CN103570817B - 间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白、其制备方法和用途 - Google Patents

间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白、其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白，是具有糖基化磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚定及表皮生长因子样（epidermal growth factor-like，EGF-like）结构域的蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示）。此外，本发明还公开了上述重组抗原蛋白的制备方法，包括间日疟原虫PvMSP1基因序列的扩增、重组质粒的构建和鉴定、重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。实验证明，本发明的PvMSP1重组抗原蛋白对间日疟原虫感染病人血清抗体的检测具有敏感性高和特异性强等优点，在间日疟血清流行病学调查方面具有广泛的应用前景。

Description

间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白、其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种用于检测间日疟感染病人血清抗体的间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白；此外，本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。
背景技术
疟疾是严重危害人类健康、影响社会经济发展的重要寄生虫病。全球每年有约100万人死于疟原虫感染。疟疾（间日疟为主）也是我国重要传染病之一，尽管目前疟疾发病率已控制在较低水平，但是在全球气候变暖、经济发展全球化带来的人流物流增加等自然和社会因素的影响下，我国疟疾疫情尚不稳定。例如中国云南与缅甸边境地区，以及安徽、河南等一些中部地区，每年报告总病例数均超过数千例。随着国际交往日益频繁，我国的输入性疟疾病例逐年增加，据统计我国2010年输入性疟疾病例1161例，比2009年上升29.4%；由于传播媒介疟蚊仍然存在，本地发病病例时有发生，因而疟疾形势仍然十分严峻。加上人们生活方式的改变和活动范围的扩大使间日疟的监测和防控工作具有极大的难度。因此，敏感、特异的诊断试剂研发已成为当前国内外间日疟研发的重点与热点。
长期以来，在间日疟流行区，各类诊断方法仍不尽如意，或是诊断敏感性不够、或是因特殊设备基层难以使用。以免疫学中抗原-抗体的特异性反应为基础的免疫检测技术一直是疟疾检测的有效方法。以检测疟原虫抗原为靶标的试纸条法（Rapid diagnostic test，RDT）一直被广泛应用于疟疾流行区的病原诊断。但是，目前国内大部分流行区疟疾均处于消除阶段，疟原虫感染率与感染度都非常低，即处于RDT的检测域值范围外，往往会导致漏检。以检测疟原虫抗体为靶标的免疫检测技术，尽管无法区别现症或既往感染，但是由于其检测敏感性很高，可以作为疟疾消除或消除后阶段进行血清流行病学监测的有效工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原，该重组抗原可用于检测间日疟感染病人的血清抗体。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于间日疟原虫PvMSP1基因PCR扩增的特异性引物。
本发明要解决的技术问题之三是提供该间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法。
本发明要解决的技术问题之四是提供上述间日疟重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。
本发明首先通过生物信息学技术和分子生物学技术分析并获得了间日疟原虫PvMSP1的编码基因序列（如SEQ ID NO：2所示）。然后通过对间日疟原虫PvMSP1基因进行扩增，将所得产物与质粒载体pET-28a(+)通过In-Fusion克隆构建重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1，转化至DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR和测序鉴定；小量抽提测序成功的pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒，将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，破碎所得菌体；本发明采用10%SDS溶解蛋白包涵体，由于构建的重组蛋白含6个His，可选用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白，最终得到纯化的重组蛋白PvMSP1，完成了PvMSP1基因的体外克隆表达及纯化。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
本发明第一个方面是提供一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。该重组抗原蛋白具有糖基化磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚定及表皮生长因子样（epidermal growth factor-like，EGF-like）结构域，分子量为Mr42000。
本发明第二个方面是提供了一对用于间日疟原虫PvMSP1基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：
上游：5′-AATGGGTCGCGGATCCgaccaagtaacaacgggagag-3′（如SEQ ID NO：3所示）；
下游：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGgctacagaaaactccctcaaagag-3′（如SEQ ID NO：4所示）。
本发明第三个方面提供了一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
1）间日疟原虫PvMSP1基因序列的扩增，PvMSP1基因扩增的具体序列如SEQ ID NO:2所示（用PCR技术从含有目的基因的间日疟原虫基因组DNA中获得间日疟原虫PvMSP1的DNA片段）；
