуры до получения всех мутаций в последовательности.

Соединение вариабельных областей с константной областью 1дС человека:

С помощью РСК получили гуманизированные вариабельные части тяжелой и легкой цепей, к которым добавили подходящие участки рестрикции.

Праймеры для вариабельной части легкой цепи:

Праймер 1:5'-ССАССССТ САС АТТ СТС СТС АСС САС ТСТ СС-3' (8ЕО ГО N0:13)

Праймер 2:5'-САСССТАССТТТТАТ ТТС САА СТТ ТСТ ССС ССА С-3' (8ЕО ГО N0:14)

- 15 013970

Праймеры для вариабельной части тяжелой цепи:

Праймер 3:5'-САС СТС САС СТС САС САС ТСТ С-3' (8ЕС) ΙΌ N0:15)

Праймер 4:5'-САТССССССТТССТССАССС ТСА ССА САС ТСТ САС САС СС-3' (8 ЕС) ΙΌ N0:16)

Протокол РСК: денатурация 5 мин 94°С, денатурация 30 с 94°С, отжиг 30 с 60°С, элонгация 30 с 72°С, элонгация 5 мин 72°С, количество циклов 25.

Продукты РСК наносили на агарозный гель, полосы отбирали и очищали (01Ас.|шек* Се1 Е.хЦасЕоп кй, 01адеп СтЬН). Продукт РСК вариабельной части тяжелой цепи 16Ό3 расщепляли 8а11, вектор рКАИЕ0-МС850-Н1еи-уаг № 24, содержащий полную константную часть тяжелой цепи человеческих антител (1дС4), расщепляли Есо47111 и 8а11 и лигировали. Продукт РСК вариабельной части легкой цепи сначала клонировали в вектор рСК®4В1ип1-Т0Р0®, поставляемый в 2его В1ип1® Т0Р0® РСК С1ошпд Кй Гог 8ес.|иепстд Дпуйгодеп™ ПГе 1ес11по1од1ек). Вариабельную часть легкой цепи отщепляли с помощью Аде1 и Βδί^Ι и клонировали в вектор рКАИЕ0-СМ30-Ь-уаг № 7, который уже содержал константную часть легкой каппа-цепи человека. Оба вектора объединяли в один вектор выщеплением экспрессирующей кассеты легкой цепи из вектора с использованием Рте1 и Рас1 и присоединением ее к вектору, содержащему тяжелую цепь.

Нуклеотидные и аминокислотные: последовательности вариабельных частей тяжелой и легкой цепей гуманизированных антител 16Ό3 представлены на 8Е0 ΙΌ N0:5, 6, 7 и 8 (см. фиг. 12).

2. Кратковременная экспрессия йи16И3

Ни16О3 ΙβΟ4κ кратковременно экспрессировали в клетках НЕК 293 с использованием Ргеек!у1е 293 Ехргеккюп 8ук1ет (Iηνй^οдеη) согласно инструкции производителя. Нц16О3 очищали от супернатанта с использованием аффинной хроматографии на рго8ер уА И11га. Чистоту очищенного 1ш16Э3 проверяли с помощью 8О8-РАСЕ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Ни16О3 далее тестировали на связывание с 1иР1СР и на ингибирование связывания НиР1СР/йиΕ^Т-1 с помощью ЕЫ8А (см. фиг. 1 и 2).

Пример 3. Исследование ш у1уо ингибирования роста опухоли антителами анти-Р1СР

1. Общее описание материалов и методов

Культура клеток

Линии клеток Рапс02 поджелудочной железы мыши и линия клеток ИапС поджелудочной железы человека любезно предоставлены 8. йоке\у|сх (Сйагйе-итуегкйа1:ктей17т Вег1т, Сегтапу). Линии клеток МИА-МВ молочной железы, Ь0У0 толстой кишки и Ме12а меланомы человека получены из Атепсап Туре СиЙиге Со11есйоп (АТСС; Мапаккак, УА, И8А) . Все клетки культивировали согласно рекомендациям. Мышиные антитела 16Ό3 анти-Р1СР использовали для всех экспериментов ш угуо, чтобы избежать иммунного ответа на антитела.

Эксперименты на животных

Все процедуры на животных полностью одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Самок мышей ИМК! пи/пи содержали в полустерильных условиях и, как общепринято, использовали их в возрасте 8-10 недель (приблизительная масса 25 г). Для получения источника опухоли опухолевые клетки обрабатывали трипсином для получения суспензии из одиночных клеток, которую промывали РВ8. Осадок после центрифугирования повторно ресуспендировали в 200 мкл РВ8 и подкожно инъецировали мышам в правый бок. Для ортотопической модели опухоли поджелудочной железы, 1х10⁶ опухолевых клеток в 30 мкл РВ8 инъецировали в головку поджелудочной железы с помощью брюшной лапаротомии самок мышей С57В16 в возрасте 9-10 недель. Перед процедурами мышей анестезировали кетамином (90 мг/кг массы тела) и ксилазином (9 мг/кг массы тела).

Введение лекарственных средств (т.е. антител, носителя и т.п.)

Лечение антителами или носителем, в качестве контроля, начинали при достижении опухолями размера приблизительно 60 мм³. Антитела Р15И11И4 (\У0 01/85796), 16Ό3, 1С8 или носитель вводили в указанных дозах внутрибрюшинно через каждые сутки. Авастин инъецировали в указанных дозах внутрибрюшинно два раза в неделю.

Измерения опухолей

Подкожно растущие опухоли измеряли через каждые сутки с использованием измерительного инструмента, и объемы опухолей вычисляли с использованием формулы р/6 (у1 х у2 х у2), где у1 и у2 представляют собой наибольший и наименьший диаметр опухоли, соответственно. Когда мышей забивали, ортотопически растущие опухоли поджелудочной железы измеряли после брюшной лапаротомии с использованием того же способа.

Статистический анализ

Статистический анализ осуществляли с помощью двустороннего критерия Стьюдента для парных наблюдений с использованием статистического программного обеспечения СгарйРай (СгарйРай 8ойуаге Шс., 8ап-И1едо, СА) . Все данные представлены в виде среднего значения ± 8ЕМ, если не указано иначе. *р<0,5, **р<0,01, если не указано иначе.

