CN108414756A - 一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。所述制备方法包括：胶体金包被原微球的制备及量子点的嵌入；以NMP22、BTA、CD20和TERT的重组蛋白作为抗原分别制备单克隆抗体，单克隆抗体分别与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联，分别得到四种微球；分别取四种微球溶液，在电磁搅拌仪的持续搅拌下充分混匀，即得同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片。本发明具有以下优点：能同时针对特异性高的NMP22、BTA、CD20及TERT，进行膀胱癌的早期检测和复发检测；芯片检测手段快速，省时省力，适合临床广泛应用。

Description

一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备 方法

技术领域

本发明属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域，具体涉及一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，我国男性膀胱癌的发病率有逐年上升且年轻化的趋势。虽然近年来膀胱癌的诊断和治疗技术有很大的进步，但是膀胱癌的死亡率仍居高不下。膀胱癌目前缺乏有效的治疗靶点和手术后评估指标，约5％～50％患者术后发生复发或转移。

目前膀胱癌诊断，尤其是术后复发的监测，主要以尿脱落细胞学检查与尿道膀胱镜检查为主。然而，膀胱镜检查具有侵入性，操作不便，患者较痛苦，还有感染、出血等风险，而且检测费用昂贵。尿脱落细胞学检查特异性好但敏感性低，容易受到尿路感染等因素的干扰。因此这两种检查方法在临床应用上都受到一定限制。

近年来，国内外学者开始致力于从尿液中寻找敏感、特异、可靠、有效的膀胱癌生物标记物并建立无创伤性检查和发明方法来提高膀胱癌早期诊断率。

以往对尿液中肿瘤标志物的检测，一般采用PCR、ELISA、免疫层析荧光标记等方法。PCR和ELISA法需要对尿液进行预处理来提取核酸和蛋白质，不适用于快速检测，免疫层析法虽然快速，但是假阴性的比例大，只能定性或半定量，其特异性和灵敏度有待提升。因此，需要结合新方法新技术新材料开发新型膀胱癌尿液早期检测的手段，提高对膀胱癌诊断的特异性和敏感性。

发明内容

核基质蛋白NMP22(NuMA)是组成细胞核内部结构的支架,而且同DNA复制、RNA合成、激素联接、基因表达调控密切相关。膀胱癌时大量肿瘤细胞凋亡并将NMP22释放入尿，使其水平可增高25倍。以10kU/mL为临界时，它对膀胱癌诊断的敏感度为69.7％，特异度为78.5％，对浸润性膀胱癌诊断的敏感度为100％。以尿液NMP22水平10U/mL为临界值，诊断膀胱移行细胞癌的敏感性为88.3％，特异性为84.0％。以6.4U/mL为临界值，诊断尿路上皮癌的敏感性为84.6％，特异性为74.2％，与尿细胞学检查联合检测敏感性可以增加至91％。尿NMP22作为尿路上皮癌的肿瘤标记物具有较高的特异性，并可在一定程度上反应肿瘤的恶性程度和预后。

膀胱肿瘤抗原(bladder tumor anti-gen，BTA)是由膀胱肿瘤分泌的蛋白水解酶，将膀胱基底膜降解为IV型胶原、纤维蛋白连接素和层粘连蛋白，随尿液排出所形成的基底膜复合物。这一类降解产物的成分主要为分子量(16～165)×10³的特异多肽。在经膀胱镜和病理活检确诊的膀胱癌患者中，BTA的敏感度为67％，特异度为78％，准确度为73％，阳性预测值为70％，阴性预测值为75％，其敏感度有随膀胱癌的分期升高而升高的趋势[谢克基，膀胱肿瘤抗原检测膀胱癌的临床价值]。可作为膀胱癌患者尿液检测的定性指标之一。

