CN110029168A - 基因fgl1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用及试剂盒 - Google Patents

基因fgl1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，诊断试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FGL1基因和管家基因的引物对；SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。本发明以FGL1作为检测诊断的靶点应用于临床制备得到诊断试剂盒，可以对包括结直肠癌和肺癌在内的癌症进行快速诊断和预测；能够通过检测FGL1基因的转录水平及其表达情况，可以判断受试者是否患有癌症；为疾病的早期诊断和癌症的治疗提供依据。

Description

基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用及试剂盒。
背景技术
在过去10年中，癌症研究取得了很大进展，包括癌症机制，药物发现和治疗方式。然而，结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，患者的5年生存率仍然很低。由于结直肠癌经常发生恶性增殖以及淋巴转移，因此很少有患者可以通过手术完全治愈。因此，结直肠癌的早期诊断和治疗是非常必要的。目前，可预测预后的生物标志物和常规临床病理参数有限，几乎没有有效的治疗方案。因此探究结直肠癌进展过程中的关键分子及调节通路对指导结直肠癌早期诊治从而降低病死率改善预后非常重要。
现有技术中可以得知：纤维蛋白原样蛋白1、FGL1是纤维蛋白原家族的成员，主要在肝脏中表达，并首先从人肝细胞癌中克隆。以前的研究表明，FGL1的表达在再生肝脏中增加，并且可以刺激原代肝细胞中3H-胸苷的摄取，这暗示FGL1促进肝细胞增殖。此外，重组FGL1可防止暴发性肝衰竭大鼠的肝损伤。这些观察结果表明FGL1在肝再生和肝脏保护中起作用。除了在肝脏中的表达外，还在脂肪组织中报道了FGL1的表达。FGL1蛋白是机体自身表达的蛋白，有免疫调节作用。正常情况下，FGL1蛋白表达局限于正常的肝脏和胰腺组织中。
综上所述，现有技术中缺少FGL1相关的基因、标志物等与肿瘤或者癌症的关联，FGL1的表达在肿瘤形成、迁移、侵袭、逃逸等过程中的机理作用。
本发明研究者发现，在许多实体瘤中包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤以及乳腺癌都有FGL1蛋白表达的上调，肺癌中比例最高。本研究者实验也证实，在很多人类肿瘤组织中，FGL1蛋白的表达上调，尤其是非小细胞肺癌。
由于目前尚无研究调查结直肠癌组织中FGL1的表达，而且FGL1在结直肠癌中的作用仍不明确。因此，本发明是根据本研究者的发现，提出一种新的用于诊断癌症的试剂盒，特别是用于诊断肺癌和结直肠癌。因此以FGL1作为肿瘤治疗的潜在药物靶点和生物标志物，在结直肠癌的诊断和治疗过程中具有重要作用。
由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
由于单克隆抗体的优势，现有技术中以蛋白质标志物作为抗原制备特异性抗体的方法较为成熟。例如在专利CN2018116124820，名称为一种外泌体肿瘤标志物PDL1的快速检测试剂盒的发明专利中，其公开了单克隆抗体作为试剂盒的应用。
从单克隆抗体的制备过程中可以看出，单克隆抗体的抗体类型主要取决于抗原决定簇。由于高分子蛋白质一般具有多个抗原决定簇，因此往往得到的抗体是多种抗原决定簇共同免疫应答得到的抗体，抗体的纯度往往较低，往往需要经过筛选才能给使用。
为了解决上述技术问题，现有技术中往往通过对抗原进行筛选。例如在CN1122108C-口蹄疫病毒的免疫原性肽的专利中，其采用的是基因组蛋白质L/L，2B，2C，3A，3B的部分区域，即采用这部分的蛋白质肽链作为抗原。
由此可见，只要选择合适的蛋白质肽链片段，也能给实现正常的免疫应答，获得更理想的单抗。
因此，对于FGL1蛋白质或者基因来说，也可以采用上述方法获得专一性更强的抗原或者抗原。单克隆抗体的制备一般需要经过动物免疫、细胞融合、细胞筛选、克隆化等。
克隆化的意义在于：从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系(又称亚克隆)，也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。
发明内容
本发明的目的之一是提供基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用；另一个目的是提供一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒能够用于诊断癌症，特别是用于结直肠癌和肺癌的诊断；该诊断试剂盒是利用对基因FGL1的检测或者对基因FGL1标志物的检测。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，诊断试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FGL1基因和管家基因的引物对；SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
