CN103387971A - 一种重组人胃蛋白酶原ii同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用。制备方法如下：以合成的人胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列为模板，经过PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列，构建重组表达质粒，筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞，筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株，扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白，通过纯化获得重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。本发明还公开了一种上述重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清或胃蛋白酶原II试剂盒校准品的应用。本发明利用基因工程技术生产出大量稳定表达的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，一个蛋白拥有人胃蛋白酶原II两个同工酶蛋白序列。

Description

一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

胃蛋白酶原（PG）是胃粘膜细胞分泌的蛋白水解酶原，它属于天门冬氨蛋白酶家族。在PH为1.0～5.0的酸性条件下，可以自动水解成胃蛋白酶。根据生化免疫学特性上可以分为PGI（PGA），PG II（PGC）两大类，有7组胃蛋白酶同工酶原，1～5组分免疫原性近似，称为PG I，主要由胃腺主细胞的黏液颈细胞分泌；组分6～7被称PG II，来源于胃体胃底黏膜泌酸腺，胃贲门腺，胃窦幽门腺和远端十二指肠Brunner氏腺，前列腺和胰腺也有少量产生。分泌后的PG大部分进入胃肠经过胃蛋白酶或胃酸水解，仅有1%的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，再通过肾排入尿中。

通常情况下，这1%的PG在血液中非常稳定。血清中PG I和PG II可以反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。PG I是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PG I升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PG I降低。PG II与胃底粘膜病变的相关性较大（相对于胃窦粘膜），其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关。PG I/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变。因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。

胃蛋白酶原（PG）在血清中的变化可反应胃黏膜变化，进一步提示胃部疾病的变化历程，包括：浅表性胃炎，胃粘膜糜烂溃疡，萎缩性胃炎，胃癌。由此在国外发达国家已经利用胃蛋白酶原作为体外诊断标志，进行于胃癌的大面积普查，使癌症的提前诊断率提高到90%，所以运用胃蛋白酶原（PG）在我们国家进行大面积人群普查非常有意义。

当前，国内外胃蛋白酶原的诊断试剂有酶联免疫法，化学发光法以及用于全自动生化分析仪的胶乳增强免疫比浊法，现市场上的《胃蛋白酶原检测试剂盒》的原料主要有人胃蛋白酶原免疫后得到的PG抗体以及可制备成试剂盒校准品的胃蛋白酶原。虽然说胃蛋白酶原可以从人的胃部组织，尿液，精液等材料提取，但是从天然材料中提取困难重重，导致来源和数量受到了很大的限制。相对于PG I，PG II的天然提取更不易，采用基因工程的方法制备胃蛋白酶原不失为一个捷径。现国内外就有用基因工程方法在大肠杆菌和酵母中表达了PG I和PG II：国内如徐晓晶等用酵母表达了人胃蛋白酶原C，国外如Ajamaluddin Malik等在大肠杆菌胞周质表达了融合的天然胃蛋白酶原A，也有Takashi Aoki等同时表达了人胃蛋白酶原A和C，可以在免疫分析试剂盒中作为试剂盒校准品使用。

然而胃蛋白酶原PG II有两个同工酶，它们在氨基酸序列上有所差异，并不完全一致，所以在胃蛋白酶原诊断试剂盒中，以多抗为原料的试剂中可能缺少一些针对另一同工酶的多抗，而以单抗为原料的试剂中可能缺少针对另一同工酶的更灵敏的单抗。在现有的文献记录中，也未曾报道过用于制备可同时产生针对于这两种同工酶多抗或是可以同时筛选针对于两同工酶单抗的胃蛋白酶原II嵌合蛋白。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种上述重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，该方法用于制备可同时产生这两种同工酶多抗或是同时筛选两同工酶单抗的嵌合蛋白。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，

氨基酸序列为SEQ ID NO6；核苷酸序列为SEQ ID NO5。

本发明还提供了一种上述重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：以合成的人胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列为模板，经过PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列，构建重组表达质粒，筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞，筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株，扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白，通过纯化获得重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，同工酶1核苷酸序列为SEQ ID NO7，同工酶2核苷酸序列为SEQ ID NO8。

