CN103275223B - 降钙素原抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种降钙素原抗体的制备方法，包括：构建降钙素原重组质粒；以降钙素原重组质粒为表达载体，通过酵母真核表达制备降钙素原；以及利用表达的降钙素原蛋白制备降钙素原抗体。本发明通过在酵母真核表达的降钙素原来制备单克隆抗体，使得制备的单克隆抗体具有更佳的亲和力和特异性。

Description

降钙素原抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物物质制备领域，特别涉及一种降钙素原抗体的制备方法。

背景技术

人体降钙素原(PCT，Procalcitonin)来自定位于第11号染色体上的单拷贝基因。该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，基因全长约7600碱基。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体，包括N端84个氨基酸、活性降钙素(CT，32肽)和降钙蛋白(katacalcin，21肽)三部分，分别由2肽(-Lys-Arg-)及4肽(-Gly-Lys-Lys-Arg-)连接。降钙素原前体在内源多肽酶作用下生成116个氨基酸的PCT。PCT是无激素活性的降钙素前肽物质。在正常情况下，具有激素活性的降钙素是在甲状腺滤泡旁细胞产生与分泌，并由细胞内特殊蛋白酶分解PCT成降钙素。正常人血中PCT浓度非常低，然而在严重的细菌感染和脓毒症时，在外周血液中发现完整的PCT浓度升高。

降钙素原是一种新的严重细菌感染诊断与治疗监测的重要临床指标。新近发现，血清PCT的升高与细菌感染密切相关。在全身系统性严重感染中，PCT早期即可升高，经抗生素治疗使感染控制后血中PCT会下降。在病毒感染及局部细菌感染而无全身表现的患者，PCT仅轻度升高。血清中PCT浓度的持续升高，反映了细菌感染的最严重后果(脓毒血症、严重脓毒症、脓毒性休克)。感染的持续发展，与PCT水平呈正相关。因此，对于细菌感染和脓毒血症，高灵敏度、全定量检测PCT不仅可以进行早期的临床诊断，而且能够预测疾病的进程、预后以及对治疗方法进行指导，并作为抗生素管理的有效工具。PCT定量检测拥有早期、快速、更高的灵敏度和特异性等特点，在细菌感染、特别是脓毒症方面的诊断上，其特异性明显优于传统诊断指标。目前，在国外已广泛应用于临床各科室。因此，PCT已被用作判断全身严重感染或败血症的一个重要的、新的观察指标。

同其他指标如CRP、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10相比，PCT对严重的细菌感染和脓毒症的早期诊断具有高的灵敏性和特异性，更有利于跟踪此类疾病的临床过程。诱发PCT产生的主要原因是机体对细菌内毒素的反应，病毒性疾病、自身免疫病、肿瘤、体内器官的细菌感染并不诱发PCT产生，因此PCT可用于鉴别诊断细菌性和非细菌性疾病，进而用于临床鉴别诊断。在脓毒症患者，PCT浓度通常是在10-100ug/L之间或更高。当治疗后，PCT浓度将以其半衰期为20-24h的速度降低至正常范围(＜0.5ug/L)。因此，对PCT浓度的检测可对临床威胁生命的感染过程做出监测，同时有助于医生制定有效的治疗方案，并最终控制细菌感染。对于混合重症监护病房(ICU)患者的临床研究发现，PCT能够作为一个选择性指标，用于脓毒症的鉴别诊断，将其与系统性炎症反应综合症区分开，并被证实为最好的辅助指标。事实上，PCT不仅是一实验指标，更重要是能够监测脓毒症临床过程。临床试验研究证实，通过PCT对脓毒症患者诊断和治疗过程的监测，为抢救患者提供了宝贵的时间，可以减少不必要抗生素的使用，缩短住院天数，从而降低患者总体治疗费用，在降低资源浪费的同时，可快速明确病原学诊断，提高治疗效果。

综上所述，在克隆表达PCT的基础上，制备抗PCT抗体，可用于制备PCT的检测试剂，供临床或研究使用，具有重大的应用前景。而现有PCT的制备都是通过细菌原核表达来制备，尤其是制备的抗体亲和力和特异性差。

