CN102559601B

CN102559601B - 用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的crept抗体

Info

Publication number: CN102559601B
Application number: CN201210009890.3A
Authority: CN
Inventors: 常智杰; 胡建祥; 韩斌; 任芳丽; 王银银; 苏富琴; 张衍泉
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2032-01-13
Also published as: CN102559601A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体。本发明提供了用于检测CREPT蛋白的试剂在如下(a)或(b)或(c)中的应用：(a)辅助鉴定肿瘤细胞；(b)辅助鉴定肿瘤组织；(c)辅助鉴定肿瘤患者。本发明发现CREPT基因在肿瘤细胞系的表达水平远高于正常细胞中的表达水平，在肿瘤组织中的表达水平远远高于癌旁组织和正常组织。所以应用本发明提供的抗体可以辅助鉴定肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤患者，具有操作简便、成本低廉、准确率高、预测愈后等优点。

Description

用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体。

背景技术

癌症，医学术语亦称恶性肿瘤，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。

癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。与之相对的有良性肿瘤，良性肿瘤则容易清除干净，一般不转移、不复发，对器官、组织只有挤压和阻塞作用，但癌症(恶性肿瘤)还可破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。

癌症发生初期很难发现，等出现各种临床表征后病人才到医院就诊，但通常已经是中晚期，很难治疗。一般治疗后，也很难预测患者的愈后情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体。

本发明提供的杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1，已于2011年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5477。

杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述单克隆抗体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定肿瘤细胞；(b)辅助鉴定肿瘤组织；(c)辅助鉴定肿瘤患者；(d)辅助检测序列表的序列1所示的CREPT蛋白。

含有所述单克隆抗体的试剂盒也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定肿瘤细胞；(b)辅助鉴定肿瘤组织；(c)辅助鉴定肿瘤患者；(d)辅助检测序列表的序列1所示的CREPT蛋白。

所述试剂盒还可含有以所述CREPT蛋白为免疫原获得的多克隆抗体。所述多克隆抗体具体可为将所述CREPT蛋白免疫兔子得到的多克隆抗体。

本发明还保护所述单克隆抗体在检测CREPT蛋白中的应用；所述CREPT蛋白为序列表的序列1所示的蛋白质。

本发明还保护用于检测CREPT蛋白的试剂在在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定肿瘤细胞；(b)辅助鉴定肿瘤组织；(c)辅助鉴定肿瘤患者；(d)辅助检测序列表的序列1所示的CREPT蛋白。所述用于检测CREPT蛋白的试剂为针对CREPT蛋白的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测CREPT蛋白的试剂；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)辅助鉴定肿瘤细胞；(b)辅助鉴定肿瘤组织；(c)辅助鉴定肿瘤患者；(d)辅助检测序列表的序列1所示的CREPT蛋白。所述用于检测CREPT蛋白的试剂为针对CREPT蛋白的抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体。

以上任一所述的肿瘤细胞可为HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、HepG2细胞(人肝癌细胞)、PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞)、MCF7细胞(人乳腺癌细胞)或B16细胞(人黑色素瘤细胞)。

以上任一所述的肿瘤组织可为肺癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织、肾癌组织、前列腺癌组织或结肠癌组织。

以上任一所述的肿瘤患者的肿瘤可为HeLa细胞(人宫颈癌细胞)引起的肿瘤、HepG2细胞(人肝癌细胞)引起的肿瘤、PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞)引起的肿瘤、MCF7细胞(人乳腺癌细胞)引起的肿瘤或B16细胞(人黑色素瘤细胞)引起的肿瘤。以上任一所述的肿瘤患者的肿瘤可为肺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌或结肠癌。

本发明发现CREPT基因在肿瘤细胞系的表达水平远远高于正常细胞中的表达水平，在肿瘤组织中的表达水平远远高于癌旁组织和/或正常组织中的表达水平。所以应用本发明提供的抗体可以辅助鉴定肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤患者，具有操作简便、成本低廉、准确率高、预测愈后等优点。本发明提供的抗体(特别是单克隆抗体)灵敏度高、特异性强。

