KR20140131802A - Bp26 복합체의 채널 유사 구조 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상기 BP26 단백질 복합체의 결정 구조에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 각 BP26 모노머들이 다중 결합을 통해 형성하는 총 16개의 BP26 헥사데카머에 있어서, BP26 모노머 8개씩 결합하여 링 구조체를 이루는 옥타머를 형성하고 이러한 2개의 링 구조체가 결합하여 최종적으로 중심에 홀(hole)을 가지는 채널 유사(channel-like) 구조를 이루는 복합체의 결정 구조 및 이의 기능에 관한 것이다.

Description

BP26 복합체의 채널 유사 구조 및 이의 용도{A Channel-like Structure of BP26X Complex and the Use of thereof}

본 발명은 BP26 단백질 복합체 결정 구조 및 이의 기능에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 BP26 단백질 복합체 결정이 이루는 채널 유사(channel-like) 구조 및 이의 병원성 박테리아 감염 및 면역반응에 관여하는 기능에 관한 것이다.

유전체학(genomics) 이후 관심의 대상으로 떠오른 단백질체학(proteomics)은 세포와 생명체 (organism) 안에 있는 모든 단백질의 구조와 상호작용을 밝힘으로써 그들의 기능을 이해하는 것을 궁극적인 목적으로 한다.

단백질은 아미노산의 선형 중합체이다. 자연적으로 발생하는 단백질은 각각이 구별되는 측쇄를 함유하는, 20 개나 되는 상이한 유형의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 단백질에서 아미노산 잔기의 특정 선형 서열은 그 단백질의 1 차 서열 또는 1 차 구조를 결정한다. 단백질의 1 차 구조는 공지된 방법을 사용하여 비교적 용이하게 결정할 수 있다.

단백질은 3 차원 구조로 폴딩된다. 폴딩은 아미노산 서열 및 단백질의 주위 환경에 의해 결정된다. 다수의 천연 단백질의 3 차원 구조 연구는 많은 반복되는 패턴을 나타냈다. 알파 헬릭스, 같은 방향 (parallel)의 베타 시트 및 다른 방향 (anti-parallel)의 베타 시트로 공지된 패턴이 일반적으로 관찰된다. 이들 공통적인 구조 패턴의 설명을 디커슨 (Dickerson, R. E.) 등의 문헌 [The Structure and Action of Proteins, W. A. Benjamin, Inc. California (1969)]에서 제시하였다. 이들 패턴 중 하나에 대한 각각의 아미노산 잔기의 지정은 단백질의 2 차 구조를 결정한다.

단백질은 그 구조에 따라 특이적인 기능을 갖고 있어, 게놈 서열결정 후의 중요한 과제로 대두되고 있다. 기존의 유전자에서 해독된 단백질의 입체구조 정보를 계통적종합적으로 연구하는Structural Genomics가 시작되고 있으며. 이런 입체구조 정보는 기능 메커니즘을 원자분자 수준에서 이해하기 위한 필수 사항이며, 단백질을 표적으로 하는 유용화합물과 변형된 단백질의 신규기능 설계를 가능하게 한다. 또 입체구조를 비교함으로써 단백질간의 먼 진화적 상관관계를 알 수도 있다.

단백질의 생물학적 특성은 직접적으로 단백질의 3 차원 (3D) 입체구조에 좌우된다. 3D 입체구조는 효소의 활성, 결합 단백질의 능력 및 특이성 및 수용체 분자의 구조적 특성을 결정한다. 단백질 분자의 3 차원 구조가 매우 중요하기 때문에, 그의 공지된 아미노산 서열로부터 단백질의 3 차원 구조를 용이하게 결정하는 방법이 매우 바람직하다.

특히, 막단백질은 세포표면의 세포막에 끼어있는 단백질로 물질수송이나 외부신호를 감지하는 세포의 관문의 역할을 하고 있어 신약개발의 주요한 표적이 되고 있다. 대부분의 막단백질은 다른 단백질들과 함께 복합체(complex)를 이루면서 복잡한 세포내 기능에 관여한다고 알려져 있다. 따라서 단백질 복합체를 찾는 것은 생물학적 기능이나 세포내 현상들을 이해함에 있어서 기본적이고 중요한 일이다.

본 발명자는 그 중에서도 막단백질 BP26에 대한, BP26 모노머의 구조적 특성을 확인하고, 이러한 BP26 모노머 16개가 형성하는 BP26 복합체의 특이한 결정 구조인 채널 유사 구조가 기능적 단위로 작용하여, 브루셀라 등의 병원성 박테리아 감염 및 면역 반응에 중요한 역할을 하는 점을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

미국공개특허 제2012-0202271호

Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jul;10(4):647-51.

본 발명의 주된 목적은 BP26 복합체의 특정 구조의 결정 및 이에 관한 정보를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 BP26 복합체 결정의 박테리아 감염 조절에 관여하는 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 BP26 복합체 결정에 기초하여 SIMPL 도메인연구의 표준 모델을 제공하는데 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해,

각각 8개의 BP26 옥타머 분자들로 이루어진 2개의 링 구조체가 결합되어 있는 헥사데카머로서, 채널 유사(channel-like) 구조를 형성하는 BP26 복합체 결정 및 이에 관한 정보를 제공한다.

상기 BP26 복합체 결정은 4개의 층을 이루고 있는 것을 특징으로 하는데, 각BP26 옥타머가 각 2개의 층을 포함하고 있기 때문이다. 2,3번 층 사이에 루프의 교환을 통해 결합이 이루어지 때문에, 결과적으로 상기 2개의 링 구조체의 결합 역시 루프(loop)의 교환을 통해 이루어지는 것이다.

본 발명의 일 실시예에의 BP26 복합체 결정은 BP26 복합체의 양 말단에 트랜스멤브레인 서열이 위치하고 있고, 또한, 120Å 높이 및 115Å 폭의 크기를 가진다. 무엇보다도, 채널 유사 구조를 형성하는 BP26 복합체 결정은 25~35 Å 직경의 홀을 가지는 것을 특징으로 한다. 일 실시예에서는 30Å 직경의 홀을 가짐을 확인하였다. 특히, 상기 홀의 가장 자리는 8개의 Pro37 잔기가 위치하고 있다.

본 발명의 BP26 복합체 결정은 외부 및 내부 모두 높게 대전되어 있는 특성을 지닌다. 이는 복합체의 우수한 반응성에 영향을 미친다.

그 중에서도, 상기 홀은 양성적으로 대전되어 있는데, 특히, 각 링마다 이하의 3개의 양성적 대전된 층을 포함한다:

홀의 가장자리의 Arg39 잔기로 이루어진 제1층,

Arg206 잔기로 이루어진 제2층, 및

Arg215 잔기로 이루어진 제3층.

이와 같은 채널 유사(channel-like) 구조를 형성하는 BP26 복합체 결정은 필라멘트 결합성을 가지는 박테리오 파지와 구조적 유사성을 가지는 것을 특징으로 한다.

그러므로, BP26 복합체 결정을 이용하여 병원성 박테리아 감염의 진단에 필요한 정보를 수득할 수 있다.