2）间日疟原虫PvMSP1重组质粒的构建和鉴定：用pET-28a(+)载体构建间日疟原虫PvMSP1重组表达质粒pET-28a(+)-PvMSP1；
3）将pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白PvMSP1；
4）螯合的Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白：采用10%SDS将表达获得包涵体蛋白溶解，通过Ni-NTA树脂亲和层析表达产物重组蛋白PvMSP1。
步骤1）具体为：以间日疟原虫基因组DNA作为模板，设计SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。所述PCR扩增的反应条件为98℃预变性2.0min；98℃变性20sec；55℃退火30sec，72℃延伸1.0min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
步骤2）具体为：分别使用内切酶Xho I和BamH I酶切pET-28a(+)载体，根据步骤1）所得的PCR产物和酶切后的pET-28a(+)载体的浓度，使用In-Fusion克隆方法连接，构建成PvMSP1编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1。将此重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，进行菌落PCR鉴定及测序鉴定。
步骤3）具体为：抽提重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1，通过热激法将步骤2）测序无误后的pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养。SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。
步骤4）具体为：取表达重组蛋白PvMSP1量较高的冻存菌种于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体。在上述菌体中加入向细胞沉淀中加入核酸裂解液裂解细菌（例如，BugBuster蛋白抽提剂），离心后保留上清液与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果。根据上述结果，用变性剂（例如，10%SDS）裂解所得沉淀，离心后用Ni-NTA亲和层析树脂进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。
本发明第四个方面提供了一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。PvMSP1重组蛋白的相对分子质量为42KDa，该重组抗原对间日疟原虫感染血清的诊断敏感性为92.2%，特异性为95.6%（见图6）。实验证明，本发明的PvMSP1重组抗原对疟疾诊断具有敏感性和特异性高等优点，具有较好的诊断价值，为研制相关诊断试剂盒奠定了基础，在疟疾诊断方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中间日疟原虫PvMSP1基因的PCR扩增结果示意图。图1中，M：DNA分子量标准；1：PvMSP1。
图2是实施例1中pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒及其菌落PCR鉴定结果示意图。图2中，M：DNA分子量标准；1-4：pET-28a(+)-PvMSP1。
图3是实施例1中重组质粒间日疟原虫PvMSP1蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图。图3中，M：蛋白分子量标准；1：诱导后菌液；2：裂解后上清；3：裂解后PBS重悬沉淀。
图4是实施例1中重组质粒间日疟原虫PvMSP1蛋白的Western-blot鉴定结果示意图。
图5是实施例1中PvMSP1重组蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳分析结果示意图。图5中，M：蛋白分子量标准；1:未纯化的PvMSP1重组蛋白；2：流出收集液；3：洗出收集液；4-11：洗脱收集液。
图6是实施例2中PvMSP1重组抗原与人血清的反应情况示意图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备
1材料
1.1间日疟原虫基因组DNA
来自于被间日疟原虫感染的病人血清红细胞，从云南省疟疾流行区采集。
1.2宿主菌株大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)分别来自于天根生化科技有限公司和Novagen公司。
1.3主要试剂和工具酶
2方法
2.1间日疟原虫PvMSP1基因的扩增与克隆
2.1.1PvMSP1基因的PCR扩增
根据报道的PvMSP1基因的序列（PVX_099980），利用上海英骏生物技术有限公司引物设计软件设计一对特异性引物，特异性引物中大写字母分别为与酶切载体末端同源的15个碱基，其中单下划线表示的分别是酶切位点Xho I和BamH I酶切位点。特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列如下：
上游PF：5′-AATGGGTCGCGGATCCgaccaagtaacaacgggagag-3′（如SEQ ID NO：3所示）；
下游PR：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGgctacagaaaactccctcaaagag-3′（如SEQ ID NO：4所示）；
以间日疟原虫基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。反应条件为98℃预变性2.0min；98℃变性20sec；55℃退火30sec，72℃延伸1.0min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo Scientific旗下的Finnzymes。反应体系为20.0μl，具体为5x Phusion HF Buffer（Phusion高保真缓冲液）4.0μl；10mM dNTPs0.4μl；P F(上游引物)(10μM each)1μl；P R(下游引物)(10μM each)1μl；TemplateDNA(DNA模板)1μl；Phusion DNA Polymerase(Phusion DNA聚合酶)0.2μl；Nuclease-freewater(无核酸酶水)12.4μl。
