WO2022143743A1 - 人lifr抗原结合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
提供了一种人LIFR抗原结合蛋白及其制备方法和应用。采用人LIFR-ECD蛋白免疫H2L2人源抗体转基因小鼠，利用单个B细胞克隆技术(SBC)，及单B细胞测序分析，Fc重组得到了一系列具有生物学功能的人LIFR抗体，该方法大大提高了抗体药物发现的效率和产率，且获得的人LIFR抗体具有很好的亲和力，可阻断huLIF蛋白与huLIFR/gp130细胞的结合，从而抑制STAT3等信号通路，进一步抑制肿瘤的生长，达到肿瘤预防和治疗的目的。
Description
本发明属于生物医药领域，具体涉及人LIFR抗原结合蛋白及其制备方法和应用。
白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)是一种具有多种生物学功能的细胞因子，因其能够诱导M1髓系白血病细胞向正常细胞分化而被命名。LIF属于白细胞介素-6(IL-6)家族，后者还包括IL-11、IL-27、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌素-1(CT-1)和制瘤素M(OSM)等，这些细胞因子与LIF共享gp130受体，因此，LIF具有与其他家族成员重叠而独特的生物学作用。
哺乳动物中LIF蛋白由180个氨基酸残基组成，具有高度保守性，人的LIF基因编码在染色体22q12上，而小鼠LIF基因定位于11号染色体上，小鼠和人类LIF基因同源性＞75％。成熟LIF蛋白是一种高度糖基化分泌蛋白，可由卵母细胞和人胚胎的胚外细胞、子宫内膜细胞、成纤维细胞、肝细胞、单核巨噬等多种成体细胞分泌。不同组织来源的LIF蛋白糖基化不同，其中研究最多的是一种分泌型、可变异的糖基化蛋白(34-63kDa)，它具有诱导自分泌和广泛的旁分泌效应，这种作用可能因细胞类型和背景不同而相互矛盾，如增殖与分化、存活和凋亡等。
LIF主要通过结合其特异性LIF受体(LIF receptor，LIFR)，然后招募gp130受体亚基形成高亲和力异源二聚体受体复合物，诱导下游JAK/STAT3，PI3K/AKT，ERK1/2，MAPK等信号通路的活化从而发挥各种细胞功能，调节细胞的增殖和存活。且LIFR丰富表达于中枢神经系统、肾脏、肝脏、骨骼、子宫等多种组织器官。LIF和LIFR的广泛分布和数条LIF信号通路决定了LIF功能的复杂多样性。
LIF通路在免疫学领域是一个很有前途的新靶点。有研究报道，LIF信号通路在肿瘤的发生和进展中发挥了重要作用，能够增强肿瘤细胞的迁移和浸润，促进肿瘤转移；同时可以调节肿瘤微环境中多种免疫细胞，包括效应T细胞(T-eff)，调节T细胞(T-reg)，Th17以及髓系细胞等。还有研究表明，LIF信号通路可以促进肿瘤起始细胞(CIC)的活性，增强抗肿瘤治疗(化疗和放疗)的抗性。在多种癌症中，LIF的高表达与不良预后相关。
专利CN111378036A公开了一种抗人白血病抑制因子(LIF)单克隆抗体的制备方法及其应用，其采用小鼠杂交瘤细胞技术制备得到抗人白血病抑制因子单克隆抗体，但该方法抗体筛选的效率和产率较低。专利CN111868086A公开了一系列抗LIF抗体及其应用，其LIF抗体可以结合LIF独特的表位，从而抑制LIF的生物活性。
目前临床上针对LIF靶点的抗体有Northern biologics的MSC-1抗体，该抗体于2019年完成了I期临床研究，目前，正计划开展多项临床疗效试验，将MSC-1用于治疗胰腺癌及肺癌等一系列实体肿瘤。MSC-1抗体是一个人源化单克隆抗体(IgG1)，可以结合免疫抑制人细胞因子LIF，用于治疗成年晚期实体瘤患者。然而，MSC-1抗体只能够结合LIF的特异性表位，因此不能完全竞争掉LIF与受体的结合。EC359是靶向LIFR的小分子抑制剂(EC359:A First-in-Class Small-Molecule Inhibitor for Targeting Oncogenic LIFR Signaling in Triple-Negative Breast Cancer，DOI:10.1158/1535-7163.MCT-18-1258)。
现有技术中尚未有针对LIFR治疗性抗体的报道，因此，亟需开发针对LIF受体(LIFR)的高效特异性的阻断抗原结合蛋白，用于LIFR相关疾病的治疗。
针对上述不足，本发明首次提供了一种全人LIFR抗原结合蛋白及其制备方法和应用。本发明采用人LIFR-ECD蛋白免疫H2L2人源抗体转基因小鼠，利用单个B细胞克隆技术(SBC)，得到了一系列具有生物学功能的人LIFR抗体，该方法大大提高了抗体药物发现的效率和产率，且得到的人LIFR抗体具有很好的亲和力，可阻断huLIF蛋白与huLIFR/gp130细胞的结合，从而抑制STAT3等信号通路，抑制肿瘤的生长，达到肿瘤预防和治疗的目的。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种人LIFR抗原结合蛋白。
具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含以下互补决定区：
(1)包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1HCDR1；
(2)包含SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2HCDR2；
(3)包含SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:25中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3HCDR3；
(4)包含SEQ ID NO:26-SEQ ID NO:32中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1LCDR1；
(5)包含SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:40中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2LCDR2；
(6)包含SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:45中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3LCDR3；
优选地，所述变体序列为与其来源的CDR相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的CDR序列；所述的置换为保守置换。
进一步具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含如下互补决定区：
(1)包含序列如GFTFSSYGMX
1所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:4：GFTFSNYAMT所示的氨基酸序列的重链互补决定区1HCDR1，其中X
1＝H、D或N；
和/或(2)包含序列如VIWYDGX
2NKYYX
3DSVKG所示的氨基酸序列、序列如VIWFDGSX
4KYYADSVKG所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:7：VIWYDGSNKFYADSVRG所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:14：TISGSGAFTYYADAVKG所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:15：VISGSGFLTYYADAVKG所示的氨基酸序列的重链互补决定区2HCDR2，其中X
2＝N或S，X
3＝E、A或T，X
4＝N、I、L或V；
和/或(3)包含序列如SEQ ID NO:16：DGESSMVRGLLNWFDP所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:17：ELRYFDWLLSPFDY所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:21：GERTLDL所示的氨基酸序列、序列如ELWFGELLSPX
5DF所示的氨基酸序列、序列如GQLVX
6DX
7所示的氨基酸序列或序列如GGILTGFDX
8所示的氨基酸序列的重链互补决定区3HCDR3，其中X
5＝L或F，X
6＝G或Q，X
7＝Y、F或L，X
8＝N或Y；
和/或(4)包含序列如RASQSX
9SSSX
10LA所示的氨基酸序列、序列如RASQSISSX
11LX
12所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:32：RASQNLNSNLA所示的 氨基酸序列的轻链互补决定区1LCDR1，其中X
9＝V或I，X
10＝Y或F，X
11＝Y、W或N，X
12＝N或A；
和/或(5)包含序列如GX
13SSRAT所示的氨基酸序列、序列如KASX
14LEX
15所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:35：AASNRAT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:36：AASSLQS所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:40：GASTRAP所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2LCDR2，其中X
13＝A或T，X
14＝S或N，X
15＝S或N；
和/或(6)包含序列如SEQ ID NO:41：QQYGSSPFT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:42：QQSYSTPLT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:43：QQYKSFSPGGLT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:44：QQYKSNPLT所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:45：QQYNNWPRT所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3LCDR3。
进一步具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：
(1)、包含SEQ ID NO:46-SEQ ID NO:59中任一个所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:60-SEQ ID NO:69中任一个所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
或者(2)、与(1)中的任一VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的任一VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
或者(3)、与(1)中的任一VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的任一VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
进一步具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：
(1)包含SEQ ID NO:70-SEQ ID NO:83中任一个所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:84-SEQ ID NO:93中任一个所示的氨基酸序列的轻链LC；
或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
进一步具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：
(1)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:16所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；
(2)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:6所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:27所示的LCDR1，如SEQ ID NO:34所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；
(3)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:18所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；
(4)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:19所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；