- 16 013970

2. Ингибирование роста опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы ЭапС человека мышиными анти-1Р1СЕ антителами 16Ό3

1/10⁶ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΚΙ пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³ начинали лечение с помощью анти-1Р1СЕ (16Ό3, 50 мг/кг массы тела; п=10), анти-тР1СЕ (ΡΕ5Ό11Ό4 (полученных, как описано в \УО01/85796) 50 мг/кг массы тела; п=10), контрольными 1дС (1С8; 50 мг/кг массы тела; п=10), сочетанием анти-1Р1СЕ и анти-тР1СЕ (каждые 25 мг/кг массы тела; п=10) и носителем (п=10). Антитела инъецировали внутрибрюшинно через каждые сутки. (А) Опухоли измеряли через каждые сутки и объем опухолей вычисляли с использованием формулы \М1 /\М2/\М2/р/2, где \М1 представляет собой наибольший и \У2 - наименьший диаметр. (В) Мышей забивали на 18 сутки после инокуляции опухоли, опухоли извлекали и взвешивали. Средний объем опухолей: носитель: 915+90 мм³, 1дС: ±89 мм³, РЬ5О1Ш4: 832±118 мм³, 16Ό3: 521±83 мм³, РЬ5П1Ю4 + 16Ό3: 497±86 мм³.

Результаты, как показано на фиг. 4, показывают, что введение антитела 16Ό3 против Р1СЕ человека обладает отчетливым влиянием на массу и размер опухоли.

3. Анти-1Р1СЕ ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы ЭанС человека дозозависимым образом.

1/10⁶ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΚ.Ι пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³ начинали лечение с помощью анти-1Р1СЕ, 1дС (1С8; 50 мг/кг) , 16Ό3 (50 мг/кг, 37,5 мг/кг, 25 мг/кг, 12,5 мг/кг массы тела; п=10 для каждой концентрации) и носителем (п=10). (В) Мышей забивали на 18 сутки после инокуляции опухоли.

Результаты показаны на фиг. 5. Средний объем опухоли ± 8ЕМ: 16Ό3, 50 мг/кг массы тела: 450±37 мм³; 37,5 мг/кг массы тела: 469±97 мм³; 25 мг/кг массы тела: 493±107 мм³; 12,5 мг/кг массы тела: 6931107 мм³; 1С8: 865±109 мм³; носитель: 889±100 мм³.

4. Анти-1шР1СЕ ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли молочной железы ΜΌΑ-МВ человека.

1/10⁷ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΒΙ пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³, начинали лечение с помощью анти-ЬР1СЕ, 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10) и носителем (п=10).

Результаты показаны на фиг. 6 (и в табл. 1 ниже).

Таблица 1

	Среднее значение	ЗЕМ	N	Р-значение
Масса опухоли для РВЗ	1086	154,1	10
Масса опухоли для 1603	586,6	71,89	10	0,0088
Размер опухоли для РВЗ	991,5	160, 8	10
Размер опухоли для 16Ό3	485,9	65,76	10	0,0091

5. Анти-1шР1СЕ ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли толстой кишки ЬОУО человека.

1/10⁷ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΒΙ пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³ начинали лечение с помощью анти-ЬР1СЕ, 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10) и носителем (п=10).

Результаты показаны на фиг. 7 и в табл. 2 ниже.

Таблица 2

	Среднее значение	5ЕМ	N	Р-значение
Масса опухоли для РВЗ	669,3	103	10
Масса опухоли для 1603	415	65,85	10	0,052
Размер опухоли для РВЗ	568,3	95,38	10
Размер опухоли для 1бВЗ	306,4	50,27	10	0,0258

6. Анти-1шР1СЕ ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли меланомы Ме12а человека.

4/10⁶ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΒΙ пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³, начинали лечение с помощью анти-ЬР1СЕ, 16Ό3 (50 мг/кг массы тела; п=10) и носителем (п=10).

Результаты показаны на фиг. 8 и в табл. 3 ниже.

- 17 013970

Таблица 3

	Среднее Значение	5 ЕМ	N	Р-значение
Масса опухоли для РВЗ	753,3	87,26	10
Масса опухоли для 16Ό3	468,9	70,57	9	0,023

Пример 4. Исследование ш угуо эффекта лечения антителами 16Ό3 на снижение массы

Материалы и методы представляли собой, как описано в примере 3.

1х10⁶ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΚ.Ι пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³ начинали лечение с помощью анти-НР1СЕ (16Ό3, 50 мг/кг массы тела; п=10), анти-тР1СЕ (РЬ5О11Ό4; 50 мг/кг массы тела; п=10), контрольными 1дС (1С8; 50 мг/кг массы тела; п=10), сочетанием анти-НР1СЕ и анти-тР1СЕ (каждые 25 мг/кг массы тела; п=10) и носителем (п=10). Антитела инъецировали внутрибрюшинно через каждые сутки. Массу тела мышей измеряли на первые и последние сутки лечения антителами. Массу опухоли вычитали из массы тела перед вычислением процентной доли снижения массы тела.

Результаты показаны на фиг. 9. Показано, что анти-НР1СЕ предотвращает снижение массы тела в этой модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы ЭанС человека.

Пример 5. Сочетание анти-НР1СЕ антител и анти-УЕСЕ антител для лечения роста опухоли

Материалы и методы представляли собой, как описано в примере 3.

1х10⁶ опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей ΝΜΚ.Ι пи/пи в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм³ начинали лечение с помощью анти-НР1СЕ (16Ό3, 50 мг/кг, 37,5 мг/кг, 12,5 мг/кг массы тела внутрибрюшинно через каждые сутки; п=10 для каждой концентрации), авастином (15 мг/кг и 5 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно два раза в неделю, п=10 для каждой) и сочетанием анти-1Р1СЕ (12,5 мг/кг массы тела) и авастином (5 мг/кг массы тела; п=10). Мышей забивали после 20 суток инокуляции опухоли.

Результаты показаны на фиг. 10. Средний объем опухоли ± 8ЕМ: 1С8, 37; 37,5 мг/кг массы тела: 954±164 мм³; 12,5 мг/кг массы тела: 1398±236 мм³; 1дС: 1789±231 мм³; авастин: 15 мг/кг массы тела: 828±186 мм³; 5 мг/кг массы тела: 926±202 мм³; авастин + 16Ό3: 569±94 мм³. Наблюдали, что анти-НР1СЕ и авастин обладают дополнительным эффектом на ингибирование роста опухоли для подкожной опухоли поджелудочной железы ЭапС человека.