作为一种优选的技术方案，所述PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列包括以下步骤：

将人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和下游引物P2进行第一次PCR扩增；人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和下游引物P4进行第二次PCR扩增；将上述扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶2进行第三次PCR扩增，获得PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列。

作为一种优选的技术方案，所述人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1的基因序列为5，TTCCATGGCAGTTGTCAAAGTTCCACTGAAGAAGTTT3，。

作为一种优选的技术方案，所述人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2的基因序列为5，GCTTCCACCGCCGCCTGCAGCAGTAGCGAAAC3，。

作为一种优选的技术方案，所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3的基因序列为5，GGCGGCGGTGGAAGCCTGGTTCTGGAATCTTCT3，。

作为一种优选的技术方案，所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4的基因序列为5，TTCTCGAGGGCACCAGAATGATGCTGACTACGTG3，。

作为一种优选的技术方案，所述第一次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min20s，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收。

作为一种优选的技术方案，所述第二次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃20s，63℃20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1.2%琼脂糖胶回收。

作为一种优选的技术方案，所述第三次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃45s，60℃45s，72℃1min30s，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收获得PCR拼接的嵌合蛋白编码基因序列。

作为一种优选的技术方案，所述构建重组表达质粒包括以下步骤：

把PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，同时把表达载体用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，将酶切的目的基因与表达载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，PCR筛选阳性克隆质粒，用双酶切进一步验证其正确性。

作为一种优选的技术方案，所述表达载体为pET-28a。

作为一种优选的技术方案，所述表达宿主细胞为BL21（DE3）。

作为一种优选的技术方案，所述筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞包括以下步骤：

取阳性克隆质粒1ul加入到感受态表达宿主细胞BL21（DE3），置冰浴30分钟，42℃水浴90秒，置冰浴1～2分钟，加入LB培养基37℃培养45分钟；取150ul涂布含卡那霉素LB平板，孵育过夜。

作为一种优选的技术方案，所述筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株包括以下步骤：

挑取LB平板上的单克隆细胞株6株，至含卡那霉素LB培养基中，37℃培养过夜；带一株含空表达载体pET-28a宿主菌一起培养；次日先保种后以1：30转种，培养2.5小时后用1mM IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体；菌体用PBS稀释后，加入Loading buffer沸水煮5分钟以上，行SDS-PAGE电泳，电泳胶经过考马斯亮蓝染色，脱色，嵌合蛋白在预期位置出现条带，而含空表达载体pET-28a宿主菌没有，再筛选出条带相对较粗的菌株作为生产备用株。

作为一种优选的技术方案，所述扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白包括以下步骤：

吸取100ul保存菌液加入至100ml含有卡那霉素抗性的LB溶液中，于37℃，200rpm培养过夜，次日以1：30的比例转种培养，培养2.5小时后用1mM IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体。

作为一种优选的技术方案，所述纯化包括以下步骤：

取离心收集菌体加入裂解缓冲液，超声破碎，离心去上清，取沉淀，加入平衡缓冲液搅拌溶解，再次离心取上清，上样于已经用平衡缓冲液平衡好的Ni-sepharose FF填料亲和柱，用平衡缓冲液平衡，用含咪唑的平衡缓冲液洗涤，最后用含咪唑的洗脱缓冲液洗脱，把收集的洗脱样品对PBS透析，得到重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

本发明还提供了一种上述重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清或胃蛋白酶原II试剂盒校准品的应用。

作为一种优选的技术方案，所述多抗血清所用动物为山羊。

由于采用了上述方案，本发明具有以下有益效果：

1、本发明运用人工合成DNA技术合成胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列，省去提取天然模板的麻烦，优化编码氨基酸的密码子，PCR拼接技术可省去一步亚克隆，利用基因工程技术生产出大量稳定表达的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，一个蛋白拥有人胃蛋白酶原II两个同工酶蛋白序列。