(5)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，如SEQ ID NO:19所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:28所示的LCDR1，如SEQ ID NO:35所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；
(6)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:9所示的HCDR2，如SEQ ID NO:19所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:35所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；
(7)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:20所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:29所示的LCDR1，如SEQ ID NO:36所示的LCDR2，如SEQ ID NO:42所示的LCDR3；
(8)如SEQ ID NO:3所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:21所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:37所示的LCDR2，如SEQ ID NO:43所示的LCDR3；
(9)如SEQ ID NO:3所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；
(10)如SEQ ID NO:3所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:39所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；
(11)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，如SEQ ID NO:23所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；
(12)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；
(13)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:13所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；
(14)如SEQ ID NO:4所示的HCDR1，如SEQ ID NO:14所示的HCDR2，如SEQ ID NO:24所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:31所示的LCDR1，如SEQ ID NO:37所示的LCDR2，如SEQ ID NO:43所示的LCDR3；
(15)如SEQ ID NO:4所示的HCDR1，如SEQ ID NO:15所示的HCDR2，如SEQ ID NO:25所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:32所示的LCDR1，如SEQ ID NO:40所示的LCDR2，如SEQ ID NO:45所示的LCDR3。
优选地，所述的人LIFR抗原结合蛋白采用Mega软件进行序列相似性分析，包含以下五组：
组一：(1)所述的抗原结合蛋白；
组二：(2)、(3)、(4)所述的抗原结合蛋白；
组三：(5)、(6)所述的抗原结合蛋白；
组四：(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)所述的抗原结合蛋白；
组五：(14)、(15)所述的抗原结合蛋白。
进一步具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：
(1)如SEQ ID NO:46所示的VH，和/或如SEQ ID NO:60所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:47所示的VH，和/或如SEQ ID NO:61所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:48所示的VH，和/或如SEQ ID NO:62所示的VL；
(4)如SEQ ID NO:49所示的VH，和/或如SEQ ID NO:62所示的VL；
(5)如SEQ ID NO:50所示的VH，和/或如SEQ ID NO:63所示的VL；
(6)如SEQ ID NO:51所示的VH，和/或如SEQ ID NO:64所示的VL；
(7)如SEQ ID NO:52所示的VH，和/或如SEQ ID NO:65所示的VL；
(8)如SEQ ID NO:53所示的VH，和/或如SEQ ID NO:66所示的VL；
(9)如SEQ ID NO:54所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；
(10)如SEQ ID NO:54所示的VH，和/或如SEQ ID NO:68所示的VL；
(11)如SEQ ID NO:55所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；
(12)如SEQ ID NO:56所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；
(13)如SEQ ID NO:57所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；
(14)如SEQ ID NO:58所示的VH，和/或如SEQ ID NO:66所示的VL；
(15)如SEQ ID NO:59所示的VH，和/或如SEQ ID NO:69所示的VL；
或者，与(1)-(15)中的任一VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)-(15)中的任一VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
或者，与(1)-(15)中的任一VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)-(15)中的任一VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
进一步具体地，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：
(1)如SEQ ID NO:70所示的HC，和/或如SEQ ID NO:84所示的LC；
(2)如SEQ ID NO:71所示的HC，和/或如SEQ ID NO:85所示的LC；
(3)如SEQ ID NO:72所示的HC，和/或如SEQ ID NO:86所示的LC；
(4)如SEQ ID NO:73所示的HC，和/或如SEQ ID NO:86所示的LC；
(5)如SEQ ID NO:74所示的HC，和/或如SEQ ID NO:87所示的LC；
(6)如SEQ ID NO:75所示的HC，和/或如SEQ ID NO:88所示的LC；
(7)如SEQ ID NO:76所示的HC，和/或如SEQ ID NO:89所示的LC；
(8)如SEQ ID NO:77所示的HC，和/或如SEQ ID NO:90所示的LC；
(9)如SEQ ID NO:78所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；
(10)如SEQ ID NO:78所示的HC，和/或如SEQ ID NO:92所示的LC；
(11)如SEQ ID NO:79所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；
(12)如SEQ ID NO:80所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；
(13)如SEQ ID NO:81所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；
(14)如SEQ ID NO:82所示的HC，和/或如SEQ ID NO:90所示的LC；
(15)如SEQ ID NO:83所示的HC，和/或如SEQ ID NO:93所示的LC；
或者，与(1)-(15)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
进一步具体地，上述人LIFR抗原结合蛋白包括嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
进一步具体地，上述人LIFR抗原结合蛋白包括全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、di-scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体和/或单域抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
另一方面，本发明提供了一系列编码所述人LIFR抗原结合蛋白的核酸分子。
具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
又一方面，本发明提供了一系列载体，所述的载体包含本申请所述的一个或多个核酸分子。
具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
又一方面，本发明提供了一系列包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本发明所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
又一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包含上述人LIFR抗原结合蛋白。
又一方面，本发明提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞包含上述嵌合抗原受体。
又一方面，本发明提供了一种抗原结合蛋白衍生物，所述的抗原结合蛋白衍生物包含上述人LIFR抗原结合蛋白和可检测的标记分子。
具体地，所述的可检测的标记分子为酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
又一方面，本发明提供了一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含上述人LIFR抗原结合蛋白，和另外的抗体或其片段或抗体类似物。
具体地，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
又一方面，本发明提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含上述人LIFR抗原结合蛋白，所述偶联部分包括但不限于可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合，所述抗体部分和偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含上述人LIFR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体和/或抗体药物偶联物。
具体地，所述的药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
具体地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
又一方面，本发明提供了上述人LIFR抗原结合蛋白的生产方法，所述的方法包括在使得所述抗原结合蛋白表达的情况下，培养上述宿主细胞。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)采用LIFR-ECD蛋白作为抗原免疫小鼠；
(2)筛选分泌抗体的抗原特异性B细胞；
(3)从步骤(2)筛选出的单个B细胞中恢复抗体的重链和轻链序列；
(4)将步骤(3)恢复的抗体重链和轻链与人Fc重组，引入宿主细胞，经细胞培养、纯化制备得到人LIFR抗原结合蛋白。
进一步具体地，步骤(1)中所述的小鼠为人源化小鼠。
优选地，所述的人源化小鼠为Harbour H2L2小鼠，所述的Harbour H2L2转基因小鼠品系能够产生具有全人源可变区的传统的两重链两轻链免疫球蛋白抗体。
进一步具体地，步骤(2)中所述的筛选分泌抗体的抗原特异性B细胞的方法为：使用Beacon光电系统的浆细胞(plasma cell)发现工作流程进行筛选。
进一步具体地，步骤(3)中所述的恢复抗体的重链和轻链序列的方法为单B细胞测序。
进一步具体地，所述的单B细胞测序的步骤为：从单B细胞裂解液中纯化RNA，cDNA的逆转录合成，cDNA的扩增纯化，重链和轻链的扩增，克隆和转染，Sanger测序，对得到的序列进行唯一性和聚类分析，最后将配对的重链和轻链DNA序列进行质粒合成。
又一方面，本发明提供了所述的人LIFR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、抗体药物偶联物和/或药物组合物在制备用于LIF和/或LIFR阻断药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。