Пример 6. Получение 5сЕу16Э3

Последовательности вариабельных частей тяжелой и легкой цепи (8ЕО ΙΌ N0:2 и 4, соответственно, полученные, как описано в примере 1) амплифицировали с помощью РСЯ с использованием праймеров с подходящими участками рестрикции и линкера. После 80Е РСЯ (сплайсинг генов с помощью перекрывающегося удлинения) ксЕу клонировали в рЕЕ14.4 (участки клонирования НшбШ-ЕсоШ) (фиг. 12). Данным 8сЕуНр16О3/рЕЕ14.4 трансфицировали клетки СНО-ΚΙ после линеаризации ВатН1 с использованием Еидепе 6 (ВоеЬппдег МаппНепп) и дважды субклонировали посредством разведения. Моноклональный зсЕу Нр 1603, 6С5О4, получали и нарабатывали. Этот клон также кратковременно трансфицировали в клетки 293 с помощью Ргобисе11 в параллели с зсЕу Ьр1603/рКАМЕ0-МС850-бЫг1 (участки клонирования Ше1-№П) (фиг. 13).

Нуклеотидная и аминокислотная последовательность 16Ό3 зсЕу представлена как 8Е0 ΙΌ N0:23 и 8Е0 ΙΌ N0:24, соответственно. Аминокислотная последовательность, обладающая вариабельными областями тяжелой и легкой цепей, линкерной последовательностью НА-маркером и Ηίδ-маркером также представлена на фиг. 15.

Пример 7. Гуманизация 8сРу16Э3

Гуманизацию вариабельных областей 8сЕу осуществляли, как описано в примере 2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гуманизированного 8сЕу 16Ό3 представлены на 8Е0 ΙΌ N0:25 и 8Е0 ΙΌ N0:26, соответственно. Аминокислотная последовательность, обладающая вариабельными областями тяжелой и легкой цепей, линкерной последовательностью, НА-маркером и Ηίδ-маркером гуманизированного 8сРу, также представлена на фиг. 15.

Пример 8. Получение гуманизированного ЕаЬ16О3

1. Амплификация УН- и УЪ-фрагментов гуманизированного 8сЕу16О3

Праймеры для амплификации УН-фрагмента гуманизированного 8сЕу16О3 16О3УЬЬаскЬ1ии! 5'-САССТССАССТССАССАСТСТС-3' (8ЕС) ΙΌ N0:27) 16О3УЬ£ог8аП 5'-САТССССССТТССТССАСССТСАССАСАСТСТСАССАССС-3' (8ЕС) ΙΌ N0:28) Праймеры для амплификации УЪ-фрагмента гуманизированного 8сЕу16О3 16^3У^ВаскАдеI 5'-ССАССССТСАСАТТСТССТСАСССАСТСТСС-3' (8ЕС) ΙΌ N0:29) 16^3У^Ео^В8^VI 5'-САСССТАССТТТТАТТТССААСТТТСТСССССАС-3' (8ЕС) ΙΌ N0:30)

2. Конструирование векторов для тяжелой и легкой цепи

Продукт РСЯ легкой цепи сначала клонировали в вектор рСЯ4Ь1ип!-Т0Р0. После секвенирования легкую цепь удаляли расщеплением Λ^Ι и ΒδίνΙ и клонировали в вектор рКАХЕ0-СМ30-Еуаг № 7.

- 18 013970

Продукт РСК тяжелой цепи после расщепления клонировали в ρΙ<ΑΝΕΟ-Μί.’850-Ε;·ιόν;·ΐΓ № 3.

3. Соединение конструкций тяжелой и легкой цепи

Оба вектора (описанные выше), содержащие легкий и тяжелый сегмент, соединяли вместе удалением кассеты, содержащей легкий сегмент и добавлением ее к вектору, содержащему тяжелый сегмент, с использованием ферментов Рте1 и Рас1 для получения окончательной конструкции, йр16П3ти1стр1ЕаЬ/рКА№О-МС850-Еа^аг № 3 (см. фиг. 16).

Пример 9. Анализ связывания антигена и ингибирования взаимодействия Р1СЕ/Г11-1 посредством 5сЕт 16Ό3 и гуманизированного 8сЕт 16Ό3 (фиг. 14)

1. ЕЬ18А связывания антигена

Планшеты для ЕЫ8А покрывали ΟΝ 1 мкг/мл 1иР1СЕ-1 в РВ8, 200 мкл/лунка, 4°С. После забивки 1% В 8А, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения 5сЕ\'16О3/гуманизированного 5сЕ\'16Э3. 200 мкл/лунка, фрагмент антител оставляли связываться 1 ч, комнатная температура. Связавшийся 5сЕ\'16Э3 детектировали мышиными анти-НА (180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура) с последующей инкубацией с козьими 1дС-НКР против мыши (81дта), 170 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством ОРО.

2. Ингибирование взаимодействия Р1СЕ/Е11-1 в ЕЫ8А

Планшеты для ЕЫ8А покрывали 0Ν 1 мкг/мл 1111Е11-1 (Κ&Ό 8у51ет5), 200 мкл/лунка, 0Ν, 4°С. После забивки 1% В 8 А, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения 5сЕ\'16О3/гуманизированного 5^^4603, 100 мкл/лунка, и добавляли дополнительно 100 мкл/лунка 1шР1СЕ-2. После инкубации 2 ч при комнатной температуре связавшийся Р1СЕ детектировали козьими анти-1шР1СЕ (Κ&Ό 8у51ет5), 180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура, с последующей инкубацией КАС-НКР (ИАКО), 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством ОРИ.

Пример 10. Анализ связывания антигена и ингибирования взаимодействия Р1СЕ/Е11-1 посредством гуманизированного ЕаЬ16И3

1. ЕЬ18А связывания антигена

Планшеты для ЕЫ8А покрывали ОN 1 мкг/мл 1иР1СЕ-1 в РВ8, 100 мкл/лунка, 4°С. После забивки 1% В8А, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения гуманизированного ЕаЬ16П3, 100 мкл/лунка, фрагмент антител оставляли связываться 1 ч, комнатная температура. Связавшийся гуманизированный ЕаЬ16И3 детектировали с помощью анти-йи1дС-НКР (специфичного к ЕаЬ) (100 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура). Анализ детектировали посредством ОРИ. Результаты представлены на фиг. 17А.

2. Ингибирование взаимодействия Р1СЕ/Е11-1 в ЕЫ8А

Планшеты для ЕЫ8А покрывали ОN 1 мкг/мл 1111Е11-1 (Κ&Ό 8у51ет5), 200 мкл/лунка, ОН 4°С. После забивки 1% В 8 А, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения гуманизированного ЕаЬ16П3, 100 мкл/лунка, и добавляли дополнительно 100 мкл/лунка 1шР1СЕ-2. После инкубации 2 ч при комнатной температуре связавшийся Р1СЕ детектировали козьими анти-1шР1СЕ (Κ&Ό 8у51ет5), 180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура, с последующей инкубацией КАС-НКР (ИАКО), 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством ОРИ. Результаты представлены на фиг. 17В.

