CN104888208A - 马红球菌致病基因VapA重组蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开了马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗或检测马红球菌病的制剂中的应用，其特征在于，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，获得的重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存在。该重组蛋白具有良好的免疫原性，适于临床治疗用高免血清抗体、疫苗、临床诊断试剂等生物技术产品的开发。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及马红球菌致病基因VapA蛋白的应用。
背景技术
马红球菌属于红球菌属，是一种人畜共患的条件性致病菌。该病原菌普遍存在于自然环境土壤中，调查表明，50～95%的农场土壤中存在该菌。马红球菌可感染人，导致呼吸道感染症状。该病也是幼龄马驹最常见的疾病之一，发病率可达80%。染病马驹一般呈慢性或亚急性支气管肺炎症状，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。
一直以来关于马红球菌的致病机制并不清楚，直至最近研究发现，导致该细菌毒性的关键是其是否含有一个致病性相关质粒。该质粒含有85～90kb的遗传编码DNA，可编码多个高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相关蛋白A（Vap A）为其主要表达蛋白。大量研究表明，马红球菌的毒性与Vap A密切相关。目前，虽有部分重组VapA蛋白表达的报道，但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，较难应用于实际的医疗诊断和治疗产品的开发和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供马红球菌致病基因VapA蛋白的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
申请人通过研究发现，MBP-VapA蛋白更接近马红球菌致病基因VapA的性质，因此MBP-VapA蛋白在中和抗马红球菌抗体时具有很高的活性。
因此，本发明还提供了马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备检测由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
一种制备治疗马红球菌病的免疫血清的方法，包括以下步骤：
S1. MBP-VapA重组蛋白的制备：扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5x载体上，构建表达载体PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得MBP-VapA重组蛋白；
S2. 将纯化后的MBP-VapA重组蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物，获得免疫血清。
本发明使用PMAL-C5x载体，它可以促进重组表达蛋白的可溶性表达，实验研究表明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构的形成，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本研究首次采用PMAL-C5x为载体，对马红球菌的致病基因VapA进行了重组，获得重组质粒—PMAL-VapA。
另外，发明人通过实验发现，单单使用PMAL-C5x载体，对VapA蛋白的可溶性表达虽然有促进作用，但作用并不明显，还必须要配合低温诱导的温度，才能够使VapA蛋白大量可溶性表达，发明人研究了多个诱导温度对VapA蛋白的表达影响，结果显示，只有在20℃时才能够获得大量的可溶性的VapA蛋白，该VapA蛋白带有MBP标签。
本发明通过上述方法获得了大量可溶性表达且活性好的VapA蛋白，该蛋白具有良好的免疫原性。
优选的，所述本发明所述免疫动物可以是兔子或小鼠，免疫血清可以是兔抗马血清，也可以是鼠抗马血清。
更优选地，本发明所述免疫动物为兔子，免疫血清是兔抗马血清。
发明人将纯化后获得的MBP-VapA蛋白进行ELISA检测，结果表明纯化的MBP-VapA可用于R. equi特异性抗体的检测。
优选地，本发明所述原核表达菌在培养至OD600值为0.5～0.7后，加入IPTG进行诱导；更优选地，原核表达菌在培养至OD600值为0.6后加入IPTG进行诱导。
优选的，本发明所述IPTG诱导的浓度为0.3～0.7mM，诱导时间为8～12h。
更优选地，申请人发现所述原核表达菌在20℃培养下，IPTG诱导浓度为0.7mM，且诱导时间为8h时，VapA蛋白的表达量最高，且多为可溶性表达。
具体地，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白通过以下方法获得：