상기 병원성 박테리아는 바람직하게는 α-프로테오박테리아 또는 γ-프로테오박테리아일 수 있는데, 예를 들어, 브루셀라(Brucella) 속 박테리아가 가장 바람직하다. 상기 브루셀라(Brucella) 속 박테리아는 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(B abortus), 브루셀라 수이스(B suis), 브루셀라 오비스(B ovis), 루셀라 캐니스(B canis), 또는 브루셀라 네오토마(B neotomae)일 수 있는데, 본 발명의 일 실시예서는 브루셀라 아보르투스(B abortus)를 사용하였다.

한편, 본 발명의 BP26 복합체 결정은 SIMPL(signaling molecule that associates with the mouse pelle-like kinase) 도메인에 속하는 단백질로서, 종래 구조 규명이 어려웠던 SIMPL 도메인을 연구함에 있어서도, 본 발명의 BP26 복합체 결정을 표준 모델로서 유용하게 사용할 수 있다.

이처럼, 본 발명은 BP26 단백질의 복합체의 결정의 입체 구조 및 그의 구조해석결과 얻어지는 기능에 대한 것이다.

본 발명은 BP26 단백질의 복합체의 신규한 결정 구조인 채널 유사 구조에 기초하여 SIMPL 도메인 영역에 대한 연구 뿐만 아니라, 상기 BP26 복합체의 결정 구조에 대한 감염성 박테리오 파지와의 구조적 유사성에 기초하여, 감염성 또는 병원성-특이적 진단 마커의 개발에 있어서 BP26의 구조적 정보를 활용할 수 있을 것인 바, 박테리아 감염 질환의 치료제의 연구 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 B. abortus, Vibrio cholerae, Ochrobactrum anthropi, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum and Ahrensia sp.R2A130 및 SIMPL 도메인 (COG2968)로부터의 BP26 상동성에 대한 다중 서열들로서, 높은 서열 보존성을 보여준다(트랜스멤브레인 서열은 빈(bracket) 것으로 표현함).
도 2는 BP26 모노머 구조의 리본 다이어그램 및 topology 다이어그램을 나타낸다.
도 3은 BP26 모노머의 도메인 I 및 II의 겹쳐지는 형태 및 각각에 대한 G3P 필러스(pilus) 결합 도메인과의 겹쳐지는 형태에 대한 모식도이다.
도 4는 헥사데카머 BP26 복합체 구조에 대한 상면도(a) 및 2개의 옥타머가 형성하는 홀(hole)에 대한 모식도(b) 및 복합체에서의 2개의 BP26 모노머들이 형성하는 층에 대한 모식도(c)이다.
도 5는 BP26의 2D class-average EM 구조(위) 및 결정 구조의 프로젝션(아래)의 일치를 보여주는 사진이다.
도 6은 BP26 모노머들 사이에서의 구체적인 상호작용을 나타낸 모식도이다[I:β베럴 구조를 형성하는 β시트를 보여주는 도메인 I 사이의 상호작용, II:β스트랜드가 또 다른 β베럴 구조를 형성하는 것을 보여주는 도메인 II 사이의 상호작용, III: 도메인II에서의 β3 및 β4 간 루프의 교차를 보여주는 두 개의 BP26 옥타머간의 상호작용, IV: 8개의 Pro37 가지를 보여주는 홀(hole)]
도 7은 헥사데카머 BP26 복합체의 정전기적 표면 확인에 대한 모식도로서, 높게 대전된 표면의 복합체 측면도(a) 및 염기성으로 높게 대전된 홀의 상면도(b)이다.
도 8는 BP26 복합체의 중심을 절단한 단면도로서, 분자 내부에 높게 대전된 표면을 가지는 것을 보여준다.
도 9는 전자 밀도 지도(Electron Density Map)로서, BP26 복합체 홀에서의 SAD 맵(a) 및 정제 후 SAD 맵(b)을 나타낸다.
도 10은 BP26 복합체 형성에 대한 구체적인 상호작용을 나타낸 모식도로서, BP26COM 형성에 관여하는 보존된 소수성 잔기를 보여준다.
도 11은 음성적으로 염색된-raw TEM 마이크로그래프 및 BP26의 2D-class Averages에 대한 것이다.
도 12는 BP26, IRAK1BP1, 및 SIMPL의 다중 서열 배열을 비교한 것이다.
도 13은 종 간 BP26의 서열 보존성(conservation)을 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위하여 본 명세서에 상호호환적으로 사용된다. 또한, 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산뿐 아니라 자연 발생 아미노산 중합체의 유사체 또는 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 또한, 용어는 예를 들어, 탄수화물 잔기의 첨가에 의하여 당단백질을 형성하도록 변형되거나 인산화된 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 자연-발생 및 비-재조합 세포에 의해 생성될 수 있거나, 폴리펩티드 및 단백질은 유전적으로 조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질은 나이브 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자 또는 나이브 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 첨가 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"발현"이라는 용어는 본 발명의 분리된 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 mRNA의 전사 및 안정적인 축적으로부터 시작하여,이어서 폴리펩타이드 산물로의 mRNA의 후속적 번역과 마지막으로 숙주 세포에 의한 폴리펩타이드 산물의 번역후 변형에 이르기까지의, 상기한 숙주 세포에서의 완전한 생물학적 과정을 가리키는 것이다.

"단백질 결정"은 무정형의 고체 상태와는 구별되는, 3차원의 결정 격자로 이루어진 물질의 고체 상태의 한 가지 유형을 말한다. 단백질이 결정형 상태에 있는지 여부는 종래 기술에 공지된 방법, 예를 들면 X-레이 회절방법 또는 분말 X-레이 회절방법으로 측정할 수 있다

"서열 특이적 결합 단백질(sequence specific binding protein)"은 상기 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 단백질의 종류를 의미한다. 용어, "모티프(motif)"는 표적 핵산의 특정 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 특정한 아미노산 서열을 의미한다. 상기 모티프는 3차 구조 및/또는 2차 구조는 물론, 1차 구조의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 모티프는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산을 특이적으로 인식할 수 있다. 상기 서열 특이적 결합 단백질은 하나 이상의 모티프를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 모티프는 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모티프를 포함하는 것일 수 있다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 병원성 박테리아 감염 여부를 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 α-프로테오박테리아 또는 γ-프로테오박테리아 관련 감염 질환 발병 여부에 유용하다. 본 발명에서는 가장 대표적인 예로서 브루셀라(Brucella) 속 박테리아를 들 수 있다.