Пример 11. Определение величин К_с

Величины 1<и для 16Ό3, гуманизированного 16Ό3 1дС4, гуманизированного 5сЕ\'16Э3 и гуманизированного ЕаЬ16И3 определяли с помощью В1асоге. Результаты представлены в табл. 4 ниже.

Таблица 4. Суммарная таблица величин К_с

Иммобилизованные белки	Добавленные антитела	Ко (М)
г1тРЮТ-2 РгсНа	εοΡν1ιρ16ϋ3τϊπιΡ	1,95Е-10
гЬ.иРЮР-2 Р1сЫа	Ър16ПЗтоизесотр1АВ	2,90Е-10
гЬиРЮР-2 Р1с111а	Ир16Ό3тийсотр1 АВ 1дО4	1,61Е-10
г!шР1СР-2 РхсЬха	Ьр1бЕЗтиЬсотр1РаЬ	1,31Е-10

Величины 1<и для 16Ό3, гуманизированного 16Ό3 1дС4, гуманизированного ЕаЬ 16Ό3 и гуманизированного 5сЕт16Э3.

- 19 013970

Список последовательностей <110 > ТЬготЬ-Х ην

Со11еп ЕезеагсЬ РоипДаЫоп νζν

71аагг,:= ТпЬегши^егвПагг 1пзЫЬии{; νοοΓ В1оЬесЬпо1од1е (νίΒ) <120> Новое анти-РЬСР антитело <130> Т3326-ЕА <150> из 60/664,768 <151> 2005-03-24 <160> 30 <170> РаТ.епЫг. версии 3.3 <210> 1 <211> 348 <212> ДНК <213> Миз тивсиТиз <220>

<221> СЬЗ <222> (1)..(348) <223> вариабельная часть тяжелой цепи 1603 мыши <400> 1

сад аЬс	сад О1п	сЬд Ьеи	сад С1п 5	сад (31п	бсь Зег	дда <31у	ССР рго
С1п 1	Не
Ьса	д^д	аад	аЬа	Ьсс	Ьдс	аад	дсс	ЬсЬ
Зег	Уа1	Ьуз	11е	Зег	Суз	Ьуз	А1а	Зег
			20					25
ьаь	аба	аас	ьдд	дрд	аад	ыд	аад	сер
Туг	11е	Азп	Тгр	ν31	Ьуз	Ьеи	Ьуз	Рго
		35					40
дда	Ьдд	аЬЬ	ЬаЪ	сер	дда	аде	ддь	ааЬ
С1у	тгр	11е	Туг	Рго	01у	Зег	О1у	Азп
	50					55
аад	ддс	аад	дсс	аса	РЬд	асЬ	аЬа	дас
Ьуз	<31у	Ьуз	А1а	ТЬг	Ьеи	ТЬг	11е	Азр
65					70
аРд	сад	сьс	аде	аде	сед	аса	ьсь	дад
Мер	<31п	Ьеи	Зег	Зег	Ьеи	ТЬг	Зег	С1и
				85
дра	ада	дас	аде	ссС	РЬе	ТО	дас	Сае
Уа1	Агд	Азр	Зег	Рго	РЬе	РЬе	Азр	Туг
			100					105
аса	дес	Рас	боа
ТЬг	Уа1	Зег	Зег
		115

дад <31и 10	ебд дЬд Ьеи Уа1	аад Ьуз	ССР Рго	ддд С1у 15	дер А1а	48
ддс	рас	асе	ЙС	аср	дас	Рас	96
<31у	Туг	ТЫ	РЬе	ТЬг 30	Азр	Туг
дда	сад	дда	сор	дад	ьдд	аЫ	144
61у	01п	С1у	Ьеи 45	С1и	тгр	Не
асб	аад	Рас	ааб	дад	аад	ЫС	192
ТЬг	Ьуз	Туг 60	Азп	С1и	Ьуз	РЬе
аса	ьсс	Ьсс	аде	аса	дсс	Рас	240
ТЬг	Зег 75	Зег	Зег	ТЬг	А1а	Туг 80
дас	асС	дсР	дбе	Раб	Ыс	ЬдЬ	288
Азр 90	ТЬг	А1а	ν&1	туг	РЬе 95	Суз
рдд	ддс	саа	ддс	асе	асЬ	сЬс	336
Тгр	(Э1у	<31п	С1у	тЬг но	ТЬг	Ьеи

348 <210? 2

- 20 013970 <211> 116 <212> РВ.Т <213> Миз тизси1из <400> 2

С1п Не С1п Ьеи 1

61п С1п 5

Зег

С1у

Рго

С1и 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Не

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьуз

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

Тгр

Не

Туг

Рго

С1у

Зег

С1у

Азп

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

СЬи

Ьув

РЬе

50

-

55

60

Ьуз

Й1у

Ьуй

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЕ

С1П

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Азр

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

100

105

110

ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <21£» 3 <211> 336 <212> ДНК <213> Миз шизсиЬиз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(336} <223> вариабельная часть легкой цепи 16ПЗ мыши <400> 3