具体地，所述的LIFR阻断药物、试剂盒和/或装置主要应用于LIF和/或LIFR表达量增高的疾病中。
又一方面，本发明提供了所述的人LIFR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、抗 体药物偶联物和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗LIFR阳性疾病的药物、试剂盒和/或给药装置中的应用。
又一方面，本发明提供了所述的人LIFR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物在制备LIFR检测试剂或试剂盒中的用途。
又一方面，本发明提供了LIFR检测方法，利用上述人LIFR抗原结合蛋白定性或定量分析检测LIFR，优选地，所述的检测方法用于非疾病诊断或治疗目的。
又一方面，本发明提供了LIFR阳性相关疾病的治疗方法，所述的治疗方法为向有需要的受试者施用有效量的上述人LIFR抗原结合蛋白、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体，抗体药物偶联物和/或药物组合物。
具体地，所述的LIFR阳性疾病为肿瘤，所述肿瘤包括但不限于胆管癌、结直肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、非小细胞肺癌。
又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括所述的人LIFR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、嵌合抗原受体、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、抗体药物偶联物和/或药物组合物，及任选地，说明书。
又一方面，本发明提供了一种给药装置，所述的给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
又一方面，本发明提供了LIFR抗原结合蛋白在制备癌症治疗药物中的用途，所述癌症选自胆管癌、结直肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、非小细胞肺癌。
具体地，所述的LIFR抗原结合蛋白包含上述任意一项LIFR抗原结合蛋白。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明首次提供了一种人LIFR抗体，所述的人LIFR抗体通过免疫人源抗体转基因小鼠(如Harbour H2L2小鼠)制备得到，具有全人源抗体氨基酸和基因序列，从而确保人体使用时的最低可能的免疫原性，去除了毒副作用。
(2)本发明采用单个B细胞克隆技术(SBC)筛选阳性克隆，与传统的单克隆抗体筛选技术相比，可大大提高抗体发现的效率和产率。
(3)本发明制备的人LIFR抗体特异性高，亲和力高，抗肿瘤活性好。
(4)本发明的抗体为全人抗体，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应，具有重大的临床价值。
图1为本发明所述人LIFR抗体在蛋白水平与LIFR-ECD的结合能力检测图，其中A为本发明所述人LIFR抗体与人LIFR-ECD的结合能力检测结果，B为本发明所述人LIFR抗体与猴LIFR-ECD的结合能力检测结果，C为本发明所述人LIFR抗体与小鼠LIFR-ECD的结合能力检测结果。
图2为本发明所述抗体在细胞水平与LIFR和LIFR/gp130结合能力检测图，其中，A为本发明所述抗体与LIFR结合能力检测结果，B为本发明所述抗体与LIFR/gp130结合能力检测结果。
图3为本发明所述抗体阻断LIF与LIFR/gp130结合能力检测图。
图4为本发明所述抗体对STAT3信号通路的抑制作用检测图。
图5为本发明所述抗体在Balb/c小鼠体内PK检测图。
图6为本发明所述抗体在Sprague Dawley大鼠体内的PK检测图，其中，A为PR300516抗体在大鼠体内的PK检测图，B为PR301168抗体在大鼠体内的PK检测图，C为PR300516抗体和PR301168抗体在大鼠体内的PK平均值检测图。
图7为本发明所述抗体在猴子体内的PK检测图，其中，A为10mg/mL单次给药检测结果图，B为100mg/mL单次给药检测结果图。
图8为本发明所述抗体在Capan-2小鼠模型体内的药效学实验检测图。
图9为本发明所述抗体在Capan-1小鼠模型体内的药效学实验检测图。
图10为本发明所述抗体在NCI-H292模型小鼠模型体内的药效学实验检测图。
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
术语定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学用语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有的其他技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968,IUPAC-IUB委员会)中所述。
本发明所述的“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR或FWR)的更保守的区域中。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物、嵌合抗原受体或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键链接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL或LCVR)和重链可变区(VH或HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
术语“互补决定区”(CDR)指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定，例如Kabat、Chothia或，AbM或IMGT编号系统。本发明中使用“Kabat编号规则”(参见Kabat等(1991))确定CDR的氨基酸序列边界。
术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”是指从基本上均质抗体的群里获得的抗体，即除可能的变体抗体外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此。“单克隆”是指从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。本发明所述的单克隆抗体可通过各种本领域技术人员已知的技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及转基因方法等。
术语“人源化单克隆抗体”是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体，可以克服由于嵌合抗体携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变(或回复突变)，以保持活性。为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551；Jakobovits等，1993，Nature 362：255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258；Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859；WO02/43478)。其他 抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。其中，“转基因动物”的实例包括但不限于HARBOURBIOMED的H2L2人源化小鼠。术语“特异性结合”、“选择性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离平衡常数(KD)表示。在本文中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。解离平衡常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以大约小于10
-8M，例如大约小于10
-9M、10
-10M、10
-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“同一性”通常是指在比对序列后，查询序列中氨基酸残基或核苷酸与第二参考多肽序列或其部分中相同的残基所占百分比，必要时引入空位(GAPS)以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸/核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域已知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN，NEEDLE或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个确定的多肽/多核苷酸序列的长度上测定，或者可以在较短的长度上，例如在从较大的确定的多肽/多核苷酸序列中获得的片段的长度上测定。应当理解，在表，附图或序列表中，本文所示的序列所支持的任何片段长度可用于作为可测量同一性百分比的长度。具有“％同一性”的序列保留与其比较或来源的序列的重要生物活性，如抗体结合特异性。具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的序列保留与其比较或来源的序列的重要生物活性，如抗体结合特异性。具有“％同一性”的核苷酸序列或相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的核苷酸序列能够实现与其比较或来源的核苷酸序列近似的功能，如所表达的蛋白都能特异地结合同一抗原或分子。
术语“保守置换”指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残 基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”，通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通 过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHOK1细胞。
术语“药学上可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。
术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如非人灵长类哺乳动物或人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有癌症(包括但不限于胆管癌、结直肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、非小细胞肺癌)，或者，具有患有上述疾病的风险。
术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防 疾病(例如，LIFR阳性相关)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，LIFR阳性相关疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
术语“嵌合抗原受体”指的是嵌合抗原受体T细胞通过识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部位与CD3-δ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体，使得患者的T细胞被“重编码”后，能够生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。把重新编码后的嵌合抗原受体T细胞加进患者身体里，这种嵌合抗原受体就像GPS一样可以特异性地追踪和识别并引导T细胞杀伤肿瘤细胞。大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链和重链组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组获得CAR结构。
术语“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞，例如淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
缩略词
CDR：免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
VH：抗体重链可变区。
VL：抗体轻链可变区。
HC：抗体重链。
LC：抗体轻链。
IgG：免疫球蛋白G。
AbM：AbM CDR定义方式来源于Martin的相关研究(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272)，此定义方法整合了Kabat及Chothia两者的部分定义。
Kabat：由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