附图说明

图1为实施例2的步骤二中，步骤3的上清和7次的洗脱液的电泳图。

图2为实施例2的步骤六中，单克隆抗体的效价测定结果。

图3为实施例2的步骤七中，多克隆抗体的灵敏度测定结果。

图4为实施例2的步骤七中，单克隆抗体的灵敏度测定结果。

图5为实施例3中采用Flag抗体进行western blot的结果。

图6为实施例3中采用多克隆抗体进行western blot的结果。

图7为实施例3中采用单克隆抗体进行western blot的结果。

图8为实施例4中，CREPT基因在一些细胞系中表达差异的结果。

图9为实施例4中，CREPT基因在肿瘤组织、癌旁组织和/或正常组织组织中表达差异的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。还原性谷胱甘肽(还原性GST)：购自AMRESCO。

实施例1、CREPT蛋白及其编码基因的发现

P15^INK4b是细胞周期依赖激酶抑制因子(CKI)家族中的一员，定位于9号染色体9P21区，此位点易发生缺失、突变和甲基化，在细胞增殖和很多肿瘤发生中起重要作用。p15^INK4b基因是一种抑制细胞增殖的细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子，它能使细胞停留在G1期，从而抑制细胞的增殖和生长。p15RS基因是p15^INK4b相关基因，对细胞周期有明显的调控作用，它可以在G1期充当一个负调控子。

以p15RS基因作为诱饵，经过生物信息学方法获得一个新基因(CREPT)及其编码蛋白。CREPT蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示(由326个氨基酸残基组成)。将编码CREPT蛋白的基因命名为CREPT基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。CREPT基因定位于人类20号染色体上约56kb的范围内，具有7个外显子。序列相似性分析显示CREPT基因与p15RS基因的同源性达67％，在人、小鼠、斑马鱼、鸡、青蛙、四膜虫、蜜蜂、蚊子、蚂蚁、果蝇、酵母、甚至一些植物等生物体中均十分保守。

实施例2、抗体的制备及其效价和灵敏度的测定

一、原核表达载体pGEX-5X-2/CREPT的构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA。

2、以步骤1的双链DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-TATAGATATCATGTCCTCCTTCTCTGAGT-3’；

R1：5’-TATACTCGAGTGAGTCAGTTGAAAACAGGT-3’。

PCR反应条件：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s、进行30个循环；72℃延伸10min。

3、用限制性内切酶EcoRV和Xho I酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶Sma I和Xho I酶切质粒pGEX-5X-2(购自clontech)，回收载体骨架(约4.9kb)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到原核表达载体pGEX-5X-2/CREPT。根据测序结果，对原核表达载体pGEX-5X-2/CREPT进行结构描述如下：在质粒pGEX-5X-2的Sma I和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA片段。

二、融合蛋白的获得

1、将原核表达载体pGEX-5X-2/CREPT转化大肠杆菌(E.coli)BL21(购自clontech)，得到重组菌。

2、将步骤1的重组菌在LB培养基中37℃、200rpm培养12小时，然后以1％(体积比)的接种量接种新的LB培养基，培养至OD600约0.4时加入IPTG(使其初始浓度为0.2mM)，自加入IPTG开始计时，16℃培养12小时。

3、将完成步骤2的培养体系4℃，6000rpm离心10min，收集菌体沉淀，然后用10倍菌体体积的PBS缓冲液(pH7.5、0.1M)重悬并超声破碎(每超声3s停3s，共进行10min；超声功率是10瓦特)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清。

4、将步骤3的上清与GST beads(购自GE公司)混匀，在4℃结合旋转3小时，然后用洗脱液进行洗脱(溶剂为pH8.8、50mM的Tris-cl缓冲液，溶质还原性GST，其浓度为10mM)，共洗脱7次，每次500ul，分别收集每次的洗脱后溶液。