发明内容

本发明实施例提供一种降钙素原抗体的制备方法，用于解决现有技术中通过细菌原核表达来制备的降钙素原所制备的抗体亲和力和特异性差的技术问题。

本发明提供的一种降钙素原抗体的制备方法，包括：构建降钙素原重组质粒；以降钙素原重组质粒为表达载体，通过酵母真核表达制备降钙素原；以及利用表达的降钙素原蛋白制备降钙素原抗体。

构建降钙素原重组质粒的步骤包括：利用引物序列制备降钙素原基因目的片段；以降钙素原基因目的片段为模板进行聚合酶链反应扩增；以及基于降钙素原基因扩增产物构建降钙素原重组质粒。利用引物序列制备降钙素原基因目的片段的步骤包括：引物F1序列与引物R1序列经变性、退化和延伸获得第一DNA片段；第一DNA片段与引物R2序列进行退火延伸获得第二DNA片段；以及第二DNA片段与引物R3序列进行退火延伸获得降钙素原基因目的片段；其中，变性处理的温度为94℃，时间60秒；退火处理的温度为50℃，时间为60秒；延伸处理的温度为72℃，时间90秒；引物F1序列含Xho I酶切位点，引物R3含Spe I酶切位点。引物序列包括：

F1：5’atctcgagaaaagagcaccattcaggtctgccctggagagcagcccagcagacccggcc3’；

R1：5’ccagtgcagccagcaggaggcgcgcttcgtcctcactgagcgtggccgggtctgctgg3’；

R2：5’tcctgctccagctcactggccttcatctgcacatagtcctgcaccagtgcagccagca3’；

R3：5’atactagtccgcttagatctggggctgtccaggctggagccctctctctcttgc3’。

以降钙素原基因目的片段为模板进行聚合酶链反应扩增的步骤包括：制备聚合酶链反应的反应物，所述反应物包括5μL降钙素原基因目的片段、12.5μL的2×EcoTaq扩增缓冲液、5.5μL无菌水、引物F1液和引物R3液各1μL(分别含引物15pmol)。进行聚合酶链反应扩增，反应条件为在94℃下变性5分钟后，进行以下扩增循环：在94℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，在72℃下延伸50秒，反应进行30个循环后，在72℃下延伸5min；然后对所述扩增产物进行纯化。

基于降钙素原基因扩增产物构建降钙素原重组质粒的步骤包括：分别对纯化的降钙素原基因扩增产物和质粒载体进行双酶切处理；分别对酶切后的质粒载体和降钙素原基因扩增产物进行纯化；将纯化后的质粒载体和降钙素原基因扩增产物进行体外连接；将连接产物体外转化克隆进大肠杆菌，获得降钙素原重组质粒；其中，酶切处理的温度为37℃，时间为1小时；降钙素原基因扩增产物酶切体系包括1μL限制性内切酶Xho I，1μL限制性内切酶SpeI，5μL缓冲液，15μL降钙素原基因扩增产物，和28μL无菌水；质粒载体酶切体系包括1μL限制性内切酶Xho I，1μL限制性内切酶Spe I，5μL缓冲液，15μL质粒载体，和28μL无菌水；连接处理条件为14℃，过夜；连接体系为：1μLT4连接酶，3μL无菌水，2μL缓冲液，10μL酶切并纯化后的降钙素原基因扩增产物，和5μL酶切并纯化后的质粒载体。大肠杆菌为DH5a菌株，质粒载体为pPIC9K-ALB质粒载体。采用1％的琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切产物。

以降钙素原重组质粒为表达载体，通过酵母真核表达制备降钙素原的步骤包括：将降钙素原重组质粒转化进毕赤酵母菌；对毕赤酵母菌进行G418抗性筛选培养；对筛选培养的菌落进行发酵培养；对发酵液进行滤膜超滤浓缩获得降钙素原；其中，筛选培养条件为：含G418的YPD培养基，温度为30℃，过夜培养；发酵培养条件为：2L的BMGY培养基，温度为30℃，溶氧度为30％，酸碱度为PH5.0。

