CN111378036B - 一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供了一种保藏号为CGMCC No.19161的小鼠杂交瘤细胞，并提供了一种由所述保藏号为CGMCC No.19161的小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，所述抗人白血病抑制因子单克隆抗体具有良好的生物学活性，可有效的结合人白血病抑制因子，封闭人白血病抑制因子与其受体的结合，对动物体内移植的肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，可单独或与其他抗肿瘤药物联合应用于肿瘤的治疗中，具有制备多种肿瘤药物的应用前景。同时，所述制备方法可大幅提高获取具有高治疗价值抗体的筛选效率。

Description

一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术
人白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)是机体分泌的一种生物活性广泛的多功能细胞炎症因子，可由多种组织产生。LIF由180个氨基酸构成，属IL-6细胞因子家族。因为最初发现LIF可作为小鼠髓系白血病细胞系M1巨噬细胞的分化诱导剂和增殖抑制因子，因此被命名为白血病抑制因子。
近年研究发现LIF表达水平的升高与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，LIF可促进肿瘤细胞增殖、上皮细胞间充质转化以及肿瘤细胞转移。目前LIF的表达水平升高已在胆管癌、结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、胰腺癌和膀胱癌等肿瘤组织中被证实(Yue X.etal.Cancer Cell&Microenvironment.2015,2:e877；Nicola NA.et al.Cytokine GrowthFactor Rev.2015,26:533-544；Xu G.et al.Journal of Cellular Physiology.2019,234:3613-3620；Wang J.et al.Hepatology.2016,64:1606-1622.)。本发明申请者前期利用NCBI中的GEO DataSets数据库，分别调取两个研究中的胰腺癌及其癌旁组织RNA-seq测序结果，胰腺癌样本数分别为45例14例(分别对应附图1A和1B)，对比人白血病抑制因子基因在胰腺癌及癌旁组织中的表达量结果，实验结果如附图1所示，分析显示人白血病抑制因子在胰腺癌组织中的表达量均明显高于癌旁正常组织(p<0.0001和p＝0.0002)，提示在发生胰腺癌时伴随有人白血病抑制因子表达量增高。
高表达的LIF往往预示着病人预后不良，体外实验结果也提示LIF在体外可刺激多种肿瘤的生长、抑制肿瘤的分化并诱导肿瘤细胞发生转移。由此，有研究者尝试阻断LIF的生物学功能，探讨此一做法在某些肿瘤治疗中的意义。结果提示，在LIF表达水平升高的肿瘤组织中阻断LIF的生物学功能，可抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，同时增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性(Liu SC.et al.J Clin Invest.2013,123:5269-5283；Li X.etal.Oncotarget.2014,5:788-801；Shi Y.et al.Nature.2019,569:131-135；Wang M.T.etal.Nat Commun.2019,10:3055)。然而，筛选用于疾病治疗的单克隆抗体是一个非常复杂的过程。首先对于针对细胞因子的抗体，要从众多的杂交瘤细胞株中筛选亲和力足够高并且阻断活性足够强的抗体；其次为了对抗体进行系统的评价，要获得优质的抗原以测试所获抗体对抗原的阻断活性；在获得具有临床应用前景的候选抗体后，还需经过人源化改造等系统的开发程序才能成为具体的抗体药物。其中获得具有临床应用前景的候选抗体尤为重要。
因此，加快研发抗人白血病抑制因子的单克隆抗体药物，筛选更具临床应用前景的抗人白血病抑制因子单克隆候选抗体具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法及其应用，所述抗人白血病抑制因子单克隆抗体与抗原结合的亲和力高、特异性好，所述制备方法利于提高获取具有高治疗价值的抗体的筛选效率。
