CN104892769A - 一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用 - Google Patents
一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用，属于医学微生物或生物制药领域。本发明在大肠杆菌中表达了该溶血素融合蛋白PEHSLO，发现该溶血素融合蛋白PEHSLO表达量提高且对宿主细胞毒性低。溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性，该工程菌果胶酶产率为5.6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为1.2mg/mL培养液。在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定量分析，避免使用免疫学和溶血法检测，简化了检测方法、缩短了检测时间、节约了检测成本。溶血素融合蛋白PEHSLO还可以应用于溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用，属于医学微生物或生物制药领域。
背景技术
化脓链球菌是一类常见的细菌，可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。
化脓链球菌的溶血素(Streptolysin O，SLO)能够与人及其它动物的细胞膜上的胆固醇相结合，结合到细胞膜上的SLO蛋白会形成环状寡聚体，形成大的孔道，导致细胞膜溶解，另外，SLO具有极强的抗原性且易在体内残留，刺激人体及其它动物产生抗体(anti-SLO，ASO)，ASO集聚，导致变态反应。
SLO作为检测试剂，可以用来检测患者体内的ASO；其次，可以作为治疗肿瘤和杀死肿瘤细胞的药物，另外，SLO作为成孔蛋白，在动物基因工程和蛋白工程领域，用作动物细胞转基因和转蛋白工具。
目前SLO蛋白的基因工程重组技术主要存在以下缺陷：SLO蛋白对宿主具有毒性，表达量低和生产过程中SLO检测方法相对繁琐。
发明内容
本发明针对SLO重组蛋白对宿主具有毒性，表达量低和SLO蛋白检测相对繁琐的问题，提供了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表达质粒与应用。
本发明的第一个目的是提供了一种溶血素融合蛋白(PeLa-EK-10His-SLO，PEHSLO)，该溶血素融合蛋白PEHSLO具有果胶酸裂解酶和溶血素蛋白活性；PEHSLO内部有肠激酶的酶切位点，可以根据需要切除果胶酸裂解酶；另外，还含有10个组氨基酸序列，为蛋白纯化提供有效的亲和基团。
所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
编码所述溶血素融合蛋白的溶血素融合基因npela-ek-10his-slo，可在大肠杆菌中高效表达溶血素融合蛋白PEHSLO。
所述溶血素融合基因npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，如SEQ ID NO.2所示。
所述npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，使用了曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列、大肠杆菌肠激酶位点序列、10个组氨基酸和化脓链球菌溶血素slo活性区与抗原区序列。而且曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列和化脓链球菌溶血素slo活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背景下的密码子优化和增加蛋白表明基团亲水性等原理，进行了优化设计。
本发明的第二个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO或使用所述npela-ek-10his-slo融合基因构建的表达质粒。
所述质粒，在本发明的一种实施方式中，为npela-ek-10his-slo-pET-28a(+)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌或转基因细胞系。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.2的溶血素融合基因npela-ek-10his-slo。
本发明的第四个目的是提供一种检测溶血素SLO的方法，所述方法是融合表达果胶酸裂解酶和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素SLO。所述融合表达是融合表达编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的基因。
本发明的第五个目的是提供一种提高SLO可溶性表达的方法。所述方法是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.2的溶血素融合基因npela-ek-10his-slo。
本发明还要求保护所述溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO蛋白生产、SLO检测、SLO抗体制品制备、抗癌药物生产、基因工程或蛋白工程等领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计并合成了溶血素融合基因npela-ek-10his-slo，构建了含该npela-ek-10his-slo融合基因的表达质粒和含该表达质粒的工程菌，该工程菌可以表达溶血素融合蛋白(PeLa-EK-10His-SLO,PEHSLO)。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白PEHSLO对宿主细胞毒性低，20℃条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌OD600可以达到2.5，高于slo独立表达的工程菌(OD600：1.60)；说明融合表达可以降低SLO蛋白对宿主具有毒性。