S1. 重组质粒PMAL-VapA的构建：设计SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述引物扩增VapA基因，将VapA基因与pZeroBack/blunt载体相连构建质粒pZeroBack-VapA；最后将PMAL-c5x和测序正确的pZeroBack-VapA进行双酶切后构建表达载体PMAL-VapA；
S2. 将PMAL-VapA 转化入BL21菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中，培养至OD600值为0.5～0.7，加入IPTG诱导后，离心重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可溶性VapA蛋白。
优选地，S2中原核表达菌在培养至OD600值为0.6后加入IPTG进行诱导。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，其特征在于，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存在。该重组蛋白具有良好的免疫原性，适于临床治疗用高免血清抗体和疫苗的制备、临床诊断试剂的开发。
附图说明
图1为VapA基因的PCR扩增图；其中，1：VapA；2：ddH2O 对照；M：2000bp的DNA分子量标准。
图2为重组克隆质粒pZeroBack-VapA的酶切鉴定；其中，1：pZeroBack-VapA重组质粒的EcoR I和Not I双酶切产物；M：5000bp的DNA分子量标准。
图3为重组表达质粒PMAL-VapA的测序鉴定结果；下划线部位分别为Not I与EcoR I的酶切位点序列。
图4为不同诱导温度对蛋白表达量的影响；其中，M：蛋白分子量标准；1：IPTG诱导前的蛋白表达；2-6：分别在10℃、15℃、20℃、28℃和37℃温度下诱导的蛋白表达。
图5为不同IPTG诱导时间对蛋白表达量的影响；其中，M：蛋白分子量标准；1-8分别为IPTG诱导0、2、4、8、12、16、20 和24小时的蛋白表达。
图6为不同IPTG浓度对诱导蛋白表达量的影响；其中，M：蛋白分子量标准； 1-7：IPTG浓度分别为：0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和1.4 mM。
图7为20℃下0.7mM IPTG诱导8h后表达的蛋白；其中，M：蛋白分子量标准；1：诱导前BL21细菌的蛋白表达；2：诱导后BL21细菌的蛋白表达；3转化空表达载体PMAL-C5x的BL21诱导前蛋白表达；4：转化空表达载体PMAL-C5x的BL21诱导后蛋白表达；5：转化空表达质粒PMAL-VapA的L21诱导前蛋白表达；6：转化表达质粒PMAL-VapA的BL21诱导后的蛋白表达；7：经亲和层析纯化后的VapA蛋白；8：诱导表达VapA蛋白的BL21菌液超声破碎上清（含可溶性表达蛋白）；9：诱导表达VapA蛋白的BL21菌液超声破碎沉淀（含包涵体表达蛋白）。
图8为不同温度诱导表达的VapA蛋白的状态分析；M：蛋白分子量标准；1：IPTG诱导前转化BL21（含PMAL-VapA）的蛋白表达；2和3分别为：20℃诱导表达产物的超声破碎上清（含可溶性表达蛋白）和沉淀（含包涵体表达蛋白）；4和5分别为：28℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀；6和7分别为：37℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀。
图9为纯化后VapA蛋白的Western-blot 分析结果；其中，1：纯化的VapA蛋白；M：蛋白分子量标准。
图10为MBP-VapA重组蛋白的Dot ELISA分析，其中，1至3孔为BSA，蛋白浓度分别为：0.1mg/mL、0.025mg/mL、0.00625mg/mL；4孔为PBS对照，5孔为马红球菌（ATCC33701）裂解液阳性对照；6至8孔为VapA蛋白浓度分别为0.1mg/mL、0.025mg/mL、0.00625mg/mL。
图11为抗原抗体稀释度图。
图12为HRP酶标二抗稀释度优化结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1原核表达重组质粒PMAL-VapA的构建与鉴定
1、马红球菌的复苏与培养：购买保藏于美国菌种保藏中心，保藏号为ATCC 33701的马红球菌，按照规定操作流程复苏马红球菌。
2、引物设计：根据NCBI基因库中马红球菌致病基因VapA序列（JN990991.1）以及pZeroBack/blunt和PMAL-C5x载体酶切位点，运用OLigo6.0软件，设计一对带酶切位点的引物（由上海英维捷基生物技术有限公司合成），引物序列如下：
F：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAGACCCTGCACAAGACGGTCTC（下划线为NotI酶切位点）
R：CCGGAATTCCTAAGCGTTGTGCCAACTACCCGAG（下划线为EcoR I酶切位点）
3、VapA基因的PCR扩增与克隆
3.1. 参照Fast HiFideLity PCR Kit说明扩增VapA基因，反应体系如表1。