да с Азр 1

аЕЕ Не

дЕд сЕд

Еса Зег 5

сад 61п

ЕсЕ Зег

сса Рго

Есс Есс

сЕд Ьеи

дсЕ А1а

дьд Уа1

Еса Зег

дса А1а 15

дда С1у

48

Уа1

Ьеи

Зег

Зег 10

дад

аад

дЬс

асЕ

аЕд

еде

Еде

ааа

Есс

адЕ

сад

адЕ

СЕд

сЕс

аас

адЕ

96

С1и

Ьуз

Уа1

ТЬг

Мес

Агд

Суз

Ьуз

Зег

Зег

61п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азп

Зег

20

25

30

дда

аЕд

еда

аад

адЕ

ЕЕс

ЕЕд

дсЕ

Едд

Еас

сад

сад

ааа

сса

ддд

сад

144

С1у

МеЕ

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

35

40

4 5

ЕсЕ

ссЕ

аад

сЕд

сЕд

аЕс

Еас

ьдд

дса

Есс

асЕ

адд

даа

ЕсЕ

ддд

дЕс

192

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЬг

Агд

С1и

Зег

С1у

Уа1

50

55

60

ссЬ

дае

еде

ЕЕс

аса

ддс

адЕ

дда

ЕсЕ

ддд

аса

даЕ

ЕЕс

асЕ

сЕс

асе

240

Рго

Аер

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

65

70

75

80

аЕс

аде

адЕ

д^д

сад

дсЕ

даа

дас

сЕд

дса

дЕЕ

ЕаЕ

Еас

Еде

аад

саа

288

Не

Зег

Зег

Уа1

С1п

А1а

С1и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

Ьуз

С1п

- 21 013970

85

90

95

бсб баб

саб

сба

ббс

асд

ббс

ддс

бед

ддд

аса

аад

ббд

да а

аба

ааа

336

Зег Туг

НЬз

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

ЬЬе

Ьуз

100

105

110

<210>

4

<211>

112

<212>

РЕТ

<213>

Миз шивсиЬиз

<400>

4

Азр Не

УаЬ

Ьеи

Зег

СЬп

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

АЬа

УаЬ

Зег

АЬа

СЬу

1

5

10

15

СЬи Ьуз

УаЬ

ТЬг

Меб

Агд

Суз

Ьуз

Зег

Зег

СЬп

Зег

Ьеи

Ьеи

Азп

Зег

20

25

30

СЬу Меб

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи

АЬа

Тгр

Туг

СЬп

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

35

40

45

Зег Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Ые

Туг

Тгр

АЬа

Зег

ТЬг

Агд

СЬи

8ех

СЬу

УаЬ

50

55

60

Рго Азр

Агд

РЬе

ТЬг

СЬу

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЫ

Ьеи

ТЬг

€5

ЬО

75

80

ЬЬе 8ег

Зег

УаЬ

СЬп

АЬа

СЬи

Азр

Ьеи

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

Ьуз

СЬп

85

90

95

Зег Туг

ΗΪ5

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

ЬЬе

Ьуз

100

105

110

<210>

5

<211>

343

<212>

ДНК

<213>

Искусственная последовательность

<220>

<223>

Гуманизированный

фрагмент антитела

<220>

<221>

СОЗ

<222>

(1) .

.(348)

<223>

Гуманизированная

вариабельная часть тяжелой цепи

16РЗ

<400>

5

сад дбс

сад

сбд

сад

сад

бсб

дда

дсс

дад

сбд

дбд

аад

ссб

ддд

дсб

48

СЬп УаЬ

СЬп

Ьеи

СЬп

СЬп

Зег

СЬу

АЬа

СЬи

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Рго

СЬу

АЬа

1

5

10

15

бса дбд

аад

аба

бсс

бдс

аад

дсс

бсб'

ддс

бас

асе

ббс

асб

дас

бас

96

Зег УаЬ

Ъуз

ЬЬе

Зег

суз

Ьуз

АЬа

Зег

СЬу

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

баб аба

аас

бдд

дбд

аад

ббд

дсс

ссб

дда

сад

дда

ебб

дад

бдд

абб

14 4

Туг ТЬе

Азп

Тгр

УаЬ

Ьуз

Ьеи

АЬа

Рго

СЬу

СЬп

61у

Ьеи

СЬи

Тгр

1Ье

35

40

45

дда бдд

абб

баб

ссб

дда

аде

ддб

ааб

асб

аад

бас

ааб

дад

аад

ббс

192

- 22 013970

С1у

Тгр 50

Не

Туг

Рго Е1у

Зег 55

С1у

Азп ТЬг

Ьуз

Туг ЙО

Азп

С1и

Ьуз

РЬе

аад

ддс

аад

дес

аса

гьд

асИ

а£а

дас

аса

Ьсс

7сс

аде

аса

дсс

Ьас

Ьуз

61у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

аЬд

сад

с£с

аде

аде

с7д

аса

Ь αΐι

дад

дас

асЬ

де!

дЬс

7а7

17с

7д7

МеЬ

С1п

Ьеи

5ег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

дЪа

ада

дас

аде

СС7

дас

Ьас

5дд

ддс

саа

ддс

асе

сьд

С7е

7а1

Агд

Азр

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

Е1п

Е1у

ТЬг

Ьеи

Ьеи

100

105

110

аса

дрс

Ьсс

£са

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210>

6

<211>

116

<212>

РКТ

<213> .

Искусственная последовательность

<220>

<223> 1

Синтетическая конструкция

<400>

6

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Е1п

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Не

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

Рго

С1у

Е1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

Е1у

Тгр

11е

Туг

Рго

С1у

Зег

С1у

Азп

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

С1и

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Азр

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Ьеи

100

105

но

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210>

7

<211>

336

<212> ,

ДНК

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Гуманизированный фрагмент антитела

- 23 013970 <220>

<221> СЦЗ <222> (1)..(336) <223> Гуманизированная вариабельная часть легкой цепи 1603 <400> 7

дас Азр 1

ас С Не

дъд 7а1

сЬд Ьеи

асе ТЬг 5

сад С1п

СсС Зег

сса Рго

дас Азр

Сое Зег 10

сед Ьеи

дсС А1а

дед Уа1

Сса Зег

сСд Ьеи 15

дда С1у

дад

сдд

д1с

асе

аСд

аас

Где

ааа

Сое

аде

сад

адС

ссд

сСс

аас

аде

С1и

Агд

Уа1

ТЬг

МеС

Азп

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азп

Зег

20

25

30

дда

аСд

еда

аад

ад!

ссо

ььд

дес

сдд

Сае

сад

сад

ааа

сса

ддд

сад

С1у

МеС

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

Е1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

35

40

45

СсС

ссС

аад

сСд

сЬд

аСс

Сас

Сдд

дса

С со

асС

адд

даа

СсС

ддд

дСс

Зег

Рго

Ьув

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТНг

Агд

С1.и

Зег

С1у

Уа1

50

55

60

ссС

даС

сдс

ССс

аса

ддс

адС

дда

СсС

ддд

аса

даС

ССс

асС

сСс

асе

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТНг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

65

70

75

80

аСс

аде

ад-Ь

дЬд

сад

дсС

даа

дас

дСс

дса

дсс

сас

Сас

Сдс

аад

саа

Не

Зег

Зег

Уа1

С1п

А1а

С1и

Азр

Ча1

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

Ьуз

С1п

85

90

95

СсС

Сас

саС

сса

ТСс

асд

ССс

ддс

Сед

ддд

аса

аад

ссд

даа

аСа

ааа

Зег

Туг

Н1з

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100 105 11С <210> 8 <211> 112 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 8