优选的，述诊断试剂盒中，扩增FGL1基因的引物对的序列如下：
正向引物序列为5’—ATGTCATGCAATGAGGCAATA—3’；
反向引物序列为5’—CATGTATACTTATTGCTATCA—3’。
优选的，管家基因是GAPDH，扩增管家基因GAPDH的引物对的序列如下：
正向引物序列为5’—TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT—3’；
反向引物序列为5’—GGTGGAATCATATTGGAACA—3’。
优选的，诊断试剂盒中还包括逆转录体系，逆转录体系包括T重复寡核苷酸OligodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；逆转录反应液包括250mMpH为8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
本发明还公开了基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用；癌症包括结直肠癌和肺癌，试剂盒包括FGL1蛋白的特异性抗体，特异性抗体是以FGL1蛋白为免疫原得到的单克隆抗体；单克隆抗体是以纯化FGL1蛋白或作为免疫原对小鼠进行免疫，经过效价检测达标后进行细胞融合，经筛选克隆获得能够分泌单克隆抗体的杂家瘤细胞，再由杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还公开了基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用；癌症包括结直肠癌和肺癌，试剂盒包括FGL1蛋白的特异性抗体，特异性抗体是以FGL1免疫原性肽段为免疫原得到的单克隆抗体；单克隆抗体是以纯化FGL1免疫原性肽段作为免疫原对小鼠进行免疫，经过效价检测达标后进行细胞融合，经筛选克隆获得能够分泌单克隆抗体的杂家瘤细胞，再由杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体。
本发明还要求解决的技术问题是：以FGL1基因对应的蛋白标志物作为免疫原产生的单抗能够与FGL2的蛋白标志物产生一定程度上的特异性结合，使得检测的准确度降低了。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种免疫原性肽段为FGL1基因组编码的蛋白质的免疫原性结构域的部分片段；免疫原性结构域为Fibrinogen-C结构域，免疫原性肽段选择免疫原性结构域的蛋白质氨基酸序列中第61至第241个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
本发明公开了一种试剂盒，包括特异性抗体，所述特异性抗体是以FGL1免疫原性肽段为免疫原得到的单克隆抗体；所述免疫原性结构域为Fibrinogen-C结构域，所述免疫原性肽段选择免疫原性结构域的蛋白质氨基酸序列中第61至第241个氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
综上所述，本发明具有以下优点：
本发明以FGL1作为检测诊断的靶点应用于临床制备得到诊断试剂盒，可以对包括结直肠癌和肺癌在内的癌症进行快速诊断和预测；能够通过检测FGL1基因的转录水平及其表达情况，可以判断受试者是否患有癌症；为疾病的早期诊断和癌症的治疗提供依据。
附图说明
图1为本发明一个实施例中癌症组织和正常组织中FGL1相对表达量的示意图，其中以癌症组织中FGL1的表达量为100％计。
具体实施方式
本发明提供了基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，诊断试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FGL1基因和管家基因的引物对；SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
诊断试剂盒中，扩增FGL1基因的引物对的序列如下：
正向引物序列为5’—ATGTCATGCAATGAGGCAATA—3’；
反向引物序列为5’—CATGTATACTTATTGCTATCA—3’。
管家基因是GAPDH，扩增管家基因GAPDH的引物对的序列如下：
正向引物序列为5’—TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT—3’；
反向引物序列为5’—GGTGGAATCATATTGGAACA—3’。
诊断试剂盒中还包括逆转录体系，逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；逆转录反应液包括250mMpH为8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