Chothia：由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
IMGT：基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information
(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
mAb：单克隆抗体。
EC50：产生50％功效或结合的浓度。
IC50：产生50％抑制的浓度。
ELISA：酶联免疫吸附测定。
PCR：聚合酶链式反应。
HRP：辣根过氧化物酶。
LIFR：白血病抑制因子受体。
IL7Rα：白介素7受体alpha亚基。
TARC：胸腺激活调节趋化因子。
hFc：人IgG抗体Fc段。
KD：解离平衡常数。
HCDR1：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区1。
HCDR2：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区2。
HCDR3：免疫球蛋白重链可变区中的互补决定区3。
LCDR1：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区1。
LCDR2：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区2。
LCDR3：免疫球蛋白轻链可变区中的互补决定区3。
发明详述
抗原结合蛋白
本发明制备了一系列全人源单克隆抗体。这些抗人LIFR抗体是通过免疫全人源抗体转基因小鼠、分子生物学和抗体工程技术制备，具有全人源抗体氨基酸和基因序列，从而确保人体使用时的最低可能的免疫原性。人源抗体转基因小鼠技术最早由Abgenix(XenoMouse)和Madarex(HuMab mouse)开发及用于全人源抗体的制备(Lonberg,et al.(1994)Nature.368(6474):856-859，Lonberg,N.and Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，Harding,F.and Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。早期的转基因小鼠产生全人免疫球蛋白(Ig)，即抗体的可变区和恒定区全为人源序列，因人Ig Fc与小鼠宿主Fc受体不匹配，因而导致免疫反应很弱，抗原免疫后血清中抗体效价很低，表现在低下的单抗制备效率。近年来该技术经过了重大革新和改进，主要表现在重链和轻链可变区采用与宿主免疫球蛋白(Ig)相同和相似的恒定区序列。本发明采用Harbour BioMed公司研发的转基因小鼠(Harbour H2L2)成功地制备了LIFR全人源抗体。Harbour转基因小鼠引入了人免疫球蛋白可变区基因和大鼠免疫球蛋白恒定区基因，小鼠本身的Ig表达则被灭活。该转基因小鼠经抗原免疫后能产生与正常小鼠(如Balb/c)相当的免疫反应和抗体效价。
在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包括以下互补决定区：
(1)包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1HCDR1；
(2)包含SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2HCDR2；
(3)包含SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:25中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3HCDR3；
(4)包含SEQ ID NO:26-SEQ ID NO:32中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1LCDR1；
(5)包含SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:40中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2LCDR2；
(6)包含SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:45中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3LCDR3；
所述变体序列为与其来源的CDR相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的CDR序列。
在某些实施方式中，本发明提供的人LIFR抗原结合蛋白包含如下互补决定区：
(1)包含序列如GFTFSSYGMX
1所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:4：GFTFSNYAMT所示的氨基酸序列的重链互补决定区1HCDR1，其中X
1＝H、D或N；
和/或(2)包含序列如VIWYDGX
2NKYYX
3DSVKG所示的氨基酸序列、序列如VIWFDGSX
4KYYADSVKG所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:7：VIWYDGSNKFYADSVRG所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:14：TISGSGAFTYYADAVKG所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:15：VISGSGFLTYYADAVKG所示的氨基酸序列的重链互补决定区2HCDR2，其中X
2＝N或S，X
3＝E、A或T，X
4＝N、I、L或V；
和/或(3)包含序列如SEQ ID NO:16：DGESSMVRGLLNWFDP所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:17：ELRYFDWLLSPFDY所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:21：GERTLDL所示的氨基酸序列、序列如ELWFGELLSPX
5DF所示的氨基酸序列、序列如GQLVX
6DX
7所示的氨基酸序列或序列如GGILTGFDX
8所示的氨基酸序列的重链互补决定区3HCDR3，其中X
5＝L或F，X
6＝G或Q，X
7＝Y、F或L，X
8＝N或Y；
和/或(4)包含序列如RASQSX
9SSSX
10LA所示的氨基酸序列、序列如RASQSISSX
11LX
12所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:32：RASQNLNSNLA所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1LCDR1，其中X
9＝V或I，X
10＝Y或F，X
11＝Y、W或N，X
12＝N或A；
和/或(5)包含序列如GX
13SSRAT所示的氨基酸序列、序列如KASX
14LEX
15所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:35：AASNRAT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:36：AASSLQS所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:40：GASTRAP所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2LCDR2，其中X
13＝A或T，X
14＝S或N，X
15＝S或N；
和/或(6)包含序列如SEQ ID NO:41：QQYGSSPFT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:42：QQSYSTPLT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:43：QQYKSFSPGGLT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:44：QQYKSNPLT所示的氨 基酸序列或序列如SEQ ID NO:45：QQYNNWPRT所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3LCDR3。
在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL：
(1)、包含SEQ ID NO:46-SEQ ID NO:59中任一个所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:60-SEQ ID NO:69中任一个所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；
或者(2)、与(1)中的任一VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的任一VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；
或者(3)、与(1)中的任一VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的任一VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
在某些实施方式中，本发明提供的抗原结合蛋白包括如下重链HC和轻链LC：
(1)包含SEQ ID NO:70-SEQ ID NO:83中任一个所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:84-SEQ ID NO:93中任一个所示的氨基酸序列的轻链LC；
或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在某些具体的实施方式中，本发明制备获得的人LIFR抗体包括下表1所述的重链及轻链的组合。
表1 结合LIFR蛋白抗体的序列特征
表1中所示的人LIFR抗体通过Mega软件进行序列相似性分析，可分为以下五组：
组一：PR300516；
组二：PR301164、PR301168、PR301176；
组三：PR301152、PR301160；
组四：PR301153、PR301177、PR301195、PR301196、PR301211、PR301215、PR301218；
组五：PR301127、PR301172。
在某些实施例中，从五组蛋白抗体中分别选取PR300516、PR301127、PR301152、PR301168、PR301211进行实验。
抗体衍生物和多特异性抗体
如上部分所述的本发明提供的抗原结合蛋白包括抗体或抗原结合片段，其可进行衍生化(例如被连接至另一个分子，例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会对其与LIFR(特别是人LIFR)的结合产生不利影响。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接于一个或多个其它分子基团，形成双特异性抗体，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
一种类型的衍生化抗体是标记的抗体。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至可检测的标记。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯类化合物、磁珠(例如，
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例 如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
作为另一种抗体的衍生物，本发明提供一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含第一抗体或其片段，和另外的抗体或其片段，或抗体类似物，其中第一抗体或其片段，另外的抗体或其片段，或抗体类似物保留其原始结合特异性。所述第一抗体或其片段是本发明的任一结合TSLP的(单克隆)抗体或其抗原结合片段。如本文中所使用的，“抗体类似物(antibody mimetic)”，指与抗体一样特异性结合抗原，但却没有抗体结构。它们通常是人工肽或蛋白质，摩尔质量约为3至20kDa，例如锚蛋白重复蛋白(DARPin)和fynomer。经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)可以与IgG抗体、scFv-Fc抗体片段或其组合相连，如CN104341529A所述。抗IL-17a的fynomer与抗IL-6R抗体融合产生双特异性融合多肽，如WO2015141862A1所述。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体由第一抗体或其抗原结合片段与其他抗体或其抗原结合片段或抗体类似物通过偶联形成，并且其中各抗体或其抗原结合片段或抗体类似物保持其原结合特异性，所述第一抗体或其抗原结合片段为本发明所述的抗体或其抗原结合片段。某些实施方案中，所述多特异性抗体为双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