反应程序：94℃预变性2min；（94℃变性30s；55℃退火30s；68℃延伸30s）共运行30个循环，68℃终延伸5min，最后4℃保存，结果如图1。
参照天根生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANgeL Midi Purification Kit）的使用说明书进行PCR产物的回收、纯化，方法如下：
（1）准备好1.5 mL的EP管，将PCR扩增后的产物用1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL EB）进行电泳，在紫外线照射下，切下含有目的基因（563bp）的凝胶，并放入准备好的EP管中，称取重量。
（2）柱平衡步骤：向吸附柱CA2（吸附柱当天经过了前处理）中（吸附柱放入收集管中）加入500 μL的平衡液BL。12,000 rpm离心1 min。倒掉收集管中的废液，并将吸附柱CA2重新放回收集管中。
（3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 μL，则加入100 μL PN溶液），置于50℃水浴温育。其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些PN溶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块），胶块完全溶解后将溶液温度降至室温再上柱。
（4）将步骤（3）所得溶液加入步骤（2）平衡后的吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）。于室温放置2 min后，12,000 rpm离心60s。倒掉收集管中的废液，并将吸附柱CA2放入收集管中。吸附柱容积为800 μL，若样品体积大于800 μL可分批加入。
（5）向吸附柱CA2中加入600 μL漂洗液PW（使用前需先检查是否已加入无水乙醇），静置2～5 min。12,000 rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，并将吸附柱CA2放入收集管中。
（6）重复操作步骤（5）。
（7）将吸附柱CA2放回收集管中，12 000 rpm离心2 min，将收集管中的漂洗液PW去除。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
（8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40uL ddH2O，室温放置2 min。12,000 rpm离心2 min收集DNA溶液，将离心得到的溶液重新加回吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。
3.2. PCR产物与pZeroBack/blunt载体的连接
参照零背景快速连接试剂盒（ZeroBack Fast Ligation Kit）说明书，连接反应体系如下：取pZeroBack/blunt载体0.3uL、T4 DNA Ligase 0.5uL、2× Reaction Buffer 5uL、ddH2O 2.2uL、目的PCR纯化产物2uL放入EP管中混匀，并于22℃条件下反应5min，结束后置于冰上，进行后序转化实验。
3.3. 大肠杆菌感受态的制备：采用氯化钙/甘油法制备，具体步骤如下：
（1）LB平板挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜，再以1：100接种于100mL LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600为0.4～0.6。
（2）将培养液分装至50mL无菌离心管，冰上放置l0min，4℃、3,000 g离心10 min。
（3）弃上清，加入预冷的0.05M CaCl2 l0mL，轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min，4℃、3,000 g离心5 min。
（4）弃上清，加预冷含15%甘油的0.05M CaCl2 2mL，轻轻悬浮细胞，分装成100或者200uL的小份，贮存于-80℃冰箱中。
3.4. 连接产物转化DH5α感受态细胞：本研究采用热休克法将3.2获得的连接产物转入大肠杆菌细胞中，包括以下步骤：
（1）从-80℃冰箱取一小份感受态细胞悬液，立即放于冰上解冻。
（2）加入适量目的质粒或连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。
（3）42℃水浴热击60 s，迅速置于冰上冷却3～5 min。
（4）加入1mL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养60min；
（5）3000rpm离心5min后，去掉上清液至只剩余100uL后，重悬菌体，将其涂布于含相应抗生素的筛选平板上，正面向上放置于37℃恒温培养箱中待菌液完全被培养基吸收后倒置平板，培养12～16h。