为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株Hybridoma-DSGZ308；其保藏编号为CGMCC No.19161，该杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株；于2019年12月03日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；同时，提供一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体，所述抗人白血病抑制因子单克隆抗体是由上述保藏编号为CGMCC No.19161的杂交瘤细胞株分泌产生的。
第二方面，本发明还提供了一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用人白血病抑制因子作为抗原免疫小鼠；
(2)分离免疫小鼠的脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞进行融合；
(3)从融合后的细胞中初步筛选出阳性杂交瘤细胞；
(4)采用细胞活性阻断分析方法从上述阳性杂交瘤细胞中进一步筛选能产生强阻断活性抗体的细胞株；
(5)采用上述能产生强阻断活性抗体的细胞株大量制备单克隆抗体。
优选地，所述步骤(1)中的采用的人白血病抑制因子是依据CN201610642110.7中所述方法制备得到的重组人白血病抑制因子。
优选地，所述步骤(1)中的免疫小鼠为：8周龄的BALB/c小鼠；
优选地，所述步骤(1)与步骤(2)之间还包括测定小鼠血清滴度的步骤；
进一步地，所述小鼠血清滴度测定采用ELISA方法进行，选择血清滴度最高的小鼠进行后续实验。
优选地，所述步骤(2)中的融合方法具体的为：处死后取出小鼠脾脏制备脾细胞悬液，将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例融合后，在融合剂聚乙二醇作用下进行细胞融合。
优选地，所述步骤(3)中的筛选方法包括：
S1：首先采用有限稀释法获得成功融合的单克隆细胞；
S2：采用ELISA方法从上述单克隆细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞株。
优选地，所述步骤(4)中的筛选步骤包括：
A)将M1细胞与人白血病抑制因子共同孵育作为对照组，检测人白血病抑制因子对于M1细胞活力的影响；
B)对步骤(3)筛选得到的阳性杂交瘤细胞株培养基中的抗人白血病抑制因子单克隆抗体进行纯化，将纯化后的抗体与M1细胞以及人白血病抑制因子共同孵育作为检测组，检测所述抗体对于M1细胞活力的影响，对比检测组M1细胞与对照组M1细胞的活力，筛选出能产生强阻断活性抗体的细胞株。
进一步地，所述纯化方法中采用的层析填料为Protein G或Protein L。
优选地，所述人白血病抑制因子为前述依据CN201610642110.7中所述方法制备得到的重组人白血病抑制因子。
优选地，所述细胞活力的检测方法为：采用CCK-8法检测M1细胞的吸光度值。
优选地，所述吸光度值的测定波长为630nm和450nm。
优选地，所述对照组还包括：不作处理的单独培养的M1细胞。
优选地，所述步骤B)之前还包括初步筛选步骤A’)，所述初步筛选步骤具体的为：
将步骤(3)中初步筛选得到的含有抗人白血病抑制因子抗体的阳性杂交瘤细胞株培养基与M1细胞以及重组人白血病抑制因子共同孵育作为筛选组，检测所述阳性杂交瘤细胞株培养基对于M1细胞活力的影响，对比筛选组和对照组M1细胞的活力，初步筛选出能产生强阻断活性抗体的细胞株。其中，所述筛选组相对于对照组的细胞活力下降越多，则所述阳性杂交瘤细胞产生的抗体的阻断活性越强。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的杂交瘤细胞株及其所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体在制备用于检测白血病抑制因子的检测试剂或试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的杂交瘤细胞株及其所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体在制备人白血病抑制因子阻断药物或药物组合物中的应用。