CK20细胞角质蛋白20(Cytokeratin20,CK20)是Ⅰ型角质蛋白中间丝的一种，在维持细胞的完整性、调节胞浆蛋白的利用、细胞信号传导、细胞分化、诱导肿瘤化疗耐药、参与肿瘤的发生、发展、以及细胞表面受体中起重要作用。CK20在胃肠道上皮及膀胱肿瘤的泌尿道上皮有表达，而正常组织上皮的表达却受到严格限制。已有研究显示，用CK20单克隆抗体与胶体金连接，制成胶体金标记的CK20单克隆抗体并吸附在硝酸纤维膜上，采用双面胶将该硝酸纤维膜固定在塑料底版上制成检测试纸条。同时用该试纸条、UBC、BTA检测尿液标本，肿瘤组为51例BC患者尿标本，19例非肿瘤的泌尿系疾病血尿为良性疾病对照组，20例健康人尿液为正常对照组，比较三者检测结果以评价CK20单克隆抗体胶体金试纸条临床应用价值。研究结果证实，CK20单抗试纸条具有检测方法简便、快速，且稳定性、准确性、特异性好及灵敏度高、无创伤性等优点，有较好的临床应用价值，便于临床推广，具有广泛的应用前景。

TERT(telomerase reverse transcriptase，端粒酶逆转录酶)是指端粒酶里具有逆转录酶活性的催化亚基,属于端粒酶的一部分。而端粒酶是指由蛋白质和RNA组成的具有催化端粒合成延伸的核糖核蛋白颗粒。端粒酶反复合成端粒的DNA片段TTAGGG，可以使端粒不因细胞分裂而损耗，从而使细胞分裂的次数增加(正常细胞分裂次数是有限的，而肿瘤细胞有永生化趋势)。公认的，多种肿瘤细胞的端粒酶活性较高。并且基因测序发现，膀胱癌及其他肿瘤中的TERT基因启动子区域存在部分位点的突变，尤其是膀胱癌中的TERT基因启动子的突变频率高达55.6％，TERT基因启动子的改变使TERT的表达量增高，从而使端粒酶活性增强，进而诱发和促进膀胱癌等肿瘤的恶变。TERT启动子突变的检测一般是通过测序、PCR来实现，也可尝试通过检测尿液中TERT基因转录的mRNA的表达量或者端粒酶的表达量来进行肿瘤的早期筛查。

合理联合利用上述四种尿液中膀胱癌生物标记物作为无创检测手段，能起到补充膀胱镜的作用，当病灶微小或由于位置关系无法通过膀胱镜看到时，可通过检查尿液肿瘤标志物来发现膀胱癌，或者通过尿液肿瘤标记物的敏感性调整复查膀胱镜的间隔时间。

随着量子技术的发展，量子点(Quantum dots,QDs)作为一类新型的半导体纳米材料，已成为分子检测和医学诊断的有力工具，应用范围包括细胞、组织标记成像、细胞示踪、活体成像、疾病诊断和食品安全检测等。量子点具有以下特点：(1)发光颜色不同，可以用单一光源实现多色检测；(2)同时激发的多种量子点不易重叠，方便实现多重分子的同时检测；(3)量子产率高、发光强度强，光化学稳定性好，可接受长时间反复激发。利用量子点对微球进行编码后制作的蛋白芯片，可以根据量子点被激发后的荧光强弱进行定量分析，实现多个膀胱癌分子靶标的同时检测。

本发明的目的在于公开了一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(一)、胶体金包被原微球的制备及量子点的嵌入；所述量子点具有同一激发波长但发射波长互不相同；

(二)、以NMP22、BTA、CD20和TERT的重组蛋白作为抗原分别制备单克隆抗体；单克隆抗体分别与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联，得到NMP22微球溶液、BTA微球溶液、CD20微球溶液和TERT微球溶液；

(三)、分别取NMP22微球溶液、BTA微球溶液、CD20微球溶液和TERT微球溶液，在电磁搅拌仪的持续搅拌下充分混匀，即得同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片。

上述技术方案所述的一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，其中，所述步骤(一)胶体金包被原微球的制备及量子点的嵌入的具体过程为：