用灭菌的10uL枪头挑取可疑菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于 37℃振荡培养12～16 h，取适量菌液作PCR鉴定，PCR扩增体系如表2。
PCR反应程序：94℃预变性5min；（94℃变性1 min；55℃退火1 min；72℃延伸1 min）共运行30个循环，70℃终延伸10min，最后4℃保存。
3.5. 阳性菌液保存和质粒的提取
将PCR鉴定为阳性的菌液送广州华大基因生物技术有限公司进行序列测定，通过互联网NCBI 基因库下载致病性马红球菌VapA基因片段，使用lasergene MegAlign软件对测序结果进行序列比对。
将测序正确的阳性菌液部分加入终浓度为30%的灭菌甘油，放入-80℃保存；部分进行扩大培养，参照天根生化科技有限公司快速质粒小提试剂盒（TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit）的使用说明书进行质粒抽提，具体步骤如下：
（1）取1～4 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，于12,000rpm下离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
（2）向留有菌体沉淀的离心管中加入150uL溶液P1（请先检查是否已加入RNase A和TIANRed），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
（3）向离心管中加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。此时菌液变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
（4）向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12～20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀；12,000 rpm离心2min。
（5）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。吸附柱CP3在12,000 rpm下离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（6）向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT（检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（7）将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm离心1 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
（8）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100uL洗脱缓冲液TB，12 000 rpm离心30s将质粒溶液收集到离心管中。
（9）利用限制性内切酶EcoR I和Notl I对抽提到的质粒进行双酶切鉴定（如图2），获得一条3.2kb左右的条带和一条560bp左右的条带，表明VapA基因已成功连接到pZeroBack/blunt载体中。将该质粒命名为pZeroBack-VapA。
4、原核表达重组质粒PMAL-VapA的构建与鉴定
将原核表达载体PMAL-c5x和已经测序正确的阳性重组质粒pZeroBack-VapA分别用限制性内切酶EcoRI、Not I进行双酶切处理，酶切体系如表3。
混匀表3中的酶切体系后，置于37℃水浴2～4 h。将载体PMAL-C5x和重组质粒pZeroBack-VapA的酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，具体回收步骤参照3.1。
将回收的PMAL-c5x以及VapA基因利用T4 DNA连接酶于16℃连接仪中过夜连接，并将PMAL-VapA转入原核表达菌BL21，经菌液PCR以及测序鉴定，结果如图3。测序结果与参考VapA基因序列完全一致，且含有正确的EcoRI和NotI酶切位点。将该原核表达重组质粒命名为PMAL-VapA。
实施例2 可溶性MBP-VapA重组蛋白的表达及最佳诱导条件的确定
将转化PMAL-VapA质粒阳性的BL21菌液按1：100比例接种于（含氨苄青霉素50μg/ml）LB液体培养基中，于37℃摇床中200r/min 振荡培养。至菌液OD600值为0.6左右时，按下列方法进行MBP-VapA重组蛋白的优化表达。
1. 诱导表达温度的确定
加入浓度为1mM的IPTG，并分别于10℃、15℃、20℃、28℃和37℃的条件下震荡培养至恰当的诱导时间取样。样本于4000r/min离心10 min，弃上清，取沉淀，并将沉淀用原体积1/10的去离子水重悬，按常规方法进行SDS-PAGE，检测融合蛋白的表达。用BandScan（5.0版）软件分析泳道内蛋白含量，以确定最佳诱导表达温度。结果表明（如图4），随着温度的由10℃的增加，VapA（59kDa）的表达量逐渐增加，并在15℃和20℃诱导时达到最大，随后降低。BandScan分析显示，在10℃、15℃、20℃、28℃和37℃的条件下诱导VapA蛋白的表达分别占总泳道蛋白量的9.1%、15.3%、16.6%、7.2%、2.7%，表明20℃诱导表达VapA的量最大。
