CN107286250A - 一种布鲁氏菌融合蛋白、其制备方法及应用 - Google Patents

一种布鲁氏菌融合蛋白、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌融合蛋白，包括布鲁氏菌BP26抗原和布鲁氏菌单链抗体。本发明公开的布鲁氏菌融合蛋白可用于制备布鲁氏菌检测试剂盒。

Description

一种布鲁氏菌融合蛋白、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种布鲁氏菌融合蛋白。
背景技术
布鲁氏菌病(brucellosis)又称地中海弛张热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病。能引起人和多种动物的急性和慢急性疾病，被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状。布鲁氏菌病在国内，羊为主要传染源，牧民或兽医接羔为主要传播途径。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提，只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体，体外诊断试剂产品才能成为现实。因此，针对布鲁氏菌抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫，从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低布鲁氏菌病蔓延的首要解决问题。
发明内容
本发明提供一种布鲁氏菌融合蛋白，所述融合蛋白包括布鲁氏菌抗原和布鲁氏菌单链抗体。
进一步地，本发明所述布鲁氏菌抗原为含有主要抗原决定簇的BP26抗原，所述布鲁氏菌单链抗体为scFv。
本发明还提供了一种布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其制备步骤如下：
(1)查找布鲁氏菌中含有主要抗原决定簇的BP26抗原
从NCBI(美国国立生物技术信息中心)中查找到布鲁氏菌含有主要抗原决定簇的BP26 抗原。
(2)优化布鲁氏菌BP26抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达
在大肠杆菌中表达蛋白时，不同密码子使用的频率有较大区别，为了使融合蛋白的表达量达到最大，需将布鲁氏菌BP26抗原基因序列进行密码子优化，然后合成优化后的核酸序列并进行表达。
(3)构建针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因
将纯化之后的BP26抗原蛋白免疫小鼠获得高活性的单克隆抗体，再调取单链抗体scFv 的基因。
(4)重组优化的布鲁氏菌BP26抗原基因和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体scFv基因，并进行表达
将优化后的布鲁氏菌BP26抗原基因(11-250aa)和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体 scFv基因(能够针对结合BP26抗原蛋白的3-10aa部分)通过递归PCR技术连接起来，测序分析序列正确后，把融合蛋白的基因片段插入到表达载体上进行表达。
(5)纯化及复性布鲁氏菌融合蛋白。
本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点。
为了使得融合蛋白更好地保持活性位点，本发明选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃、37℃，进一步优选的诱导温度为25℃、37℃，更进一步优选的诱导温度为25℃。诱导转速为250rpm，诱导的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 浓度为0.1mM。这样使得融合蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。
本发明可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候，为了避免剧烈条件，将破碎条件定为200w，每次超声6s，间隔3s超声一次，共180次。
本发明融合蛋白的纯化方式有离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法，进一步优选为亲和层析。
本发明在融合蛋白中加入了6XHis标签，使亲和层析纯化方式能够达到较高的纯度。
本发明的融合蛋白利用基因工程重组技术，在大肠杆菌系统中表达布鲁氏菌抗原和单链抗体的融合蛋白方法，具有生产周期短、产量高、成本低等优点。
本发明的布鲁氏菌融合蛋白可做为布鲁氏菌免疫诊断试剂盒的一部分。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)首次开发针对布鲁氏菌主要抗原BP26的单链抗体scFv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点，不含抗体恒定区；2)分子量小，减少了抗体的非特异性结合，降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单，易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达，可以在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。