优选地，所述人白血病抑制因子阻断药物或药物组合物，其主要应用于伴随有人白血病抑制因子表达量增高的疾病。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的一种杂交瘤细胞系及其所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体在制备用于治疗人类肿瘤性疾病的药物或药物组合物中的应用。
优选地，所述肿瘤性疾病选自目前已经证实的存在有人白血病抑制因子表达增高的肿瘤性疾病，包括胆管癌、结直肠癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌以及神经胶质瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
首先，本发明提供的杂交瘤细胞株能够分泌产生特异性高、亲和力强的抗人白血病抑制因子单克隆抗体，该抗体能够识别人白血病抑制因子，并可特异的与人白血病抑制因子结合，阻断人白血病抑制因子的生物学功能。所述单克隆抗体可用于制备人白血病抑制因子的阻断药物，用于治疗伴随有人白血病抑制因子异常升高的疾病，联合应用时可增强抗肿瘤药物的治疗效果，改善肿瘤病人的治疗效果。
其次，本发明还提供了一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体的制备方法，所述制备方法提高了从不同杂交瘤细胞株中筛选可分泌高亲和力且具有强阻断活性的单克隆抗体细胞株的效率，该方法首先采用ELISA方法作为初筛手段，可获得可结合目标抗原的抗体，再通过细胞活性阻断分析方法，进一步对所获抗体是否具有强阻断活性进行鉴定，利于提高获得具有治疗价值抗体的筛选效率。
附图说明
附图1：人白血病抑制因子基因在胰腺癌及癌旁组织中的表达鉴定；
附图2：具有阻断重组人白血病抑制因子活性的单克隆抗体筛选；
附图3：鼠源抗人白血病抑制因子抗体对重组人白血病抑制因子的生物学功能的抑制；
附图4：DSGZ308单克隆抗体与人白血病抑制因子蛋白的亲和力测定；
附图5：人白血病抑制因子基因在胰腺癌细胞株中的表达量检测；
附图6：DSGZ308单克隆抗体和吉西他滨对胰腺癌细胞增殖功能的影响；
附图7：DSGZ308单克隆抗体和吉西他滨对胰腺癌耐药细胞增殖功能的影响；
附图8：DSGZ308单独应用及与白蛋白紫杉醇联合用药对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的影响；
附图9：DSGZ308单独应用及与白蛋白紫杉醇(nab-PTX)联用对胰腺癌小鼠生存期的影响。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步说明本发明的有益效果，应理解为这些实施方式仅用于解释本发明，而非对本发明的限定，同时，本领域普通技术人员根据本发明所做出的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。除另有说明外，本发明所列举的实施例中的实验材料均为可以购买而获得的常规市售商品，且所有技术和科学术语同本发明所属相关领域的普通技术员所理解的含义一致，同时，本发明所列举的实施例中的所有未注明具体条件的实验操作，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1
重组人白血病抑制因子的制备方法为：
S1：将Tris-HCL、NaCl、EDTA混合，混合液中的三者的浓度分别达到20mM、60mM和1mM，然后加入Triton X-100，使其浓度达到0.5％，得到裂解液备用。
S2：接种含有人白血病抑制因子表达载体的大肠杆菌至LB培养基中，在37℃、200转过夜培养，之后以1:50的体积比接种于新鲜配制的LB培养基中，在37℃度、200转振摇培养至细菌OD600nm检测结果达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，然后降低细菌培养液的温度至16℃，并同时改变细菌的培养温度至16℃，继续200转振摇培养20小时后收获细菌；将所收获细菌称重后，根据细菌湿重按照1:10的体积比加入裂解液(如细菌湿重为1g，则加入的裂解液为10mL)进行破碎，破碎细菌后分离上清，使用0.2M的NaH2PO4溶液调整裂解液上清的pH至6.0备用。