(2)本发明的工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5.6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为1.2mg/mL培养液，占到细胞总蛋白的30％，相比slo胞内独立表达(可溶性目标蛋白占胞内蛋白的5％)，可溶性目标蛋白产量上升达400％；说明融合表达可以提高SLO蛋白的表达量。
(3)在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定量分析，一次果胶酶检测所需时间为0.3h，检测成本为0.15元人民币，避免使用免疫学(一次检测所需时间为10h,检测成本为500.00元人民币)和溶血法检测(一次检测所需时间为1.0h，检测成本为0.50元人民币)，相对于经测定免疫学和溶血法检测，检测时间分别缩短9.5h和0.5h，检测成本分别节省499.85元和0.35元人民币，经测定1Unit果胶酶活性对应于0.2mg左右的蛋白量和7.0×104Unit溶血酶活性。本发明的方法可以简便SLO的检测，缩短检测时间、降低检测成本。
附图说明
图1：设计的npela-ek-10his-slo-pET-28a(+)质粒结构图；
图2：npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)酶切鉴定图；1.DNA Marker，2.npela-ek-10his-slo/pET-28a，3.npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)双酶切；
图3：重组表达Pela-EK-10His-SLO的SDS-PAGE图谱；1.蛋白Marker，2.npela-slo/pET28a(+)/BL21(DE3)的胞内上清,3.纯化的Pela-EK-10His-SLO。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。
实施例1 溶血素融合基因npela-ek-10his-slo设计与表达质粒设计
所述核苷酸序列使用了曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列、大肠杆菌肠激酶位点序列、10个组氨基酸和化脓链球菌溶血素slo活性区与抗原区序列，而且曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列和化脓链球菌溶血素slo活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背景下的密码子优化和增加蛋白表明基团亲水性等原理，进行了优化设计。在果胶酸裂解酶酶pela序列的上游添加Noc Ⅰ位点序列，在果胶酸裂解酶酶pela序列下游加上肠激酶序列、10个组氨酸序列和Nde Ⅰ位点序列；Nde Ⅰ位点序列下游，连接slo基因序列，slo下游加上BamH Ⅰ序列，构建的融合基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达质粒npela-ek-10his-slo-pET-28a(+)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。npela-ek-10his-slo-pET-28a(+)质粒结构如图1所示。
本发明加入果胶酸裂解酶pela序列的目的，是利用该Pela蛋白在大肠杆菌中可以高效表达出活性蛋白同时对宿主毒性低的优越性，提高SLO蛋白的可溶性，降低SLO蛋白对宿主的毒性，同时提供一种低成本和短时间的目标蛋白检测方法；加肠激酶序列的作用是可以根据应用需要出发，提供切除果胶酸裂解酶Pela的便利；加入10个组氨酸序列，是为了提供Ni-亲和层析的亲和基团，由于是加在二个蛋白基团之间，根据本本发明的需要，10个组氨基，能保证有效结合，同时在40mM咪唑浓度下可以有效洗脱，不必使用常规的500mM咪唑，可以减少成本。
实施例2 溶血素融合基因npela-ek-10his-slo中npela-ek-10his序列的合成与克隆
使用化学合成和Over-Lap PCR的方法合成血红素融合基因npela-ek-10his-slo的npela-ek-10his部分(SEQ ID NO.2的1-992bp)，合成npela-ek-10his片段，上游加上Noc Ⅰ位点，下游加上Nde Ⅰ序列将合成的片段与PMD18T载体连接，转化JM109，转化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，得到单克隆转化子npela-ek-10his/PMD18T/JM109，经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，测定的序列和设计序列完全相同。
实施例3 溶血素融合基因npela-ek-10his-slo中slo序列的合成与克隆
使用化学合成和Over-Lap PCR的方法合成血红素融合基因npela-ek-10his-slo的slo部分(SEQ ID NO.2的992-2483bp)，上游加上Nde Ⅰ位点，下游加上BamH Ⅰ序列，将合成的slo基因与PMD18T载体连接，转化JM109，转化产物涂布含100g/mL氨苄青霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，得到单克隆转化子slo/PMD18T/JM109，经过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定和测序鉴定，表明新合成的slo基因全长为1485bp，编码495氨基酸，测定的序列和设计序列完全相同，提取slo/PMD18T备用。
