CN109709328A - 一种卵巢癌的诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明首次发现了myocilin基因及其表达产物在卵巢癌组织中异常表达，通过基因水平的定量检测实验和蛋白水平的免疫组化实验，证明myocilin在卵巢癌肿瘤组织中与正常组织中差异表达具有统计学意义，可以作为临床诊断卵巢癌的有效标志物。

Description

一种卵巢癌的诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及癌症的诊断/分级/分期和预后的领域，更具体来 说，本发明涉及卵巢癌的领域。本发明还涉及了包括生物标志物表达的卵巢癌诊断、分级、 分期和预后领域，并且还提供了相关的分析试剂、诊断模型、测试试剂盒和临床分析。

背景技术

卵巢癌多发于围绝经期的女性，约有60％～70％的患者发现疾病时已经进展为III－IV 期或已发生腹部转移。由于患者早期症状不明显，通常在晚期才会表现出腹痛、腹胀、腹部 包块、消化系统症状以及肿瘤压迫等症状和体征，因此大部分卵巢癌患者在发病中晚期才能 得到诊断。尽管卵巢癌的手术治疗技术以及放化疗手段不断进展，但疾病的5年生产率仍低 至30％，且预后差。

目前最常用早期诊断方式包括经阴道彩色多普勒超声、血清CA125等检查方法。然而临 床实践表明，以上方法尚存在局限性:B超诊断卵巢癌的准确性较低，难以发现微小肿瘤， 且受操作者主观因素影响较大；血清CA125检查特异性及敏感性较低。

进入21世纪以来，随着分子生物学的发展，陆续有多种关于卵巢癌的诊断标志物被开发， 如2016年Dayyani F等的一项系统性回顾，纳入了5篇文献、1 975个研究对象，分析结 果表明CA125诊断卵巢癌的敏感性和特异性分别为0.796(95％CI:0.663～0.885)和0.825(95％CI:0.662～0.919)。然而CA125检测在早期卵巢癌患者的诊断中表现欠 佳，且受月经及妊娠等因素的影响较大；。美国食品药品管理局(food and drugadministration， FDA)已经批准将HE4和CA125用于卵巢癌的检测。现主要通过ELISA技术作为HE4的检测 手段。Dayyani F等的一项研究表明，血清HE4用于检测卵巢癌的敏感性和特异性分别为 0.817(95％CI:0683～0.902)和0.851(95％CI:0.716～0.928)；Simon I等设计了一种双抗体 夹心酶联免疫吸附试验用以检测血液中共刺激分子B7同源体4(B7-H4)的水平，发现卵巢癌 患者血液B7-H4水平明显增高，B7-H4和CA125联合诊断卵巢癌敏感性和特异性可分别达 到65％和97％，高于CA125单独诊断；另外还有研究表明，甲壳质酶蛋-40((YKL-40)在乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌中均有较高的表达，并且在肿瘤的发生、发展中起到重要的 作用；Resnick KE等通过检测28例浆液性卵巢癌患者的血清标本和15例正常对照组的血 清标本，发现卵巢癌患者血清中miR-21、miR-29b、miR-92、miR-93和miR-126水平较高， 其中miR-21、miR-92和miR-93在CA125升高前即有显著的上调，表明这三种microRNA 可用于卵巢癌的早期诊断；另外，还有研究表明多个非编码长链RNA也在卵巢癌中有异常 表达，如多种lncRNA都在卵巢癌中表现出了失调，研究显示，对比健康组织，卵巢肿瘤 组织中有多个lncRNA上调，如ANRIL、AB073614、BCYRN1、CCAT1、FALI等。

近期的研究则显示组合型标记物及基于血清标志物建立的卵巢癌风险评估模型，能增加 其特异性和敏感性，从而提高卵巢癌的早期诊断率，因此我们在以后的研究中，也应更加关 注多种标志物的组合检验及更有效的评估模型。同时，CA-125也并不适合在人群中进行大 规模筛查，所以我们需要寻找更加敏感以及信息更丰富的生物标志物。