通过免疫动物克隆制备降钙素原抗体。

由于酵母表达具有糖基化功能、蛋白产量高、更接近于天然的降钙素原蛋白，而且，通过含有人白蛋白融合表达基因的质粒载体制备的降钙素原其蛋白更加稳定，免疫原性更佳。本发明通过在酵母真核表达的降钙素原来制备单克隆抗体，使得制备的单克隆抗体具有更佳的亲和力和特异性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中：

图1为本发明提供的降钙素原抗体的制备方法的流程图。

图2为本发明提供的降钙素原抗体的制备方法中通过引物序列延伸得到的DNA片段的电泳分析图。

图3为本发明提供的降钙素原抗体的制备方法中得到的降钙素原重组质粒双酶切的电泳分析图。

图4为本发明提供的降钙素原抗体的制备方法中获得的PCT重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图对本发明实施例作进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明提供一种降钙素原抗体的制备方法。如图1所示，该方法包括：

步骤S110：构建降钙素原重组质粒；

在该步骤中，首先利用引物序列制备降钙素原基因目的片段。根据Genbank提供的氨基酸序列进行表位分析并结合基因序列确定PCT76-252为目的基因片段，引物上下游分别引入xho I和spe I酶切位点。具体引物序列包括：

F1：5’atctcgagaaaagagcaccattcaggtctgccctggagagcagcccagcagacccggcc3’；

R1：5’ccagtgcagccagcaggaggcgcgcttcgtcctcactgagcgtggccgggtctgctgg3’；

R2：5’tcctgctccagctcactggccttcatctgcacatagtcctgcaccagtgcagccagca3’；

R3：5’atactagtccgcttagatctggggctgtccaggctggagccctctctctcttgc3’。

引物F1序列含Xho I酶切位点，引物R3含Spe I酶切位点。

引物F1序列与引物R1序列经变性、退化和延伸获得双链DNA片段1(96bp)。DNA片段1与引物R2序列进行退火延伸获得双链DNA片段2(139bp)；DNA片段2与引物R3序列进行退火延伸获得降钙素原基因目的片段，即PCT76-252的双链DNA基因片段(193bp)。其中，变性的处理条件为94℃，60秒；退火的处理条件为50℃，60秒；延伸的处理条件为72℃，90秒。各DNA片段的电泳分析如图2所示，显示制备的PCT目的基因DNA片段与预期大小相符。1列为DNA片段1；2列为DNA片段2；3列为PCT基因目的片段；M列为DNA分子量参照。

然后，以得到的降钙素原基因目的片段(PCT76-252基因片段)为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增。具体包括：PCR扩增反应体积为25μL，其中包括5μL的DNA模板、12.5μL的2x扩增缓冲液、5.5μL无菌水、引物F1和R3各1μL(分别含引物15pmol)。反应过程依次包括：在94℃下变性5min后，进行以下循环：在94℃下变性30S、在50℃下退火30S、在72℃下延伸50S。反应进行30个循环后，在72℃下延伸5min。对获得的扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳回收纯化。

最后，基于获得的降钙素原基因扩增产物构建降钙素原重组质粒。具体包括：分别对纯化的降钙素原基因扩增产物和质粒载体进行双酶切处理，在37℃下对两种酶切体系进行1小时的酶切处理。其中降钙素原基因扩增产物酶切体系包括1μL限制性内切酶Xho I，1μL限制性内切酶Spe I，5μL缓冲液，15μL降钙素原基因扩增产物，和28μL无菌水。质粒载体酶切体系包括1μL限制性内切酶Xho I，1μL限制性内切酶Spe I，5μL缓冲液，15μL质粒载体，和28μL无菌水。采用1％的琼脂糖凝胶电泳回收分别对酶切后的质粒载体和降钙素原基因扩增产物进行纯化。将纯化后的质粒载体和降钙素原基因扩增产物进行体外连接，具体将连接体系在14℃下进行过夜连接处理。连接体系包括1μLT4连接酶，3μL无菌水，2μL10倍连接缓冲液，10μL酶切并纯化后的降钙素原基因扩增产物，和5μL酶切并纯化后的质粒载体。质粒载体可以为但不限于pPIC9K-ALB质粒载体。连接产物体外转化克隆进DH5α大肠杆菌，获得pPIC9k-PCT-ALB重组质粒。提取重组质粒pPIC9k-PCT-ALB，经序列分析鉴定克隆进酵母表达载体的目的基因片段。图3所示为pPIC9k-PCT-ALB重组质粒用Xho I和Spe I双酶切后的电泳分析结果。结果显示PCT的DNA为174bp，与预期大小相符。其中1列为DNA参照；2列为酶切产物，即小片段的PCT DNA。