(2)国内外首次开发布鲁氏菌主要抗原表位及针对BP26抗原的scFv融合蛋白。
由于感染布鲁氏菌初期不产生抗体，致使在此段时间我们检测不到相应的布鲁氏菌抗体，从而导致漏检，为了解决此问题必须在检测布鲁氏菌抗体的同时增加对抗原的检测，开发针对布鲁氏菌BP26抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合布鲁氏菌抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的融合蛋白。
在主要抗原表位和针对布鲁氏菌BP26抗原的抗体开发出后，利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(布鲁氏菌BP26抗原的11-250aa)和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体 scFv(3-10aa)融合，制备成具有同时结合布鲁氏菌抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的融合蛋白，该融合蛋白具有以下优点：1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可，这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上，只需要稳定一种原料的生产工艺即可，这样可以减少生产成本的投入，缩短原料生产周期，降低生产批间差；3)节省了开发布鲁氏菌诊断试剂的成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。
实施例1布鲁氏菌BP26抗原基因的密码子优化及表达载体构建
从NCBI查找BP26抗原基因GenBank：AAB38523.1，蛋白质序列如下：
MNTRASNFLAASFSTIMLVGAFSLPAFAQENQMTTQPARIAVTGEGMMTASPDMAILNLSVLRQAKTAREAMTANNEAMTK VLDAMKKAGIEDRDLQTGGINIQPIYVYPDDKNNLKEPTITGYSVSTSLTVRVRELANVGKILDESVTLGVNQGGDLNLVND NPSAVINEARKRAVANAIAKAKTLADAAGVGLGRVVEISELSRPPMPMPIARGQFRTMLAAAPDNSVPIAAGENSYNVSVNV VFEIK
经过密码子优化后序列如下：
ATGAATACCCGTGCCAGCAACTTTCTGGCCGCCAGCTTCAGCACCATCATGCTGGTGGGTGCCTTTAGTCTGCCGGCCTT TGCCCAGGAGAATCAGATGACCACCCAGCCTGCACGCATTGCCGTGACAGGTGAAGGTATGATGACCGCCAGTCCGGAT ATGGCCATTCTGAACCTGAGCGTGCTGCGCCAAGCAAAAACCGCCCGCGAGGCCATGACCGCCAACAACGAAGCCATG ACCAAAGTGCTGGACGCCATGAAAAAAGCCGGCATCGAAGACCGTGATCTGCAGACCGGCGGCATTAACATCCAGCCG ATCTATGTGTATCCGGATGACAAAAATAACCTGAAGGAACCGACCATTACCGGCTATAGCGTGAGCACCAGCCTGACCG TTCGCGTGCGCGAACTGGCCAACGTTGGCAAGATTCTGGATGAGAGCGTTACCCTGGGTGTGAACCAAGGCGGCGACC TGAATCTGGTGAATGATAACCCGAGCGCCGTGATTAACGAAGCCCGCAAACGCGCAGTGGCCAATGCCATTGCCAAGG CCAAAACCCTGGCCGATGCCGCAGGTGTGGGTTTAGGCCGCGTGGTGGAAATTAGCGAACTGAGTCGCCCGCCGATGC CGATGCCTATTGCCCGTGGTCAGTTTCGCACCATGCTGGCAGCAGCACCTGATAATAGCGTGCCTATCGCAGCCGGCGAA AACAGCTACAATGTTAGCGTGAATGTGGTTTTTGAAATTAAA
设计引物如下：
P1u：GCATATGAATACCCGTGCCAGCAACTTTCTGGCCGCCAGCTTCAGCACCATCATGCTGGTGGG
P1d：TGGTCATCTGATTCTCCTGGGCAAAGGCCGGCAGACTAAAGGCACCCACCAGCATGATG
P2u：AGAATCAGATGACCACCCAGCCTGCACGCATTGCCGTGACAGGTGAAGGTATGATGAC
P2d：GGCGCAGCACGCTCAGGTTCAGAATGGCCATATCCGGACTGGCGGTCATCATACCTTCA
P3u：TGAGCGTGCTGCGCCAAGCAAAAACCGCCCGCGAGGCCATGACCGCCAACAACGAAGCC
P3d：TCTTCGATGCCGGCTTTTTTCATGGCGTCCAGCACTTTGGTCATGGCTTCGTTGTTGGC
P4u：AGCCGGCATCGAAGACCGTGATCTGCAGACCGGCGGCATTAACATCCAGCCGATCTATG
