CN109134650A - 抗人plgf单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

抗人plgf单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，包括动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、细胞融合、细胞筛选、亚克隆、抗体纯化、染色体分析等步骤；本发明通过将试验过程、试验材料进行优化，使其最适于PLGF单克隆抗体的制备，所制备的PLGF单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与PLGF抗原结合力强等优点，可用于免疫组化、免疫荧光、放射自显影或其他方法来定性定位或定量检测各种疾病如肿瘤或炎症患者的组织器官中的PLGF表达水平，以辅助临床诊断，同时PLGF单克隆抗体可作为PLGF蛋白的拮抗剂药物成分，用于治疗因血管过度增生而引起的多种疾病包括各种恶性肿瘤。

Description

抗人PLGF单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及抗人PLGF单克隆抗体的制备方法。
背景技术
血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。VEGF是目前已知的最强烈的刺激血管内皮细胞分裂增生的因子。VEGF一般常由血管内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞所合成，并通过自分泌/旁分泌方式特异地作用于血管内皮细胞上的受体，而发挥促进血管内皮细胞生长、增殖、迁移、形成等作用。研究表明，在多数恶性肿瘤患者的癌组织中也能够检测到VEGF，且VEGF的表达水平增高与肿瘤恶性程度和疾病进展有关此外，VEGF在炎症病理的血管中起着重要的作用。
PLGF与VEGF两者同源，结构与生物活性相近，且都可与VEGFR1受体结合。但以往的研究更为关注的是VEGF，而对于PLGF，尽管其编码基因早在1991年就已克隆出，但其在血管增生中的意义长时期以来一直是处于从属或未定状态。近年来随着研究的深入，越来越多的结果证明PLGF实际上参与许多生理或病理条件下的血管增生。因此，需进一步研发出一种PLGF蛋白的单克隆抗体，可用于能够快速、准确检测人PLGF的免疫检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，制备的抗体特异性好，亲和力高，能够用于PLGF免疫荧光检测试剂盒，对人体内PLGF蛋白做出快速、准确的检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA检测法检测血清中抗体效价，取效价高的小鼠免疫脾细胞；
(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞融合前1天，进行细胞换液并使骨髓瘤细胞在融合当天为对数生长阶段；
(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用5ml HAT培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/mL，将饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
(4)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完毕，将融合细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(5)细胞筛选：细胞长至孔底1/10面积时，酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，选择OD值高的杂交瘤细胞进行亚克隆；
(6)亚克隆：采用软琼脂法进行杂交瘤细胞的亚克隆，阳性孔继续进行2-3次克隆化，直至100％杂交瘤细胞阳性率，最终得到高特异性PLGF杂交瘤细胞株，将高特异性PLGF杂交瘤细胞株液氮保存；
(7)抗体纯化：将上述高特异性PLGF杂交瘤细胞株经过滤离心处理后，再通过protein-A亲合层析柱分离纯化PLGF单克隆抗体，纯化后，经SDS-PAGE测定PLGF单克隆抗体纯度大于93％。
本发明具有有益效果：本发明制备PLGF单克隆抗体的方法通过将试验过程、试验材料进行优化，使其适合于PLGF单克隆抗体的制备，本发明所制备的PLGF单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与PLGF抗原结合力强等优点，可用于免疫组化、免疫荧光、放射自显影或其他方法来定性定位或定量检测各种疾病如肿瘤或炎症患者的组织器官中的PLGF表达水平，以辅助临床诊断，同时PLGF单克隆抗体可作为PLGF蛋白的拮抗剂药物成分，用于治疗因血管过度增生而引起的多种疾病包括各种恶性肿瘤，例如人乳腺癌，结肠癌和横纹肌瘤等。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为100ug/只，接种4只小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为100ug/只，间隔3周进行抗原冲击，100ugPLGF蛋白不加佐剂尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，分离血清，用ELISA检测法检测血清中抗PLGF抗体的效价，处死效价高的小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中；最后一次免疫多采用尾静脉注射，可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分；
(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；
(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，通过颈脱位处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，2000r/min离心5min,弃上清，用5mlHAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，饲养细胞有助于杂交瘤细胞的繁殖，同时饲养细胞吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用；