现有技术中曾研究过肌纤蛋白(Myocilinilin)与青光眼相关，在长期的地塞米松治疗的患 者中，其出现了高表达，且有研究表明其参与了Wnt信号通路，且可以调控细胞的增殖， 但是并未有确切的证据表明所述的Myocilinilin与卵巢的关系。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊治卵巢癌标志物，具体 的，所述的标志物为Myocilin基因或其编码的产物。

在一个具体的实施例中，所述的myocilin基因的序列包含如SEQ ID NO:1所示，或者包 含与SEQ ID NO:1所示的基因具有90％以上同源性的基因；在另外一个具体的实施例中，所 述myocilin基因的编码产物为myocilin蛋白，其具体的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的 多肽序列，或者包含与SEQ ID NO:2具有90％以上同源性的多肽序列。

本发明的另外一个目的是提供了检测myocilin基因或其表达产物在制备诊断卵巢癌的 试剂中的应用。在一个具体的实施例中，所述的试剂包括：可以通过RT-PCR、实时定量PCR、 QPCR、原位杂交或芯片检测myocilin基因的表达水平以诊断卵巢癌的产品；进一步，所述 用RT-PCR诊断卵巢癌的试剂至少包括一对特异扩增myocilin基因的引物，优选的，所述用 实时定量PCR诊断卵巢癌的试剂至少包括的一对特异扩增myocilin基因的引物和探针，其中 引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述用实时定量PCR诊断卵巢癌的试剂至少包括一 对特异扩增myocilin基因的引物；所述用dPCR诊断卵巢癌的试剂至少包括一对特异扩增 myocilin基因的引物；所述用免疫检测诊断卵巢癌的试剂包括：与myocilin蛋白特异性结合 的抗体，优选为多克隆抗体或单克隆抗体；所述用原位杂交诊断卵巢癌的试剂包括：与myocilin基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断卵巢癌的试剂包括：蛋白芯片和基因 芯片，优选的，蛋白芯片包括与myocilin蛋白特异性结合的抗体，优选的，抗体为多克隆抗 体或单克隆抗体；基因芯片包括与myocilin基因的核酸序列杂交的探针。

进一步的，本发明中针对myocilin基因的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA 或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异 性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同 样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由 于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14 个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对 最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率；优选的，所述的探 针原位杂交的探针序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的另外一个方面是提供一种可以检测myocilin基因或其表达产物表达量的试剂。 在一个具体的实施例中，所述试剂包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋 白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相 载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测myocilin基因转 录水平的针对myocilin基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相 载体的myocilin蛋白的特异性抗体。

在一个具体的实施例中，所述myocilin蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。 所述myocilin蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合 抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与myocilin蛋白的结合能力即可。 用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法 来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成；所述 的特异性抗体是单克隆抗体，所述的抗体特异性接合myocilin的抗原表位为SEQ ID NO:6所 示。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了myocilin基因在卵巢癌的发生发展中起着重要的作用，通过检测受 试者卵巢组织中myocilin的表达水平，可以判断受试者是否患有卵巢癌，从而指导临床医师 给受试者提供个性化预防方案或者治疗方案，同时本发明的研究为揭示卵巢癌的发病机理提 供了理论和实验依据。

附图说明

图1显示利用QPCR检测myocilin基因在卵巢癌组织中的表达情况；

图2显示利用WESTERN检测myocilin蛋白在正常卵巢(图2a)及卵巢癌组织(图2b)中的表达情况。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarborLaboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1样本准备

1、样品收集

收集各8例正常卵巢组织和卵巢癌组织样本，手术切除30min内液氮保存。上述所有 标本的取得均通过医院组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离 RNA。具体如下：