2. IPTG 诱导时间的确定
重复诱导实验，当转化菌液OD600值达0.6左右时，加入浓度为1mM的IPTG，20℃诱导表达，分别在0h、2h、4h、8h、12h、16h、20 h和24h后取样。样本经4000r/min 离心10min，弃上清，并将沉淀用原体积1/10的去离子水重悬，进行 SDS-PAGE 检测，并经BandScan分析，确定IPTG 最佳诱导时间。结果（如图5）显示，随诱导时间的延长VapA表达量逐渐增加，并于诱导8h时达到最大表达量。其BandScan分析显示，IPTG诱导0h、2h、4h、8h、12h、16h、20 h和24h的VapA蛋白表达量分别占总泳道蛋白量的0%、14.3%、21.3%、31.4%、31.5%、26.5%、21.2%和12.3%。结果表明，IPTG的最佳诱导时间是8h。
3. IPTG 诱导浓度的确定
按上述最佳诱导方法，当转化菌液OD600值达0.6左右时，分别用终浓度为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM 和1.4mM的IPTG于20℃诱导表达8h后取样。样品以4000r/min离心10min，弃上清。收集菌体沉淀并用原体积1/10的去离子水重悬，进行 SDS-PAGE检测并经BandScan分析，确定IPTG最佳诱导浓度。结果（如图6）显示，肉眼观察VapA蛋白的表达不随IPTG诱导浓度的变化而变化。但是，BandScan分析显示VapA蛋白表达量在IPTG浓度分别为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM 和1.4mM时，分别占总泳道蛋白量的0%、26.9%、31.3%、30.3%、32.4%、27.9%和24.8%。显示为随着IPTG诱导浓度的增加而增加，至0.7mM达到最高而后下降。标明该IPTG诱导VapA表达的最佳浓度为0.7mM。
4. 重组表达的VapA蛋白状态的鉴定
申请人通过实验发现，IPTG诱导VapA重组蛋白的表达时，不同的温度对其表达的VapA蛋白的状态具有一定的影响。采用最佳IPTG浓度和诱导时间分别在20℃、28℃和37℃温度条件下对表达的VapA蛋白进行检测。取样菌液样本于4000r/min离心10 min，弃上清，取沉淀。用原体积的1/10的上样缓冲液将沉淀重悬，并用超声在冰浴的条件下破碎细胞10min。经4℃离心，12000r/min 20min。按常规方法进行SDS-PAGE，检测上清（含可溶性表达的蛋白）和沉淀（含包涵体表达的蛋白）中蛋白的表达。
试验结果（如图8）显示，诱导前、20℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀、28℃诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀、以及37℃诱导表达产物超声破碎上清和沉淀内VapA蛋白表达量分别占总泳道蛋白量的0%、8.9%、10.1%、2.4%、5.3%、0%和5.6%。以上诱导表达产物经紫外分光度计检测，浓度分别为：3.0、8.3、1.5、5.3、3.2、6.5和2.7mg/mL。表明，20℃诱导表达条件下目的蛋白的表达量最大且绝大部分为可溶性表达。同时，在最佳诱导条件下，多次进行诱导表达，将产物超声波裂解细菌的上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白绝大部分以可溶性的形式存在（图7）。
5. 可溶性重组VapA蛋白的非变性纯化
将含有阳性质粒（PMAL-VapA）的BL21菌液按1：100 的比例接种于200ml LB液体培养基（含氨苄青霉素 50μg/ml）中，于37℃振荡培养至OD600大约0.6左右时，加入浓度为0.7mM的IPTG，20℃诱导8h，使用NEB公司Amylose Resin产品（E8021）对表达蛋白进行纯化。参照说明书进行，具体操作如下：
（1）蛋白粗提
将诱导蛋白表达后菌液，4000g离心10min，收集菌体。用柱子缓冲液 20mL重悬（柱子缓冲液用量为原菌液体积的1/10），储存于-20℃。纯化蛋白时，将其置于冷水中化冻，并于冰水浴中，以4s的破碎，5s的间隔，进行超声破碎细胞。持续超声破碎直到所释放的蛋白质达到最大量，菌悬液变澄清为止。
将破碎后菌液在4℃，12000rpm条件下离心20min，获取的上清即为蛋白粗提物。
（2）亲和层析
a.柱子的准备：将1mL amylose介质填充于规格为1.0 x 10cm的柱子中。用5倍柱子体积的柱子缓冲液冲洗柱子。
b.上柱：介质的量决定融合蛋白质的量，每毫升柱床体积可结合6～8mg融合蛋白质，根据目的蛋白的表达量估算上样体积。控制最大线性流速为24cm/h，即0.3mL/min。流速计算方式为：线性流速（cm/h）×π r=体积流速（mL/h）。
c.洗脱：用10倍介质体积的柱子缓冲液洗柱子，然后用10倍介质体积的柱子洗脱液洗脱目的蛋白，以每组分1mL收集10个组分，使用微量分光光度计测量每组分目的蛋白的量，1-6号收集液分别为：2.3、1.7、1.5、1.2、0.7和0.3mg/ml，7-10号收集液蛋白浓度为0。