(1)、胶体金的制备；

(2)、胶体金包被原微球：在离心管中加入步骤(1)制备所得的胶体金和0.05g微球，充分振荡混匀后离心，弃去上层液体，沉淀反复用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，在室温下干燥后获得胶体金包被的原微球；

(3)、将量子点嵌入胶体金包被原微球：取玻璃试管，分别加入2mL量子点氯仿溶液和0.01g步骤(2)制备所得的胶体金包被的原微球，充分振荡至溶液中几乎不存在游离的量子点，于通风橱中待氯仿挥发完全后，将剩下的微球用无水乙醇反复洗涤，在室温下干燥后获得在嵌入了量子点的胶体金包被微球。

上述技术方案所述的一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，其中，胶体金制备的具体过程为：将氯金酸配置成0.01％的水溶液，取100mL至250mL烧杯中，加热至沸腾后，保持沸腾的状态下加入柠檬酸钠，当氯金酸水溶液的颜色为稳定的红色后停止加热，待红色水溶液冷却至室温后，用蒸馏水恢复至原体积，即得；

上述技术方案所述的一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，其中，所述步骤(二)中单克隆抗体分别与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联的具体过程为：

(a)、对溶于磷酸缓冲液中的NMP22、BTA、CD20和TERT单克隆抗体，分别进行下述处理：在电磁搅拌仪的持续搅拌下稀释成浓度为30ug/mL的溶液；

(b)、往步骤(a)中再依次加入1％的吐温80、0.01g步骤(3)中制备所得的嵌入量子点的胶体金包被的原微球，持续搅拌15min后，加入5％的BSA溶液封闭微球上没有偶联完的位点，待封闭完成后，对溶液进行离心，取沉淀用PBS缓冲液反复洗涤后，分别得到偶联了NMP22单克隆抗体的NMP22微球、偶联了BTA单克隆抗体的BTA微球，偶联了CD40单克隆抗体的CD20微球和偶联了TERT单克隆抗体的TERT微球。

本发明具有以下有益效果：

本发明的方法制备得到的同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片，针对特异性高的NMP22、BTA、CD20及TERT，进行膀胱癌的早期检测和复发检测。该芯片制备过程相对简单，可批量化生产，价格便宜，芯片检测手段快速，省时省力，适合临床广泛应用。

附图说明：

1、图1为本发明所述蛋白芯片制备方法的流程示意图。

2、图2为本发明所述偶联了单克隆抗体的经嵌入量子点的胶体金包被的微球的结构示意图。

3、图3为本发明所述的蛋白芯片的结构示意图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法作进一步的说明。

本发明制备方法制备所得的蛋白芯片，由偶联有四个待检标志物抗体的量子点胶体金包被的微球构成。在本发明中，将未被包被处理的微球命名为原微球，根据标志物的不同，分别将包被后的微球命名NMP22微球、BTA微球、CD20微球和TERT微球。原微球的内核均为直径相同聚苯乙烯，并已通过接枝处理使其带上负电性。原微球表面包被有嵌有量子点的胶体金，并进一步通过共价的方式分别偶联待测标志物的单克隆抗体，形成NMP22微球、BTA微球、CD20微球和TERT微球。

所述NMP22微球、BTA微球、CD20微球和TERT微球表面均包被有嵌有量子点的胶体金，嵌入的量子点的激发波长一样但发射波长互不相同。NMP22微球通过共价方式偶联NMP22单克隆抗体形成NMP22量子点荧光微球，BTA微球通过共价方式偶联BTA单克隆抗体形成BTA量子点荧光微球，CD20微球通过共价方式偶联CD20单克隆抗体形成CD20量子点荧光微球，TERT微球通过共价方式偶联TERT单克隆抗体形成TERT量子点荧光微球。