2、本发明可运用于免疫制备单克隆抗体，可以克隆出针对于两同工酶中任意一种同工酶的单抗，进一步筛选出灵敏度更高的单抗。

3、本发明在制备多抗血清时，也能够产生同时针对于两同工酶的多克隆抗体，进一步提高胃蛋白酶原II检测试剂盒的捕获率。

4、本发明为胃蛋白酶原II检测试剂盒提供了校准品原料来源，解决了我国的胃蛋白酶原II检测试剂盒自主研发的一些关键问题。

附图说明

图1是本发明实施例1中制备重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的流程图。

图2是本发明实施例1中重组质粒限制性酶切电泳图。

图3是本发明实施例1中纯化洗脱的过程图。

图4是本发明实施例1中蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图5是本发明实施例2重组嵌合蛋白定标曲线图。

图6是本发明实施例2中样本实际测定值与理论值数据评价结果。

具体实施方式

在当前的人胃蛋白酶原II检测试剂盒中，运用于单抗或多抗制备的原料人胃蛋白酶原II可以是从天然提取，但是由于来源有限，提取困难重重；亦可用基因工程方法表达获得，然人胃蛋白酶原II有两种同工酶，无文献记载同时表达两同工酶的，本发明就采用基因工程方法，通过基因拼接表达人胃蛋白酶原II两同工酶嵌合蛋白，该制备方法获取的蛋白可运用于同时针对于两同工酶的多克隆抗体制备，亦可运用于针对于两同工酶中任意一种同工酶的单抗免疫制备。同时还可运用于为胃蛋白酶原II检测试剂盒校准品原料提供来源。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中制备重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的具体步骤主要包括：用全基因合成DNA技术分别合成并取得胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列。PCR拼接，取得嵌合蛋白编码基因序列。用限制性内切酶双酶切，同时将质粒pET-28a用相同的内切酶双酶切，分别回收并纯化酶切产物，用T4DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，然后涂布于含有卡那霉素的LB平板，筛选阳性克隆菌株，阳性质粒pET-28a／PGC转化表达宿主菌BL21(DE3)。用IPTG诱导胃蛋白酶原II嵌合蛋白的表达。纯化上述人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

实施例1

制备重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，如图1所示，图1是本发明实施例1中制备重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的流程图。

（1）人工合成人胃蛋白酶原II同工酶基因序列

按照已经报道的人胃蛋白酶原II两个同工酶基因序列，进行基因优化，分别合成两同工酶基因序列。同工酶1核苷酸序列为SEQ ID NO7，同工酶2核苷酸序列为SEQ ID NO8。

（2）PCR拼接人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白基因序列

根据已经合成的两个同工酶基因序列，设计人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物：P1：5，TTCCATGGCAGTTGTCAAAGTTCCACTGAAGAAGTTT3，，下游引物：P2：5，GCTTCCACCGCCGCCTGCAGCAGTAGCGAAAC3，。人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物：P3：5，GGCGGCGGTGGAAGCCTGGTTCTGGAATCTTCT3，，下游引物：P4：5，TTCTCGAGGGCACCAGAATGATGCTGACTACGTG3，。

利用人胃蛋白酶原II同工酶1片段PCR扩增，50ul扩增体系中取上游引物P1和下游引物P2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min20s，30个循环，72℃延伸10min。PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收。

利用人胃蛋白酶原II同工酶2片段PCR扩增，50ul扩增体系中取上游引物P3和下游引物P4各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃20s，63℃20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR完成后，用1.2%琼脂糖胶回收。

利用上述扩增的人胃蛋白酶原II同工酶1和同工酶2片段PCR扩增，50ul扩增体系中取上游引物P1和下游引物P4各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃45s，60℃45s，72℃1min30s，30个循环，72℃延伸10min。PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收PCR拼接的序列。

（3）构建重组表达质粒

把PCR拼接人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白基因序列用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，同时把表达载体也用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，将酶切的目的基因与载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，PCR筛选正确的阳性克隆，取两个克隆小量提取质粒酶切鉴定，电泳结果如图2所示。图中，1为重组质粒1号NcoI/XhoI酶切，2为重组质粒2号NcoI/XhoI酶切，3为100bp DNA ladder marker。