纯化后蛋白液用SDS-PAGE检测，使用Bandscan软件对SDS-PAGE图片进行分析重组VapA蛋白的纯度，为83.7%。
6. 重组VapA蛋白的抗原性分析
用Western blot对纯化的重组VapA蛋白的抗原性进行检测，具体步骤如下：
（1）将VapA蛋白的SDS-PAGE的置于转印平皿中，剪一张与SDS-PAGE凝胶一样大小的6张3mm滤纸及1张硝酸纤维素膜，浸泡于转移缓冲液中大约15min左右，以驱除留于滤膜上的气泡。
（2）阳极朝上，阴极在底部，上下各是3张滤纸，PAGE凝胶一定要在NC 膜上面被滤纸包裹，并保证无气泡。
（3）安装电转移，以恒定电流150mA转移30min。
（4）加10ml封闭液（含8%～10%脱脂奶粉的TBS），4℃封闭过夜。
（5）然后吸掉封闭液，用TBST洗三次，每次5min。
（6）以1：100稀释的抗马红球菌VapA蛋白的马阳性血清（Gluck Equine Research Center 馈赠）作为一抗，37℃作用2h
（7）弃反应液体，用 TBST共洗15min，每次5min。
（8）最后再用羊抗马IgG Fab'2-HRP酶标二抗（LSBio公司）37℃条件下作用1h，同样洗3次，最后再拍照保存。Western-blot检测结果（如图9）显示，纯化的重组蛋白（59kDa）可被抗马红球菌VapA蛋白的马阳性血清特异性识别，表明，该重组蛋白具有良好的免疫源性。
因VapA蛋白在马红球菌中的表达量并不高，与直接从马红球菌中提纯VapA蛋白（Julien Cauchard，2004）相比，本发明采用非致病菌作为表达菌具生产更加安全、高效的特点；其次，与人工氨基酸合成VapA蛋白（Julien Cauchard，2006）相比，本发明所述方法表达的VapA氨基酸序列可通过天然细菌蛋白加工工厂完成正常的折叠、加工和修饰过程，形成更接近于马红球菌VapA蛋白的自然结构形态。最后，与已报导的VapA蛋白的表达方法相比，本方法表达出的蛋白为可溶性蛋白，而非包涵体蛋白。本发明方法表达的可溶性VapA蛋白具有更好的蛋白活性和免疫源性，而且，WB验证所表达的VapA具有较高的活性。另外，虽然以包涵体蛋白形式表达的重组蛋白量通常较大，但因其加工处理过程繁琐且需经变性方式纯化，并不适用于工业生产的应用。相比之下，本发明采用非变形方法纯化对VapA重组蛋白活性影响较小且过程简单、易操作，更适用于商业化大批量生产。
实施例3 制备兔抗马红球菌VapA的高免血清
1、抗体制备
免疫抗原选择本发明实施例2经原核表达纯化获得的融合蛋白MBP-VapA。
试验动物：SPF级雄性新西兰白兔（1.5～2kg），SPF昆明小鼠（18～22g），由广州南方医科大学实验动物中心提供。
制备方法如下：
基础免疫：用纯化的融合蛋白MBP-VapA与Montanide Gel 01 ST佐剂（终浓度比例为8%）充分乳化。兔子进行颈背部皮下注射，将1.0mL抗原乳剂（含抗原量约1mg）进行多点注射，平均每点0.2mL；小鼠进行腹腔注射，剂量为200uL抗原乳剂（含抗原量约200ug）。
二免及三免疫：初次免疫后两周，部位及剂量同基础免疫，进行二次免疫，两周后再进行一次加强免疫，部位及剂量同基础免疫。三免疫后两周经耳缘静脉采血进行抗体效价测定。
2、制备的抗致病性R. equi血清的效果检测
抗体效价检测采用间接ELISA检测方法，具体操作如下：使用纯化的VapA蛋白作为抗原以包被液（0.1M NaHCO3、pH9.6）稀释，100uL/孔包被于96孔板，4度过夜（>8h）。使用 PBST（pH7.2），每孔200uL，在洗板机上洗涤4次，每次3min；加入200uL封闭液(0.5% PVA)，于室温封闭1h；洗涤4次，方法如上所述；将血清用PBS（pH7.2）稀释，100uL/孔加入ELISA板，37℃温浴1h；洗涤4次，方法如上所述；加入羊抗兔 IgG-HRP酶标二抗，100uL/孔，37℃温浴1h；洗涤4次，方法如上所述；加入显色液100uL（TMB），室温10min；加入终止液（2M H2SO4）100uL；ELISA读板机读450nm处的数值。以 P/N值>3为标准，判断血清抗体为阳性，具体结果如表4，免疫后的新西兰兔血清抗体效价为1：256000，免疫后的昆明小鼠血清抗体效价大于1：512000。
由此可知，用MBP-VapA免疫兔子制备的兔抗马红球菌VapA蛋白的高免血清可以特异性识别马红球菌的VapA蛋白，可作为临床治疗马红球菌病的高免血清使用，提供特异性中和抗体。
实施例4 MBP-VapA重组蛋白的Dot ELISA
Dot ELISA采用本领域的常规方法，一抗为马源抗马红球菌血清（20uL），二抗为HRP标记兔抗马IgG（1：1000稀释），结果如图10。
用于检测马抗致病性红球菌病的抗体。图10中1至3孔为BSA，蛋白浓度分别为：0.1mg/mL、0.025mg/mL、0.00625mg/mL；4孔为PBS对照，5孔为马红球菌（ATCC33701）裂解液阳性对照；6至8孔为VapA蛋白，浓度分别为0.1mg/mL、0.025mg/mL、0.00625mg/mL。