本发明还提供了一种所述诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样本总RNA的提取。用RNA抽提体系获得结直肠组织样本的总RNA；具体步骤为：
a、获取直肠组织样本，置于离心管后立即放入液氮中；
b、组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
c、取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
d、取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；弃上清，加入1ml75％乙醇(用DEPC水现配现用)，于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；弃上清后，室温干燥5-7mins；
e、加入适量(20-30ul)的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃(最好-80℃)保存，检测RNA浓度，并电泳检测。
(2)将样本总RNA逆转录为cDNA，即使用逆转录体系将获得的总RNA经过逆转录为样本的cDNA。逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；逆转录反应液包括250mMpH为8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
具体步骤为：
使用逆转录反应液对2微克总RNA进行逆转录，采用100微升的反应体系，每个样品取2微克总RNA作为模板RNA，然后在PCR试管中加入Nuclease-Free Water 8微升，oligo(dt)1微升，65℃反应5min、然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4微升、dNTP Mix2微升以及Reverse Transcriptase 1微升，于5℃反应60min；低速离心后70℃下灭火5min。
(3)使用PCR扩增仪对FGL1基因和管家基因进行扩增；扩增完毕后进行定量检测；具体步骤为：
配制SYBR Green聚合酶链式反应体系25微升，正向引物10微摩，模板cDNA2微升，无没水10微升、扩增FGL1的正向引物序列为5’—ATGTCATGCAATGAGGCAATA—3’；反向引物序列为5’—CATGTATACTTATTGCTATCA—3’。
设置扩增程序，75℃10min，以SYBR Green作为荧光标记物，通过融解曲线分析和电泳确定，CT法进行相对定量。
(4)若FGL1的基因表达提高，则说明诊断对象为结肠癌患者。
实验一：FGL1在结直肠癌组织和正常组织中的表达
实验目的：检测FGL1在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达，即通过实验验证FGL1在结肠癌组织中具有更高的表达。
实验材料：收集100个结肠癌组织样本，同时收集100个正常组织样本，采用荧光实时定量PCR进行经典的分子生物学实验验证(qRT-PCR)。
实验步骤：
(1)样本总RNA的提取。用RNA抽提体系获得结直肠组织样本的总RNA；具体步骤为：
a、获取直肠组织样本，置于离心管后立即放入液氮中；
b、组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
c、取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
d、取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；弃上清，加入1ml75％乙醇(用DEPC水现配现用)，于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；弃上清后，室温干燥5-7mins；
e、加入适量(20-30ul)的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃(最好-80℃)保存，检测RNA浓度，并电泳检测。
(2)将样本总RNA逆转录为cDNA，即使用逆转录体系将获得的总RNA经过逆转录为样本的cDNA。逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；逆转录反应液包括250mMpH为8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
具体步骤为：
使用逆转录反应液对2微克总RNA进行逆转录，采用100微升的反应体系，每个样品取2微克总RNA作为模板RNA，然后在PCR试管中加入Nuclease-Free Water 8微升，oligo(dt)1微升，65℃反应5min、然后加入5×Reverse Transcript Reaction Buffer 4微升、dNTP Mix2微升以及Reverse Transcriptase 1微升，于5℃反应60min；低速离心后70℃下灭火5min。