步骤3的上清和7次的洗脱液的电泳图见图1，M为marker，1为步骤3的上清，2至8依次为第一次至第七次的洗脱后溶液，可以观察到，洗脱得到了高纯度的目的蛋白，且随着洗脱的进行，目的蛋白的含量逐渐降低。

将7次洗脱的洗脱后溶液合并，即为含有纯化后目的蛋白(GST-CREPT融合蛋白)的溶液。

三、多克隆抗体的获得

以步骤二制备的GST-CREPT融合蛋白为抗原，免疫兔子(兴隆实验动物养殖厂，许可证号：SCXK(京)2006-0001)。每只兔子颈背部免疫100μg抗原，皮下多点注射，注射体积为1ml/只。第一次免疫后间隔2周进行第二次免疫，间隔4周后进行第三次免疫，第三次免疫后10天左右采血检测，通过间接ELISA测定抗体效价。第1次与完全福氏佐剂混合免疫，第2次和第3次与不完全福氏佐剂混合免疫。

抗体效价测定的具体步骤如下(均采用pH9.5、0.1M的PBS缓冲液)：

(1)采用步骤二制备的GST-CREPT融合蛋白溶液(采用PBS缓冲液调节浓度)进行包被，100μL/孔，包被浓度为1μg/mL，4℃孵育16小时，封闭并洗板。

(2)每孔加入100μL血清或其稀释液(采用PBS缓冲液进行梯度稀释)，设置只加入PBS缓冲液的孔作为阴性对照，室温孵育2h，洗板。

(3)每孔加入50μL酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)，室温避光孵育2h，洗板。

(4)每孔加入50ul NP显色液，避光显色5min。

(5)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

以检测孔与阴性对照孔OD值的比值大于2.1(P/N≥2.1)为阳性结果。

选择效价达1∶10000的血清，即为多克隆抗体。

四、杂交瘤细胞的获得

以步骤二制备的GST-CREPT融合蛋白为抗原，免疫5周龄雌性BALB/C小鼠(维通利华公司，许可证号：SCXK(京)2002-0003)。每只小鼠免疫5μg抗原，在四肢的淋巴结附近皮下多点注射，注射体积为0.3ml/只。每间隔7天免疫1次，第1次与完全福氏佐剂混合免疫，第2次和第3次与不完全福氏佐剂混合免疫。

第三次免疫后，眼眶采血并分离血清，通过间接ELISA测定抗体效价。测定抗体效价(方法同步骤三)。选择血清抗体效价达到1×10⁵的小鼠，于融合前3天加强免疫1次(免疫方法和免疫剂量同步骤三的第3次免疫)。取对数生长期的小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞和免疫小鼠的脾细胞按常规PEG方法融合，有限稀释法克隆细胞，间接ELISA筛选特异性抗体，克隆化后的细胞株经传代确定为稳定的细胞株后，液氮保存，获得4株杂交瘤细胞，将其中一株命名为CREPT-Ab-4H1。

杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1已于2011年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5477。

五、单克隆抗体的获得

Balb/c小鼠(维通利华公司)腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)，3天后腹腔注射杂交瘤细胞株(5×10⁵个/只)，7天后采集腹水，即为单克隆抗体，-80℃保存备用。

也可以采用如下增量培养法制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞株置于细胞培养基中，37℃培养3-4天，得到的培养液即为单克隆抗体溶液(-80℃保存)。

六、单克隆抗体的效价测定

测定方法为间接ELISA，方法同步骤三。

4株杂交瘤细胞采用步骤五的方法制备的单克隆抗体的效价均为1∶25600以上。其中杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1采用步骤五的方法制备的单克隆抗体的效价达到1∶2048000以上(三次实验的平均值见图2)。