实验结果表明：与R. equi标准细菌相同，本发明纯化的VapA蛋白可特异性识别马血清中的R. equi细菌抗体并经酶标二抗反应显色；其次，与BSA对照相比，纯化的VapA蛋白与特异性抗体结合的能力随着蛋白浓度的下降而降低；最后，因对洗脱液对照孔无显色，该纯化蛋白特异性识别R. equi细菌抗体的特性与其溶液无关。因此，本实验室纯化的VapA可用于R. equi特异性抗体的检测。
实施例5MBP-VapA重组蛋白的间接ELISA
1、马红球菌间接 ELISA 方法的建立
纯化的VapA蛋白作为抗原包被96孔板，抗原以包被液（0.1M NaHCO3 PH9.6）稀释，100uL/孔包被于96孔板，4度过夜（>8h）。使用PBST（PH7.2），每孔200uL，在洗板机上洗涤4次，每次3min；加入200uL封闭液（0.5%PVA），于室温封闭1h；洗涤4次，方法如上所述；将血清用PBS（PH7.2）稀释，100uL/孔加入ELISA板，37℃温浴1h；洗涤4次，方法如上所述；加入羊抗马 IgG Fab'2-HRP酶标二抗，100uL/孔，37℃温浴1h；洗涤4次，方法如上所述；加入显色液100uL（TMB），室温10min；加入终止液（2M H2SO4），100uL；ELISA读扳机于OD450nm读数。
2、抗原包被浓度及血清最佳稀释度的确定
采用矩阵滴定法确定抗原抗体的最佳浓度，纯化的VapA蛋白抗原分别以0.1ug、0.05ug、0.025ug、0.0125ug、0.00625ug每孔包被96孔板，标准R. equi阴、阳性血清分别作100倍、200倍、400倍、800倍稀释。以标准R. equi阳性血清OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大，为标准确定抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释度。
P/N=（阳性血清OD450nm值-阳性血清空白对照OD450nm值）/（阴性血清OD450nm值-阴性血清空白对照OD450nm值）。
考虑到较低的血清稀释倍数可降低血清背景值，因而确定抗原的最佳包被浓度为0.125ug/mL，血清的最佳稀释倍数为400倍（见图11，表5）。
3、酶标二抗最佳工作浓度的确定
酶标二抗分别以1：1250、1：5000、1：20000、1：80000、1：320000稀释，使用优化好的抗原浓度包被ELISA板，并使用最佳的标准R. equi阴、阳性血清稀释倍数，进行ELISA操作，以标准R. equi阳性血清OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大为标准确定羊抗马IgG Fab'2-HRP最佳稀释度。
结果表明：羊抗马 IgG Fab'2-HRP最佳稀释度为20000倍稀释（见图12，表6）。
4、封闭液的选择
分别使用2%BSA、1%BSA、5%脱脂奶粉、1%PVA、0.5%PVA做ELISA封闭，选用优化好的抗原浓度包被ELISA板，并使用最佳的标准R. equi阴、阳性血清稀释倍数，以及酶标二抗稀释倍数，进行ELISA操作，以标准R. equi阳性血清OD450nm值在1.0左右，且P/N比值最大为标准确定最佳封闭液，为0.5%PVA（见表7）。
5、ELISA 阴阳性临界值的确定
用上述已建立的ELISA检测方法，检测对标准阴性样品1份、无疫区马匹血清样品19份，做1：400稀释，每份血清重复3孔，进行ELISA测定（结果见表8）。
经计算各样本的OD450平均值 X=0.210，标准偏差SD=0.054，临界值X+3SD=0.370。在规定实验条件下，血清样本做1：400稀释，其OD450值大于临界值，即待检血清样本OD450值≧0.370时判定为阳性，否则判定为阴性，结果如表8。
6、特异性试验
选取非R. equi疫区马场H7N7或H3N8流感病毒血清阳性的马匹，采集血清作为H7N7或H3N8流感病毒抗体阳性血清，进行马红球菌抗体间接ELISA检测。按最佳反应体系进行检测，与标准R. equi阴、阳性血清对照，每份血清重复3孔。如表9所示，与R. equi阳性血清对照相比，该ELISA检测H7N9或H3N8阳性血清以及R. equi阴性血清均为的阴性（OD450nm<0.370）。结果表明，本实验建立的ELISA方法具有特异性检测血清中R. equi抗体的能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 马红球菌致病基因VapA重组蛋白的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 585
<212> PRT
<213> MBP-VapA
<400> 1
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Ile Ser His Met Ser Met Gly Gly Arg Met Lys Thr Leu
385 390 395 400
His Lys Thr Val Ser Lys Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Ala Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Met Ile Pro Ala Gly Val Ala Asn Ala Thr Val Leu Asp Ser