具体的，本发明蛋白芯片的制备方法和检测是通过以下方式来实现的。

实施例1：胶体金包被微球的制备及量子点的嵌入：

1、胶体金的制备

本发明中按照下述方法制备的胶体金颗粒，粒径约为20nm，其中金的浓度约为0.1mg/mL。

具体制备方法为：先将氯金酸(HAUC₁₄)配置成0.01％的水溶液，取100mL至250mL烧杯中，烧杯使用前经酸洗、蒸馏水冲净并硅化处理。加热至沸腾后，保持沸腾的状态下加入柠檬酸钠并观察氯金酸水溶液的颜色变化，可见氯金酸水溶液由淡黄色变为灰色，随后变为黑色，再逐渐过渡到红色并保持稳定不变，全程约3min。待红色水溶液冷却至室温后，用蒸馏水恢复至原体积，即得。

2、原微球的包被：

本发明中的微球表面带有负电性，能通过静电作用吸引上述制备的胶体金在其表面沉积，从而实现微球的包被。

具体实施方法为：在15mL离心管中加入0.05g微球和适量的胶体金，充分振荡混匀后离心，弃去上层液体，沉淀反复用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，在室温下干燥后获得胶体金包被的原微球，备用。

3、量子点的嵌入：

选取同一激发波长但发射波长互不相同的四份量子点材料，以游离的形式保存于氯仿溶液中。取洁净的5mL玻璃试管，分别加入2mL量子点氯仿溶液和约0.01g胶体金包被的原微球，充分振荡至溶液中几乎不存在游离的量子点，于通风橱中待氯仿挥发完全后，将剩下的微球用无水乙醇反复洗涤，在室温下干燥后获得在嵌入了量子点的胶体金包被微球，备用。

实施例2：单克隆抗体的制备及与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联：

1、细胞融合和杂交瘤细胞的制备：

选取6-8周龄雌性Balb/c小鼠，分别腹腔注射NMP22、BTA、CD20和TERT的重组蛋白作为抗原，使抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。三天后，采用CO₂气体处死小鼠，在无菌操作下取出脾脏，制备成脾细胞悬液。取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞按5：1的比例，在40℃水浴的无菌无毒环境中混合，加入50％聚乙二醇(PEG)作为促融合剂，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合形成杂交瘤细胞，将杂交瘤置于HAT培养基上培养，每3天换液一次，观察杂交瘤增殖情况。

2、阳性杂交瘤的筛选与克隆化：

在杂交瘤出现后，吸取上清液，检查抗体。确定为能特异性分泌抗体的阳性杂交瘤后，取继续生长的杂交瘤进行增殖传代，在传代过程中，以10％FCS取代HAT，将传代细胞保存于液氮中并进行克隆化。每一代杂交瘤细胞都需要检查抗体，避免阳性细胞的变异和丢失。

3、单克隆抗体腹水的制备及抗体的纯化

取Balb/c小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡进行预处理1-2周后，分别在腹腔内接种阳性杂交瘤细胞，观察1-2周，待小鼠腹部明显膨大后，用注射器抽取腹水，反复收集数次，获得含有大量单克隆抗体的腹水。腹水均采用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化，经纯化沉淀的单克隆抗体，溶于10umol/L的磷酸缓冲溶液中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定各单克隆抗体的纯度，并采用简介ELISA方法对各单克隆抗体的效价进行测定。依本发明所述方法制备和纯化的单克隆抗体效价1：521000-1：124000。通过纯度和效价测定的单克隆抗体保存于–80℃冰箱中备用。

4、单克隆抗体与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联

分别将溶于磷酸缓冲液中的单克隆抗体，在电磁搅拌仪的持续搅拌下稀释成浓度为30ug/mL的溶液，再依次加入1％的吐温80，0.01g已嵌入量子点的胶体金包被的原微球，持续搅拌15min后，加入5％的BSA溶液封闭微球上没有偶联完的位点，待封闭完成后，对溶液进行离心，取沉淀用PBS缓冲液反复洗涤后，分别获得偶联了NMP22单克隆抗体的NMP22微球、偶联了BTA单克隆抗体的BTA微球，偶联了CD40单克隆抗体的CD40微球和偶联了TERT单克隆抗体的TERT微球，各号微球保存在PBS缓冲液中，微球浓度均保持在1ug/mL左右。