七、单克隆抗体和多克隆抗体的灵敏度

1、双抗夹心ELISA检测多克隆抗体的灵敏度

(1)将步骤五制备的单克隆抗体分别进行1∶1、1∶2倍(均为体积比)稀释，得到各种抗体稀释液(用于稀释的缓冲液为pH9.5、0.1M的PBS缓冲液)。

(2)将各种抗体稀释液分别包被不同的酶标板，100μL/孔，4℃孵育16小时，封闭并洗板。

(3)将融合蛋白标准品溶液(用pH9.5、0.1M的PBS缓冲液稀释步骤二制备的GST-CREPT融合蛋白得到，融合蛋白的浓度分别为1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、1pg/μL、0.1pg/μL、0.01pg/μL，每个浓度设置三个复孔；将牛血清白蛋白作为融合蛋白的阴性对照，浓度为1ng/μL)分别加入各个酶标板，100μL/孔，室温孵育2h，洗板。

(4)加入步骤三制备的多克隆抗体(用pH9.5、0.1M的PBS缓冲液进行1∶500体积稀释)，每孔加入100ul，37℃孵育1h，洗板。

(5)每孔加入50μL酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，购自中杉公司)，37℃孵育1h，洗板。

(6)每孔加入50ul NP显色液(购自中杉公司)，避光显色5min。

(7)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD₄₅₀值。

结果见图3。以检测孔与阴性对照孔OD值的比值大于2.1(P/N≥2.1)为阳性结果。结果表明，多克隆抗体检测抗原的灵敏度为100ng/μL。

2、双抗夹心ELISA检测单克隆抗体的灵敏度

(1)将步骤三制备的多克隆抗体分别进行1∶50、1∶100、1∶200或1∶400倍(均为体积比)稀释，得到各种抗体稀释液(用于稀释的缓冲液为pH9.5、0.1M的PBS缓冲液)。

步骤(2)和步骤(3)同步骤1的步骤(2)和步骤(3)。

(4)加入步骤五制备的单克隆抗体(用pH9.5、0.1M的PBS缓冲液进行1∶500体积稀释)，每孔加入100ul，37℃孵育1h，洗板。

(5)每孔加入50μL酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，购自中杉公司)，37℃孵育1h，洗板。

步骤(6)和步骤(7)同步骤1的步骤(6)和步骤(7)。

结果见图4。单克隆抗体检测抗原的灵敏度可达到20ng/ml。

实施例3、抗体特异性的测定

一、真核表达载体的构建

1、真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT的构建

(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA。

(2)以步骤(1)的双链DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-TATAGATATCCACCATGTCCTCCTTCTCTGAGT-3’；

R1：5’-TATACTCGAGGTCAGTTGAAAACAGGTCCC-3’。

PCR反应条件同实施例2的步骤一。

(3)用限制性内切酶EcoRV和Xho I酶切步骤(2)的PCR扩增产物，回收酶切产物。

(4)用限制性内切酶EcoRV和Xho I酶切质粒Flag-pcDNA3.1(购自clontech公司)，回收载体骨架(约5.5kb)。

(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接，得到真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT。根据测序结果，对真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT进行结构描述如下：在质粒Flag-pcDNA3.1的EcoRV和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA片段，序列2所示DNA和载体骨架上的Flag标签编码序列形成融合基因，表达Flag-CREPT融合蛋白。

2、真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/CCT的构建(CREPT羧基端)

(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA。

F2：5’-TATAGAATTCGCCACCATGCCCCCCAAAGCAACAGA-3’；

R1：5’-TATACTCGAGGTCAGTTGAAAACAGGTCCC-3’。

PCR反应条件同实施例2的步骤一。

(3)用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切步骤(2)的PCR扩增产物，回收酶切产物。

(4)用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切质粒Flag-pcDNA3.1，回收载体骨架(约5.5kb)。

(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接，得到真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/CCT。根据测序结果，对真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/CCT进行结构描述如下：在质粒Flag-pcDNA3.1的EcoR I和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第406至978位核苷酸所示的DNA片段，该DNA片段和载体骨架上的Flag标签编码序列形成融合基因，表达Flag-CREPT-CCT融合蛋白。

3、真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/RPR的构建(CREPT氨基端)

(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA。

(2)以步骤(1)的双链DNA为模板，用F1和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-TATAGGATCCCCACCATGTCCTCCTTCTCTGAGTC-3’；