组织提取釆用液氮研磨法，将组织在液氮下用研钵研杵捣碎研磨，待液氮挥发后，加试 剂，充分研磨直至试剂由结冰状态变为澄清液体，立即移至离心管中，加入氯仿，彻底振荡 混匀后静置15min，4℃12000rpm离心15min，将上层水相移至另一1.5mL离心管中，加500uL异丙醇，振荡混匀后静置10min，4℃12000rpm离心弃上清，加入1mL 70％乙醇， 振荡片刻，4℃7500rpm离心5min，加入100μL 0.1％DEPC ddH2O。

3、逆转录

采用随机引物和作为逆转录引物进行逆转录反应；反应体系如表所示：

混匀后，逆转录反应条件为：37℃45min，85℃5min，4℃保存。

实施例2QPCR测序检测myocilin在癌症组织和正常组织中的差异表达

(1)引物设计

根据Genebank中myocilin基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

GAPDH的引物序列：

正向引物：5’-GGCGCTGAGTACGTCGTGGA-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3’(SEQ ID NO.8)

MYOCILIN的引物序列：

正向引物：5’-TGAAGTCCGAGCTAACTGAA-3’(SEQ ID NO.3)，

反向引物：5’-CATCCGTGCCAACTGTGTCG-3’(SEQ ID NO.4).

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应， 通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表2PCR反应体系

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃30s，60℃60s)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

(4)、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采 用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。

(5)、结果

结果如图1所示，与正常卵巢组织相比，myocilin基因在卵巢癌组织中下调，差异具有 统计学意义(P<0.05)。

实施例3单克隆抗体的制备

结合文献并应用DNASTAR软件,对myocilin蛋白序列的抗原性、亲水性及表面结构可能 性进行分析,选择抗原性高,亲水性强,表面可能性大的16个氨基酸左右的肽段作为免疫肤段： DTVGTDVRQVFEYDLIC(命名为myo-AG，SEQ ID NO:6),序列对应于蛋白的289-304位的氨基酸, 末端的半耽氨酸是人为加上的,以提供游离巯基与载体蛋白偶联。委托杭州中肤生物有限公 司进行免疫肽段的合成及偶联,并提供完整的质检报告,并与核酸数据库比对以确定其特异 性。

(1)抗原制备

a)由公司合成能够表达上述多肽的原核表达质粒pET-28a(+)，质粒命名为pET-myo-AG；

b)将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选，挑取单菌落进 行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET-myo-AG的工程菌。

c)表达纯化重组抗原蛋白——重组质粒pET-myo-AG在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯 化：将含有重组质粒pET-myo-AG的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于5ml含有50μg/ml卡 那霉素的LB液体培养基中，37℃下200r/min震荡培养9～10h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，1：100扩大培养2h，至OD600约为0.6。向 菌液中加入终浓度为0.6mmol/l的IPTG，16℃震荡培养过夜。离心收集过夜诱导的菌体，LysisBuffer重悬，冰浴30min后超声破碎15min，离心收集上清。用Ni-NTA纯化上清液中的重 组GroEL蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脱液洗去杂质，再用含200mmol/l咪唑的洗脱 液洗脱重组蛋白。

(2)动物免疫BALB/C小鼠免疫

第1天经眼静脉采集免疫前小鼠血清作为阴性对照。起始免疫抗原重组蛋白20μg与等 体积的弗氏完全佐剂混合,采用注射器法使抗原和佐剂充分乳化。对小鼠进行腹腔多点皮下 注射。第14天加强免疫抗原用量为初始免疫量的,与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化,采用 腹腔多点注射。第21天眼静脉取血,间接方法检测抗体滴度。第28天加强免疫直到产生满 意的免疫效果。冲击免疫，在融合前三天进行一次免疫。

(3)细胞融合

无菌条件下取免疫后的小鼠脾脏,放入平皿中用不完全培养基冲洗脾脏组织用两只镊子 剥离脾脏包膜并将脾脏组织镊碎,使细胞尽可能多地游离加入更多的不完全培养基,以利于过 滤用目不锈钢丝网,过滤脾细胞。过滤前先从下面湿润网,将细胞虑入50mL融合管将生长状 态好,处于对数生长期的SP2/0细胞与脾细胞混合,比例为1:10