S3：初步纯化：以磷酸、NaCl、EDTA按照25mM、50mM和1mM配制缓冲液A，以磷酸、NaCl、EDTA按照25mM、500mM和1mM配制缓冲液B，然后以缓冲液A平衡装填有阳离子交换色谱填料SP sepharose fast flow的色谱柱，在基线稳定后将裂解液上清进行上样，然后使用缓冲液A平衡色谱柱，再以磷酸、NaCl、EDTA按照三者浓度25mM、100mM和1mM配制溶液，加入Triton X-114，得到含有0.1％Triton X-114的清洗缓冲液，对结合在填料上的蛋白进行清洗，在基线稳定后应用以缓冲液A和B体积比1:4配制的洗脱缓冲液对结合在层析填料上的蛋白样品进行洗脱，收集洗脱峰；对收集的洗脱峰进行超滤换液处理，将洗脱组分的缓冲液置换为pH 7.0的25mM磷酸缓冲液。
S4：中度纯化：以25mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡装填有阴离子交换色谱填料Qsepharose fast flow的色谱柱后，在基线稳定后将上述合并后换液的洗脱液组分进行上样，使用25mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡色谱柱，在紫外吸收升高以及回落至20mAU-200mAU收集流穿的含有样品的组分。
S5：精细纯化：以pH 7.0的25mM磷酸缓冲液平衡装填有羟基磷灰石的色谱柱后，在基线稳定后将上述步骤收集的组分进行上样，上样后应用25mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡色谱柱，以磷酸、NaCl按照25mM、500mM配制pH 7.0的缓冲液C，之后按照三倍色谱柱体积的洗脱溶液体积，从100％的pH 7.0的25mM磷酸缓冲液变换至100％的缓冲液C，应用线性梯度洗脱的方式对结合在填料上的样品进行洗脱，在紫外吸收升高以及回落至20mAU-200mAU时收集洗脱峰组分，得到最终的重组人白血病抑制因子洗脱液。
实施例2
实验动物的免疫方法如下：
应用80μg重组人白血病抑制因子蛋白与等体积完全弗式佐剂混合，免疫8周龄雌性BALB/c小鼠，第一次免疫之后每隔2周加强免疫一次，共免疫3次后，应用ELISA方法检测小鼠血清效价达到1:105时,选取血清效价最高的小鼠，对小鼠进行强化免疫一次，3天后处死小鼠，无菌取脾脏后在平皿研磨制成脾单细胞悬液备用。
实施例3
杂交瘤细胞的制备方法如下：
在免疫小鼠同时复苏小鼠SP2/0骨髓瘤细胞。细胞融合时，取对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，用不完全RPMI-1640培养基洗涤2次，重悬并与上述脾单细胞悬液应用50％PEG4000诱导融合，在含HAT的RPMI1640培养基中进行选择培养1周，吸取上清液，应用间接ELISA法检测抗体分泌情况，将2μg/mL的抗原按照体积(人白血病抑制因子蛋白)100μL/孔包被96孔板，洗涤液洗涤三次后加入150μL/孔封闭液在室温封闭2小时，洗涤后拍干。加入待测细胞上清，按2倍梯度稀释为8个浓度，37℃孵育1小时后洗板并拍干，取辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗后显色，判定阳性后应用有限稀释法对抗体分泌阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆。
实施例4
阳性杂交瘤细胞的初步筛选方法如下：
应用如上所述的间接ELISA法检测亚克隆后的杂交瘤细胞分泌抗人白血病抑制因子抗体的能力；对应用间接ELISA法检测后抗体分泌量在前400位的亚克隆细胞株，收集其培养上清液并应用超滤膜进行浓缩，体积浓缩10倍后无菌过滤备用。
同时，复苏小鼠M1细胞并按照ATCC推荐方法进行培养24–48小时后，收集细胞并离心后进行细胞计数。将细胞浓度稀释至20000细胞/mL,在细胞悬液中加入适当浓度的人白血病抑制因子蛋白后混匀。之后将细胞均分成两份，一份与上述经过浓缩并无菌过滤的细胞培养上清混合，另一份与等体积的PBS混合。将上步细胞悬液分装至96孔板中，培养24小时后应用CCK-8测定每个孔在630nm和450nm处的光吸收值。根据测定的抗人白血病抑制因子抗体的阻断活性，选择排位在前50位的亚克隆细胞继续进行进一步的筛选。
实施例5
进一步筛选能产生强阻断活性的抗体的杂交瘤细胞的方法如下：
S1：设置对照组1：将M1细胞加入与以下各组所加溶液等体积的PBS溶液孵育后，应用CCK-8测定在630nm和450nm处的吸光度值；
S2：设置对照组2：将M1细胞与重组人白血病抑制因子共同孵育后，应用CCK-8测定在630nm和450nm处的吸光度值；