"진단용 마커, 진단하기 위한◎마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 α-프로테오박테리아 또는 γ-프로테오박테리아 등의 병원성 박테리아 감염 질환 여부를 및 관련 정보를 진단하는데 사용될 수 있는 물질로, 본 발명의 BP26 복합체 단백질 및 이의 기능적 유사체를 의미한다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"항박테리아제"는 살균 또는 제균 활성을 갖는 실험실에서 합성되거나 변형된 작용제를 지칭한다. 이와 관련해서 "활성" 작용제는 브루셀라 등 그람-음성 박테리아의 성장을 억제할 것이다. 용어 "성장을 억제하는"은 특정 박테리아의 집단의 수가 증가하는 속도를 감소시키는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 박테리아 집단이 증가하긴 하지만 느린 속도로 증가하는 상황 뿐만 아니라, 집단에서 박테리아의 수가 감소되거나 심지어 집단이 제거되는 상황을 포함한다. 효소 활성 검정이 억제제를 스크리닝하는데 사용되는 경우, 효소 억제와 성장 억제를 상호관련시키기 위해 화합물에 대해 흡수/유출, 용해도, 반감기 등을 변경시킬 수 있다. 항박테리아제의 활성은 반드시 박테리아로 제한되지는 않으며, 기생충, 바이러스 및 진균에 대한 활성을 포함할 수 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

브루셀라의 외부 멤브레인 단백질(outer membrane protein) BP26/OMP28, 통상적으로 "BP26"로 표시하는 단밸질은 주요한 면역우성의 항원으로써, 브루셀라증(Brucellosis)에 대한 백신 및 진단마커로서 널리 사용되어 왔다.

본 발명은, 비제한적으로, BP26 단백질이 관여하는 모든 병원성 박테리아의 감염 및 면역 반응에 관여하는 단백질 복합체의 결정 구조에 관한 것이다.

다만, 여기에서는 상기 브루셀라 감염증 등을 대표적인 예로 들어 설명하도록 한다.

브루셀라균 속은 많은 종류의 동물과 사람에 감염할 수 있는 α-프로박테리아(Proteobacteria) 강 Brucellaceae과에 속하는 그람 음성, 통성 세포내 기생 세균이다.

본 발명의 브루셀라 속 균주는 브루셀라 속에 속하는 모든 균주일 수 있으며, 그 예로는 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(B abortus), 브루셀라 수이스(B suis), 브루셀라 오비스(B ovis), 루셀라 캐니스(B canis), 브루셀라 네오토마(B neotomae)가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 브루셀라 아보르투스(B abortus) 유래 BP26 단백질을 사용하였다.

브루셀라 균의 숙주 탐식세포 내 침입 및 증식 기전에 대한 정확한 해석은 아직까지 확립되어 있지 않지만, 많은 연구자의 결과에서 B. abortus는 탐식 세포와 결합한 후에 세포막에서 멤브레인 선택(membrane sorting)이 일어난 후, 일정의 경과를 거쳐 식포(phagosome)을 형성하며, 이 멤브레인 선택에 참여하는 막 성분은 지질 래프트(lipid raft)-관련 분자로서 여기에 속하는 물질로는 GPI 고정 단백질( anchored protein), GMl 강글리오사이드(ganglioside, 콜레스테롤), 스캐빈저(scavenger) 수용체 등으로 보고되고 있다.

브루셀라 감염증의 증상은 인체에 감염될 경우 지속적 발열, 두통, 식욕부진, 원기쇠약을 보이다가 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 된다. 감염된 동물에서 보이는 증상은 특별한 외부 증상이 없이 암컷에서의 태반염, 자궁 내막염 등으로 인한 유산과 수컷에서 고환염, 기형정자 등으로 인한 불임을 유발한다. 특히, 감염축은 특별한 외부 증상 없이 균을 장기간 보균하며, 지속적으로 균을 배출하여 사람과 건강한 동물에 감염되어 폭발적인 감염률을 보인다

현재 국내의 브루셀라 감염증의 증가로 인체 및 동물 유래의 야외주가 다수 분리되고 있으나, 진단상의 어려움을 겪고 있으며, 야외주에 대한 병원성 및 항원성에 대한 연구가 미흡하여, 병원성 요인의 분석, 감염경로 및 발병기전에 대한 기초적 자료가 거의 없는 실정이다.

그러므로, 이러한 감염증에 관련하는 BP26 단백질 복합체의 특이적 결정 구조 및 이의 해석을 통해 진단 및 치료에 필요한 정보를 수득할 필요성이 요구되어왔다. 특히, BP26은 SIMPL(signaling molecule that associates with the mouse pelle-like kinase) 도메인을 포함하는 단백질의 군에 속해있고, 이러한 SIMPL 도메인의 구조에 대해서는 거의 알려진 바가 없었기 때문에, 이러한 구조적 특이성에 대한 규명이 필요한 실정이었다.

본 발명은 상기 BP26 단백질 복합체의 결정 구조에 관한 것이다.

보다 구체적으로는 각 BP26 모노머들이 다중 결합을 통해 형성하는 총 16개의 BP26 헥사데카머에 있어서, 각 BP26 옥타머가 링 구조체를 형성하고 이러한 2개의 링 구조체가 결합하여 최종적으로 중심에 홀(hole)을 가지는 채널 유사(channel-like) 구조를 이루는 복합체의 결정 구조에 관한 것으로, 특히, 이러한 결정 구조가 기능적 단위로 작용하여 감염성 박테리아 질환의 감염 및 면역반응에 관여하는 기능을 가지는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명은 일 관점에서 BP26 단백질 복합체의 신규한 결정 구조, 특히 3차원 결정 구조에 관한 것이다. "3차원 구조"라는 용어는 당업계에서 "공간 배치", "공간 구조" 등의 용어와 바꾸어 사용될 수 있다.

본 발명은 BP26 모노머들이 형성하는 특정의 채널 유사(channel-like) 구조의 결정 및 이의 유사체를 제공한다.

본 발명의 BP26 단백질 복합체를 구성하는 BP26 모노머의 서열적 특이성 및 구체적인 구조에 대해서는 본 발명의 실시예에서 확인하였다(도 2-4).

BP26 모노머들은 2개의 도메인(도메인 I 및 도메인 II)으로 구성되어 있고, 이러한 2개의 도메인은 서로 유사한 구조적 특성을 지니고 있다.

두 도메인은 1 β-시트 및 2 α-헬릭스로 구성되어 있고, 도메인 I에서, β-시트는 3개의 반대방향의(antiparallel) β-스트랜드로 구성되어 있는데, 2개의 β-스트랜드는 BP26의 N-말단(β1, 잔기 39-50) 및 C-말단 (β6, residues 235?250) 부분으로부터 오고, 3번째 β-스트랜드는 다수 프롤린 잔기를 함유하는 루프에 의해 방해를 받는다. 도메인 I은 하나의 긴 α-헬릭스 (α3) 및 하나의 짧은 α-헬릭스 (α4)를 가지는데, 상기 긴 α-헬릭스는 β-스트랜드의 평행축에 대하여 40° 각도에서 β-시트 상에 위치하고, 짧은 α-헬릭스는 β-시트의 다른 사이드에 위치한다. 도메인 II 역시 3개의 β-스트랜드 및 2개의 α-헬릭스로 구성된 반대방향의 β-시트를 가진다.

두 α-헬릭스는 β-시트와 대부분 평행한 방향으로 β-시트의 동일 사이드에 위치하는데, 상기 도메인 I 및 도메인 II는 2개의 루프에 의해서 연결되어 있다. 첫번째 루프는 β1 및 β2와 연결되어 있고, 두번째 루프는 α2 및 α4와 연결되어 있다.