(3)使用PCR扩增仪对FGL1基因和管家基因进行扩增；扩增完毕后进行定量检测；具体步骤为：
配制SYBR Green聚合酶链式反应体系25微升，正向引物10微摩，模板cDNA2微升，无没水10微升、扩增FGL1的正向引物序列为5’—ATGTCATGCAATGAGGCAATA—3’；反向引物序列为5’—CATGTATACTTATTGCTATCA—3’。
设置扩增程序，75℃10min，10min分为45个循环，以SYBR Green作为荧光标记物，通过熔解曲线分析和电泳确定，CT法进行相对定量。
实验结果：
通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常组织相比，FGL1基因在结肠癌组织中的表达上调。
实验二：FGL1在细胞系中显著高表达
选择不同结直肠的细胞系，利用qPCR技术检测FGL1在结直肠癌细胞系(SW480、SW620、SW1116、HCT116、HT29)和正常结直肠粘膜上皮细胞系(FHC)中的表达模式，发现FGL1在结直肠癌细胞系中均显著高表达。由此可以说明FGL1在结直肠癌细胞系中异常高表达，可能在结直肠癌的发生和发展过程中扮演着重要的角色。
实验三：敲低FGL1的表达对癌细胞的影响实验
本实验对敲低FGL1的癌细胞和未处理的癌细胞进行对比实验，检测敲低前后癌细胞的增殖和迁徙能力。实验结果得知敲低FGL1的表达抑制了结直肠细胞的增殖和迁移，并诱导了细胞凋亡。
选择相较于其他结直肠癌细胞系，FGL1表达水平较高的结直肠癌细胞系(SW480、HCT116)作为这一部分实验的研究对象。首先，利用RNA干扰技术敲低FGL1在SW480、HCT116细胞中的表达。合成靶向FGL1的shRNA，通过Lipofectamine2000脂质体将shRNA转染至SW480、HCT116细胞中，qRT-PCR检测FGL1的表达水平。
结果显示，相比于阴性对照组(NC)，shRNA的转染显著降低了SW480和HCT116细胞中FGL1的表达。
此外，本发明还进行了CCK8实验和克隆形成实验，结果表明FGL1的敲低显著抑制了SW480和HCT116细胞的增殖和克隆形成，转染shRNA 72h的SW480和HCT116细胞的OD值显著低于阴性对照组，形成细胞克隆的数量也明显少于阴性对照组。与此同时，流式细胞仪检测发现，FGL1的敲低显著诱导了SW480和HCT116细胞的凋亡，并影响了凋亡相关蛋白的表达。
除对细胞增殖和凋亡的影响外，FGL1的表达还影响了结直肠癌细胞的迁移和侵袭。Transwell实验结果表明，FGL1的敲低明显阻碍了SW480和HCT116细胞的侵袭。转染shRNA后结直肠癌细胞穿过膜的细胞数量明显少于阴性对照组。划痕实验结果表明，FGL1的敲低明显抑制了SW480和HCT116细胞的迁移。转染shRNA后结直肠癌细胞划痕愈合的面积和速度明显低于阴性对照组。这些结果表明，FGL1的表达对于维持结直肠癌细胞的恶性表型至关重要。
从上述实验可以看出，FGL1基因对结直肠癌和肺癌的形成、迁移等具有一定影响，由于基因的表达产物是蛋白质，基因是通过蛋白质来实现相应的功能的，FGL1基因能够对癌症的形成等产生影响是由于蛋白质的表达来实现的。因此，FGL1基因表达的蛋白质可以用于诊断癌症。
因此，本发明要求保护基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用；癌症包括结直肠癌和肺癌，试剂盒包括FGL1蛋白的特异性抗体，特异性抗体是以FGL1蛋白为免疫原得到的单克隆抗体；单克隆抗体是以纯化FGL1蛋白或作为免疫原对小鼠进行免疫，经过效价检测达标后进行细胞融合，经筛选克隆获得能够分泌单克隆抗体的杂家瘤细胞，再由杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体。
蛋白质的活性是因为其具有相关的空间结构，蛋白质能够具有免疫原性是由于蛋白质中具有抗原决定簇，能够刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞。
现有技术中，较少有FGL1蛋白质作为癌症诊断试剂的应用研究，对应FGL1蛋白质的抗原性研究更少。FGL1蛋白质的氨基酸序列表如SEQ ID NO：1所示。
FGL1基因是位于8p22的基因，其对应的编码蛋白质具有312个氨基酸片段，其第1-第22位氨基酸序列肽段为信号肽Signal peptide；第23-第312位氨基酸序列肽段是蛋白质具有免疫原性的相关结构域。因此，实际上FGL1的免疫原性存在于第23-第312位肽链上，本文简称该肽链为活性肽链；该活性肽链上具有若干二硫键，包括位于第26号氨基酸的二硫键，位于第83和第112上的二硫键以及位于第248和第261上的二硫键。FGL1的结构域是纤维蛋白原β和γ链上c端的球状域。
因此，基于上述现有技术，本发明提出通过FGL1的蛋白标志物用于制备诊断试剂盒的特异性抗体，特异性抗体是以FGL1蛋白标志物作为抗原产生的抗体。