步骤S120：以降钙素原重组质粒为表达载体，通过酵母真核表达制备降钙素原；

在该步骤中，首先将降钙素原重组质粒转化为毕赤酵母菌。然后对毕赤酵母菌进行G418抗性筛选培养。具体包括：将酵母菌涂布在MD平板上记性30℃培养，挑取阳性克隆菌落转接种至含(G418浓度1mg/mL)的YPD平板上，从中再挑取菌落转接种到含G418浓度分别为2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL的YPD培养基平板上进行筛选，筛选出高G418抗性的阳性克隆转种到5mL YPD培养基中，经过30℃的过夜培养后，再转入到250mLYPD培养基中30℃扩大培养5小时。然后对筛选培养的菌落进行发酵培养，具体包括将筛选培养后的菌落接种到2L的BMGY培养基继续扩大培养，待培养基碳源耗尽时，取样并加入甲醇以诱导重组蛋白上游AOX1启动子进行重组蛋白的表达。发酵培养条件设定为温度30℃、溶氧度30％和PH5.0。获得的发酵液进行滤膜超滤浓缩获得目的蛋白，应用蛋白免疫印迹实验鉴定所表达的降钙素原蛋白。应用8％SDS-PAGE电泳分析PCT在酵母中的表达。如图4所示，箭头所示表达的重组白蛋白-PCT融合蛋白的分子量为75kD，与预期大小相符。其中1列为蛋白分子量参照，2-5列分别为诱导72h、48h、36h、24h后的发酵液，6列为诱导前的发酵液。

步骤S130：以及利用表达的降钙素原制备降钙素原抗体。

在该步骤中，通过免疫动物克隆制备降钙素原抗体。具体包括：(1)用表达的PCT蛋白免疫BALB/c纯系小鼠；(2)收集免疫小鼠的脾细胞，并制成单细胞悬液；(3)将单细胞悬液和骨髓瘤细胞进行融合；(4)应用PCT蛋白包被微孔板，酶联免疫方法筛选分泌PCT抗体的融合细胞；(5)克隆化分泌PCT抗体的融合含细胞，其分泌的上清液即为PCT单克隆抗体；(6)ELISA筛选鉴定阳性杂交瘤克隆：在包被有重组表达抗原的ELISA条板上，每孔加入微孔板中的杂交瘤上清液100μL(设阳性孔加入保存的免疫鼠血清，阴性孔为正常鼠血清，空白对照为二抗稀释液)，37℃孵育40min后洗涤3次，再加入1∶10000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，洗涤3次后进行TMB显色。测定结果为阳性孔后，将阳性孔杂交瘤细胞从96孔板转到24孔板中培养，待细胞生长稳定，形态良好后进行计数，按每孔0.5-1个细胞稀释后，转入96孔板继续培养，上清液用ELISA筛选鉴定阳性的杂交瘤克隆。依照前述步骤，重复进行3次克隆化，分批冻存阳性细胞株。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括：