Азр 1

Не Уа1

Ьеи

ТЬг 5

<31п

Зег

Рго

Азр

Зег 10

Ьеи

А1а

Уа1

Зег

Ьеи 15

С1у

С1и

Агд

Уа1

ТЬг

Мес

Азп

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азп

Зег

20

25

30

С1у

МеС

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

31п

35

40

45

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЬг

Агд

61и

Зег

Е1у

Уа1

50

55

60

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

65

70

75

80

Не

Зег

Зег

Уа1

С1п

А1а

С1и

Αερ

Уа1

А1а

Уа1

туг

Туг

Суз

Ьуз

С1п

85

90

95

Зег

Туг

ΗίΞ

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

51у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Т1е

Ьуз

100

105

110

- 24 013970 <210> 9 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400>9 аЕддгаРдда дсбдка^си! ϊίιΐο24 <210> 10 <211>25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Олигонуклеотидный праймер <400>10 саеаушсадд ддссадйдда £адас25 <210> 11 <211>27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Олигонуклеотидный праймер <400>11 абдгадГсас акасусаддб скбугба27 <210> 12 <211>24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Олигонуклеотидный праймер <400>12 дсГсасДдда £дд11дддаад аГдд24 <210>13 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 13 ссассддбда саббдбдсЬд асссадбс^с с31 <210>14 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 25 013970 <220 <223> Олигонуклеотидный праймер <40014 сассдЬасдЬ 1:Ш1!:Ьсса аоНЬд-Ьссс сдад34 <210 15' <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Олигонуклеотидный праймер <40015 саддГссадс СдсадсадЪс Сд22 <210> 16 <211>40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <40016 да^дддсссЪ бдд):сдасдс 1:даддадас(: дрдадсаддд40 <210>17 <211> 8 <212> РКТ <213> Низ тизси1из <220>

<221> штзс <222> (1)..(8) <223> Тяжелая цепь С0К1 16йЗ <400> 17

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг Туг

5 <210> 18 <211> 8 <212> РКТ <213> Миз пизсиЗиз <220>

<221> М13С_ГЕАТиКЕ <222> (1)..(8) .

<223> Тяжелая цепь ΟϋΚ2 16ϋ3 <400 18

Не Туг Рго <31у Зег С1у Азп ТЬг

5

- 26 013970 <210> 19 <211> 9 <212> РКТ <213> Миз тизси1из <220>

<221> М13С_ГЕАТиВЕ <222> (1) . .(9) <223> Тяжелая цепь СОР.З 1603 <400> 19

Уа1 Агд Азр Зег Рго РТ1е РПе Азр Туг

5 <210> 20 <211> 12 <212> РКТ <213> Миз тизси1из <220>

<221> ш!зс <222> (1)..(12) <223> Легкая цепь ΟϋΚΙ 1603 <40020

С1п Зег Беи Ьеи Азп Зег С1у Ме- Агд Ьуз Зег РНе 1510 <210> 21 <211>3 <212> РЕТ <213> Мие тизси1из <220 <221> тизс <222> (1)..(3) <223> Легкая цепь С0В2 1603 <400> 21

Тгр А1а Зег

<210> <211> <212> <213>

22 8 . РКТ Миз тизси1из

<220> <221> <222> <223>	М13С ГЕАТОКЕ (1)..(8) Легкая цель СЭКЗ ЮЗ
<400	22

- 27 013970

Ьуз С1п Зег Туг ΗΪ3 Ьеи РЬе ТЬг <210>23 <211>736 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 16ϋ3 ЗсГ?

<220>

<221> СОЗ <222> (1)..(786) <220>

<221> ιηίθα <222> (1).. (348) <223> Тяжелая цепь <220>

<221> т!зс <222> (349)..(393) <223> Линкерная последовательность <220>

<221> тЬзс <222> (394)..(729) <223> Легкая цепь <220>

<221> π>Ϊ3θ .

<222> (736)..(762) <223> ЕА-маркер <220>

<221> тгзс <222> (769)..(786) <223> Н1з-маркер

<400> 23

сРд Ьеи

сад Й1п 5

сад С1п

рср Зег

дда С1у

сср Рго

дад 61и 10

сРд Ьеи

д-Ьд Уа1

аад Ьуз

ОСЬ Рго

ддд С1у 15

дсР А1а

48

сад С1п 1

арс сад Не С1п

Ьса

дЬд

аад

аРа

Рсс

Рдс

аад

дсс

РсР

ддс

Рас

асе

РРс

аср

дас

Рас

96

Зег

Уа1

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

ЬаЬ

аРа

аас

Ьдд

дьд

аад

РРд

аад

сс!

дда

сад

дда

ерр

дад

ьдд

аРР

144

Туг

Не

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьуз

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

дда

ьдд

аРР

РаР

сер

дда

аде

дду

ааР

аср

аад

Рас

аа 0

дад

аад

РРС

192

С1у

Тгр

Не

Туг

Рго

С1у

Зег

С1у

Азп

ТЬг

Ьуз

Туг

Аз :п

С1и

Ьуз

РЬе

50

55

60

аад

ддс

аад

дсс

аса

ЬЬд

асР

аРа

дас

аса

Рсс

Рсс

аде

аса

дсс

Рас

240

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Азр

ТЬг

Зег

Зех

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

абд

сад

сРс

аде

аде

сРд

аса

РсР

дад

дас

асР

дсР

др с

РаР

РРс

РдР

. 288

- 28 013970

Меб

С1п Ьеи

Зег

Зег 85

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе 95

Суз

дба

ада

дас

аде

ссб

ббс

ббб

дас

бас

бдд

ддс

саа

ддс

асе

асб

сбс

336

Уа1

Агд

Азр

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

31п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

100

105

110

аса

дбе

бсс

бса

ддб

ддб

дд£

ддб

бсб

ддс

ддс

ддс

ддс

бсс

ддб

дда

394

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

С1у

С1у

С1у

С1у

Зег

С1у

С1у

С1у

С1у

Зег

С1у

С1 у

115

120

125

дд!

дд^

бсб

дас

абб

д^д

ебд

Сса

сад

бсб

сса

бсс

бсс

ебд

дсб

дбд

432

С1у

С1у

Зег

Азр

11е

Уа1

Ьеи

Зег

С51п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

130

135

140

Пса

дса

дда

дад

аад

дбе

асб

абд

сдс

б де

ааа

бсс

адб

сад

адб

ебд

480

Зег

А1а

С1у

61и

Ьуз

Уа1

ТЬг

Меб

Агд

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

145

150

155

160

СбС

аас

адб

дда

абд

еда

аад

адб

ббс

ббд

дсб

бдд

бас

сад

сад

ааа

529

Ьеи

Азп

Зег

С1у

Меб

Агд

Ьуз

Зег

РНе

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

165

170

175

сса

ддд

сад

Ес!

ссб

аад

ебд

ебд

абс

бас

бдд

дса

бес

асб

адд

даа

576

Рго

С1у

С1п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЬг

Агд

О1и

180

185

190

бсб

ддд

дбе

ссб

даб

сдс

ббс

аса

ддс

адб

дда

бсб

ддд

аса

даб

ббс

624

Зег

61у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

195

200

205

ас!