2.1.2间日疟原虫PvMSP1基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1的构建和鉴定
分别使用内切酶Xho I和BamH I酶切pET-28a(+)空载质粒，根据所得的PCR产物和酶切后的pET-28a(+)空载质粒的浓度，使用In-Fusion克隆方法连接，构建成PvMSP1编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1。具体步骤如下：
1）取5μl PCR反应产物，加入2μl Clonging Enhancer（克隆促进剂），购自Clontech公司；
2）将上一步中的混合物放入PCR仪中，37℃孵育15min，80℃孵育15min；
3）使用In-Fusion克隆方法连接PCR产物和酶切后的pET-28a(+)空载质粒。反应条件为37℃孵育15min；50℃孵育15min；取出放冰上，待转化使用。In-Fusion酶购自Clontech公司。反应体系为10.0μl，具体为5x In-Fusion Reaction Buffer(In-Fusion反应缓冲液)2.0μl；In-Fusion Enzyme(In-Fusion酶)1.0μl；Vector（载体）2.0μl(～100ng)；Insert（插入片段）2.0μl；dH2O（蒸馏水）(根据需要)3.0μl；
将连接后的重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1通过热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素（Kan）的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，进行菌落PCR鉴定及测序鉴定。将菌落PCR鉴定正确的菌样送华大基因公司进行测序分析。将测序正确的pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。
2.2间日疟原虫PvMSP1的重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化
2.2.1间日疟原虫PvMSP1的重组质粒在大肠杆菌中的表达
具体步骤如下：
1）将重组菌接种于10ml LB液体培养基（Kan+,50μg/ml）中，于37℃，200rpm，培养至OD600=0.6；
2）向试管中加入5μl IPTG（1M），使其终浓度为0.5mM，继续震荡培养（37℃,200rpm）4h；
3）将诱导表达后的菌液，5000rpm，离心5min，去上清，向细胞沉淀中加入BugBuster蛋白抽提剂充分悬浮沉淀后，置于摇床上，室温震荡1h，使菌体充分裂解（每克沉淀湿重加5ml BugBuster蛋白抽提剂）；
4）菌体裂解液，12,000rpm离心1min，将离心后上清保存于干净的EP管中，沉淀用100μl PBS重悬，取5μl裂解后上清和PBS重悬后沉淀；
5）分别将诱导后菌液及裂解后上清和PBS重悬后沉淀进行SDS-PAGE电泳分析以了解重组蛋白的表达及溶解情况。
2.2.2重组蛋白PvMSP1的纯化
将裂解后的PBS重悬沉淀进行Western-blot鉴定。具体步骤如下：
1）将PBS重悬的包涵体，经SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上
2）将膜剪成条状置于5%脱脂奶粉溶液（3%BSA）中封闭1h（用TBST溶解），用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min；
3）将一抗（Penta·His·Ab）和TBST按一定比例稀释（1:2000），置于摇床上反应1h，用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min；
4）将二抗（Goat-a-Mouse IgG-HRP）和TBST按一定比例稀释（1:2000），置于摇床上反应1h，用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min；
5）按比例配好显色液（DAB:PBS:30%H2O2=2mg:3ml:0.9μl），将漂洗后的PVDF膜放入含显色液的托盘里显色，待出现目的条带，立即用PBS漂洗终止反应，并用滤纸吸干。
按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。
3结果
3.1间日疟原虫PvMSP1基因的扩增与克隆
3.1.1PvMSP1基因的PCR扩增
以间日疟原虫基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，扩增出1140bp与预期长度一致的目的片段（见图1），表明成功扩增出PvMSP1基因。
3.1.2间日疟原虫PvMSP1基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1的构建和鉴定
目的基因片段与酶切后的pET-28a(+)空载质粒通过In-Fusion克隆方法连接，构建成重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1，经菌落PCR及测序鉴定，菌落PCR结果（见图2）及测序结果均与目的基因片段大小相符，表明重组表达质粒构建成功。
3.2间日疟原虫PvMSP1的重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化
3.2.1间日疟原虫PvMSP1的重组质粒在大肠杆菌中的表达
将诱导前、后样品及裂解后上清和PBS重悬后沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，在分子量为42KDa处，诱导后的菌体较诱导前的菌体呈现明显表达条带，大小与预期结果相符。重组蛋白以不可溶性形式存在于PBS重悬后沉淀中（见图3）。
3.2.2重组蛋白PvMSP1的纯化
Western-blot分析结果显示，重组蛋白PvMSP1可被抗His的抗体特异性识别，在42KDa处出现条带（见图4中箭头所指）。如图5所示，经纯化后的重组蛋白PvMSP1在42KDa处出现一清晰条带，且杂带较少，与目的蛋白符合。
实施例2间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白检测人血清抗体的效果实验
1材料