构建降钙素原重组质粒；

以所述降钙素原重组质粒为表达载体，通过酵母真核表达制备降钙素原；以及

利用表达的降钙素原蛋白制备降钙素原抗体；

其中，构建降钙素原重组质粒的步骤包括：

利用引物序列制备降钙素原基因目的片段；

以所述降钙素原基因目的片段为模板进行聚合酶链反应扩增；以及

基于所述降钙素原基因扩增产物构建所述降钙素原重组质粒；

所述引物序列包括：

F1：5’atctcgagaaaagagcaccattcaggtctgccctggagagcagcccagcagacccggcc3’；

R1：5’ccagtgcagccagcaggaggcgcgcttcgtcctcactgagcgtggccgggtctgctgg3’；

R2：5’tcctgctccagctcactggccttcatctgcacatagtcctgcaccagtgcagccagca3’；

R3：5’atactagtccgcttagatctggggctgtccaggctggagccctctctctcttgc3’。

2.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，利用引物序列制备降钙素原基因目的片段的步骤包括：

引物F1序列和引物R1序列经变性、退化和延伸获得第一DNA片段；

所述第一DNA片段和引物R2序列进行退火延伸获得第二DNA片段；以及

所述第二DNA片段和引物R3序列进行退火延伸获得降钙素原基因目的片段；

其中，变性处理的温度为94℃，时间为60秒；退火处理的温度为50℃，时间为60秒；延伸处理的温度为72℃，时间为90秒；引物F1序列含Xho I酶切位点，引物R3含Spe I酶切位点。

3.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，以所述降钙素原基因目的片段为模板进行聚合酶链反应扩增的步骤包括：

制备聚合酶链反应的反应物，所述反应物包括5μL降钙素原基因目的片段、12.5μL的2×EcoTaq缓冲液、5.5μL无菌水、引物F1液和引物R3液各1μL，所述引物液分别含对应引物15pmol；

进行聚合酶链反应扩增，反应条件为在94℃下变性5分钟，然后进行以下扩增循环：在94℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，在72℃下延伸50秒，反应进行30个循环后，在72℃下延伸5min；以及

对所述扩增产物进行纯化。

4.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，基于所述降钙素原基因扩增产物构建所述降钙素原重组质粒的步骤包括：

分别对所述降钙素原基因扩增产物和质粒载体进行双酶切处理；

分别对酶切后的质粒载体和降钙素原基因扩增产物进行纯化；

将纯化后的质粒载体和降钙素原基因扩增产物进行体外连接；

将所述连接产物体外转化克隆进大肠杆菌，获得降钙素原重组质粒；

其中，酶切处理的温度为37℃，时间为1小时；降钙素原基因扩增产物酶切体系包括1μL限制性内切酶Xho I，1μL限制性内切酶Spe I，5μL缓冲液，15μL降钙素原基因扩增产物，和28μL无菌水；质粒载体酶切体系包括1μL限制性内切酶Xho I，1μL限制性内切酶Spe I，5μL缓冲液，15μL质粒载体，和28μL无菌水；

连接处理的温度为14℃，时间为过夜；连接体系为：1μLT4连接酶，3μL无菌水，2μL缓冲液，10μL酶切并纯化后的降钙素原基因扩增产物，和5μL酶切并纯化后的质粒载体。

5.如权利要求4所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌为DH5a菌株，所述质粒载体为pPIC9K-ALB质粒载体。

6.如权利要求3或4所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于：采用1％的琼脂糖凝胶电泳回收进行纯化。

7.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于，以所述降钙素原重组质粒为表达载体，通过酵母真核表达制备降钙素原的步骤包括：

将所述降钙素原重组质粒转化进毕赤酵母菌；

对所述毕赤酵母菌进行G418抗性筛选培养；

对筛选培养的菌落进行发酵培养；

对发酵液进行滤膜超滤浓缩获得降钙素原；

其中，筛选培养条件为：含G418的YPD培养基，温度为30℃，过夜培养；发酵培养条件为：2L的BMGY培养基，温度为30℃，溶氧度为30％，酸碱度为PH5.0。

8.如权利要求1所述的降钙素原抗体的制备方法，其特征在于：

利用所述表达的降钙素原蛋白，通过免疫动物、细胞融合和杂交瘤克隆化步骤制备降钙素原抗体。