특히, 상기 BP26 모노머는 필라멘트성 파지로부터 G3P(phage Ike gene 3 protein)의 N-말단 pilus-결합 도메인이, 각각 3.4 ~ 2.1 A 값의 r.m.s.d로 도메인 I and 도메인 II 모두와 매우 유사한, 박테리아 파지와 구조적 상동성을 가지는 것을 특징으로 하므로, pilus-결합 도메인이 감염 최초 단계에 관여하게 된다.

BP26 모노머 단백질은 야생형 단백질, 또는 돌연변이를 포함하나 야생형 단백질과 동일한 3차 구조를 갖는 단백질 결정을 포함하는 것이다. 한 구현예에서 상기 BP26단백질은 브루셀라 아보투스 유래이나, 동일한 3차 구조를 갖는 그람 음성균, 특히 다른 프로테오박테리아 유래의 경우도 포함한다.

특정 구현예에서 상기 BP26 모노머 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으며(도 1), 상기 서열번호에 치환 등이 일어난 서열변이체도 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 BP26 모노머들의 결합을 통해 형성되는 복합체의 결정 구조에 관한 것이다.

BP26 모노머 구조의 특징을 이용한 높은 오더 다합체화 또는 다중결합화(order multimerization)를 통해, 4개의 비대칭 유닛으로부터 BP26의 16개 모노머 분자들은 채녈-유사 구조의 결정을 형성한다(BP26COM이라 함).

트랜스멤브레인 서열은 BP26COM 복합체의 양 말단에 위치하고 있는데, 이는 트랜스멤브레인 서열이 BP26 모노머의 N 말단부의 끝에 위치하고 있기 때문으로, BP26COM 복합체는 N-말단 트랜스멤브레인 서열이 절단 된 후 형성되는 것을 알 수 있다.

이 때, 16개의 BP26 모노머들이 각 8개 분자들마다 8-배 대칭을 가지는 링 구조체를 형성하고, 형성된 2개 링 구조체들은 아래면-아래면 모드(bottom-to-bottom mode)에서 서로 상호작용하여, BP26의 2개의 각 도메인들은 BP26COM에 대해 하기의 4층의 구조를 형성하고 있다(I-II-II-I)(도 4c 참조).

첫번째 층은, β-베럴(barrel) 구조를 형성하기 위해 나란히 정렬되어있는 BP26의 8개 분자로부터 도메인 I에서 β-시트로 구성되는 24 반대방향 β-스트랜드로 구성되어 있다. 도메인 I에서 긴 α-헬릭스가 대각선으로 쌓여 바깥 프레임(outer frame)을 형성하고 β-시트 간의 상호작용을 강화한다. BP26 분자들의 β-시트 사이에서 β-베럴의 아래 부분에서 위치하고 있는 도메인 I에서의 짧은 α-헬릭스는 BP26 사이에서 웨지(wedge)로서 제공되어 β-베럴 구조의 윗부분보다 폭이 훨씬 넓은 아래 부분을 형성하게 되는 것이다.

두번째 층은 β-베럴 구조를 형성하기 위해 나란히 정렬되어 있는 도메인 II 의 β-스트랜드로 구성되어 있고, α2 및 α3 사이의 연결 루프 또한 이러한 β-스트랜드에 맞추어 조정되어 있다 . 각 BP26 도메인 II로부터 전체의 16 α-헬릭스, 2 α-헬릭스 역시 대각선으로 쌓여 두번째 β-베럴 구조를 고정시키고 있다.

또한, 다른 8개의 BP26 분자들에 의해 구성된 세번째 층 및 네번째 층은 각각 첫번째 및 두번째 층과 동일하다. 두번째 층 및 세번째 층 사이의 상호작용은 2개의 옥타머 링들로부터 도메인 II에서 β3 및 β4 사이의 루프를 교환함으로써 이루어진다. 상이한 BP26 분자들로부터 온 16 루프들은 선택적으로(alternatively) 교차하고 있고, 2개의 옥타머 링 구조를 홀딩하고 있다. 이러한, BP26 모노머들간 상호작용은 대부분 보존된 소수성 잔기를 통해 이루어지고, 이는 BP26COM의 올리고머 상태가 용액에서 잘 유지됨을 의미한다.

상기 설명한 구조의 배열로 인해, BP26COM는 큰 내부의 공간(cavity)을 생성하게 되고, 최종적으로 "채널 유사(channel-like)" 구조 결정을 가지게 되는 것이다.

본 발명은 상기 BP26 모노머 단백질 16개의 각 도메인 부분과, BP26 옥타머 가 형성하는 각각의 링 구조 및 이들의 결합 부위, 이러한 결합에 따른 복합체의 특정 3차원 결정 구조; 그리고 이러한 결정화 조건 및 최적화 조건을 모두 포함한다.

그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 3차원 구조의 BP26 복합체의 결정화 방법을 포함한다.

이는 공지의 방법을 적절히 변경하여 수행할 수 있지만. 예를 들어, 실시예에서 기재하고 있는 방법으로 수행할 수 있다. 이와 같은 단백질 복합체의 결정화 방법은 일례에 불과하며, 당업계에서 통상적인 지식을 가지는 자가 공지의 기술에 기초하여 적절히 수행할 수 있음은 자명할 것이다.

한편, 본 발명의 BP26 복합체의 구조는, 이에 제한되지는 않지만, 바람직하게는 X-선 결정학 등을 이용하여 분석할 수 있다.

단백질 복합체의 구성 아미노산 각각을 구조 좌표(또한 "원자 좌표"로서 공지됨)의 세트로 정의할 수 있다. 용어 "구조 좌표"는 결정 형태의 본 발명의 복합체에 의해 X-선의 단색 빔을 회절시켜 수득한 패턴과 관련된 수학식으로부터 유도된 카테시안 좌표를 지칭한다. 회절 데이타를 사용하여 결정의 반복단위의 전자 밀도 맵을 계산한다. 이어서, 전자 밀도 맵을 사용하여 복합체의 개개 원자의 위치를 확립한다. 구조 좌표의 약간의 편차는 복합체 구조 좌표를 수학적으로 조정함으로써 생성될 수 있다.

예를 들면, 구조 좌표는 순열, 분할, 전체 세트의 가감, 역전 또는 상기의 임의의 조합에 의해 조정될 수 있다. 또는, 아미노산의 돌연변이, 부가, 치환 및/또는 결실에 기인하는 결정형 구조의 변형, 또는 결정을 구성하는 임의 성분들의 기타 변화는 또한 구조 좌표의 변경을 제공할 수 있다. 개개 좌표에서의 이러한 약간의 편차는 전체 배열에 대해 효과가 거의 없을 것이다. 이러한 편차가 본래 좌표와 비교하여 허용 가능한 표준 오차 내에 있는 경우, 생성된 3차원 형상은 구조적으로 등가인 것으로 간주된다.

X-선 구조 좌표는 공간 중의 독특한 지점 배치를 정의한다. 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 단백질 또는 단백질 복합체 또는 이의 부분에 대한 구조 좌표 세트가 또한 3차원으로 배치를 규정하는 관련 지점 세트를 규정하는 것으로 이해될 것이다. 유사하거나 동일한 배치는 전체적으로 상이한 세트의 좌표에 의해 규정될 수 있고, 단 좌표 사이의 거리 및 각도는 실질적으로 동일하게 유지된다. 또한, 확장성 지점 배치는 각도를 실질적으로 동일하게 유지하면서 스칼라 인자에 의해 좌표 사이의 거리를 증가 또는 감소시킴으로써 정의될 수 있다.