СбС

асе

абс

аде

адб

дбд

сад

дсб

даа

дас

ебд

дса

дбб

баб

бас

672

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Уа1

С1п

А1а

С1и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

Туг

210

215

220

бдс

аад

саа

бсб

баб

саб

сба

ббс

асд

ббс

ддс

бед

ддд

аса

аад

ббд

720

Суз

Ьуз

С1п

Зег

Туг

Нтз

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

<31у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

225

230

235

240

даа

аба

ааа

дд£

бсб

бас

сса

бас

дас

дбе

сса

дас

бас

дсб

ддб

бсб

768

С1и

Не

Ьуз

С1у

Зег

Туг

Рго

Туг

Азр

Уа1

Рго

Азр

Туг

А1а

С1у

Зег

245

250

255

саб

саб

сас

саб

сас

саб

786

Н13

Нтз

Н13

Нтз

Нтз

ΗΪ3

260 <210> 24 <211> 262 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 24

01п 1

11е С1п

Ьеи

С1п 5

С1п

Зег С1у Рго С1и 10

Ьеи \Га1

Ьуз

Рго

31у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Не

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РНе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

- 29 013970

Туг

Не Азп 35

Тгр Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьуз 40

Рго С1у 61п 61у

Ьеи 4 5

61и

Тгр

Не

61 у

Тгр

Не

Туг

Рго

61 у

Зег

61 у

Азп

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

61и

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЫ

Не

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Меб

61п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суэ

85

90

95

Уа1

Агд

Айр

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

б!у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

100

105

110

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

61у

61у

61у

61 у

Зег

61у

61у

С1у

61 у

Зег

61у

61у

115

120

125

61 у

61у

Зег

Азр

Не

Уа1

Ьеи

Зег

61п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

130

135

140

Зег

А1а

С1у

61«

Ьуз

Уа1

ТЬг

Меб

Агд

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

145

150

155

160

Ьеи

Азп

Зег

С1у

МеЬ

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

165

170

175

Рго

61у

61п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

Тгр

А1а

Зег

ТЬг

Агд

С1и

180

185

190

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

61 у

ТЬг

Азр

РЬе

195

200

205

ТЫ

Ьеи

ты

Не

Зег

Зег

Уа1

С1п

А1а

С1и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

Туг

210

215

220

Суз

Ьуз

61п

Зег

Туг

ΗΪ3

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

61у

Зег

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

225

230

235

240

61и

Не

Ьуз

С1у

Зег

Туг

Рго

Туг

Азр

Уа1

Рго

Азр

Туг

А1а

С1у

Зег

245

250

255

Н1з Н13 Ηίδ Ηίε ΗίΞ Ηΐδ

260 <210> 25 <211> 786 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Гуманизированный 16ϋ3 ЗсГ?

-<220>

<221> С03 <222> (1)..(786) <220>

<221> ш1зс <222> (1)..(348) <223> Тяжелая цепь

- 30 013970 <220>

<221> пц.зс <222> (349)..(393} <223> Линкерная последовательность <220>

<221> т1зс <222> (394)..(729) <223> Легкая цепь

<220>
<221>	т!зс
<222>	(736)	. . (762)
<223>	НА-маркер
<220
<221>	Д113С
<222>	(769)	..(786)
<223>	НА-маркер
<400>	25

сад 61 п 1

дГс Уа1

сад 61п

сГд Ьеи

сад е1п 5

сад 61п

ГсГ Зег

дда 61 у

дсс А1а

дад 61и 10

сГд Ьеи

дГд Уа1

аад Ьуз

сеГ Рго

ддд 61у 15

дсГ А1а

Гса

дГд

аад

аба

Тсс

Где

аад

дсс

ГсГ

ддс

Гас

асе

ГГс

ас!

дас

Гас

Зег

Уа1

Ьуз

Не

Зег

Суз

Ьуа

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Гас

аса

,аас

Ьдд

дГд

аад

Ид

дсс

ссГ

дда

сад

дда

сГГ

дад

Гдд

агг

Туг

Не

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

Рго

61у

61п

61 у

Ьеи

61 и

Тгр

Не

35

40

45

дда

Едд

άΐΐ

Га Г

ССГ

дда

аде

ддь

ааГ

асГ

аад

Гас

ааГ

дад

аад

ГГс

61у

Тгр

11е

Туг

Рго

61 у

Зег

61у

Аеп

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

61и

Ьуз

РЬе

50

55

60

аад

ддс

аад

дсс

аса

Ид

асГ

аГа

дас

аса

Гсс

Гсс

аде

аса

дсс

Гас

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

аГд

сад

сГс

аде

аде

сГд

аса

ГсГ

дад

дас

асГ

де Г

дГс

гаг

ГГс

Гдг

мег

61п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

дГа

ада

дас

аде

ССГ

ГГс

ГГГ

дас

Гас

Гдд

ддс

саа

ддс

асе

сГд

сГс

Уа1

Агд

Азр

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61 п

61у

ТЬг

Ьеи

Ьеи

100

105

НО

аса

дГс

Гсс

Гса

ддГ

ддЬ

ддГ

дд^

ГсГ

ддс

ддс

ддс

ддс

Гсс

ддГ

дда

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

С1у

С1у

С1у

С1у

Зег

С1у

01 у

61 у

61у

Зег

61у

С1у

115

120

125

ддЕ

ГсГ

дас

аГГ

дЬд

сГд

асе

сад

ГсГ

сса

дас

Гсс

сГд

дсГ

дгд

С1у

С1у

Зег

Азр

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Азр

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

130

135

140

Гса

сгд

дда

дад

едд

дГс

ас!