S3：初步筛选：收集实施例4中初步筛选得到的阳性杂交瘤细胞株的培养上清，应用Protein G Beads按照厂商建议的方法对培养上清中的抗体进行纯化，并将纯化所得的抗体与M1细胞以及重组人白血病抑制因子共同孵育后，应用CCK-8测定每组在630nm和450nm处的吸光度值，部分实验结果如附图2所示，根据其吸光值相对于对照组2的下调程度筛选具有强阻断活性的杂交瘤细胞株，其中，吸光度值下调程度越大，所述杂交瘤细胞株产生的抗体的阻断活性越强；
S4：选取经过上述S3步骤筛选得到的阳性细胞株进行培养，收集其培养基，用Protein L beads按照厂商建议的方法对培养上清中的抗体进行纯化以去除可能存在的杂质抗体的干扰，从而得到纯度较高的抗人白血病抑制因子单克隆抗体，将抗体按照不同的体积比稀释后与M1细胞以及重组人白血病抑制因子共同孵育，结果显示纯化后的单克隆抗体均能不同程度抑制LIF蛋白的功能，从而使CCK-8检测到的M1细胞吸光值降低，实验结果如附图3所示，其结果显示，所选细胞株所产生的抗体均能阻断重组人白血病抑制因子的功能，根据检测结果选择阻断活性较高的单克隆抗体进行后续实验，并将对应的分泌该种单克隆抗体的单克隆阳性细胞株进一步进行扩大培养，并冻存细胞至液氮中保存备用。
实施例6
将经过筛选后得到的能产生较高阻断活性抗体的杂交瘤细胞接种于6-8周龄BALB/c小鼠腹腔，培养一段时间后收集腹水，应用Protein G beads按照厂商建议的方法对小鼠腹水中的抗体进行纯化，对应得到相应单克隆细胞所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体DSGZ308、DSGZ309、DSGZ310、DSGZ311、DSGZ312、DSGZ313。
使用抗体亚型鉴定试剂盒，按照厂商说明书的方法对所获得DSGZ308抗体的亚型进行鉴定，结果显示，单克隆抗体DSGZ308的亚型为IgG1。
实施例7
为了进一步验证抗人白血病抑制因子单克隆抗体对人白血病抑制因子的结合能力，本发明利用表面等离子共振技术检测筛选到的单克隆抗体DSGZ308与人白血病抑制因子蛋白的结合能力。将Anti-Mouse antibody用固定试剂醋酸钠稀释后注入活化的CM5芯片的实验通道(FC4)，之后芯片用乙醇胺进行封闭。参比通道(FC3)与试验通道(FC4)进行相同的操作；然后进行配体捕捉操作，具体为将DSGZ308抗体应用运行缓冲液稀释后注入到实验通道，参比通道(FC3)不需进行配体捕获；将重组人白血病抑制因子蛋白用运行缓冲液进行稀释，稀释至不同浓度之后，将稀释后的重组人白血病抑制因子依次注入实验通道与参比通道，结合时间为200s，解离时间为1200s。结合解离步骤均在运行中进行。每一个浓度分析后，芯片需要再生掉配体以及未解离的分析物，进行下一个浓度分析时，实验通道需要重新捕获相同量的配体，实验结果如附图4所示，结果显示DSGZ308单克隆抗体与重组人白血病抑制因子结合亲和力为0.345nM，进一步验证了DSGZ308单克隆抗体可以和人白血病抑制因子蛋白特异性地结合，并且亲和力较强。
实施例8
本发明申请者前期在胰腺癌细胞株中检测了人白血病抑制因子基因的表达量，实验结果如附图5所示，结果显示胰腺癌细胞株人白血病抑制因子基因表达量明显高于正常细胞株(人源肾上皮细胞系293T)。而后本发明选用胰腺癌细胞系SW1990作为实验材料进行培养，比较不同时间下不同浓度的DSGZ308单克隆抗体处理和化疗药物吉西他滨处理对细胞增殖功能的影响，实验结果如附图6所示，结果显示吉西他滨能够在一定程度上抑制胰腺癌细胞系SW1990的生长；DSGZ308单抗处理对胰腺癌细胞SW1990生长的抑制作用随自身浓度的增加而逐渐增强，存在剂量依赖关系。
选用既往构建成功的胰腺癌耐吉西他滨细胞系SG2μM进行培养，将培养细胞分为：阴性对照组、吉西他滨与IgG共同给予组、吉西他滨与不同浓度DSGZ308单克隆抗体(0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL)联合给予组。采用3D培养方法，使细胞在接近体内的相对立体的环境中生长，然后再进行不同的药物处理。实验结果如附图7所示，结果显示与吉西他滨与IgG共同给予组对细胞增殖的影响对比，吉西他滨与不同浓度DSGZ308单克隆抗体(0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL)联合给予组对胰腺癌耐吉西他滨细胞系SG2μM的抑制效果均较为明显，并且随着DSGZ308单克隆抗体浓度的增加，其同吉西他滨联用后对细胞的抑制作用更强，具有剂量效应依赖关系。
实施例9