다양한 컴퓨터 분석을 사용하여, 분자 또는 이의 부분이, 이의 3차원 구조의 측면에서 정의된, 본원에 기재된 복합체 또는 이의 부분에 대해 "구조적으로 등가"인지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 상이한 구조, 동일한 구조의 상이한 형태 또는 동일한 구조의 상이한 부분은 다양한 컴퓨터 분석에 의해 이루어질 수 있다. 한 가지 양태에서, 이러한 분석은 4단계: (1) 비교되는 구조를 적재하는 단계; (2) 이들 구조에서 원자가를 정의하는 단계; (3) 적합화 작업을 수행하는 단계 및 (4) 결과를 분석하는 단계로 분리할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 전자 현미경(election microscopy, EM)을 이용하여 BP26 복합체 결정 구조를 분석하였다.

전자현미경(Electron Microscope)은 광학현미경(Light Microscope)에서 사용하는 가시광선(visible rays) 대신 전자선(electron beam)을, 또한 유리렌즈(glass lens) 대신에 전자렌즈(electron lens)를 사용하여 물체의 확대상을 만드는 장치를 말하는데, 전자현미경에서는 전자선이 시료의 표면에 충돌하면서 발생하는 이차 전자, 산란전자, 투과전자, X-Ray 등을 측정하여 표면의 형태를 영상으로 나타낸다.

전자현미경으로 재료의 표면형상, 적층 결함, 계면 등을 직접 관찰함에 따라 이들이 재료의 여러 성질들에 미치는 영향을 정확히 규명할 수 있다. 전자회절로써 결정의 결자상수와 대칭성 등을 규명할 수 있고, 분석전자현미경으로 원자의 종류와 양을 분석할 수 있다. 그리고 고 분해능 전자현미경으로 원자의 배열을 관찰할 수 있다. 이들 전자현미경 기술을 이용하면 원자의 종류와 위치를 원자 규모로 규명할 수 있고 따라서 이들이 재료의 성질에 미치는 영향을 규명하여 새로운 재료의 개발에 이용할 수 있다.

전자현미경 분석법에 의해서는, 물체의 표면의 형상(topograhpy)을 관찰할 수 있고, 물체를 구성하는 입자들의 형상과 크기(morphology) 관찰에 유리하다. 또한, 분광학에 의한 전자와 시편이 상호 작용하여 생기는 X-선이나 전자를 분석하여 시편 내에 존재하는 원자의 종류와 양을 알아내는 방법으로 에너지 분산 X-선 분광학과 전자 에너지 손실 분광이 있다. 즉, 분광학을 이용한 재료표면의 원소의 종류와 양은 같은 화학적 조성 정보를 제공한다. 녹는점, 반응성, 경도 등 재료물성과 조성과의 관계를 알 수 있다.

특히, 재료 내 원자들의 배열상태(Crystallography)를 분석하는데도 유용하게 사용할 수 있는데, 이는 전자와 시편 내의 원자 간의 간섭을 이용하여 원자의 위치 및 배열에 대한 정보를 얻는 것이다. 회절 패턴을 이용한 결정 구조정보와 같은 역공간의 정보를 제공한다. 이를 통해, 전도성(conductivity), 전자 특성(electrical properties) 등의 재료고유 물성과 원자배열과의 관계 연구할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 BP26 단백질 복합체 BP26COM의 전체 크기를 관찰한 결과, 120 Å 높이 및 115 Å 폭을 가지고 있었다. 상기 결정의 단위 세포 파라미터가 모든 세포 파라미터에서 최대 5%의 가변성을 지닐 수 있다.

도 6 내지 도 8에서 본 발명의 BP26 복합체 3차원 결정 구조의 모식도 및 간단한 개략도를 도시하였는데, 특히, 하기와 같은 특성을 지니고 있다.

(i) 본 발명의 채널 유사 구조의 BP26 단백질 복합체의 중요한 일 특징은 BP26 옥타머에 의해 생성되는 홀(hole)이다.

상기 홀의 직경은 약 25 ~ 35 Å, 바람직하게는 약 30 Å을 이루고, 2개의 BP26 옥타머 링에서 2개의 홀이 나란히 정렬되어 BP26 단백질 복합체 BP26COM가 채널을 가지도록 한다(도 4). 특히, 상기 홀의 가장자리는 잘 정돈된 8개의 Pro37 잔기로 구성되어 있다 (도 6 IV).

(ii) 본 발명의 BP26 단백질 복합체는 외부 및 내부 모두 높게 대전되어 있는 특성을 지닌다.

본 발명의 복합체에서 바깥 표면은 중요한 국부적 염기 또는 산성 패치없이도 높게 대전되어 있다. 홀의 가장가리는 Arg39, Arg197 및 Lys250의 존재로 인해 높은 염기성을 띠는데, 이는 홀이 음성적으로 대전된 분자들과 상호작용할 수 있음을 의미한다. 즉, 복합체의 내부 표면 또한 높게 대전되어 있다.

흥미롭게도, 본 발명의 복합체에는 6개의 양성적의 대전된 층들이 존재한다(도 8). 홀의 가장자리는 첫번째 층을 만들고, 내부 벽 상의 8개의 Arg 206 잔기는 두번째 층을 만들며, 8개 Arg215 잔기는 세번째 층을 만들고 있다. 그리고, 두번 째 옥타머 링은 다른 3개의 층을 생성하고 있다.

이러한 대전 층들을 통해서 BP26의 16개 모노머 분자들이 형성하는 본 발명의 BP26 복합체는 높게 대전된 표면 및 높게 양성적으로 대전된 홀을 가지는 채널-유사 구조를 형성한다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 BP26 단백질 복합체의 3차원 결정 구조에 따른 감염성 박테리아 질환, 예를 들어 브루셀라증에 대한 감염 및 면역 반응에 관여하는 정보를 제공하는 용도를 포함한다.

특히, 본 발명의 BP26 단백질 복합체는 감염성 박테리아의 감염 및 면역 반응에 기능하는 핵심적인 단백질로서, 이러한 "채널 유사 구조" 자체가 기능적 단위체(functional unit)로서 기능한다.

BP26 서열로 한 BLAST 써치는 BP26 상동성이 대부분의 α-프로테오박테리아 및 일부 γ-프로테오박테리아에서 발견됨을 보여주고, 이들이 잘 보존되어 있음을 시사한다. 그리고, BP26는 구조적으로 감염에 관여하는 박테리오 파지와 유사하다. 다중결합화된 BP26의 올리고머(복합체) 구조는 다른 박테리아 종에서도 보존되어 있는데, 다른 종에 걸쳐 높게 보존되어 있는 잔기의 맵핑은 이러한 잔기들이 채녈 유사 구조를 형성하는데 중요함을 알 수 있다(도 13). 다만, 홀의 가장자리 및 올리고머 내부에 위치하는 염기성 잔기들이 다양화되어 있을 뿐, 올리고머 구조 자체는 유사하게 형성되어 있다. 즉, 특정의 잔기 종류보다 채널 유사 구조 자체가 BP26의 기능에 중요하다.