抗体药物偶联物
抗体药物偶联物包括本发明提供的抗原结合蛋白部分以及偶联部分。抗原结合蛋白部分包括如上所述的“抗原结合蛋白”，以及在“抗原结合蛋白”基础上 获得的抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb等。偶联部分可以包含至少一个载荷药物。所述载荷药物可以包含药物活性物成分和/或前述的标记分子。载荷药物是一类具有药学活性的小分子化合物或者毒素或其他药物分子形式，可以是但不局限于小分子化合物、毒素分子、寡核苷酸、蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)、亲和配体、荧光基团、核素基团等。本领域已知多种载荷药物。例如，小分子化合物通常是指具有较强细胞毒性的一类物质。示例性的小分子化合物可通过包括但不限于微管蛋白结合、DNA结合、抑制RNA聚合酶、蛋白质合成或抑制拓扑异构酶等机制来发挥此类细胞毒性和细胞抑制性效应。例如，小分子化合物可以是微管蛋白抑制剂；例如，所述微管蛋白抑制剂可以是美登素(例如，DM1或DM4)和奥瑞司他汀(例如，MMAE或MMAF)等等。例如，所述小分子化合物可以是DNA损伤剂；例如，所述DNA损伤剂可以是卡奇霉素(Calicheamicins)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD，pyrrolobenzodiazepines)等等。例如，蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)是一类能够通过诱导靶蛋白的多聚泛素化而导致靶蛋白降解的化合物；例如，所述PROTAC可以是BET蛋白降解剂。所述药物偶联物还可以包含至少一个连接子。例如，所述连接子可包含可断裂连接子或非可断裂连接子。所述连接子用于将一个或多个载荷药物连接到抗原结合蛋白。在本申请中，可断链的连接子可以是便于释放药物的“可切割”连接子。例如，可切割连接子可以包括但不局限于酸敏感连接子，蛋白酶敏感连接子，光敏感连接子，或含二硫化物连接子。连接子可包含一种或多种连接子构件，本领域已知多种连接子构件，例如，马来酰亚胺基己酰基(MC，maleimidocaproyl)，马来酰亚胺基丙酰基(MP)，缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc，valine-citrulline)，对氨基苄氧羰基(PAB，paminobenzyloxycarbonyl)。
核酸、载体、宿主细胞及抗体的制备
本发明的抗原结合蛋白可通过本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
在某些具体的实施方式中，本发明提供了分离的核酸分子，包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段、或其重链可变区和/或轻链可变区、或其一个或多个CDR的核苷酸序列。根据本领域已知的密码子简并性，在某些实施方案中，所述核苷酸序列是可以根据密码子简并性进行替换的。在某些实施方案中，所述核苷酸序列是密码子最优化的。
在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子的克隆载体或表达载体。在某些实施方案中，所述的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，慢病毒等。在某些实施方案中，所述的载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌)。合适的真核细胞包括但不限于NS0细胞、Vero细胞、Hela细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、和MDCKII细胞。适宜的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DXB11、CHO DG44)。
在某些实施方式中，本发明提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
制药用途、治疗方法、药物组合物和给药装置
本发明提供了所述的人LIFR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物在制备用于LIF和/或LIFR阻断药物、制备用于预防和/或治疗LIF和/或LIFR阳性疾病的药物中的用途。
相应地，本发明提供了所述的人LIFR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物用于阻断LIF和/或LIFR、用于预防和/或治疗LIF和/或LIFR阳性疾病方法。
在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗的药物组合物，所述的药物组合物包含所述的人LIFR抗原结合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、免疫细胞、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体和/或抗体药物偶联物及任选地药学上可接 受的载体。“药学上可接受的载体”包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
在某些实施方式中，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
在某些实施方式中，在所述药物组合物中，本发明的抗原结合蛋白与所述组合治疗剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本发明的抗原结合蛋白与所述组合治疗剂可以联合或分开，同时或相继施用。抗LIFR的抗体或其抗原结合片段可单独或与其它治疗剂组合给药。抗LIFR的抗体或其抗原结合片段和一种或多种其它治疗剂可分开、同时或相继给药。
药物组合物可呈任何适合形式(视将其投予患者的所需方法而定)，可通过多种途径(例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内、局部、鞘内和脑室内)向患者投予本发明的人LIFR抗体。在任何指定情况下最适于投药的途径将视特定抗体、个体和疾病的性质和严重度以及个体的身体状况而定。
在某些实施方式中，本发明还提供了施用所述抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物及包含上述成分的药物组合物的给药装置，所述装置包括：
(i)输注模块，所述输注模块用于对受试者施用包括具有一活性成分的药物组合物；
(ii)用于输注的药物组合物，所述药物组合物中含有一活性成分，所述活性成分选自下组：抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物、多特异性抗体、免疫细胞、抗体药物偶联物或其组合；以及
(iii)任选的药效监控模块。
在另一优选例中，所述的施用包括肠道外施用和非肠道外施用。在另一优选例中，所述肠道外施用包括注射施用，所用的注射的路径包括：静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。在另一优选例中，所述非肠道外施用包括外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。在另一优选例中，所述的输注模块为无针皮下注射设备、微量输液泵、经皮给药设备、推注设备，或渗透设备。
检测方法、试剂盒
本发明的抗体或其抗原结合片段能够结合LIFR，从而可用于检测LIFR在样品中的存在或其水平。
在一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白带有可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
在本发明中，所述可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。
在本发明中，提供了对LIFR表达的检测，其包含使用一种或一种以上本发明的人LIFR抗体(任选接合于可检测部分)接触生物样品(个体细胞、组织或体液)，和检测样品关于LIFR表达是否呈阳性，或检测样品相较于对照样品是否具有改变(例如减少或增加)的表达。在某些实施例中，组织或体液为周边血液、周边血液白血球、活组织检查组织(例如肺或皮肤活组织检查)以及组织。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，用于LIF/LIFR途径研究、药物筛选、组化分析等)。在某些实施方案中，用于非诊断目的的样品是细胞样品，例如细胞系或离体细胞培养物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测样品中LIFR的存在或其水平的方法，所述方法包括在允许本发明所述抗体或其抗原结合片段与LIFR之间形成复合物的条件下，使所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，并且检测所述复合物的形成。
在另一个方面，本发明提供了一种诊断受试者中LIFR阳性疾病的方法，包括将本发明所述的抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、或抗体药物偶联物与来自受试者的样品在允许抗体或其抗原结合片段与LIFR之间形成复合物的条件下接触，检测所述复合物的形成，其中与健康对照相比，LIFR水平升高指示存在癌症。
可选地，所述受试者是哺乳动物，包括非人哺乳动物和人。优选地，所述受试者是人。
优选地，所述癌症为胆管癌、结直肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、非小细胞肺癌。
在另一个方面，本发明提供了检测试剂盒，其包含本发明所述的人LIFR抗原结合蛋白、抗原结合蛋白衍生物等，在优选的实施例中，所述试剂盒包含用于描述其使用方法的使用说明书。
实施例1Harbour转基因小鼠免疫
1.免疫原：重组人LIFR蛋白氨基酸序列(GenBank登录号：NP_001121143.1)胞外区1-833位被克隆到含有his标签的pcDNA3.1载体并制备重组表达质粒。对HEK293细胞进行瞬时转染并扩大培养，4天后收集细胞培养液，对培养上清进行纯化，得到高纯度的huLIFR-ECD蛋白(>90％)，具有生物活性，分装后冻存于-80℃。
2.Harbour H2L2小鼠免疫：huLIFR-ECD蛋白用于免疫6-8周Harbour H2L2转基因小鼠。所有的转基因小鼠饲养于SPF级环境中。初次免疫中，50μg huLIFR-ECD蛋白与弗式完全佐剂(Sigma，F5881)乳化后，腹腔注射到小鼠体内。对于后续的加强免疫，25μg huLIFR-ECD蛋白与RIBI佐剂(Sigma，S6322)混匀后，腹腔注射到小鼠体内。每次免疫之间的间隔为2周。在免疫后7天取血用ELISA检测血清抗体滴度，选择血清滴度高的小鼠用于后续单个B细胞筛选实验。
实施例2基于
Optofluidic system的单个B细胞筛选
本申请使用浆细胞(plasma cell)发现工作流程，每次实验中最多可以筛选14k个单个plasma细胞，用于挑选抗体分泌的抗原特异性的浆细胞。然后，将 这些分泌特异性抗体的浆细胞分别导出到含细胞裂解液的96孔板中，用于后续的单个B细胞测序，以鉴定单个B细胞(单克隆)产生的抗体的重链和轻链序列。
实施例3单B细胞测序和全人源抗体的制备
本发明采用单B细胞测序方法从单个浆细胞中获得抗体重链和轻链序列。单B细胞测序已经成为获得抗体序列的强有力工具。一般程序包括从单浆细胞裂解液中纯化RNA，cDNA的逆转录合成，cDNA的扩增纯化，重链和轻链的扩增，克隆和转染，Sanger测序。对得到的序列进行唯一性和聚类分析，然后将配对的重链和轻链DNA序列进行质粒合成。
具体的在得到编码抗体分子的轻、重链可变结构域序列以后，可以采用常规的重组DNA技术，将轻、重链可变结构域序列和相应的人的抗体轻、重链恒定结构域序列进行融合表达，得到重组抗体分子。在本实施例中，抗体重链可变结构域序列(VH)通过基因合成并克隆到编码人IgG1抗体重链恒定结构域序列的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生IgG1抗体的全长重链。抗体轻链可变结构域序列(VL)通过基因合成并克隆到编码人抗体Igκ轻链恒定结构域序列的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生抗体的全长轻链。在本实施例中，由于从免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗LIFR单克隆抗体分子可变结构域的序列是人源抗体序列，因而本实施例也得到全人源的抗LIFR重组IgG1抗体。其中，本发明获得的所述人LIFR抗体重链、轻链互补区决定区(CDR)序列，重链、轻链可变区(V)，重链、轻链序列如上表1所示。
通过Mega软件对表1中的15个抗体进行序列相似性分析，发现上述抗体可分为5组：(1)组一：PR300516；(2)组二：PR301164、PR301168、PR301176；(3)组三：PR301152、PR301160；(4)组四：PR301153、PR301177、PR301195、PR301196、PR301211、PR301215、PR301218；(5)组五：PR301127、PR301172。所有抗体均进行了实施例4.2和4.4的试验。从5组中分别挑选了代表性抗体PR300516、PR301127、PR301152、PR301211、PR301168进行了实施例4.1，4.3，实施例5的试验。代表性抗体PR300516和PR301168进行了体内PK和药效学试验。