以分子量为1500的PEG为介导进行融合,离心后用HAT培养基重悬细胞,并用该含有细 胞的HAT培养基铺孔板,每孔2滴。置于37℃,5％CO2培养箱中培养。融合后第3天用HAT培养基半量换液,第五天、第七天分别半量换液一次。两周后换HT培养基。

(4)单克隆抗体筛选

观察杂交瘤细胞的生长情况,当克隆生长至孔底面积的1/3-1/2时,取上清,用间接方法进 行检测,筛选阳性克隆。以有限稀释法对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化培养,五次后,克隆化 细胞抗体阳性率为100％。将阳性克隆细胞进行进一步扩大培养。杂交瘤细胞经体外连续传 代3月以上,反复冻存,复苏,定期收集上清,用筛选抗体的方法测定上清中的抗体,直至细胞系 能稳定分泌单克隆抗体。

(5)单克隆抗体制备

选用12周龄以上的小鼠,腹腔注射液体石蜡,一周后收集生长状态良好的单克隆杂交瘤 细胞,每只小鼠腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后收集腹水，等体积的腹水与生理盐 水混合后，利用饱和硫酸铵沉淀法沉淀，去上清后沉淀用生理盐水重悬溶解，再此加入饱和 硫酸铵至33％,弃上清，用生理盐水重悬溶解沉淀，装入透析袋，透析，AKTAproteinA层析 柱层析纯化后备用。

实施例4免疫组化检测卵巢癌中myocilin蛋白的表达

组织为取自浙江省肿瘤医院的活检或手术标本，卵巢癌标本共109例,正常卵巢组织8 例，每一例标本的组织学类型均经病理证实。

(1)利用Envision加强免疫组织化学法进行染色，所述的方法是本领域技术人员所公 知的技术，主要包括脱蜡水化，利用3％的过氧化氢甲醇阻断内源性的过氧化物酶，利用柠 檬酸盐溶液中微波处理对抗原进行修复，血清封闭后，利用实施例3制备的单克隆抗体进行 免疫反应，第二天后添加二抗后室温孵育，利用新配制的DAB显色液进行显色，苏木素复 染细胞核，二甲苯透明后封片。读片结果见图2。

(2)免疫组化评分

阳性细胞病理评分等级0分(阴性)

1分(≤30％)

2分(30-70％)

3分(≥70％)

染色强度分级评分

0分阴性(-)

1分弱阳性(+)

2分中度阳性(++)

3分强阳性(+++)

将阳性细胞百分比评分与染色强度评分相加,总分<2为阴性,2-3为弱阳性,4中度阳性,5-6 强阳性。

对上述病理的统计结果见表3。

通过本发明发现，myocilin基因及其表达产物在正常卵巢组织中具有显著的高表达，是 良好的潜在的卵巢癌诊断标志物，可以与CA-125等标志物共同作为卵巢癌诊断标志物，提 高卵巢癌的诊断特异性和灵敏性。

上述的基因序列和蛋白序列仅是发明人的实验所使用的，而本发明的技术贡献在于发现 了myocilin与卵巢癌的关系，任何与此相关的技术方案均涵盖于本发明之内。

序列表

<110> 浙江省肿瘤医院

<120> 一种卵巢癌的诊断标志物及其应用

<130> CN-CN-2019-0114-1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1515

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgaggttct tctgtgcacg ttgctgcagc tttgggcctg agatgccagc tgtccagctg 60