（4）重组表达质粒转化表达宿主细胞

取鉴定正确的重组表达质粒1ul加入到感受态表达宿主细胞BL21（DE3），置冰浴30分钟左右，42℃水浴90秒，置冰浴1～2分钟，加入LB培养基37℃培养45分钟。取150ul涂布含卡那霉素LB平板，孵育过夜。

（5）筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株

挑取LB平板上的单克隆细胞株6株，至含卡那霉素LB培养基中，37℃培养过夜；带一株含空表达载体pET-28a宿主菌一起培养；次日先保种后以1：30转种，培养2.5小时后用1mM IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体；菌体用PBS稀释后，加入Loading buffer沸水煮5分钟以上，行SDS-PAGE电泳，电泳胶经过考马斯亮蓝染色，脱色，嵌合蛋白在预期位置出现条带，而含空表达载体pET-28a宿主菌没有，再筛选出条带相对较粗的菌株作为生产备用株。

（6）扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白

吸取100ul保存菌液加入至100ml含有抗性的LB中37℃，200rpm培养过夜，次日以1：30的比例转种培养，培养2.5小时后用1mM IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体。

（7）纯化人重组胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白

取离心收集菌体加入适量裂解缓冲液，超声破碎，离心12000rpm30分钟弃上清，取沉淀，加入平衡缓冲液（PH8.0，50mM PB，300mM NaCl，10mM咪唑，8M脲）彻底搅拌溶解，再次离心12000rpm30分钟取上清，上样于已经用平衡缓冲液平衡好的Ni-sepharose FF亲和层析柱，用平衡缓冲液平衡，含50mM咪唑的平衡缓冲液洗涤，最后用含300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，把收集的洗脱样品对PH7.450mM PBS透析，透析完毕后得到重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

图3是本发明实施例1中纯化洗脱的过程图，峰1是上样穿过峰，峰2是50mM咪唑洗涤峰，峰3是300mM咪唑洗脱峰。重组嵌合蛋白诱导前后对比和纯化过程前后的蛋白纯度如图4所示，其中，1是嵌合蛋白全菌，2是超声上清，3是超声沉淀，4是低分子量marker，5是沉淀上样样品，6是上样穿过样品，7是50mM咪唑洗涤峰，8是300mM咪唑洗脱峰。

重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的核苷酸序列如下SEQ ID NO5：

ATGGCAGTTGTCAAAGTTCCACTGAAGAAGTTTAAGTCTATCCGTGAGACCATGAAGGAGAAGGGTTTGCTTGGTGAGTTCCTTCGTACTCACAAGTATGATCCTGCTTGGAAGTATCGTTTTGGTGATCTTAGTGTTACCTATGAACCAATGGCATACATGGATGCAGCATACTTTGGTGAAATCAGTATTGGTACTCCACCACAGAACTTCCTGGTCCTGTTTGATACTGGTTCTTCTAACTTGTGGGTTCCATCTGTCTACTGTCAGAGTCAAGCATGTACCAGTCACTCTCGTTTCAATCCAAGCGAGTCTTCTACCTACTCTACCAATGGTCAGACCTTCTCTCTTCAGTATGGTAGTGGTAGTCTCACTGGTTTCTTTGGTTATGATACTCTGACTGTTCAGAGTATCCAAGTTCCAAACCAAGAGTTCGGTTTGAGTGAGAATGAACCTGGTACTAACTTCGTCTATGCACAGTTTGATGGTATCATGGGTCTTGCATACCCTGCACTGTCTGTTGATGAAGCAACCACTGCAATGCAAGGTATGGTTCAAGAAGGTGCACTGACTTCTCCTGTCTTCAGCGTCTACCTCAGCAACCAACAAGGTTCTAGTGGTGGTGCAGTTGTCTTTGGTGGTGTTGATAGCAGCCTGTACACTGGTCAAATCTACTGGGCACCAGTCACTCAAGAACTCTACTGGCAGATTGGTATTGAAGAGTTCCTGATTGGTGGTCAAGCATCTGGTTGGTGTTCTGAGGGTTGTCAAGCAATTGTTGATACTGGTACTTCTCTGCTGACTGTTCCACAACAATACATGAGTGCTCTTCTTCAAGCAACTGGTGCACAAGAAGATGAGTATGGTCAGTTTCTTGTCAACTGCAACAGCATTCAGAATCTTCCATCTTTGACCTTCATCATCAATGGTGTTGAGTTCCCACTTCCACCATCTTCTTACATCCTTAGTAACAATGGTTACTGTACTGTTGGTGTTGAACCAACTTATCTGTCTTCTCAGAATGGTCAACCACTGTGGATTCTTGGTGATGTCTTCCTTCGTTCTTACTATTCTGTCTACGACTTGGGTAACAACCGTGTCGGTTTCGCTACTGCTGCAGGCGGCGGTGGAAGCCTGGTTCTGGAATCTTCTGGTCTTGGTCCACTGCTCACTCCAAGTCGTGCAGCTCCACCTAGCTCTACTCTCCAGCTTCCAGAGAAGCCACTGGAACAGACTTGGAACATCCTTACTCCATTCACCAAGACCCTTCCTGTCTCTAATCTCAGCCGTAAAGTCACTAGCTGGGCTGGTGTTGGTATCCCAGTCACCTGTCTTCCAGAGGCAGGTAGTGGTGGTGAACGTCGTGCTGAATGTGGTCTTGGTGTTCCAACCACTCGTGGTCCACCACGTAGTCAGCATCATTCTGGTGCCTAA