(4)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，放入融合管中，2000r/min离心5min,弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；50％聚乙二醇PEG40001mL，左手匀速转动融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1000rpm/min离心10min，弃上清，加入20mL HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(5)细胞筛选：细胞长至孔底1/10面积时，用碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)将PLGF蛋白稀释为5ug/ml，以100ul/孔量加入酶标板孔中，4℃过夜，弃去孔内液体，磷酸盐缓冲液清洗2次，每孔加200ul封闭液4℃过夜，封闭液为含2％BSA的磷酸盐缓冲液，经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清，以未融合的骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照，以免疫小鼠血清为阳性对照，37℃孵育2小时，经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig，37℃孵育1小时，再经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入含3％H2O2的邻苯二胺底物液显色10-15min，以0.2MH2SO4终止反应，在酶标仪读取OD值，选择OD值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存；
采用ELISA对杂交瘤细胞进行筛选，具有快速、准确、简便，便于一次处理大量样品等特点；
(6)亚克隆-软琼脂法：在培养皿中制备饲养细胞，将2.0％琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1％琼脂糖培养液，45℃水浴中温育，吸去平皿上层培养液，加入1％琼脂糖培养液3ml，室温10分钟，取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1％琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层，37℃、7.5％湿润培养10天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养，吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性PLGF杂交瘤细胞株，将高特异性PLGF杂交瘤细胞株液氮保存；
细胞融合后得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的，对杂交瘤细胞进行多次克隆化，才能得到完全同质的单克隆抗体；
(7)抗体纯化：将上述高特异性PLGF杂交瘤细胞株于无血清培养基中扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄后收集培养液，1500rpm/min离心10分钟，上清液再经0.22um滤膜过滤后，将上述上清液上样于protein-A亲合层析柱中，上样完毕后，protein-A亲合层析柱以磷酸盐缓冲液洗涤去除杂蛋白，再以5倍柱体积的甘氨酸溶液(0.1M，pH＝2.7)洗脱被吸附的抗体蛋白，并加入Tris(1M，pH＝9.0)中和甘氨酸，使pH为7.2，再以10倍株体积的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)透析12～16小时后(期间换液2-3次)，透析后的样品再经0.22um滤膜过滤后即获得纯化的PLGF单克隆抗体，经SDS-PAGE测定PLGF单克隆抗体纯度大于93％。
实施例2
抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，接种4只小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，小鼠的接种剂量为50ug/只，间隔3周进行抗原冲击，50ugPLGF蛋白不加佐剂尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，分离血清，用ELISA检测法检测血清中抗PLGF抗体的效价，处死效价高的小鼠，无菌条件下取免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于不完全RPMI1640培养液中；
(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％(v/v)胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；
(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，通过颈脱位处死未免疫的BALB/c小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，2000r/min离心5min,弃上清，用5ml HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为105个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
(4)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以8:1的比例混合，放入融合管中，2000r/min离心5min,弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散成糊状；50％聚乙二醇PEG40001mL，左手匀速转动融合管，右手持1mL移液管吸取50％PEG溶液1mL，沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，加入速度为：第lmin内加1mL，第2min内加4mL，剩余20mL在5min内加完，1500rpm/min离心10min，弃上清，加入20mL HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，加入量为0.1mL/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(5)细胞筛选：细胞长至孔底1/10面积时，用碳酸盐缓冲液(0.1M，pH＝9.6)将PLGF蛋白稀释为5ug/ml，以100ul/孔量加入酶标板孔中，4℃过夜，弃去孔内液体，磷酸盐缓冲液清洗3次后，每孔加200ul封闭液4℃过夜，封闭液为含2％BSA的磷酸盐缓冲液，经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清，以未融合的骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照，37℃孵育2小时，经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig，37℃孵育1小时，再经含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入含3％H2O2的TMB底物液显色10-15min，以0.2M H2SO4终止反应，在酶标仪读取OD值，选择OD值比阴性对照高5-10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存。