P4d：GGTAATGGTCGGTTCCTTCAGGTTATTTTTGTCATCCGGATACACATAGATCGGCTGGA
P5u：GAACCGACCATTACCGGCTATAGCGTGAGCACCAGCCTGACCGTTCGCGTGCGCGAACT
P5d：CACCCAGGGTAACGCTCTCATCCAGAATCTTGCCAACGTTGGCCAGTTCGCGCACGCGA
P6u：GCGTTACCCTGGGTGTGAACCAAGGCGGCGACCTGAATCTGGTGAATGATAACCCGAGC
P6d：ATGGCATTGGCCACTGCGCGTTTGCGGGCTTCGTTAATCACGGCGCTCGGGTTATCATT
P7u：AGTGGCCAATGCCATTGCCAAGGCCAAAACCCTGGCCGATGCCGCAGGTGTGGGTTTAG
P7d：GGCATCGGCGGGCGACTCAGTTCGCTAATTTCCACCACGCGGCCTAAACCCACACCTG
P8u：TCGCCCGCCGATGCCGATGCCTATTGCCCGTGGTCAGTTTCGCACCATGCTGGCAGCA
P8d：TAGCTGTTTTCGCCGGCTGCGATAGGCACGCTATTATCAGGTGCTGCTGCCAGCATGGT
P9d：GCTCGAGTTTAATTTCAAAAACCACATTCACGCTAACATTGTAGCTGTTTTCGCCGGCTG
实验方法如下：
将引物P1u,P1d,P2u,P2d,P3u,P3d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W1；将引物P4u,P4d,P5u,P5d,P6u,P6d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W2；将引物 P7u,P7d,P8u,P8d,P9d混合，进行PCR反应，所得产物命名为W3；然后将上述三个产物 W1,W2,W3混合做为模板，用引物P1u,P9d进行PCR反应即得到优化后布鲁氏菌的BP26基因。上述四个PCR(TOYOBO公司产品，货号：02510D1)反应条件如下：94℃，2分钟X 1 个循环；(98℃，15秒，55℃，30秒，68℃，15秒)X30个循环；72℃，7分钟X 1个循环。测序证明序列正确后，将此PCR产物用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中。
实施例2构建针对布鲁氏菌核心蛋白布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体
(1)单克隆抗体(只针对结合BP26抗原蛋白3-10aa的抗体)细胞株的获得
a.将构建成功的pET30a-BP26载体转化至BL21表达菌种表达纯化后获得BP26抗原蛋白
b.用获得的BP26抗原蛋白免疫小鼠
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合BP26抗原蛋白3-10aa的抗体细胞株
(2)细胞RNA的提取
用TRIzol LS(invitrogen产品,货号10296-010)试剂，按照说明书操作步骤提取细胞总 RNA。
cDNA第一链的合成
取1μg RNA做逆转录模板，Oligo(d)T 1μl做逆转录引物，加DEPC水至总体积12μl，混匀。70℃变性5min，迅速冰浴冷却。依次加入5×缓冲液4μl，RNase抑制剂1μl，dNTP(10mMeach)2μl，混匀。37℃孵育5min，加入AMV逆转录酶1μl，37℃反转录60min，70℃、10min 终止反应，冰上冷却。
(3)以逆转录cDNA为模板，按照以下引物，用RT-PCR扩增重链轻链基因。
mHVu1:GATGTGAAGCTTCAGGAGTC
mHVu2:CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC
mHVu3:CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC
mHVu4:CAGGTTACTCTGAAAGAGTC
mHVu5:AAGGTCCAGCTGCAACAATC
mHVu6:GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC
mHVu7:CAGGTCCAACTGCAGCAGCC
mHVu8:GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC
mHVu9:GAGGTGAAGCTGGTGGAATC
mHVu10:GATGTGAACTTGGAAGTGTC
mHVd1:TGCAGAGACAGTGACCAGAGT
mHVd2:TGAGGAGACTGTGAGAGTGGT
mHVd3:TGAGGAGACGGTGACTGAGGT
mHVd4:TGAGGAGACGGTGACCGTGGT
mKVu1:GATGTTTTGATGACCCAAACT
mKVu2:GATATTGTGATGACGCAGGCT
mKVu3:GATATTGTGATAACCCAG
mKVu4:GACATTGTGCTGACCCAATCT
mKVu5:GACATTGTGATGACCCAGTCT
mKVu6:GATATTGTGCTAACTCAGTCT
mKVu7:GATATCCAGATGACACAGACT
mKVu8:GACATCCAGCTGACTCAGTCT
mKVu9:CAAATTGTTCTCACCCAGTCT