抗人白血病抑制因子单克隆抗体对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤小鼠肿瘤生长及生存期的影响实验：
选取裸鼠皮下接种Panc-1胰腺癌细胞系，成瘤后(实验操作不清楚)分别应用抗人白血病抑制因子单克隆抗体DSGZ308单独给药、白蛋白紫杉醇(nab-PTX)单独给药以及联合应用抗人白血病抑制因子单克隆抗体DSGZ308与白蛋白紫杉醇(nab-PTX)给药。
30天后，处死小鼠取出肿瘤组织，实验结果如附图8所示，实验结果显示，联合用药组的肿瘤体积显著降低白蛋白紫杉醇组、DSGZ308组、及联合用药组的移植瘤体积及瘤重与对照组相比，均显著降低，其中联合用药组更为显著，与白蛋白紫杉醇、DSGZ308单独给药组相比，也有显著降低。瘤重结果显示分白蛋白紫杉醇、DSGZ308单独给药组及联合用药组的肿瘤抑制率分别为31.17％、45.21％、72.72％，提示DSGZ308明显抑制皮下移植瘤生长，联合白蛋白紫杉醇后这种抑制作用更为显著。
抗人白血病抑制因子单克隆抗体对荷瘤小鼠生存期实验结果如附图9所示，其结果显示抗人白血病抑制因子单克隆抗体DSGZ308及白蛋白紫杉醇(nab-PTX)单独给药或联合给药后，能明显延长小鼠生存期。对照组小鼠在70天左右全部死亡(或肿瘤直径达到20mm)，给予抗人白血病抑制因子单克隆抗体DSGZ308治疗后小鼠生存期明显延长，与白蛋白紫杉醇联用后，小鼠生存期延长更显著。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，在不脱离本发明原理的前提下，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种抗人白血病抑制因子单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNo.19161的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.19161。
3.如权利要求2所述杂交瘤细胞株及其所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体在制备用于检测白血病抑制因子的试剂或试剂盒中的应用。
4.如权利要求2所述杂交瘤细胞株及其所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体在制备人白血病抑制因子阻断药物或药物组合物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其主要应用于伴随有人白血病抑制因子表达量增高的疾病。
6.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株及其所分泌的抗人白血病抑制因子单克隆抗体在制备用于治疗人类胰腺癌药物或药物组合物中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109134650A (zh) * 2018-09-10 2019-01-04 宁波奥丞生物科技有限公司 抗人plgf单克隆抗体的制备方法
CN109320609A (zh) * 2010-04-05 2019-02-12 瓦尔德希伯伦肿瘤研究所 一种单克隆抗体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109320609A (zh) * 2010-04-05 2019-02-12 瓦尔德希伯伦肿瘤研究所 一种单克隆抗体及其应用
CN109134650A (zh) * 2018-09-10 2019-01-04 宁波奥丞生物科技有限公司 抗人plgf单克隆抗体的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Research on the expression of integrin β3 and leukaemia inhibitory factor in the decidua of women with cesarean scar pregnancy;Zhi-Da Qian 等;《BMC Pregnancy Childbirth》;20170311;第17卷(第1期);第1-8页 *
单克隆抗体药物临床应用进展;肖潇 等;《检验医学》;20190530;第34卷(第5期);第466-471页 *

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