5个代表性抗体中，PR300516重链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:94所示，PR300516轻链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示；PR301127重链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:96所示，PR301127轻链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:97所示；PR301152重链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:98所示，PR301152轻链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:99所示；PR301168重链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:100所示，PR301168轻链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:101所示；PR301211重链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:102所示，PR301211轻链可变区的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:103所示。
实施例4重组抗体的表达和纯化
293F细胞用于抗体的表达。调整细胞密度为1×10e6cells/mL。将重链和轻链抗体的质粒按照1：1.5的比例加入管中，然后加入转染试剂PEI，PEI与DNA的比例为4：1，混匀后室温孵育15min。将上述混合物加入细胞中，转染细胞于37℃，5％CO
2孵箱中培养，125rpm振荡。转染后24h补充OPM-CHO PFF05营养(奥浦迈，货号FB1279-001)至终浓度为3％。细胞培养5天后，待细胞活率降为70％以下，收集上清。对转染上清用protein G柱子进行蛋白纯化。
4.1抗体亲和力检测实验
将按照本发明实施例1-4的方法制备得到的5个抗体PR300516、PR301127、PR301152、PR301168、PR301211通过生物膜干涉(Biolayerinterferometry，BLI)的方法(Fortebio octet RED 96e)，检测其对于人LIFR-ECD蛋白的结合动力学。
将待测抗体稀释至终浓度6μg/mL，直接固化到AHC biosensor上，进行动力学测量，将抗原蛋白(Human LIF)用0.02％PBST20分别稀释至100nM、50nM、25nM 3个浓度，进样70s，结合时间为300s，解离时间为300s，10mM glycine-HCl(pH1.5)再生15s。使用简单一对一Languir结合模型(Octet Red96数据分析软件)，计算结合速率(kon)和解离速率(kdis)，平衡解离常数(kD)以比率kdis/kon计算。抗体亲和力检测结果如下表2所示。
表2 抗体亲和力检测结果
| 抗体 | PR301127 | PR301152 | PR301168 | PR301211 | PR300516 | MSC-1 |
| KD | - | 1.57E-08 | 4.92E-10 | 4.21E-10 | 3.04E-10 | 1.25E-09 |
由表2可知，人LIFR抗体的亲和力高于LIF抗体MSC-1的亲和力。
4.2抗体在蛋白水平与LIFR-ECD的结合能力检测
基于ELISA测定法检测本发明通过实施例1-4制备得到的15个抗体与LIFR-ECD蛋白的结合能力。通过比较不同抗体与LIFR-ECD蛋白的结合曲线来测定其结合能力。具体实验过程为：先将人LIFR-ECD，猴LIFR-ECD和小鼠LIFR-ECD蛋白依次稀释成1μg/mL浓度，加入96孔板中，每孔100μL，放置于4℃过夜。96孔板用PBST溶液洗三遍后，加入2％BSA的PBS溶液于37℃放置1h。将待测抗体进行浓度梯度稀释后(100nM，10-fold-dilution)，加入96孔板中，37℃孵育1h。PBST溶液洗三遍后，加入anti-human IgG Fc-HRP二抗(5000x稀释使用)于37℃孵育30-60min。PBST溶液洗三遍后，加入TMB显色液5-15min，然后加入终止液终止显色。
表3 抗体在蛋白水平与LIFR-ECD的结合能力检测结果
检测结果如表3和图1所示，PR300516、PR301127、PR301172、PR301152、PR301153、PR301160、PR301164、PR301168、PR301176、PR301177、PR301195、PR301196、PR301211、PR301215和PR301218抗体都具有和人LIFR-ECD蛋白和猴LIFR-ECD蛋白结合的能力，但只有PR301127和PR301172抗体可与小鼠LIFR-ECD蛋白交叉结合。
4.3抗体在细胞水平与LIFR和LIFR/gp130结合能力检测
基于流式细胞术测定法检测本发明通过实施例1-4制备得到的5个抗体PR300516、PR301127、PR301152、PR301168、PR301211与表达于293T细胞表面的人LIFR受体或者人LIFR/gp130受体异二聚体的结合能力。通过比较不同抗体与表达于293T细胞表面的人LIFR受体或人LIFR/gp130受体异二聚体的结合曲线来测定其结合能力。具体实验过程为：(1)使用lenti-huLIFR和lenti-LIFR/gp130慢病毒感染HEK293T细胞，用嘌呤霉素筛选感染后的细胞得到稳定细胞池：HEK293T-huLIFR和HEK293T-huLIFR/gp130；(2)对稳定的细胞池进行亚克隆筛选，得到高表达目的基因的单克隆细胞系；(3)使用不同浓度的待测抗体与单克隆细胞系于4℃孵育30min，PBS清洗三次后，使用FITC标记的羊抗人二抗与之4℃孵育30min，PBS再次清洗三次后，使用l00μL FACS缓冲液重悬细胞；(4)使用流式细胞仪测定其一通道中位荧光度值。以抗体浓度以10为底的对数为横坐标，以一通道中位荧光度值为纵坐标，比较其EC50及曲线峰值。
表4 抗体在细胞水平与LIFR和LIFR/gp130结合能力检测结果
检测结果如表4和图2所示，人LIFR抗体在同等浓度条件下，与HEK293T-huLIFR/gp130细胞的结合能力要强于与HEK293T-huLIFR细胞的结合。
4.4抗体阻断LIF与LIFR/gp130结合的能力检测
基于流式细胞术测定法检测本发明通过实施例1-4制备得到的15个抗体阻断huLIF蛋白与表达于293T细胞表面的人LIFR/gp130受体异二聚体的结合的能力。通过比较不同抗体阻断huLIF蛋白与HEK293T-huLIFR/gp130细胞结合的曲线来测定其阻断能力。具体实验过程为：(1)首先确定huLIF蛋白与HEK293T-huLIFR/gp130细胞结合的EC80浓度。对huLIF蛋白进行生物素标记(biotin labeling)，得到huLIF-biotin蛋白；(2)使用不同浓度的待测抗体和huLIF蛋白(终浓度为EC80的值)与HEK29ET-huLIFR/gp130细胞于4℃孵育1h，PBS清洗三次后，使用APC标记的Strepavidin二抗与之4℃孵育30min，PBS再次清洗三次后，使用l00μL FACS buffer重悬细胞；(3)使用流式细胞仪测定其四通道中位荧光度值。以抗体浓度以10为底的对数为横坐标，以四通道中位荧光度值为纵坐标作图，比较其IC50及曲线峰值。
表5 抗体阻断LIF与LIFR/gp130结合的能力检测结果
| 抗体 | PR300516 | PR301127 | PR301172 | PR301152 | PR301153 | hIgG1 |
| IC50 | 0.562 | NA | NA | 2.018 | 7.382 | 0.001774 |
| 抗体 | PR301160 | PR301164 | PR301168 | PR301176 | PR301177 | - |
| IC50 | 2.404 | 1.129 | 0.991 | 1.436 | 0.496 | - |
| 抗体 | PR301195 | PR301196 | PR301211 | PR301215 | PR301218 | - |
| IC50 | 0.753 | 0.799 | 0.572 | 0.533 | 0.628 | - |
检测结果如表5和图3所示，与阴性对照hIgG1相比，PR300516、PR301152、PR301153、PR301160、PR301164、PR301168、PR301176、PR301177、PR301195、PR301196、PR301211、PR301215和PR301218都有明显的阻断huLIF与HEK293T-huLIFR/gp130结合的功能。
实施例5抗体对STAT3信号通路的抑制作用检测
基于Western blot检测LIF诱导的STAT3酪氨酸705位点磷酸化的抑制作用，包括Capan-2胰腺癌细胞，MDA-MB-231乳腺癌细胞，A549和NCI-H292非小细胞肺癌细胞。具体实验过程为：先将肿瘤细胞铺于6孔板，每孔1x10
6个细胞，饥饿处理24小时(培养基不加血清)。再将一定浓度的huLIF蛋白与对应的抗体于37℃培养箱中共孵育1h，将huLIF蛋白和抗体混合物加入到肿瘤细胞中，于 37℃培养箱中处理30min。弃掉培养基，用预冷的PBS洗两次。每孔加入200μL预冷的裂解buffer，加入一定量的蛋白酶抑制剂(100×稀释)和磷酸酶抑制剂(50×稀释)。冰上孵育30min后，12000转离心10min。将上清转移到新的EP管中，取25μL上清蛋白进行BCA定量，余下的加入5×SDS buffer，95℃金属浴处理5min。对蛋白样品跑SDS-PAGE胶，转膜后，加block buffer室温孵育1h。一抗Stat3(124H6)Mouse mAb(Cell Signaling Technology，#9139)、Phospho-Stat3(Tyr705)Antibody(Cell Signaling Technology，#9131)4℃过夜。PBST溶液洗三次，每次10min。加二抗Anti-Mouse IgG(Fc Specific)-Peroxidase(Sigma-Aldrich，A0168)、Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Jackson immune research，111-035-045)室温孵育1h。PBST洗三次后，加入A+B显色液，ChemiDoc Imaging System曝光拍照。
检测结果如图4所示，人LIFR抗体在Capan-2胰腺癌细胞，MDA-MB-231乳腺癌细胞，A549和NCI-H292非小细胞肺癌细胞四种肿瘤细胞中均可以抑制由LIF诱导的STAT3信号通路的激活。
实施例6抗体在体内的PK检测
6.1.Balb/c小鼠体内PK
本研究的目的是在雌性Balb/c小鼠静脉注射抗体后确定其药代动力学参数。具体实验过程为：Balb/c小鼠尾静脉注射抗体前，先取血留样。然后按照5mg/kg抗体的剂量尾静脉注射后，在15min，5h，24h，day2，day4，day7，day14和day21时间点取血，检测血清中的抗体浓度。PK实验设计如下表6。
表6 PK实验设计
表7 PK参数统计
| 抗体 | PR300516 | MSC-1 |
| T1/2(hr) | 178.25 | 212.84 |
| Vz(mL/kg) | 114.09 | 81.57 |
| AUCall(hr*μg/mL) | 9521.05 | 16003.13 |
| Cl(mL/hr/kg) | 0.45 | 0.27 |
| C0(μg/mL) | 92.90 | 134.97 |
由表7和图5可知，人LIFR抗体PR300516在小鼠中的半衰期为178.25小时。
6.2.Sprague Dawley大鼠体内PK
本研究的目的是在雄性Sprague Dawley大鼠静脉注射抗体后确定其药代动力学参数。具体实验过程为：Sprague Dawley大鼠尾静脉注射抗体前，先取血留样。然后按照5mg/kg抗体的剂量尾静脉注射后，在给药前，10min，2h，8h，24h，day4，day7，day10，day14，day21和day28时间点取血，检测血清中的抗体浓度。PR300516抗体和PR301168抗体每组各安排3只大鼠进行实验。PK实验设计如下表8。
表8 PK实验设计
表9 大鼠PK参数统计
| 抗体 | PR300516 | PR301168 |
| T1/2(hr) | 219 | 242 |
| Vz(mL/kg) | 122 | 177 |
| AUCall(hr*μg/mL) | 11056.83 | 8173.60 |
| Cl(mL/hr/kg) | 0.40 | 0.53 |
| C0(μg/mL) | 92.78 | 65.32 |
由表9和图6可知，人LIFR抗体PR300516和PR301168在大鼠中的半衰期分别为219小时和242小时。
6.3.猴子体内PK实验
本研究的目的是在雄性和雌性猴子静脉注射抗体后确定其药代动力学参数。具体实验过程为：雄性和雌性猴子尾静脉注射抗体前，先取血留样。然后按照低剂量10mg/kg和高剂量100mg/kg抗体的剂量尾静脉注射后，10mg/kg计量组在给药前，10min，2h，8h，24h，day4，day7，day10，day14时间点取血，100mg/kg计量组在计量组在给药前，10min，2h，8h，24h，day4，day7时间点取血，检测血清中的抗体浓度。PK实验设计如下表10。