根据上述理论，本发明公开了基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用；癌症包括结直肠癌和肺癌，试剂盒包括FGL1蛋白的特异性抗体，特异性抗体是以FGL1免疫原性肽段为免疫原得到的单克隆抗体；单克隆抗体是以纯化FGL1免疫原性肽段作为免疫原对小鼠进行免疫，经过效价检测达标后进行细胞融合，经筛选克隆获得能够分泌单克隆抗体的杂家瘤细胞，再由杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体，优选肽段的氨基酸序列表如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，本发明公开了基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用，免疫原性肽段为FGL1基因组编码的蛋白质的免疫原性结构域的部分片段；免疫原性结构域为Fibrinogen-C结构域，免疫原性肽段选择免疫原性结构域的蛋白质氨基酸序列中第61至第241个氨基酸，氨基酸序列表如SEQ ID NO：2所示。
实验四：以FGL1蛋白标志物或者肽链为抗原制备特异性单克隆抗体
1、实验背景
FGL1基因是位于8p22的基因，其对应的编码蛋白质具有312个氨基酸片段，其第1-第22位氨基酸序列肽段为信号肽Signal peptide；第23-第312位氨基酸序列肽段是蛋白质具有免疫原性的相关结构域。具体的，FGL1蛋白标志物的结构域是纤维蛋白原β和γ链上c端的球状域。然而，FGL1属于纤维蛋白基因，大部分纤维蛋白原β和γ链有高度同源性，若以FGL1整个蛋白质链条作为抗原免疫得到的单克隆抗体能给与纤维蛋白原家族中FGL2蛋白质结合，这使得制备得到的单克隆抗体的特异性降低。即FGL1与纤维蛋白原家族的纤维蛋白原FGL2具有共同抗原，以FGL1基因蛋白标志物作为抗原进行单克隆抗体制备获得的抗体能给与FGL家族中近似的FGL2的蛋白标志物或者抗原进行较弱的特异性结合。经过研究，FGL1中位于第28-第52氨基酸序列上存在的抗原决定簇与纤维蛋白原FGL2的抗原决定簇相同。
因此，需要将FGL1蛋白的结构域中剪出部分结构，选择能够与FGL2纤维蛋白原具有显著性区别的肽链作为抗原，使得制备得到的单克隆抗体的特异性更高。
2、抗原的准备
抗原A：FGL1基因对应的蛋白质标志物，含有312个氨基酸；含有第1至第312个氨基酸。氨基酸序列表如SEQ ID NO：1所示。
抗原B：FGL1基因对应的蛋白质标志物的部分结构域，含有第61至第241个氨基酸。氨基酸序列表如SEQ ID NO：2所示。
抗原C：FGL2基因对应的蛋白质标志物。FGL2是位于7q11.23的基因。
3、单克隆抗体的制备方法：
(1)免疫动物
以抗原A和抗原B分别作为目的抗原进行分别实验，分别获取对应的单克隆抗体。
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞。选用8周龄雌性小鼠。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
(2)细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
A、将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1：5～1：10比例混合，·加入20～50mlRPMI-1640液。1000r/min×6～10min离心弃上清，将上清尽量吸净。
B、用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中。吸取1ml37℃预温的50％PEG·缓慢滴入离心管内，45秒左右加完，边加边轻轻搅拌，37℃静置1～5min。
C、在5min内滴加不完全完全培养液(37℃预温)20ml，第一分钟内滴加1ml，第2分钟2ml，第3分钟5ml，第4和第5分钟各6ml，同时应边加边轻轻地转动离心管，应沿管壁滴加，不应直接滴加在沉淀细胞上，以防将刚融合的细胞冲开。然后加1640液至50ml使PEG作用终止。800r/min×5～10min离心，弃上清。
D、将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液中，接种24孔板(每孔1.0-1.5ml)或96孔培养板(每孔0.10-0.15ml)。接种完毕后,将培养板放入37℃5％CO2温箱中培养。
(3)选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞和淋巴细胞逐渐死亡。融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
(4)杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
(5)单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法：
①体内诱生法：取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