实施例4 npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)表达载体构建
用于实现融合基因在大肠杆菌中表达的载体是pET-28a(+)，但对构架有较大改变，不使用pET-28a(+)的二个His-tag和Thrombin序列，将pET-28a(+)质粒和npela-ek-10his/PMD18T用Noc Ⅰ和Nde Ⅰ切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经过37℃培养过夜，挑选转化子，通过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定(见图2)和测序鉴定，保存鉴定的npela-ek-10his/pET-28a(+)E.coli JM109菌，提取npela-ek-10his/pET-28a(+)备用。将npela-ek-10his/pET-28a(+)质粒和slo/PMD18T用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ切，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，在100g/mL卡那霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，挑选转化子，通过菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定(见图2)和测序鉴定(序列如SEQ ID NO.3所示)，保存鉴定的npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)E.coli JM109菌，提取npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)备用。
实施例5 表达溶血素融合蛋白PelA-EK-10His-SLO的工程菌构建
将质粒npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，再在100g/mL卡那霉素的LB平板，经过37℃培养过夜，经过菌落PCR鉴定，得到单克隆转化子npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)。
实施例6 溶血素融合蛋白Pela-EK-10His-SLO表达与分离纯化
将npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)接种在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO412.54g/L，KH2PO42.31g/L)发酵液体培养基，37℃培养到细菌OD600到0.8，用0.5mM IPTG(异丙基硫代β-D半乳糖苷)诱导，降温至20℃培养，表达48h。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白PEHSLO对宿主细胞毒性低，20℃条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌OD600可以达到2.5，高于slo独立表达的工程菌(OD600：1.60)；该工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5.6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为1.2mg/mL培养液，占到细胞总蛋白的30％，相比slo独立表达(占胞内蛋白的5％)，可溶性目标蛋白产量上升达400％。
实施例7 溶血素融合蛋白Pela-EK-10His-SLO的分离纯化
将npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达后的培养液离心，得到上清用0.45m膜过滤，过滤后的溶液按照1：1的比例和2X Binging buffer(10mM咪唑，1M NaCl，40mMTris-HCL)混匀备用；His-tag亲和层析柱用5倍柱体积的1X charging buffer(50mM NiSO4)处理后，再用倍柱体积1X Binding buffer(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)平衡；上样品后用10倍柱体积1X Binging buffer洗柱，再用5倍柱体积1X Washing buffer(10mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗柱；用6倍柱体积1X Elution buffer(40mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCL)洗脱。重组表达的溶血素融合蛋白PEHSLO的SDS-PAGE图谱如图3所示。
实施例8 溶血素融合蛋白PEHSLO的果胶酶活性测定
检测上清的酶活，果胶酸裂解酶活性检测的反应体系为：0.5mL反应液，内含25mmol/LTris/HCl(pH 8.0)，0.1％果胶酸，1mmol/L CaCl2和1μL上清，在50℃反应10min，反应结束后,加1mL 0.02mol/L HCl终止反应，然后在235nm检测光吸收值的变化。一个酶活单位定义为每min释放的1μmol不饱和半乳糖醛酸(unsaturated galacturonic acid)的酶量。在235nm,不饱和半乳糖醛酸光吸收系数为4600/M-1cm-1。