1.1间日疟病人血清及正常人血清样本,从云南省疟疾流行区采集。
1.2羊抗人全分子IgG，来自于SIGMA公司。
2方法
将多份被间日疟原虫感染的病人血清和正常人血清分别等量混合配制成阳性和阴性血清对照。具体步骤如下：
1）用包被液稀释抗原至最终浓度为4ng/μl，100μl/孔，37℃孵育2h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；
2）用1%BSA（PBS稀释），100μl/孔，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；
3）将一抗（间日疟病人血清和正常人血清）用PBS-T稀释（1:100），100μl/孔，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；
将二抗（羊抗人全分子IgG）用PBS-T稀释（1:10000），100μl/孔，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；
4）加TMB底物显色液，100μl/孔，常温3min左右，加2M H2SO4终止液，100μl/孔；
5）将96孔板放入酶标仪中读数，光波波长为450nm。
3数据统计分析
使用Excel电子表格处理软件对实验数据进行整理和统计分析。
4结果
用重组抗原PvMSP1分别对受间日疟原虫感染的病人血清和正常人血清进行ELISA的IgG检测，以正常人血清抗体均值的2倍作为阳性判断值，其敏感性为92.2%，特异性为95.6%（见图6）。
5讨论
本发明以间日疟原虫基因组DNA作为模板，采用In-Fusion克隆方法，成功克隆获得PvMSP1与原核表达载体pET-28a(+)构建的重组质粒，并通过大肠杆菌系统高效表达了PvMSP1重组蛋白，经Western-blot鉴定表明其可被抗His的抗体特异性识别。经纯化后的重组蛋白PvMSP1在42KDa处出现一清晰条带，与目的蛋白分子量大小相符。
基因工程技术为发展检测人血清抗体的重组抗原制备与检测方法提供了方便，基于ELISA免疫检测方法具有较高的实用性，且已广泛应用于间日疟辅助诊断和血清流行病学监测，所以本发明用该重组抗原对378份血清（219份间日疟病人血清和159份正常人血清）进行ELISA检测，结果表明PvMSP1重组抗原对间日疟患者血清的敏感性为92.2%（202/219），诊断特异性为95.6%（152/159），是一种具有较好血清流行病学监测潜能的抗原，在间日疟流行区有较好的应用前景。

Claims (7)

1.一种用于间日疟原虫PvMSP1基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为：
上游：5′-AATGGGTCGCGGATCCgaccaagtaacaacgggagag-3′，如SEQ ID NO：3所示；
下游：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGgctacagaaaactccctcaaagag-3′，如SEQ ID NO：4所示。
2.一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，该重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其特征在于，包括如下步骤：
1)间日疟原虫PvMSP1基因序列扩增，PvMSP1基因扩增的具体序列如SEQ ID NO:2所示；步骤1)具体为：设计SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，提取间日疟原虫总DNA，以其为模板进行PCR扩增；
2)间日疟原虫PvMSP1重组质粒的构建和鉴定，采用的重组质粒载体为：pET-28a(+)载体；
3)将重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达产物重组蛋白；
4)螯合的Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达产物重组蛋白。
3.如权利要求2所述的间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应条件为98℃预变性2.0min；98℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.0min，35个循环；72℃延伸10min，最后保存于4℃。
4.如权利要求2所述的间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将质粒载体pET-28a(+)经Xho I和BamH I双酶切，并回收纯化；根据步骤1)所得的PCR产物和质粒载体酶切片段的浓度进行In-Fusion连接，构建成PvMSP1编码基因原核表达的重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1；将此重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，摇菌培养后，将菌液进行PCR鉴定及测序鉴定。
5.如权利要求2所述的间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：通过热激法将步骤2)测序无误后的pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中，培养后涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养；SDS-PAGE电泳鉴定诱导表达结果。
6.如权利要求2所述的间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：取表达重组蛋白PvMSP1量较高的冻存菌液于含卡那霉素的液体培养基中，培养过夜之后，转种至同样含卡那霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入核酸裂解液裂解细菌，离心后保留上清与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果；根据上述结果，用变性剂裂解所得沉淀，离心后用Ni-NTA亲和层析树脂进行纯化，SDS-PAGE检验纯化结果。
7.一种如权利要求2所述方法制得的重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。
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