表10 PK实验设计
表11 猴PK参数统计
由表11和图7可知，低剂量人LIFR抗体PR300516在猴子中的半衰期分别为173.7小时和182.9小时，高剂量人LIFR抗体PR300516在猴子中的半衰期分别为239.3小时和128.2小时。
实施例7抗体在体内的药效学实验
7.1.Capan-2模型
本实验利用Capan-2小鼠肿瘤模型研究抗人LIFR抗体的抗肿瘤活性。研究了PR300516抗体单独给药(5mg/kg和15mg/kg)在Capan-2小鼠模型中的药效学。人胰腺癌Capan-2细胞(ATCC细胞库)5x10e6细胞数皮下接种到雌性Balb/c nude小鼠(维通利华)。抗体组处理方法为：肿瘤细胞接种后的第5天，第9天，第12天，第16天，第19天和第23天给各组小鼠腹腔注射相应的抗体。小分子抑制剂组处理方法为：肿瘤细胞接种后的第5天，第7天，第9天，第12天，第14天，第16天，第19天，第21天和第23天对小鼠口服EC359小分子抑制剂。肿瘤细胞接种后的第5天，第9天，第12天，第16天，第19天和第23天测量肿瘤的体积，之后对小鼠实施安乐死。结果如表15和图8所示，本申请的抗人LIFR抗体PR300516与阴性对照相比，在单独使用时对肿瘤生长有一定的抑制作用。与EC359小分子抑制剂和MSC-1阳性对照抗体相比，本申请所述的抗人LIFR抗体对肿瘤生长的抑制作用更强。本研究中所有组小鼠在接种后37天，小鼠体重均无明显变化。
7.2.Capan-1模型
本实验利用Capan-1小鼠肿瘤模型研究抗人LIFR抗体的抗肿瘤活性。研究了PR300516和PR301168抗体单独给药(15mg/kg)在Capan-1小鼠模型中的药效学。人胰腺癌Capan-1细胞(ATCC细胞库)5x10e6细胞数皮下接种到雌性Balb/c nude小鼠(维通利华)。抗体组处理方法为：肿瘤细胞接种后的第5天，第8天，第12天，第15天，第18天和第21天给各组小鼠腹腔注射相应的抗体。肿瘤细胞接种后的第5天，第8天，第12天，第15天，第18天,第21天和测量肿瘤的体积，之后对小鼠实施安乐死。结果如表16和图9所示，本申请的抗人LIFR抗体PR300516和PR301168与阴性对照相比，在单独使用时对肿瘤生长有一定的抑制作用。和MSC-1阳性对照抗体相比，本申请所述的抗人LIFR抗体对肿瘤生长的抑制作用更强。本研究中所有组小鼠在接种后25天，小鼠体重均无明显变化。
7.3.NCI-H292模型
本实验利用NCI-H292小鼠肿瘤模型研究抗人LIFR抗体的抗肿瘤活性。研究了PR300516和PR301168抗体单独给药(15mg/kg)在NCI-H292小鼠模型中的药效学。人胰腺癌NCI-H292细胞(ATCC细胞库)5x10e6细胞数皮下接种到雌性 Balb/c nude小鼠(维通利华)。抗体组处理方法为：肿瘤细胞接种后的第5天，第8天，第12天，第15天，第18天和第21天给各组小鼠腹腔注射相应的抗体。肿瘤细胞接种后的第5天，第8天，第12天，第15天，第18天,第21天和测量肿瘤的体积，之后对小鼠实施安乐死。结果如表17和图10所示，本申请的抗人LIFR抗体PR300516和PR301168与阴性对照相比，在单独使用时对肿瘤生长有一定的抑制作用。和MSC-1阳性对照抗体相比，本申请所述的抗人LIFR抗体对肿瘤生长的抑制作用弱一些。本研究中所有组小鼠在接种后25天，小鼠体重均有所下降。
表12 抗体体内药效学实验设计(Capan-2)
表13 抗体体内药效学实验设计(Capan-1)
表14 抗体体内药效学实验设计(NCI-H292)
表15 Capan-2模型中肿瘤生长抑制率统计
| 组别 | 给药 | TGI(％) |
| 1 | Isotype，5mg/kg | 0 |
| 2 | EC359，5mg/kg | 40.99 |
| 3 | EC359，15mg/kg | 47.85 |
| 4 | PR300516，5mg/kg | 54.92 |
| 5 | PR300516，15mg/kg | 55.32 |
| 6 | MSC-1，5mg/kg | 48.93 |
| 7 | MSC-1，15mg/kg | 49.34 |
表16 Capan-1模型中肿瘤生长抑制率统计
| 组别 | 给药 | TGI(％) |
| 1 | Isotype，15mg/kg | 0 |
| 2 | MSC-1，15mg/kg | 53.96 |
| 3 | PR300516，15mg/kg | 59.32 |
| 4 | PR301168，15mg/kg | 59.89 |
表17 NCI-H292模型中肿瘤生长抑制率统计
| 组别 | 给药 | TGI(％) |
| 1 | Isotype，15mg/kg | 0 |
| 2 | MSC-1，15mg/kg | 39.99 |
| 3 | PR300516，15mg/kg | 36.35 |
| 4 | PR301168，15mg/kg | 15.58 |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为 准。
Claims (31)
- 一种人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含以下互补决定区：(1)包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区1HCDR1；(2)包含SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:15中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区2HCDR2；(3)包含SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:25中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的重链互补决定区3HCDR3；(4)包含SEQ ID NO:26-SEQ ID NO:32中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区1LCDR1；(5)包含SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:40中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区2LCDR2；(6)包含SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:45中任一个所示的氨基酸序列或其变体序列的轻链互补决定区3LCDR3；所述变体序列为与其来源的CDR相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的CDR序列。
- 根据权利要求1所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含如下互补决定区：(1)包含序列如GFTFSSYGMX 1所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:4：GFTFSNYAMT所示的氨基酸序列的重链互补决定区1 HCDR1，其中X 1＝H、D或N；和/或(2)包含序列如VIWYDGX 2NKYYX 3DSVKG所示的氨基酸序列、序列如VIWFDGSX 4KYYADSVKG所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:7：VIWYDGSNKFYADSVRG所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:14：TISGSGAFTYYADAVKG所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:15：VISGSGFLTYYADAVKG所示的氨基酸序列的重链互补决定区2 HCDR2，其中X 2＝N或S，X 3＝E、A或T，X 4＝N、I、L或V；和/或(3)包含序列如SEQ ID NO:16：DGESSMVRGLLNWFDP所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:17：ELRYFDWLLSPFDY所示的氨基酸序列、序列如SEQ IDNO:21：GERTLDL所示的氨基酸序列、序列如ELWFGELLSPX 5DF所示的氨基酸序列、序列如GQLVX 6DX 7所示的氨基酸序列或序列如GGILTGFDX 8所示的氨基酸序列的重链互补决定区3HCDR3，其中X 5＝L或F，X 6＝G或Q，X 7＝Y、F或L，X 8＝N或Y；和/或(4)包含序列如RASQSX 9SSSX 10LA所示的氨基酸序列、序列如RASQSISSX 11LX 12所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:32：RASQNLNSNLA所示的氨基酸序列的轻链互补决定区1LCDR1，其中X 9＝V或I，X 10＝Y或F，X 11＝Y、W或N，X 12＝N或A；和/或(5)包含序列如GX 13SSRAT所示的氨基酸序列、序列如KASX 14LEX 15所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:35：AASNRAT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:36：AASSLQS所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:40：GASTRAP所示的氨基酸序列的轻链互补决定区2LCDR2，其中X 13＝A或T，X 14＝S或N，X 15＝S或N；和/或(6)包含序列如SEQ ID NO:41：QQYGSSPFT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:42：QQSYSTPLT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:43：QQYKSFSPGGLT所示的氨基酸序列、序列如SEQ ID NO:44：QQYKSNPLT所示的氨基酸序列或序列如SEQ ID NO:45：QQYNNWPRT所示的氨基酸序列的轻链互补决定区3 LCDR3。
- 根据权利要求2所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：(1)、包含SEQ ID NO:46-SEQ ID NO:59中任一个所示的氨基酸序列的重链可变区VH；和/或包含SEQ ID NO:60-SEQ ID NO:69中任一个所示的氨基酸序列的轻链可变区VL；或者(2)、与(1)中的任一VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)中的任一VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；或者(3)、与(1)中的任一VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添 加或其任意组合的VH；和/或，与(1)中的任一VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
- 根据权利要求3所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：(1)包含SEQ ID NO:70-SEQ ID NO:83中任一个所示的氨基酸序列的重链HC；和/或包含SEQ ID NO:84-SEQ ID NO:93中任一个所示的氨基酸序列的轻链LC；或者(2)重链和轻链，其中，与(1)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