ctgcttctgg cctgcctggt gtgggatgtg ggggccagga cagctcagct caggaaggcc 120

aatgaccaga gtggccgatg ccagtatacc ttcagtgtgg ccagtcccaa tgaatccagc 180

tgcccagagc agagccaggc catgtcagtc atccataact tacagagaga cagcagcacc 240

caacgcttag acctggaggc caccaaagct cgactcagct ccctggagag cctcctccac 300

caattgacct tggaccaggc tgccaggccc caggagaccc aggaggggct gcagagggag 360

ctgggcaccc tgaggcggga gcgggaccag ctggaaaccc aaaccagaga gttggagact 420

gcctacagca acctcctccg agacaagtca gttctggagg aagagaagaa gcgactaagg 480

caagaaaatg agaatctggc caggaggttg gaaagcagca gccaggaggt agcaaggctg 540

agaaggggcc agtgtcccca gacccgagac actgctcggg ctgtgccacc aggctccaga 600

gaagtttcta cgtggaattt ggacactttg gccttccagg aactgaagtc cgagctaact 660

gaagttcctg cttcccgaat tttgaaggag agcccatctg gctatctcag gagtggagag 720

ggagacaccg gatgtggaga actagtttgg gtaggagagc ctctcacgct gagaacagca 780

gaaacaatta ctggcaagta tggtgtgtgg atgcgagacc ccaagcccac ctacccctac 840

acccaggaga ccacgtggag aatcgacaca gttggcacgg atgtccgcca ggtttttgag 900

tatgacctca tcagccagtt tatgcagggc tacccttcta aggttcacat actgcctagg 960

ccactggaaa gcacgggtgc tgtggtgtac tcggggagcc tctatttcca gggcgctgag 1020

tccagaactg tcataagata tgagctgaat accgagacag tgaaggctga gaaggaaatc 1080

cctggagctg gctaccacgg acagttcccg tattcttggg gtggctacac ggacattgac 1140

ttggctgtgg atgaagcagg cctctgggtc atttacagca ccgatgaggc caaaggtgcc 1200

attgtcctct ccaaactgaa cccagagaat ctggaactcg aacaaacctg ggagacaaac 1260

atccgtaagc agtcagtcgc caatgccttc atcatctgtg gcaccttgta caccgtcagc 1320

agctacacct cagcagatgc taccgtcaac tttgcttatg acacaggcac aggtatcagc 1380

aagaccctga ccatcccatt caagaaccgc tataagtaca gcagcatgat tgactacaac 1440

cccctggaga agaagctctt tgcctgggac aacttgaaca tggtcactta tgacatcaag 1500

ctctccaaga tgtga 1515

<210> 2

<211> 504

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Arg Phe Phe Cys Ala Arg Cys Cys Ser Phe Gly Pro Glu Met Pro

1 5 10 15

Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Ala Cys Leu Val Trp Asp Val Gly Ala

20 25 30

Arg Thr Ala Gln Leu Arg Lys Ala Asn Asp Gln Ser Gly Arg Cys Gln

35 40 45

Tyr Thr Phe Ser Val Ala Ser Pro Asn Glu Ser Ser Cys Pro Glu Gln

50 55 60

Ser Gln Ala Met Ser Val Ile His Asn Leu Gln Arg Asp Ser Ser Thr

65 70 75 80

Gln Arg Leu Asp Leu Glu Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ser Ser Leu Glu

85 90 95

Ser Leu Leu His Gln Leu Thr Leu Asp Gln Ala Ala Arg Pro Gln Glu

100 105 110

Thr Gln Glu Gly Leu Gln Arg Glu Leu Gly Thr Leu Arg Arg Glu Arg

115 120 125

Asp Gln Leu Glu Thr Gln Thr Arg Glu Leu Glu Thr Ala Tyr Ser Asn

130 135 140

Leu Leu Arg Asp Lys Ser Val Leu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Leu Arg

145 150 155 160

Gln Glu Asn Glu Asn Leu Ala Arg Arg Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu

165 170 175

Val Ala Arg Leu Arg Arg Gly Gln Cys Pro Gln Thr Arg Asp Thr Ala

180 185 190

Arg Ala Val Pro Pro Gly Ser Arg Glu Val Ser Thr Trp Asn Leu Asp

195 200 205

Thr Leu Ala Phe Gln Glu Leu Lys Ser Glu Leu Thr Glu Val Pro Ala

210 215 220

Ser Arg Ile Leu Lys Glu Ser Pro Ser Gly Tyr Leu Arg Ser Gly Glu

225 230 235 240

Gly Asp Thr Gly Cys Gly Glu Leu Val Trp Val Gly Glu Pro Leu Thr

245 250 255

Leu Arg Thr Ala Glu Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Gly Val Trp Met Arg

260 265 270

Asp Pro Lys Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gln Glu Thr Thr Trp Arg Ile

275 280 285

Asp Thr Val Gly Thr Asp Val Arg Gln Val Phe Glu Tyr Asp Leu Ile

290 295 300

Ser Gln Phe Met Gln Gly Tyr Pro Ser Lys Val His Ile Leu Pro Arg

305 310 315 320

Pro Leu Glu Ser Thr Gly Ala Val Val Tyr Ser Gly Ser Leu Tyr Phe

325 330 335

Gln Gly Ala Glu Ser Arg Thr Val Ile Arg Tyr Glu Leu Asn Thr Glu

340 345 350

Thr Val Lys Ala Glu Lys Glu Ile Pro Gly Ala Gly Tyr His Gly Gln

355 360 365

Phe Pro Tyr Ser Trp Gly Gly Tyr Thr Asp Ile Asp Leu Ala Val Asp

370 375 380

Glu Ala Gly Leu Trp Val Ile Tyr Ser Thr Asp Glu Ala Lys Gly Ala

385 390 395 400

Ile Val Leu Ser Lys Leu Asn Pro Glu Asn Leu Glu Leu Glu Gln Thr

405 410 415

Trp Glu Thr Asn Ile Arg Lys Gln Ser Val Ala Asn Ala Phe Ile Ile

420 425 430

Cys Gly Thr Leu Tyr Thr Val Ser Ser Tyr Thr Ser Ala Asp Ala Thr

435 440 445

Val Asn Phe Ala Tyr Asp Thr Gly Thr Gly Ile Ser Lys Thr Leu Thr

450 455 460

Ile Pro Phe Lys Asn Arg Tyr Lys Tyr Ser Ser Met Ile Asp Tyr Asn

465 470 475 480

Pro Leu Glu Lys Lys Leu Phe Ala Trp Asp Asn Leu Asn Met Val Thr

485 490 495

Tyr Asp Ile Lys Leu Ser Lys Met

500

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

Claims (10)

1.mycilin基因在制备诊断卵巢癌试剂中的应用。

2.myocilin蛋白在制备诊断卵巢试剂中的应用。

3.权利要求1所述的应用，所述的myocilin基因的序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQID NO:1所示的基因具有99％以上同源性，且编码具有myocilin蛋白的功能来源于人类的基因。

4.权利要求2所述的应用，所述的myocilin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白，或者与SEQ ID NO:2所示的蛋白具有99％以上同源性，具有myocilin蛋白的功能来源于人类的蛋白。

5.一种可以检测myocilin基因表达量的试剂在制备检测卵巢癌的产品中的应用。

6.权利要求5所述的应用，所述的试剂为检测myocilin表达的引物，优选所述的引物对为SEQ ID NO:3-4所示。

7.权利要求5所述的应用，所述的试剂为原位杂交的探针，优选所述的探针为SEQ IDNO:5所示。

8.权利要求5所述的应用，所述的试剂为抗体，优选的，所述的抗体识别SEQ ID NO:6所示的抗原。

9.一种检测卵巢癌的试剂盒，所述的试剂盒含有可以检测myocilin基因表达量的引物，优选的，所述的引物为SEQ ID NO:3-4所示。

10.一种检测卵巢癌的试剂盒，所述的试剂盒含有可以检测myocilin蛋白表达量的抗体，优选的，所述的抗体为单克隆抗体，更有选的，所述的单克隆抗体特异性识别SEQ IDNO:6所示的抗原。