420 425 430
Gly Ser Ser Ser Ala Ile Leu Asn Ser Gly Ala Gly Ser Gly Ile Val
435 440 445
Gly Ser Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Thr Ser Leu Asn Leu Gln Lys
450 455 460
Asp Glu Pro Asn Gly Arg Ala Ser Asp Thr Ala Gly Gln Glu Gln Gln
465 470 475 480
Tyr Asp Val His Gly Asp Val Ile Ser Ala Val Val Tyr Gln Arg Phe
485 490 495
His Val Phe Gly Pro Glu Gly Lys Val Phe Asp Gly Asp Ala Gly Gly
500 505 510
Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Ala Phe Trp Gly Thr Leu Phe Thr Asn
515 520 525
Asp Leu Gln Arg Leu Tyr Lys Asp Thr Val Ser Phe Gln Tyr Asn Ala
530 535 540
Val Gly Pro Tyr Leu Asn Ile Asn Phe Phe Asp Ser Ser Gly Ser Phe
545 550 555 560
Leu Gly His Ile Gln Ser Gly Gly Val Ser Thr Val Val Gly Val Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Ser Trp His Asn Ala
580 585
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物F
<400> 2
aaggaaaaaa gcggccgcat gaagaccctg cacaagacgg tctc 44
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物R
<400> 3
ccggaattcc taagcgttgt gccaactacc cgag 34
Claims (6)
1.马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，其特征在于，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2. 马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备检测由马红球菌引起的疾病的制剂中的应用，其特征在于，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3. 一种制备治疗马红球菌病的免疫血清的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. MBP-VapA重组蛋白的制备：扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5x载体上，构建表达载体PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20℃下诱导获得MBP-VapA重组蛋白；
S2. 将纯化后的MBP-VapA重组蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物，获得免疫血清。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是将原核表达菌在培养至OD600值为0.5～0.7后，加入IPTG进行诱导。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，IPTG诱导的浓度为0.3～0.7mM，诱导时间为8～12h。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白通过以下方法获得：
S1. 重组质粒PMAL-VapA的构建：设计SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述引物扩增VapA基因，将VapA基因与pZeroBack/blunt载体相连构建质粒pZeroBack-VapA；最后将PMAL-c5x和测序正确的pZeroBack-VapA进行双酶切后构建表达载体PMAL-VapA；
S2. 将PMAL-VapA 转化入BL21菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中，培养至OD600值为0.5～0.7，加入IPTG诱导后，离心重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可溶性VapA蛋白。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171226 |