②体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一次是筛选出杂交瘤细胞；另一次是在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂家瘤细胞，这两次筛选的方法和原理各不相同。
a、用20G或22G的注射针，小鼠腹膜内注射降植烷，每只鼠0.5～1ml，1周后接种细胞。在175cm2培养瓶中加完全DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。将培养液转入50ml锥形离心管中，室温下500g离心5min。
b、细胞重悬于50ml无菌的PBS或HBSS(不含FBS)中洗涤。然后室温下500g离心5min，弃上清。重复2次，然后细胞重悬于5ml的PBS或HBSS中。计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细胞活力。用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5×102细胞/ml。
c、用一个10ml的无菌的带22G针头的注射器，对裸鼠进行腹膜内注射2ml细胞，等待腹水形成(1～2周)。
d、收获腹水。
一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。另一只手将一只18G的计头插入小鼠腹腔1～2cm深。进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中线处的主要大血管。令腹水滴入一只无菌的15ml聚丙烯锥形离心管中。于室温下，1 500g离心腹水10min，收集上清，弃沉淀，将腹水存放于4℃，直到收集腹水的工作完成(在1周内)。再次收获腹水前，让小鼠再次积累腹水(2～3天)，具体操作同步骤8，腹水的加工处理操作同步骤9。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。
e、把在几天内收集到的腹水汇集到一起，于56℃水浴45min进行热处理，如果凝块形成，可用牙签挑出除之，然后再离心。采用适当的方法检测腹水中的MAb的效价。按大于1：10的比例稀释MAb，并进行滤过除菌，滤膜孔径为0.45μm，分装并冻存于-70℃，避免反复冻融，可冻存数年之久。
制备结果：
获得抗原A对应的单克隆抗体A以及抗原B对应的单克隆抗体B。
4、双向免疫扩散实验
第一步：实验方法
a、在沸水浴中溶解1％离子琼脂；冷至50～60℃左右，吸3.5～4ml加在载玻片(必须放在水平位置)上，使其均匀布满玻片而又不流失。
b、琼脂凝固后，取方阵型打孔器打2个孔，再用注射针头挑去孔中琼脂。用记号笔在琼脂板的底面将孔编号。
c、用毛细滴管加抗原于一个孔1中，另一个孔2中加入抗体，浓度稀释20倍。
d、将玻片放入有湿滤纸的培养板或有盖搪瓷盒内；置37℃温箱，24～48h后取出观察结果；孔中所加抗体和抗原如表1所示。
孔1中抗原 孔2中抗体 沉淀现象
抗原A 抗体A 有明显的沉淀线
抗原B 抗体B 有明显的沉淀线
抗原C 抗体A 有较弱的沉淀线
抗原C 抗体B 无沉淀线
从表1中可以看出，抗原A和抗体A、抗原B和抗体B是具有明显的特异性的，因此在双向扩散实验中具有明显的沉淀线，抗原C和抗原A具有较弱的沉淀线，说明两者之间能够进行一定程度的特异性结合，抗原C和抗原B无沉淀线，说明两者之间不能够进行特异性结合。由此可见，由于抗原C为FGL2的蛋白质标志物，其具有与FGL1共同的抗原决定簇，能够与由FGL1蛋白质作为免疫原制备得到的抗体A进行部分特异性结合。而抗体B仅仅是FGL1蛋白标志物的部分肽链，其具有的抗原决定簇与抗原A不完全相同。因此抗体B不能够与抗原C进行特异性结合，不能够产生沉淀现象；这一现象正好说明本发明选取了第61至第241个氨基酸，该肽链上不含有能够与抗原C特异性结合的肽链空间结构或者抗原决定簇；因而抗体B无法与抗原C产生沉淀线。
本发明的诊断试剂盒是包括以基因对应的蛋白标志物作为抗原制备对应的单克隆抗体，使用诊断试剂盒进行检测诊断时，是以其中的单克隆抗体和被检测的物质中的抗原进行特异性结合来完成检测诊断的。因此，在进行血清检测时，人体的血清中不可避免的有可能含有FGL2的蛋白质标志物M，抗体A能够与蛋白质M进行结合，从而使得诊断试剂盒的诊断精确度降低了。因此当使用抗体B作为诊断试剂盒的组分时，不能够与蛋白质标志物M进行特异性结合，因此检测精度提高了。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修饰均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 山东省立医院
<120> 基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用及试剂盒
<130> 2019
<140> 2019
<141> 2019-05-08
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 312