따라서, 병원성 박테리아 감염 및 면역 반응에 있어서, 본 발명의 BP26의 구조적 정보를 활용할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 복합체의 3차원 구조를 포함하는 단백질 공간 구조 모델을 제공할 수 있고, 상기 체널 유사 구조를 포함하는 펩티드로부터 유도되는 지점의 확장성 3차원 배치를 제공한다. 확장성 3차원 배치는 홀로그래픽 이미지, 입체 다이아그램, 모델 또는 컴퓨터 표시 이미지로서 나타내어질 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 BP26 복합체의 3차원 결정 구조에 있어서의 상기 설명한 특정 결합부위에 대한 정보를 포함한다. 그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 복합체의 3차원 구조의 선택된 부분을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 개개 아미노산은 본 기술분야에서 이해되는 바와 같이 다른 밀접하게 관련된 아미노산에 의해 치환될수 있는 변이체 펩티드를 포함한다. 예를 들면, 개개 아미노산은 다음과 같이 치환될 수 있다: 임의의 소수성 지방족 아미노산은 임의의 다른 소수성 지방족 아미노산으로 치환될 수 있고; 임의의 소수성 방향족 아미노산은 임의의 다른 소수성 방향족 아미노산으로 치환될 수 있으며; 극성 측쇄를 갖는 임의의 중성 아미노산은 극성 측쇄를 갖는 임의의 다른 중성 아미노산으로 치환될 수 있고; 산성 아미노산은 임의의 다른 산성 아미노산으로 치환될 수 있고; 염기성 아미노산은 임의의 다른 염기성 아미노산으로 치환될 수 있다.

"유사체", "기능적/구조 유사체"는 본원에 기재된 폴리펩티드와 동일한 작용성/구조 활성을 갖는 펩티드변이체 또는 유기 화합물로서, 이러한 유사체 또는 동족체의 예는 본원에 기재된 인터페론의 3차원 구조와 유사하도록 모델링되어 있는 화학적 화합물 또는 펩티드, 바람직하게는 아미노산 잔기의 상기 정렬을 갖는 화합물 및 펩티드를 포함한다.

따라서, 본 발명의 BP26 복합체의 유사체는 본 발명의 복합체와 동일한 작용/구조 활성을 갖는 펩티드 변이체 또는 유기 화합물, 특히 본 발명의 BP26 복합체와 동일한 구형 공간 구조를 갖는 것을 포함한다. "유사체"가 펩티드 변이체인 경우, 이의 아미노산 서열의 길이는 일반적으로 본 발명의 복합체에서의 길이와 유사하다.

구체적인 일 예로써, BP26 복합체 또는 이의 항체는 특정 병원체 의한 감염의 검출을 위한 "진단 마커"로서 사용될 수 있다. BP26 복합체 결정 및/또는 BP26 복합체 결정은 염을 포함하는 조성물의 형태로 제공될 수도 있다.

유사한 관점에서 BP26 복합체 결정을 사용하여 이의 활성을 저해 및/또는 방해하는 그람음성 병원균, 특히 프로티오박테리아 (proteobacteria), 가장 바람직하게는 브루셀라균에 의한 감염을 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하거나 또는 디자인하는 방법을 제공한다. 상기 방법에는 기본적으로 본원에서 수득한 BP26 다중 결합부위에 대한 3차 구조를 사용될 수 있으며, 적어도 하나의 후보물질을 상기 3차 구조의 활성영역 및/또는 결합부위에 대한 영향을 평가하여, 활성영역과 공간적으로 적합한 물질을 약물로서 선별할 수 있다

다른 예로써, 본 발명의 3차 구조를 사용하여 체계적 약물 설계(rational drug design)를 사용할 수 있다. 후보 화합물을 활성영역의 전부 또는 일부와 결합시킨 후 이의 결합 잠재성(potential)을 측정하고 이를 기존의 알려진 물질의 결합력과 비교하여 후보 물질을 선별할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 BP26 복합체 결정에 기초하여 SIMPL(signaling molecule that associates with the mouse pelle-like kinase) 도메인 연구의 표준 모델을 제공할 수도 있다.

BP26의 다른 기능적 보존된 도메인 데이터베이스에 따르면 SIMPL 수퍼패밀리에 속한다(도 12).

특히, SIMPL 도메인 단백질의 구조는 종래 거의 알려지지 않았는 바, 처음으로 규명된 본 발명의 BP26 단백질 복합체의 채널 유사 구조를 참고하여, BP26 단백질 등이 속하는 SIMPL 도메인 단백질에 구조적 특성을 예측하거나 연구할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 BP26 복합체는 병원성 박테리아의 감염에 관여하는 단백질로서, 이의 채널 유사(channel-like) 결정 구조는 박테리아 파지와 구조적으로 유사성을 지니고 이러한 구조적 특징으로 인해 박테리아의 감염 및 이의 면역 기능에 관여하는 바, 병원성 박테리아 관련 감염 질환의 예방 및 치료에 본 발명의 BP26 복합체 결정 구조를 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 재조합 BP26 단백질 발현 및 정제

BP26 (29~250 아미노산), B. abortus OMP28의 단일 펩타이드가 없는 주변세포질 부분(periplasmic portion)을, N-말단 Histag 및 His-tag (Novagen) 후 tobacco etch 바이러스 프로테아제절단 사이트를 함유하는 변형된 pET28a 벡터 내로 클론화하였다.

BP26를 함유하는 상기 플라스미드를 BL21 (DE3) RIPL E. coli 컴피턴트 세포 내로 형질전환하였다.

BP26를, 1 mM 이소프로필-1-티오-β-D 갈락토피라노사이드로 16시간동안 18 °C에서 발현시켰다. 상기 세포들을 수득하고, 500 mM NaCl 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 버퍼 A를 이용하여 재현탁시켰다. 재현탁된 세포들을 초음파처리하고 1시간 동안 t 18,000 rpm 에서 원심분리하였다. 상청액을 5 ml Ni-NTA 수지(Qiagen)와 함께 배양하였다. 상기 단백질을, 1M NaCl를 함유하는 버퍼 A로 세척 후 300 mM NaCl 및 100~200 mM 이미다졸을 함유하는 버퍼 A로 용리시켰다.

N 말단 His-tag를 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.5 mM 에틸렌디아민테트라 아세트산 및 1 mM DTT를 함유하는 버퍼에서 투석 중, tobacco etch 바이러스 프로테아제로 절단하였다.

상기 절단된 His-tag 및 절단되지 않은 BP26를 Ni-NTA 수지로 제거하였다. BP26를 tandem HiTrap Q-SP 컬럼에 적용하였다.. 나아가 흐르는 프렉션(flow-through fraction) 중 BP26를, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl 및 20 mM β-머캅토에탄올으로 평형화된 Superdex 200 26/60 size-exclusion column (GE Healthcare)로 정제하였다. BP26의 최종 농도를 15.2 mg/ml로 하였다. Se-치환된 단백질이 발현되었고 야생형 단백질과 유사한 방법으로 정제되었다.