5、蛋白芯片的制备：

分别取等量NMP22微球溶液、BTA微球溶液、CD20微球溶液和TERT微球溶液，在电磁搅拌仪的持续搅拌下充分混匀，即得，于–80℃冰箱中保存，以备同时检测尿液样品中四个膀胱癌标志物(NMP22、BTA、CD20和TERT)用。

实施例3：本发明所制备的蛋白芯片对四个膀胱癌标志物的检测：

1、待测样品的获取：

本发明所制备蛋白芯片适用于尿液中微量标志物的检测。收集晨起中段尿，立即转送至实验室，低温保存备用，于12h内完成检测。

2、蛋白芯片与待测样品的共孵育：

取保存在PBS缓冲液当中的蛋白芯片，震荡充分后使形成微球悬液。在培养皿中一次加入尿液样本和悬液状态的蛋白芯片，充分混匀后，于37℃孵箱内避光反应45min。取出培养皿后再次加入适量微球悬液，充分混匀后，于37℃孵箱内避光反应30min。

3、四个膀胱癌标志物的检测：

取共孵育完成的样本，置于多功能流式细胞分析仪上检测，用分析仪自带软件拟合剂量-反应曲线，计算待测尿液样本中四个膀胱癌标志物的浓度。重复检测三次，取各标志物浓度的平均数作为报告浓度。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(一)、胶体金包被原微球的制备及量子点的嵌入；所述量子点具有同一激发波长但发射波长互不相同；

(二)、以NMP22、BTA、CD20和TERT的重组蛋白作为抗原分别制备单克隆抗体；单克隆抗体分别与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联，得到NMP22微球溶液、BTA微球溶液、CD20微球溶液和TERT微球溶液；

(三)、分别取NMP22微球溶液、BTA微球溶液、CD20微球溶液和TERT微球溶液，在电磁搅拌仪的持续搅拌下充分混匀，即得同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(一)胶体金包被原微球的制备及量子点的嵌入的具体过程为：

(1)、胶体金的制备；

(2)、胶体金包被原微球：在离心管中加入步骤(1)制备所得的胶体金和0.05g微球，充分振荡混匀后离心，弃去上层液体，沉淀反复用蒸馏水和无水乙醇洗涤后，在室温下干燥后获得胶体金包被的原微球；

(3)、将量子点嵌入胶体金包被原微球：取玻璃试管，分别加入2mL量子点氯仿溶液和0.01g步骤(2)制备所得的胶体金包被的原微球，充分振荡至溶液中几乎不存在游离的量子点，于通风橱中待氯仿挥发完全后，将剩下的微球用无水乙醇反复洗涤，在室温下干燥后获得在嵌入了量子点的胶体金包被微球。

3.根据权利要求1或2所述的一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，其特征在于，胶体金制备的具体过程为：将氯金酸配置成0.01％的水溶液，取100mL至250mL烧杯中，加热至沸腾后，保持沸腾的状态下加入柠檬酸钠，当氯金酸水溶液的颜色为稳定的红色后停止加热，待红色水溶液冷却至室温后，用蒸馏水恢复至原体积，即得。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(二)中单克隆抗体分别与嵌入量子点的胶体金包被的原微球的偶联的具体过程为：

(a)、对溶于磷酸缓冲液中的NMP22、BTA、CD20和TERT单克隆抗体，分别进行下述处理：在电磁搅拌仪的持续搅拌下稀释成浓度为30ug/mL的溶液；

(b)、往步骤(a)中再依次加入1％的吐温80、0.01g步骤(3)中制备所得的嵌入量子点的胶体金包被的原微球，持续搅拌15min后，加入5％的BSA溶液封闭微球上没有偶联完的位点，待封闭完成后，对溶液进行离心，取沉淀用PBS缓冲液反复洗涤后，分别得到偶联了NMP22单克隆抗体的NMP22微球、偶联了BTA单克隆抗体的BTA微球，偶联了CD40单克隆抗体的CD20微球和偶联了TERT单克隆抗体的TERT微球。