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Lys Val Phe Ser Phe Ile Leu Val Thr Thr Ala Leu Thr Met
1 5 10 15
Gly Arg Glu Ile Ser Ala Leu Glu Asp Cys Ala Gln Glu Gln Met Arg
20 25 30
Leu Arg Ala Gln Val Arg Leu Leu Glu Thr Arg Val Lys Gln Gln Gln
35 40 45
Val Lys Ile Lys Gln Leu Leu Gln Glu Asn Glu Val Gln Phe Leu Asp
50 55 60
Lys Gly Asp Glu Asn Thr Val Ile Asp Leu Gly Ser Lys Arg Gln Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Cys Ser Glu Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Lys Leu Ser Gly Phe
85 90 95
Tyr Lys Ile Lys Pro Leu Gln Ser Pro Ala Glu Phe Ser Val Tyr Cys
100 105 110
Asp Met Ser Asp Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Ser Asp
115 120 125
Gly Ser Glu Asn Phe Asn Arg Gly Trp Lys Asp Tyr Glu Asn Gly Phe
130 135 140
Gly Asn Phe Val Gln Lys His Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Lys Asn
145 150 155 160
Leu His Phe Leu Thr Thr Gln Glu Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Asp Leu
165 170 175
Ala Asp Phe Glu Lys Asn Ser Arg Tyr Ala Gln Tyr Lys Asn Phe Lys
180 185 190
Val Gly Asp Glu Lys Asn Phe Tyr Glu Leu Asn Ile Gly Glu Tyr Ser
195 200 205
Gly Thr Ala Gly Asp Ser Leu Ala Gly Asn Phe His Pro Glu Val Gln
210 215 220
Trp Trp Ala Ser His Gln Arg Met Lys Phe Ser Thr Trp Asp Arg Asp
225 230 235 240
His Asp Asn Tyr Glu Gly Asn Cys Ala Glu Glu Asp Gln Ser Gly Trp
245 250 255
Trp Phe Asn Arg Cys His Ser Ala Asn Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Ser
260 265 270
Gly Pro Tyr Thr Ala Lys Thr Asp Asn Gly Ile Val Trp Tyr Thr Trp
275 280 285
His Gly Trp Trp Tyr Ser Leu Lys Ser Val Val Met Lys Ile Arg Pro
290 295 300
Asn Asp Phe Ile Pro Asn Val Ile
305 310
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Phe Leu Asp Lys Gly Asp Glu Asn Thr Val Ile Asp Leu Gly Ser
1 5 10 15
Lys Arg Gln Tyr Ala Asp Cys Ser Glu Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Lys
20 25 30
Leu Ser Gly Phe Tyr Lys Ile Lys Pro Leu Gln Ser Pro Ala Glu Phe
35 40 45
Ser Val Tyr Cys Asp Met Ser Asp Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln
50 55 60
Arg Arg Ser Asp Gly Ser Glu Asn Phe Asn Arg Gly Trp Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Asn Gly Phe Gly Asn Phe Val Gln Lys His Gly Glu Tyr Trp Leu