결과 : 모노머 구조( Monomeric structure )

Brucella BP26의 상동성은 대부분의 프로테오박테리아에서 발견되었다 (Fig. 1a). 트랜스멤브레인 서열이 없는 Brucella abortus BP26 (29~250 amino acids)의 결정 구조를 Se SAD(single-wavelength anomalous dispersion) 방법을 이용하여 3.5 A 해상도에서 결정하였다(표 1).

분명한 전자 밀도 지도가 생성되었고, 각 BP26 분자에서 셀레노메티오닌들이 아미노산이 전자 밀도 내에 존재하였다 (도 9). 결정들은 I4122 스페이스 그룹에 속하였고 비대칭 유닛(asymmetric unit)에서 4개의 BP26 분자가 존재하였다. 상기 4개의 BP26 분자들은 서로가 1 Å pairwise r.m.s.d. 이하로 거의 동일하였다

BP26 모노머들은 2개의 도메인(도메인 I 및 도메인 II)으로 구성되어있다 (도 2). 흥미롭게도, 상기 2개 도메인은 유사한 구조적 구성(organization)을 가지고 있다.

두 도메인은 1 β-시트 및 2 α-헬릭스 (도 2)로 구성되어 있고, 이들은 r.m.s.d. 3.7 A 로 거칠게 겹쳐있을 수 있다.(도 3 a).

도메인 I에서, β-시트는 3개의 반대방향의(antiparallel) β-스트랜드로 구성되어 있다. 2개의 β-스트랜드는 BP26의 N-말단(β1, 잔기 39-50) 및 C-말단 (β6, residues 235-250) 부분으로부터 온다. 상기 3번째 β-스트랜드는 다수 프롤린 잔기를 함유하는 루프에 의해 방해를 받는다(도 1).

도메인 I은 하나의 긴 α-헬릭스 (α3) 및 하나의 짧은 α-헬릭스 (α4)를 가진다. 긴 α-헬릭스는 β-스트랜드의 평행축에 대하여 40° 각도에서 β-시트 상에 위치한다 (도 2). 짧은 α-헬릭스는 β-시트의 다른 사이드에 위치한다. 도메인 II 역시 3개의 β-스트랜드 및 2개의 α-헬릭스로 구성된 반대방향의 β-시트를 가진다 (도 2). 두 α-헬릭스는 β-시트와 대부분 평행한 방향으로 β-시트의 동일 사이드에 위치한다.

도메인 I 및 도메인 II는 2개의 루프에 의해서 연결되어 있다. 첫번째 루프는 β1 및 β2와 연결되어 있어, 두번째 루프는 α2 및 α4와 연결되어 있다 (도 2).

BP26는 임의의 기능적으로 부가된(annotated) 단백질에 대한 명백한 서열 상동성을 보이지 않은 반면, Dali 서버를 통한 구조적 상동성 써치는 필라멘트성 파지로부터 G3P(phage Ike gene 3 protein)의 N-말단 pilus-결합 도메인이, 각각 3.4 ~ 2.1 A 값의 r.m.s.d로 도메인 I and 도메인 II 모두와 매우 유사함을 보여주었다(도 3 b 및 c).

상기 pilus-결합 도메인은 대장균의 F pilus와 상호작용함으로써 감염 최초 단계에 관여하고, 이는 BP26가 숙주 단백질과 상호작용하여 감염에 관여함을 시사한다

실시예 2 : 결정화, 데이터 수집 및 구조 결정

BP26의 최초 결정은 20℃에서 Mosquito (TTP LabTech)를 이용하여 sitting-drop 방법에 의해 2.5 M 암모늄 설페이트(AMS) 및 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5)를 함유하는 버퍼에서 성장되었다.

최적의 결정을 hanging-drop 방법에 의해 2.4 M AMS, 75 mM Tris-HCl (pH 8.5) 및 3% (v/v) 메탄올에서 수득하였다. Se-메티오닌 치환된 결정 조건이 2.4 M AMS, 175 mM Tris-HCl (pH 8.5) 및 100 mM NaCl로서 최적화하였다. 냉해방지(cryoprotection)를 위해, 결정화 조건 하 함량이 20%까지 이르는 점차적으로 증가하는 글리세롤에 결정들을 담구었다.

X-선 회절 데이터를, 한국 포항 가속기 연구소에서 빔라인 5C(SB-II) 에서 CCD Quantum 315r (ADSC)를 이용하고, 일본 츠쿠바 양성자 팩토리에서 빔라인 BL1A에서 PAD Pilatus 2M-F를 이용하여 수득하였다. 데이터들을 HKL2000 (HKL Research)를 이용하여 프로세싱하였다. PHENIX와 함께 Autosol를 이용하여 SAD 방법에 의해 최초의 상(phases)을 수득하였다.

프로그램 O 및 COOT를 이용하여 모델 빌딩(구축)을 수행하였다. 원래의 결정으로부터 고 해상도 데이터를 이용하여 프로그램 PHENIX 및 CNS로 구조 정제(refinement)를 완료하였다.

실시예 3 : EM 분석

BP26 단백질 was negatively stained with 0.75% uranyl formate로 음성적으로 염색하였다. 120 kV에서 작동하는 Tecnai T120 microscope (FEI) 상에서 4 K×4 K Eagle HS CCD camera (FEI)로 이미지들을 수집하였다. 모든 이미지에 대해 디포커스 및 작은 확대는 각각 - 1μm 및 67,000×이었다.

입자들을 EMAN2 boxer29로 자동적으로 선별하고 나쁜 입자들을 손으로 제거하였다. 이미지 프로세싱을 IMAGIC을 이용하여 수행하였다.

간략히 보면, 창이 있는 입자들을(windowed particles) 정상화하고, 통과 주파수 대역(band-pass)을 15 및 100 Å 사이에서 여과하였다.. 레퍼런스 없는 정렬 후에, MSA 분류, 평균화하여 MSA(multivariate statistical analysis)를 수행하였고, 5520 입자들을 30 클래스내로 분류하였다. 30개 클래스 중 5개의 선별된 클래스를 추가의 다수-레퍼런스 정렬(multi-reference alignment) 및 MSA 차례로 사용하였다.

반복된 다수-레퍼런스 정렬(multi-reference alignment)/MSA 후, 모든 데이터들을 최종 10개의 상이한 클래스로 분류하였다. 각 10 클래스를 결정 구조의 전방 투사 이미지로 비교하였고, 이는 10 Å에서 여과된 저주파이다.

결과 : BP26의 채널 유사 구조(Channel-like structure)

BP26 구조의 현저한 특징은 보다 높은 오더 다합체화(order multimerization)에 있다. 4개의 비대칭 유닛으로부터 BP26의 16개 분자들은 채녈-유사 구조를 형성한다(BP26COM이라 함) (도 4 a 및 b). BP26의 8개 분자들은 8-배 대칭을 가지는 링 구조를 형성하고, 2개의 링 구조는 아래면-아래면 모드(bottom-to-bottom mode)에서 서로 상호작용한다(도 4). 그러므로, BP26의 2개의 도메인들은 BP26COM에 대해 4층의 구조를 형성한다(I-II-II-I)(도 4 c). BP26COM의 전체 크기는 120 A 높이 및 115 A 폭을 가진다..