在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定量分析，一次果胶酶检测所需时间为0.5h，检测成本为0.15元人民币，避免使用免疫学(一次免疫学检测所需时间为10h，检测成本为500.00元人民币)和溶血法检测(一次溶血酶检测所需时间为1.0h，检测成本为0.50元人民币)，相对于经测定免疫学和溶血法检测，检测时间分别缩短9.5h和0.5h，检测成本分别节省499.85元和0.35元人民币，经测定1Unit果胶酶活性对应于0.2mg左右的蛋白量和7.0×104Unit溶血酶活性。
实施例9 溶血素融合蛋白PEHSLO的融血活性测定
溶血素融合蛋白样品可用溶液A(溶液A：36mM H3PO4，126mM NaCl，1g/L BSA(bovineserum albumin)，pH 7.0)进行系列梯度稀释。将0.5ml的150mM 2-mercaptoethanol与1ml稀释样品混匀，30℃孵育15min，然后每管加0.5ml含绵羊红细胞的A溶液(1.58×108cell/ml)30℃下反应20min，离心后，用541nm检测上清中血红蛋白的浓度，1U定义为在该实验条件下，引起上述反应体系中红细胞溶解的最小酶量，经测定，融合蛋白Pela-EK-10His-SLO具有溶血性，酶活为4×105Unit/mL培养基左右。Western实验结果为阳性，表明融合蛋白PEHSLO具有抗原性。
实施例10 溶血素融合蛋白PEHSLO在诊断试剂生产中的应用
用npela-ek-10his-slo/pET-28a(+)/BL21(DE3)表达的融合蛋白可以用作临床检测患者体内ASO(抗SLO蛋白的抗体)的重要生物学试剂。利用融合蛋白PelA-EK-10His-SLO、偶联辣根过氧化物酶的二抗和邻苯二胺，定量分析患者体内的SLO抗体(ASO)的量。
实施例11 溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO抗体制品生产中的应用
将融合蛋白用肠激酶消化后，再用亲和层析纯化，得到SLO蛋白，用200μg SLO蛋白免疫牛等敏感动物，首次注射后大约3周后，用50μg SLO蛋白加强免疫一次，在大约14天后左右，抗体的滴度会达到最大值，抽取血样，获得血清，制备成多抗。
可参考下列文献：
1.Kimoto H,Fujii Y,Hirano S,Yokota Y,Taketo A.Expression of recombinant Streptolysin Oand specific antibody production.J Mol Microbiol Biotechnol.2005；10(1):64-8.
2.Velázquez B,Massaldi H,Battistoni J,Chabalgoity JA.Construction and expression ofrecombinant streptolysin-o and preevaluation ofits use in immunoassays.Clin Diagn Lab Immunol.2005May；12(5):683-4.
实施例12 溶血素融合蛋白PEHSLO在动物基因工程领域中作为打孔试剂，转移核酸与蛋白
将动物细胞悬浮在Hank平衡盐溶液中(配方为：8g/L NaCl,0.4g/L KCl,1g/L葡萄糖,60mg/L KH2PO4,47.5mg/L Na2HPO4,NaHCO3,0.35g/L，30mM Hepes，pH至7.2，定容到1L)，加入一定量的PEKSLO蛋白，在37℃，处理15min。
实施例13 溶血素融合蛋白PEHSLO可以作为药物封闭乳腺癌细胞EGF受体蛋白ErbB1
用终浓度为10unit/ml的SLO Hank平衡盐溶液，处理乳腺癌细胞1.5h。
可参考下列文献：
Hall EH,Gurel V,Dahlberg AE,McMichael J,Brautigan DL.Inhibition of human breastcancer Matrigel invasion by Streptolysin O activation ofthe EGF receptor ErbB1.Cell Signal.2011Dec；23(12):1972-7.
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种溶血素融合蛋白PEHSLO，其特征在于，所述溶血素融合蛋白PEHSLO含果胶酸裂解酶和溶血素蛋白序列；编码所述果胶酸裂解酶和溶血素蛋白的氨基酸序列之间还含有肠激酶酶切位点序列和10个组氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的溶血素融合蛋白PEHSLO，其特征在于，所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的溶血素融合蛋白PEHSLO，其特征在于，编码所述溶血素融合蛋白PEHSLO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的质粒。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌。
7.表达权利要求1-3任一所述溶血素融合蛋白PEHSLO的转基因细胞系。
8.一种检测溶血素融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法是融合表达果胶酸裂解酶和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素融合蛋白PEHSLO。
9.一种提高溶血素SLO可溶性表达的方法，其特征在于，所述方法是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO.2的溶血素融合基因npela-ek-10his-slo。
10.权利要求1所述溶血素融合蛋白PEHSLO在溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产中的应用。
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