85 90 95
Gly Asn Lys Asn Leu His Phe Leu Thr Thr Gln Glu Asp Tyr Thr Leu
100 105 110
Lys Ile Asp Leu Ala Asp Phe Glu Lys Asn Ser Arg Tyr Ala Gln Tyr
115 120 125
Lys Asn Phe Lys Val Gly Asp Glu Lys Asn Phe Tyr Glu Leu Asn Ile
130 135 140
Gly Glu Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Leu Ala Gly Asn Phe His
145 150 155 160
Pro Glu Val Gln Trp Trp Ala Ser His Gln Arg Met Lys Phe Ser Thr
165 170 175
Trp Asp Arg Asp His
180

Claims (8)

1.基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：
所述诊断试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增FGL1基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
2.如权利要求1所述的基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒中，所述扩增FGL1基因的引物对的序列如下：
正向引物序列为5，—ATGTCATGCAATGAGGCAATA—3，；
反向引物序列为5，—CATGTATACTTATTGCTATCA—3，。
3.如权利要求1所述的基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：所述管家基因是GAPDH，扩增管家基因GAPDH的引物对的序列如下：
正向引物序列为5，—TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT—3，；
反向引物序列为5，—GGTGGAATCATATTGGAACA—3，。
4.如权利要求1所述的基因FGL1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒中还包括逆转录体系，所述逆转录体系包括T重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述逆转录反应液包括250mMpH为8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
5.基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用；所述癌症包括结直肠癌和肺癌，其特征在于：所述试剂盒包括FGL1蛋白的特异性抗体，所述特异性抗体是以FGL1蛋白为免疫原得到的单克隆抗体；所述单克隆抗体是以纯化FGL1蛋白或作为免疫原对小鼠进行免疫，经过效价检测达标后进行细胞融合，经筛选克隆获得能够分泌单克隆抗体的杂家瘤细胞，再由杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体；所述FGL1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6.基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用；所述癌症包括结直肠癌和肺癌，其特征在于：所述试剂盒包括FGL1蛋白的特异性抗体，所述特异性抗体是以FGL1免疫原性肽段为免疫原得到的单克隆抗体；所述单克隆抗体是以纯化FGL1免疫原性肽段作为免疫原对小鼠进行免疫，经过效价检测达标后进行细胞融合，经筛选克隆获得能够分泌单克隆抗体的杂家瘤细胞，再由杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的基因FGL1蛋白标志物在诊断癌症的试剂盒中的应用，其特征在于：所述免疫原性肽段为FGL1基因组编码的蛋白质的免疫原性结构域的部分片段；所述免疫原性结构域为Fibrinogen-C结构域，所述免疫原性肽段选择免疫原性结构域的蛋白质氨基酸序列中第61至第241个氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
8.一种试剂盒，包括特异性抗体，所述特异性抗体是以FGL1免疫原性肽段为免疫原得到的单克隆抗体；所述免疫原性结构域为Fibrinogen-C结构域，所述免疫原性肽段选择免疫原性结构域的蛋白质氨基酸序列中第61至第241个氨基酸；其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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