- 根据权利要求1-4任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：(1)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:16所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；和/或(2)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:18所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；和/或(3)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:6所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:27所示的LCDR1，如SEQ ID NO:34所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；和/或(4)如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:19所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:26所示的LCDR1，如SEQ ID NO:33所示的LCDR2，如SEQ ID NO:41所示的LCDR3；和/或(5)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，如SEQ ID NO:23所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；和/或(6)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:20所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:29所示的LCDR1，如SEQ ID NO:36所示的LCDR2，如SEQ ID NO:42所示的LCDR3；和/或(7)如SEQ ID NO:3所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:21所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:37所示的LCDR2，如SEQ ID NO:43所示的LCDR3；和/或(8)如SEQ ID NO:3所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；和/或(9)如SEQ ID NO:3所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:39所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；和/或(10)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3；和/或(11)如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:13所示的HCDR2，如SEQ ID NO:22所示的HCDR3，和/或如SEQ ID NO:30所示的LCDR1，如SEQ ID NO:38所示的LCDR2，如SEQ ID NO:44所示的LCDR3。
- 根据权利要求5所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：(1)如SEQ ID NO:46所示的VH，和/或如SEQ ID NO:60所示的VL；(2)如SEQ ID NO:48所示的VH，和/或如SEQ ID NO:62所示的VL；(3)如SEQ ID NO:47所示的VH，和/或如SEQ ID NO:61所示的VL；(4)如SEQ ID NO:49所示的VH，和/或如SEQ ID NO:62所示的VL；(5)如SEQ ID NO:55所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；(6)如SEQ ID NO:52所示的VH，和/或如SEQ ID NO:65所示的VL；(7)如SEQ ID NO:53所示的VH，和/或如SEQ ID NO:66所示的VL；(8)如SEQ ID NO:54所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；(9)如SEQ ID NO:54所示的VH，和/或如SEQ ID NO:68所示的VL；(10)如SEQ ID NO:56所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；(11)如SEQ ID NO:57所示的VH，和/或如SEQ ID NO:67所示的VL；或者，与(1)-(11)中的任一VH相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VH；和/或，与(1)-(11)中的任一VL相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的VL；或者，与(1)-(11)中的任一VH相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VH；和/或，与(1)-(11)中的任一VL相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的VL；所述的置换是保守置换。
- 根据权利要求6所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包含：(1)如SEQ ID NO:70所示的HC，和/或如SEQ ID NO:84所示的LC；(2)如SEQ ID NO:72所示的HC，和/或如SEQ ID NO:86所示的LC；(3)如SEQ ID NO:71所示的HC，和/或如SEQ ID NO:85所示的LC；(4)如SEQ ID NO:73所示的HC，和/或如SEQ ID NO:86所示的LC；(5)如SEQ ID NO:79所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；(6)如SEQ ID NO:76所示的HC，和/或如SEQ ID NO:89所示的LC；(7)如SEQ ID NO:77所示的HC，和/或如SEQ ID NO:90所示的LC；(8)如SEQ ID NO:78所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；(9)如SEQ ID NO:78所示的HC，和/或如SEQ ID NO:92所示的LC；(10)如SEQ ID NO:80所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；(11)如SEQ ID NO:81所示的HC，和/或如SEQ ID NO:91所示的LC；或者，与(1)-(11)中的重链和轻链相比，所述重链具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和/或，所述轻链具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
- 根据权利要求1-7任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述 的人LIFR抗原结合蛋白包括嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
- 根据权利要求1-8任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白，其特征在于，所述的人LIFR抗原结合蛋白包括全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、di-scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体和/或单域抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
- 编码权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白的核酸分子。
- 包含权利要求10所述的核酸分子的载体。
- 包含权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的载体的宿主细胞。
- 一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包含权利要求1-9中任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白。
- 一种免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞包含权利要求13所述的嵌合抗原受体。
- 一种抗原结合蛋白衍生物，其特征在于，所述的抗原结合蛋白衍生物包含权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白和可检测的标记分子，所述的可检测的标记分子为酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。
- 一种多特异性抗体，其特征在于，所述的多特异性抗体包含权利要求1-9任一项所述的人LIFR抗原结合蛋白，和另外的抗体或其片段或抗体类似物；所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
- 一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白，所述偶联部分包括但不限于可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合，所述抗体部分和偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
- 一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11所述的载体、权利要求12所述的宿主细胞、权利要求14所述的免疫细胞、权利要求15所述的抗原结合蛋白衍生物、权利要求16所述的多特异性抗体和/或权利要求17所述的抗体药物偶联物及任选地药学上可接受的载体。
- 根据权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
- 权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白的生产方法，其特征在于，所述的方法包括在使得权利要求1-9任一项所述的抗原结合蛋白表达的情况下，培养权利要求12所述的宿主细胞。
- 根据权利要求20所述的人LIFR抗原结合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)采用LIFR-ECD蛋白作为抗原免疫小鼠；(2)筛选分泌抗体的抗原特异性B细胞；(3)从步骤(2)筛选出的单个B细胞中恢复抗体的重链和轻链序列；(4)将步骤(3)恢复的抗体重链和轻链引入宿主细胞，经细胞培养、纯化制备得到人LIFR抗原结合蛋白。
- 权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11所述的载体、权利要求12所述的宿主细胞、权利要求13所述的嵌合抗原受体、权利要求14所述的免疫细胞、权利要求15所述的抗原结合蛋白衍生物、权利要求16所述的多特异性抗体、权利要求17所述的抗体药物偶联物和/或权利要求18-19所述的药物组合物在制备用于LIF和/或LIFR阻断药物、试剂盒和/或医疗装置中的应用。
- 权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述的载体、权利要求13所述的宿主细胞、权利要求14所述的嵌合抗原受体、权利要求15所述的免疫细胞、权利要求16所述的抗原结合蛋白衍生物、权利要求17所述的多特异性抗体、权利要求18所述的抗体药物偶联物和/或权利要求19-20所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗LIFR阳性疾病的药物、试剂盒和/或给药装置中的应用。
- 权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白、权利要求15所述的抗原结合蛋白衍生物在制备LIFR检测试剂或试剂盒中的用途。
- LIFR检测方法，其特征在于，利用权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白定性或定量分析检测LIFR，所述的检测方法用于非疾病诊断或治疗目的。
- LIFR阳性相关疾病的治疗方法，其特征在于，所述的方法为向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白、权利要求14所述的免疫细胞、权利要求15所述的抗原结合蛋白衍生物、权利要求16所述的多特异性抗体，权利要求17所述的抗体药物偶联物和/或权利要求18-19所述的药物组合物。
- 根据权利要求23所述的应用或权利要求26所述的方法，其特征在于，所述LIFR阳性疾病为肿瘤，所述肿瘤包括但不限于胆管癌、结直肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和非小细胞肺癌。
- 试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-9任意一项所述的人LIFR抗原结合蛋白、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11所述的载体、权利要求12所述的宿主细胞、权利要求13所述的嵌合抗原受体、权利要求14所述的免疫细胞、权利要求15所述的抗原结合蛋白衍生物、权利要求16所述的多特异性抗体、权利要求17所述的抗体药物偶联物和/或权利要求18-19所述的药物组合物，及任选地，说明书。
- 给药装置，其特征在于，所述的给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用权利要求18或19所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
- LIFR抗原结合蛋白在制备癌症治疗药物中的用途，其特征在于，所述癌症选自胆管癌、结直肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和非小细胞肺癌。
- 根据权利要求30所述的用途，其特征在于，所述LIFR抗原结合蛋白如权利要求1-9任一项所述。
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