重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO6：

MAVVKVPLKKFKSIRETMKEKGLLGEFLRTHKYDPAWKYRFGDLSVTYEPMAYMDAAYFGEISIGTPPQNFLVLFDTGSSNLWVPSVYCQSQACTSHSRFNPSESSTYSTNGQTFSLQYGSGSLTGFFGYDTLTVQSIQVPNQEFGLSENEPGTNFVYAQFDGIMGLAYPALSVDEATTAMQGMVQEGALTSPVFSVYLSNQQGSSGGAVVFGGVDSSLYTGQIYWAPVTQELYWQIGIEEFLIGGQASGWCSEGCQAIVDTGTSLLTVPQQYMSALLQATGAQEDEYGQFLVNCNSIQNLPSLTFIINGVEFPLPPSSYILSNNGYCTVGVEPTYLSSQNGQPLWILGDVFLRSYYSVYDLGNNRVGFATAAGGGGSLVLESSGLGPLLTPSRAAPPSSTLQLPEKPLEQTWNILTPFTKTLPVSNLSRKVTSWAGVGIPVTCLPEAGSGGERRAECGLGVPTTRGPPRSQHHSGA。

实施例2

制备人胃蛋白酶原II试剂盒校准品

取实施例1制备好的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白经过北京九强生物公司检测试剂盒测定，用稀释液（20mM PB，150mM NaCl，1%BSA pH7.4）稀释成10mg/l制成校准品。再以不同稀释浓度蛋白测定（如图5所示，分别是5ng/ml，15ng/ml，30ng/ml，60ng/ml，100ng/ml），制得校准曲线，结果见图5，图5是本发明实施例2重组嵌合蛋白定标曲线图。

以此校准曲线为基础，取10个样本，经过测定，实际测定值与理论值数据如图6所示，图6是本发明实施例2中样本实际测定值与理论值数据评价结果。回归方程R²达到0.9963，说明测量值与理论值一致性较高。该重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白可以用于人胃蛋白酶原II检测试剂盒校准品的应用。

实施例3

抗人胃蛋白酶原II两同工酶羊多抗血清的制备

采用3只4～6个月大，体重25公斤健康的山羊为免疫动物。以实施例1中制备的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白为免疫原，进行免疫。免疫剂量：基础免疫为3mg/只，加强免疫剂量为4mg/只。

具体免疫步骤如下：用稀释液稀释适量免疫原，加入等体积弗式完全佐剂，充分乳化，在羊背部皮内多点注射进行首次免疫；两周后，取抗原加弗式不完全佐剂充分乳化后进行背部皮下多点注射，每两周加强免疫一次，从加强免疫第三次开始，在每次免疫后第七天采血检测效价，第6次免疫后，羊产生了高效价胃蛋白酶原II抗体。