mKVd1:CCGTTTCAGCTCCAGCTTG
mKVd2:CCGTTTTATTTCCAGCTTGGT
mKVd3:CCGTTTTATTTCCAACTTTG
用引物mHVu1—mHVu10分别与mHVd1—mHVd4组合；mKVu1—mKVu9分别与 mKVd1—mKVd4组合做PCR反应。
PCR反应体系25μl，其中cDNA 0.5μl，上游引物0.25μl下游引物0.25μl，Taq酶0.2μl dNTP 2μl 10×buffer 2.5μl。
PCR(TOYOBO公司产品，货号：02510D1)，PCR条件为：94℃，2分钟X 1个循环； (98℃，5秒，55℃，30秒，68℃，15秒)X30个循环；72℃，7分钟X 1个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因，然后通过递归PCR将重链和轻链基因连接起来，此重组基因为rscFv。
实施例3含有布鲁氏菌BP26抗原基因(11-250aa)和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体基因(3-10aa)融合，并进行表达
(1)通过递归PCR将有布鲁氏菌BP26抗原基因(11-250aa)和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体基因(3-10aa)连接在一起，用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品，货号69909-3)载体中。
(2)将上述融合蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司，货号：KB0286)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达 0.6左右，用浓度为0.1mM的IPTG(生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：37℃，转速250rpm，5h。诱导之后，将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
实施例4含有布鲁氏菌融合蛋白的纯化及复性
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mM Tris-HCl，0.5MUreapH 7.5，0.5M NaCl,2％Triton X-100)重悬，然后超声破碎，条件为每次超声3s，间隔6s，共180次，12000rpm，4℃离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，8M Urea，0.5M Nacl，20mM咪唑pH8.0)50ml破碎包涵体，上柱纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mM Tris，8MUrea， 0.5M Nacl，300mM咪唑pH8.0)洗脱目的蛋白。将纯化后的融合蛋白用透析缓冲液(1mM 氧化型谷胱甘肽GSSH，2mM还原型谷胱甘肽GSH，2mMEDTA，20mM Tris,pH8.5)透析, 每隔48h换一次透析液。取出透析后的蛋白液，经据乙醇-20000进行浓缩，于-20℃保存备用。

Claims (9)

1.一种布鲁氏菌融合蛋白，其特征在于包括布鲁氏菌抗原和布鲁氏菌单链抗体：
所述布鲁氏菌抗原为含有主要抗原决定簇的BP26抗原；
所述布鲁氏菌单链抗体为scFv。
2.一种权利要求1所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其制备步骤如下：
(1)查找布鲁氏菌中含有主要抗原决定簇的BP26抗原；
(2)优化布鲁氏菌BP26抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；
(4)重组优化的布鲁氏菌BP26抗原基因和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；
(5)纯化及复性布鲁氏菌融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
4.根据权利要求2所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。
5.根据权利要求4所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其特征在于所述诱导温度为25℃或37℃。
6.根据权利要求5所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其特征在于所述诱导温度为25℃。
7.根据权利要求2所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(5)的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
8.根据权利要求7所述的布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤(5)的纯化方式为亲和层析。
9.一种权利要求1所述的布鲁氏菌融合蛋白的应用，其特征在于所述融合蛋白用于制备布鲁氏菌检测试剂盒。
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