аЬд

аас

Где

ааа

Гсс

адг

сад

адГ

егд

Зег

Ьеи

С1у

С1и

Агд

Уа1

ТЬг

мег

Азп

Суз

Ьуз

Зег

Зег

61 п

Зег

Ьеи

145

150

155

160

сГс

а ас

адГ

дда

аГд

еда

аад

адГ

ГГс

ГГд

дсГ

Гдд

Гас

сад

сад

ааа

Ьеи

Азп

Зег

С1у

МеЬ

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

61п

61п

Ьуз

165

170

175

144

192

240

288

336

384

432

480

528

сса Рго

ддд С1у

сад С1п

РсР Зег 180

ссР Рго

аад Ьуз

ерд Ьеи

сРд Ьеи

аРс Не 185

Рас Туг

рдд Тгр

дса А1а

Рсс Зег

асР ТЬг 190

адд Агд

даа С1и

576

РсР

ддд

дрс

ссР

дар

еде

РРс

аса

ддс

адр

дда

РсР

ддд

аса

дар

РРС

624

Зет

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

31у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

195

200

205

асР

сРс

асе

аРс

аде

адр

дрд

сад

дсР

даа

дас

дрс

дса

дРР

РаР

Рас

672

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Зег

Уа1

С1п

А1а

61и

Азр

Уа1

А1а

Уа1

Туг

Туг

210

215

220

Рдс

аад

саа

РсР

Сар

саЬ

сра

ОРС

асд

ЬРс

ддс

Род

ддд

аса

аад

РЬд

720

Суз

Ьуз

С1п

8ег

Туг

Ηίδ

Ьеи

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

Зег

61 у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

225

230

235

240

даа

ара

ааа

дд^

Пор

Рас

сса

рас

дас

др с

сса

дас

Рас

дсР

дд^

РСР

768

С1и

11е

Ьуз

61 у

Зег

Туг

Рго

Туг

Азр

Уа1

Рго

Азр

Туг

А1а

61у

Зег

245

250

255

саР	саР	сас	саР	сас	саР	786
Н1з	Ηίε	ΗΪ3	Нгз 260	Н1е	Н1з

<210 26 <211> 262 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400 26

61п Уа1 1

61п Ьеи

61п 5

61п Зег

61 у

А1а

С1и 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61 у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

11е

Аз η

Тгр

Уа1

Ьуз

Ьеи

А1а

Рго

С1у

С1п

61у

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Тгр

11е

Туг

Рго

61 у

Зег

С1у

Аз η

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

С1и

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

61у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Азр

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мер

61п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

61и

Аер

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Αερ

Зег

Рго

РЬе

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

61 у

ТЬг

Ьеи

Ьеи

100

105

110

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

С1у

61 у

61у

С1у

Зег

С1у

С1у

61у

61у

Зег

61у

С1у

115

120

125

С1у

61у

Зег

Азр

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Αερ

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

130

135

140

Зег

Ьеи

61у

61и

Агд

Уа1

ТЬг

Мер

Аз η

Суз

Ьуз

Зег

Зег

61п

Зег

Ьеи

145

150

155

160

- 32 013970

Ьеи

Азп

Зег

СЬу

Мер 165

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

Ьеи 170

А1а

Тгр

Туг

СЬп

СЬп 175

Ьуз

Рго

01 у

СЬп

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Тгр

АЬа

Зег

ТЬг

Агд

СЬи

180

185

190

Зег

61 у

УаЬ

Рго

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

СЬу

Зег

СЬу

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

195

200

205

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11©

Зег

Зег

УаЬ

СЬп

АЬа

СЬи

Азр

УаЬ

АЬа

УаЬ

Тух

Туг

210

215

220

Суз

Ьуз

СЬп

Зег

Туг

НЬз

Ьеи

РЬе

Т17Г

РЬе

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

225

230

235

240

СЬи

Ые

Ьуз

СЬу

Зег

Туг

Рго

Туг

Азр

УаЬ

Рго

Азр

Туг

АЬа

СЬу

Зег

245

250

255

ΗΪ3 Ηχε Ηίβ НЬз НЬз НЬз

260 <210> 27 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400>27 саддбссадс бдсадсадбс бд22 <210> 28 <211>40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400>28 дабдддсссб бддбсдасдс бдаддадасб дбдадсаддд40 <210>29 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 29.

ссассддбда саббдбдсбд асссадбсбс с31 <210>30 <211>34 <2Ь2> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Олигонуклеотидный праймер <400> 30 ' сассдбасдб КбРабббеса асбббдбссс сдад 34

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Антигенсвязывающая молекула, способная связываться с плацентарным фактором роста человека (РЬСЕ), отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере две определяющие комплементарность области СИК, выбранные из группы, состоящей из последовательностей БЕЦ Ш N0:17-22 или по

   - 33 013970 следовательностей, обладающих по меньшей мере 90%-ной идентичностью с указанными.
2. 2. Антигенсвязывающая молекула по п.1, отличающаяся тем, что она содержит шесть областей СИК, соответствующих последовательностям 8Е0 ΙΌ Н0:17-8ЕО ΙΌ N0:22 или последовательностям, обладающим по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности с указанными.
3. 3. Антигенсвязывающая молекула по п.1, выбранная из группы, включающей РаЬ, РаЬ' или Р(аЬ')2, конструкцию по меньшей мере из двух СИК, растворимый или заякоренный в мембране одноцепочечный вариабельный фрагмент (8сРу) или одиночный вариабельный домен.
4. 4. Антигенсвязывающая молекула по п.1, отличающаяся тем, что она содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2 или последовательность, обладающую по меньшей мере 90%-ной идентичностью с указанной в пределах областей СИК, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность 8Е0 ΙΌ N0:4 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%-ной идентичностью с указанной в пределах областей СИК.
5. 5. Антигенсвязывающая молекула по п.1, представляющая собой антитело 16Ό3, продуцируемое линией клеток ЬМВР 6399СВ, или фрагмент указанного антитела.
6. 6. Антигенсвязывающая молекула по п.1, представляющая собой гуманизированное антитело или фрагмент указанного гуманизированного антитела.
7. 7. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (8сРу) по п.3, который содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:24.
8. 8. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (8сРу) по п.3, который содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:26.
9. 9. Линия клеток, продуцирующая антигенсвязывающую молекулу по п.1.
10. 10. Линия клеток по п.9, которая является линией клеток ЬМВР 6399СВ.
11. 11. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента антигенсвязывающую молекулу по п.1 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
12. 12. Фармацевтическая композиция по п.11, дополнительно содержащая терапевтически эффективное количество другого антиангиогенного средства.
13. 13. Полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающую молекулу по п.1.
14. 14. Способ лечения и/или профилактики нежелательного ангиогенеза при патологическом состоянии у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества антигенсвязывающей молекулы по п.1.
15. 15. Способ по п.14, в котором патологическое состояние выбрано из группы, включающей рак, воспаление, образование спаек, заболевание глаз, легочную гипертензию и сосудистое кровотечение.
16. 16. Способ по п.15, в котором раковое заболевание выбрано из группы, включающей рак толстой кишки, рак молочной железы, рак поджелудочной железы и меланому.
17. 17. Применение антигенсвязывающей молекулы по п.1 для скрининга соединений с аддитивным эффектом в отношении ингибирования РЬСР при лечении рака.
18. 18. Применение антигенсвязывающей молекулы по п.1 в качестве диагностического средства ш νί1го для детекции усиленной экспрессии РЬСР при патологических состояниях.
19. 19. Применение антигенсвязывающей молекулы по п.1 для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики нежелательного ангиогенеза при патологическом состоянии у млекопитающего.