通过琼脂糖免疫沉淀反应测定胃蛋白酶原II抗体效价，可以达到1：16。具体方法步骤如下：将抗体用生理盐水对倍稀释成不同倍数的样品液（1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128）。将加热溶解后琼脂糖溶液铺于载玻片上，用打孔器打梅花形孔斑，孔直径5毫米，孔间距一个孔径。中心孔加入1mg/ml重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，外圈孔加入稀释成不同倍数的样品液，每孔50ul，以两孔间出现白色痕迹的最高稀释倍数作为蛋白效价。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，其特征在于，

氨基酸序列为SEQ ID NO6；核苷酸序列为SEQ ID NO5。

2.根据权利要求1所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以合成的人胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列为模板，经过PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列，构建重组表达质粒，筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞，筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株，扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白，通过纯化获得重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，同工酶1核苷酸序列为SEQ ID NO7，同工酶2核苷酸序列为SEQ ID NO8。

3.根据权利要求2所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列包括以下步骤：

将人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和下游引物P2进行第一次PCR扩增；人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和下游引物P4进行第二次PCR扩增；将上述扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶2进行第三次PCR扩增，获得PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列。

4.根据权利要求3所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1的基因序列为5，TTCCATGGCAGTTGTCAAAGTTCCACTGAAGAAGTTT3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2的基因序列为5，GCTTCCACCGCCGCCTGCAGCAGTAGCGAAAC3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3的基因序列为5，GGCGGCGGTGGAAGCCTGGTTCTGGAATCTTCT3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4的基因序列为5，TTCTCGAGGGCACCAGAATGATGCTGACTACGTG3，；

所述第一次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min20s，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收；

所述第二次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃20s，63℃20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1.2%琼脂糖胶回收；

所述第三次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃45s，60℃45s，72℃1min30s，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收获得PCR拼接的嵌合蛋白编码基因序列。

5.根据权利要求2所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述构建重组表达质粒包括以下步骤：

把PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，同时把表达载体用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，将酶切的目的基因与表达载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，PCR筛选阳性克隆质粒，用双酶切进一步验证其正确性。

6.根据权利要求5所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET-28a。

7.根据权利要求2所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达宿主细胞为BL21（DE3）；

所述筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞包括以下步骤：

取阳性克隆质粒1ul加入到感受态表达宿主细胞BL21（DE3），置冰浴30分钟，42℃水浴90秒，置冰浴1～2分钟，加入LB培养基37℃培养45分钟；取150ul涂布含卡那霉素LB平板，孵育过夜；

所述筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株包括以下步骤：

挑取LB平板上的单克隆细胞株6株，至含卡那霉素LB培养基中，37℃培养过夜；带一株含空表达载体pET-28a宿主菌一起培养；次日先保种后以1：30转种，培养2.5小时后用1mM IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体；菌体用PBS稀释后，加入Loading buffer沸水煮5分钟以上，行SDS-PAGE电泳，电泳胶经过考马斯亮蓝染色，脱色，嵌合蛋白在预期位置出现条带，而含空表达载体pET-28a宿主菌没有，再筛选出条带相对较粗的菌株作为生产备用株；

所述扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白包括以下步骤：

吸取100ul保存菌液加入至100ml含有卡那霉素抗性的LB溶液中，于37℃，200rpm培养过夜，次日以1：30的比例转种培养，培养2.5小时后用1mM IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体。

8.根据权利要求2所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：

取离心收集菌体加入裂解缓冲液，超声破碎，离心去上清，取沉淀，加入平衡缓冲液搅拌溶解，再次离心取上清，上样于已经用平衡缓冲液平衡好的Ni-sepharose FF填料亲和柱，用平衡缓冲液平衡，用含咪唑的平衡缓冲液洗涤，最后用含咪唑的洗脱缓冲液洗脱，把收集的洗脱样品对PBS透析，得到重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

9.一种权利要求1或权利要求2～8制备得到的任一所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清或胃蛋白酶原II试剂盒校准品的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多抗血清所用动物为山羊。

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