(6)亚克隆-软琼脂法：在培养皿中制备饲养细胞，将2.0％琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1％琼脂糖培养液，45℃水浴中温育，吸去平皿上层培养液，加入1％琼脂糖培养液3ml，室温10分钟，取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1％琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层，37℃、7.5％湿润培养10天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养，吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性PLGF杂交瘤细胞株，将高特异性PLGF杂交瘤细胞株液氮保存；
(7)抗体纯化：将上述高特异性PLGF杂交瘤细胞株于无血清培养基中扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄后收集培养液，1500rpm/min离心10分钟，上清液再经0.22um滤膜过滤后，将上述上清液上样于protein-A亲合层析柱中，上样完毕后，protein-A亲合层析柱以磷酸盐缓冲液洗涤去除杂蛋白，再以5倍柱体积的甘氨酸溶液(0.1M，pH＝2.7)洗脱被吸附的抗体蛋白，并加入Tris缓冲液(1M，pH＝9.0)中和甘氨酸，使pH为7.2，再以10倍柱体积的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)透析12-16小时后(期间换液2-3次)，透析后的样品再经0.22um滤膜过滤后即获得纯化的PLGF单克隆抗体，经SDS-PAGE测定PLGF单克隆抗体纯度大于93％。
实施例3
对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，杂交瘤细胞染色体分析的具体方法为：
a.在加秋水仙素前36-48小时将杂交瘤细胞传代；
b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素(100ug/ml，除菌，-20℃保存)，使最终秋水仙素的浓度为0.1-0.4ug/ml，继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清；
c.加入已预热到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟；
d.向细胞悬液中加入1ml新配制的固定液，固定液为甲醇与冰醋酸以3：1的比例混合，混匀，然后1000r/min离心10分钟，弃去上清液；
e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min离心10分钟，弃去上清液，重复操作一次，其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，置4℃过夜；
f.取出细胞悬液，1000r/min离心5分钟，吸去上清液，根据细胞体积留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，轻轻摇晃载玻片，使细胞悬液在载玻片上铺展开来，并在酒精灯上方穿过3-5次，自然干燥；
g.用新配制的10％Giemsa染液染色10-20分钟，然后用去离子水洗去染液，自然干燥；
h.镜检：在显微镜下选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析，每份标本应计数100个完整的中期核细胞。
本发明提供的PLGF单克隆抗体制备方法所用试验动物、生物制剂、试剂、仪器均可由市场购得。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将PLGF蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀成油包水的乳剂，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将PLGF蛋白尾静脉注射，3天后，小鼠眼球采血，用ELISA检测法检测血清中抗体效价，取效价高的小鼠免疫脾细胞；
(2)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞融合前1天，进行细胞换液并使骨髓瘤细胞在融合当天为对数生长阶段；
(3)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用5ml HAT培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/mL，将饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；
(4)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，加入50％聚乙二醇PEG4000，待融合完毕，将融合细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI-1640完全培养液换液；
(5)细胞筛选：细胞长至孔底1/10面积时，酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，选择OD值高的杂交瘤细胞进行亚克隆；
(6)亚克隆：采用软琼脂法进行杂交瘤细胞的亚克隆，阳性孔继续进行2-3次克隆化，直至100％杂交瘤细胞阳性率，最终得到高特异性PLGF杂交瘤细胞株，将高特异性PLGF杂交瘤细胞株液氮保存；
(7)抗体纯化：将上述高特异性PLGF杂交瘤细胞经过滤离心处理后，再通过protein-A亲合层析柱分离纯化PLGF单克隆抗体，纯化后，经SDS-PAGE测定PLGF单克隆抗体纯度大于93％。
2.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，每次免疫时，小鼠的接种剂量为50或100ug/只。
3.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，饲养细胞的制备方法为通过颈脱位处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，2000r/min离心5min，弃上清，用5ml HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/mL，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用。
4.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，50％聚乙二醇PEG4000的加入量为1ml。
5.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，HAT完全培养液为98ml完全RPMI-1640培养基、1ml HT贮存液、1ml A贮存液的混合液，HT完全培养液为99ml完全RPMI-1640培养基、1ml HT贮存液的混合液。
6.如权利要求1所述的抗人PLGF单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，过滤膜的孔径为0.22um，离心速度为1500rpm/min，离心时间为10min。
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