R2：5’-TATACTCGAGAGGGCTCTTGGAGTCCTCCA-3’。

PCR反应条件同实施例2的步骤一。

(3)用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切步骤(2)的PCR扩增产物，回收酶切产物。

(4)用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切质粒Flag-pcDNA3.1，回收载体骨架(约5.5kb)。

(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤(4)的载体骨架连接，得到真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/RPR。根据测序结果，对真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/RPR进行结构描述如下：在质粒Flag-pcDNA3.1的BamH I和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1至405位核苷酸所示的DNA片段，该DNA片段和载体骨架上的Flag标签编码序列形成融合基因，表达Flag-CREPT-RPR融合蛋白。

二、抗体特异性的测定

第一组：将真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT转染293T细胞(购自协和肿瘤所)；

第二组：将真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/CCT转染293T细胞；

第三组：将真核表达载体Flag-pcDNA3.1/CREPT/RPR转染293T细胞；

第四组：将质粒pcDNA3.1-Flag转染293T细胞；

转染24小时后，用细胞裂解液裂解细胞后进行western blot检测，分别采用Flag抗体(Sigma公司，产品目录号：F4042)、实施例2的步骤三制备的多克隆抗体或实施例2的步骤五制备的单克隆抗体。

采用Flag抗体的结果见图5。第一组、第二组和第三组分别可以检测到Flag-CREPT融合蛋白以及两个缺失体，对照组没有相应条带。

采用多克隆抗体的结果见图6。多克隆抗体不但识别全长的CREPT蛋白，而且识别其氨基端和羧基端两个不同的缺失体。

采用单克隆抗体的结果见图7。单克隆抗体识别CREPT全长及其羧基端，却不识别其氨基端。

实施例4、CREPT基因在细胞以及组织中的表达差异

一、CREPT基因在细胞中的表达差异

分别对HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、HepG2细胞(人肝癌细胞)、PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞)、MCF7细胞(人乳腺癌细胞)、B16细胞(人黑色素瘤细胞)、COS7(非洲绿猴肾细胞)、NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞)、BaF3(小鼠原B细胞)、MulLu(貂肺上皮细胞)、293T细胞(人胚肾细胞)以及293细胞(人胚肾细胞)进行试验(以上细胞购自协和肿瘤所)。将各个细胞裂解液裂解细胞后进行westernblot检测(采用实施例2的步骤五制备的单克隆抗体)，结果见图8。结果表明，CREPT基因在肿瘤细胞系中的表达明显高于非肿瘤细胞系。

二、CREPT基因在组织中的表达差异

在患者知情同意的基础上，分别从多家医院获得的肿瘤组织(包括肿瘤组织、癌旁或正常组织)，切片后进行免疫组化(均采用实施例2的步骤五制备的单克隆抗体作为一抗，HPR-anti-mouse作为二抗，DAB显色，苏木素进行复染，二抗和显色试剂均购自中杉公司)。

结果见图9，肿瘤组织显示为棕色，癌旁或正常组织显示为蓝色。结果显示，在不同类型的肿瘤组织中，CREPT蛋白在肺癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织、肾癌组织、前列腺癌组织和结肠癌组织中的表达均明显高于相应的癌旁或正常组织。

以上结果说明CREPT基因在疾病发生过程中可能发挥了重要的作用，同时为该基因功能的深入研究奠定了基础和提供了依据。

Claims

1.杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1，它的保藏编号为CGMCC No.5477。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞CREPT-Ab-4H1分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述单克隆抗体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定肿瘤细胞；（b）辅助鉴定肿瘤组织；（c）辅助鉴定肿瘤患者；（d）辅助检测序列表的序列1所示的CREPT蛋白。

4.含有权利要求2所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定肿瘤细胞；（b）辅助鉴定肿瘤组织；（c）辅助鉴定肿瘤患者；（d）辅助检测序列表的序列1所示的CREPT蛋白。

5.权利要求2所述单克隆抗体在制备检测CREPT蛋白的试剂盒中的应用；所述CREPT蛋白为序列表的序列1所示的蛋白质。