첫번째 층은, β-베럴(barrel) 구조를 형성하기 위해 나란히 정렬되어있는 BP26의 8개 분자로부터 도메인 I에서 β-시트로 구성되는 24 반대방향 β-스트랜드로 구성되어 있다.

도메인 I에서 긴 α-헬릭스가 대각선으로 쌓여 바깥 프레임(outer frame)을 형성하고 β-시트 간의 상호작용을 강화하였다(도 6). BP26 분자들의 β-시트 사이에서 β-베럴의 아래 부분에서 위치하고 있는 도메인 I에서의 짧은 α-헬릭스는 BP26 사이에서 웨지(wedge)로서 제공되어 β-베럴 구조의 윗부분(38 A)보다 폭이 훨씬 넓은 아래 부분(77 A)을 형성한다 (도 6, I).

두번째 층은 β-베럴 구조를 형성하기 위해 나란히 정렬되어 있는 도메인 II 의 β-스트랜드로 구성되어 있다.

게다가, α2 및 α3 사이의 연결 루프 또한 이러한 β-스트랜드에 맞추어 조정되어 있다 . 각 BP26 도메인 II로부터 전체의 16 α-헬릭스, 2 α-헬릭스 역시 대각선으로 쌓여 두번째 β-베럴 구조를 고정시키고 있다(도 6, II).

다른 8개의 BP26 분자들에 의해 구성된 세번째 층 및 네번째 층은 각각 첫번째 및 두번째 층과 동일하다. 두번째 층 및 세번째 층 사이의 상호작용은 2개의 옥타머 링들로부터 도메인 II에서 β3 및 β4 사이의 루프를 교환함으로써 이루어진다 (도 6, III). 끼워진 핑거들(locked fingers)처럼, 상이한 BP26 분자들로부터 온 16 루프들은 선택적으로(alternatively) 교차하고 있고, 2개의 옥타머 링 구조를 홀딩하고 있다. BP26 모노머들간 상호작용은 대부분 보존된 소수성잔기(도 10)를 통해 이루어지고, 이는 BP26COM의 올리고머 상태가 용액에서 잘 유지됨을 의미한다.

이러한 구조의 배열로, BP26COM는 큰 내부의 공간(cavity)을 생성한다.

BP26COM의 구조가 용액에서 유지되는지 여부 및 BP26COM 구조는 결정 패킹(crystal packing)에 따른 가능성을 알아보기 위해, 2차원(two-dimensional, 2D) class-average 전자 현미경 이미지를 5520 음성적으로 염색된 입자들로 수득하고, 상기 이미지를 결정 구조의 프로젝션과 비교하였다 (도 5 및 도 11, 도 6).

2D class-average 구조가 결정 구조의 프로젝션과 유사함을 명확히 보여주었고, 이는 헥사데카머(hexadecameric) BP26가 확실한 올리고머임을 의미하고, BP26의 생리학적 구조를 나타내고 있다.

BP26COM의 다른 현저한 특징은 BP26 옥타머에 의해 생성되는 홀(hole)이다.

상기 홀의 직경은 약 30 A이고, 2개의 옥타머 링에서 2개의 홀이 나란히 있어 BP26COM가 채널을 가지도록 한다(도 4). 상기 홀의 가장자리는 잘 정돈된 8개의 Pro37 잔기로 구성되어 있다 (도 6, IV).

BP26COM의 정전기적 표면 표현(Electrostatic surface representation)은 BP26의 바깥 표면이 중요한 국부적 염기 또는 산성 패치없이 높게 대전되어있음을 보여준다(도 7 a).

그러나, 홀의 가장가리는 Arg39, Arg197 및 Lys250의 존재로 인해 높은 염기성을 띠는데, 이는 홀이 음성적으로 대전된 분자들과 상호작용할 수 있음을 의미한다(도 7 b). 복합체의 내부 표면 또한 높게 대전되어 있었다.

흥미롭게도, 6개의 양성적의 대전된 층들이 존재하였다: 홀의 가장자리는 첫번째 층을 만들고, 내부 벽 상의 8개의 Arg 206 잔기는 두번째 층을 만들며, 8개 Arg215 잔기는 세번째 층을 만든다. 그리고 두번째 옥타머 링은 다른 3개의 층을 생성한다(도 8).

요컨대, BP26의 16 분자들은 높게 대전된 표면 및 높게 양성적으로 대전된 홀을 가지는 채널-유사 구조를 형성한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있다.

Claims (17)

1. 각각 8개의 BP26 옥타머 분자들로 이루어진 2개의 링 구조체가 결합되어 있는 헥사데카머로서, 채널 유사(channel-like) 구조를 형성하는 BP26 복합체 결정.
2. 제1항에 있어서,
   상기 BP26 복합체 결정은 4개의 층을 이루고 있는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
3. 제1항에 있어서,
   상기 2개의 링 구조체의 결합은 루프(loop)의 교환을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
4. 제1항에 있어서,
   상기 BP26 복합체 결정은 120Å 높이 및 115Å 폭의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
5. 제1항에 있어서,
   상기 채널 유사 구조는 25~35 Å 직경의 홀을 가지는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
6. 제5항에 있어서,
   상기 채널 유사 구조는 30 Å 직경의 홀을 가지는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
7. 제5항에 있어서,
   상기 홀의 가장 자리는 8개의 Pro37 잔기가 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
8. 제5항에 있어서,
   상기 홀은 양성적으로 대전되어 있는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
9. 제8항에 있어서,
   링마다 이하의 3개의 양성적 대전된 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정:
   홀의 가장자리의 Arg39 잔기로 이루어진 제1층,
   Arg206 잔기로 이루어진 제2층, 및
   Arg215 잔기로 이루어진 제3층.
10. 제1항에 있어서,
    BP26 복합체의 양 말단에 트랜스멤브레인 서열이 위치하는 것을 특징으로하는 BP26 복합체 결정.
11. 제1항에 있어서,
    상기 BP26 복합체 결정은
    필라멘트 결합성을 가지는 박테리오 파지와 구조적 유사성을 가지는 것을 특징으로 하는 BP26 복합체 결정.
12. 제1항의 BP26 복합체 결정을 이용하여 병원성 박테리아 감염의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 α-프로테오박테리아 또는 γ-프로테오박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 브루셀라(Brucella) 속 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 브루셀라(Brucella) 속 박테리아는 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(B abortus), 브루셀라 수이스(B suis), 브루셀라 오비스(B ovis), 루셀라 캐니스(B canis), 및 브루셀라 네오토마(B neotomae)로 구성된 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제15항에 있어서,
    상기 브루셀라(Brucella) 속 박테리아는 브루셀라 아보르투스(B abortus)인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항의 BP26 복합체 결정을 표준 모델로 사용하는 것을 특징으로 하는 SIMPL(signaling molecule that associates with the mouse pelle-like kinase) 도메인 단백질에 관한 정보를 제공하는 방법.

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