CN105063065A - 密码子优化型1型鸭甲肝病毒vp1基因及其重组蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种密码子优化型1型鸭甲肝病毒VP1基因及其重组蛋白的应用。通过优化密码子获得了密码子优化型VP1基因，将该密码子优化型VP1基因的重组蛋白制备成胶体金试纸，并将其用于检测1型鸭甲肝病毒抗体，获得了性能更高的检测DHAV-1抗体的胶体金试纸。本发明所述试纸敏感性高，将DHAV-1弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到16～32倍，也可以被其检测到；并且本发明所述试纸具有很好的特异性；应用本发明所述试纸检测I型鸭甲肝病毒抗体具有良好的批内和批间重复性；本发明制备的试纸可在4℃或室温(25℃)保存数月。

Description

密码子优化型1型鸭甲肝病毒VP1基因及其重组蛋白的应用

技术领域

本发明涉及动物医学领域，具体涉及一种密码子优化型VP1基因及其重组蛋白的应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎(DuckViralHepatitis)为主要由1型鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirustype1，DHAV-1)引起的雏鸭的一种急性、高度致病性传染病，发病急，传播迅速，病程短，死亡率高。临床表现角弓反张，剖检见肝脏肿大和大量的出血性斑点，是危害养鸭业的主要疾病之一。虽然我国研制的鸭肝炎鸡胚化弱毒疫苗和灭活苗，在全国应用推广，对种鸭、雏鸭进行免疫预防，取得很好的效果，然而，对DHAV-1特异性抗体的监测是评价DHAV-1弱毒疫苗和灭活苗免疫效果及制定合理免疫程序的关键，也是确认DHAV-1感染的手段之一。目前，用于DHAV-1抗体检测的方法主要有中和试验(neutralizationtest，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法、间接血凝及血凝抑制试验等。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DHAV-1感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段，但检测过程耗时费力。

DHAV-1病毒主要由衣壳和核酸组成。生物信息学分析表明，基因组由5’端非编码区、一个大的开放阅读框、及3’端非编码区组成。ORF编码含2249个氨基酸的多聚蛋白，编码的多聚蛋白在病毒包装过程中，先进行自我切割，最终裂解为3种结构蛋白(VP0、VP3和VP1)和7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。其中，VP1全长714bp，编码238个氨基酸，是DHAV-1最重要的结构蛋白之一。对其他小RNA病毒的研究表明，VP1蛋白位于病毒最外部，是病毒中占有优势的表面结构蛋白，含有多个抗原表位和关键的抗原决定簇，能诱导机体产生中和抗体，从而产生免疫反应，因而被认为是检测感染该病毒的最可靠的指示器。刘明等建立了以VP1蛋白作为包被抗原的ELISA检测方法。因此，VP1蛋白可作为研制新型疫苗和诊断抗原的候选分子，对于鸭肝炎病毒的诊断具有重大作用。但采用大肠杆菌原核表达蛋白时，常常遇到由于密码子的偏嗜性问题而影响重组蛋白的表达和表达蛋白的活性低而影响应用等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种密码子优化型VP1基因及其重组蛋白，基于该重组蛋白制备的胶体金免疫层析试纸在检测DHAV-1抗体方面具有操作简单，灵敏度高，特异性好等特点。

本发明采取的技术方案如下：

1、1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因(optiVP1)，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。

优选的，所述基因为针对大肠杆菌表达进行密码子优化获得的VP1基因。

2、1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因编码的重组蛋白在制备检测I型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸中的应用。

3、胶体金免疫层析试纸，由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度≥1.0mg/ml的所述optiVP1基因编码的重组蛋白包被而成，质控线由浓度≥0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度≥0.06mg/ml的optiVP1基因编码的重组蛋白和胶体金标记的浓度≥0.05mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述A抗BIgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另一种任一种动物IgG。

优选的，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度为1.0mg/ml的optiVP1基因编码的重组蛋白包被而成，质控线由浓度为0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度为0.06mg/ml的optiVP1基因编码的重组蛋白和胶体金标记的浓度为0.05mg/ml的A抗BIgG包被而成。

优选的，所述A抗BIgG为羊抗兔IgG。

4、胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

(1)硝酸纤维素膜上质控线和测试线的喷制：将optiVP1基因编码的重组蛋白点于硝酸纤维素膜上形成测试线，将A抗BIgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，37℃干燥后低温密封保存；

(2)金标垫的制备：将胶体金标记的optiVP1基因编码的重组蛋白和胶体金标记的A抗BIgG均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4℃冻干后低温密封保存；

(3)试纸的组装：分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在底板上，硝酸纤维素膜上所述质控线一端靠近吸收垫，所述测试线一端靠近金标垫，切割成试纸条后，干燥密封低温保存。

优选的，所述步骤(1)中所述测试线和质控线之间的距离为0.6cm，测试线和质控线距硝酸纤维素膜边缘0.2cm。

优选的，所述步骤(2)中所述胶体金标记重组蛋白和A抗BIgG时，金标重组蛋白的最佳标记pH为每毫升金溶液加入8μl0.2mmol/LK₂CO₃溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记12μg重组蛋白；金标A抗BIgG的最佳标记pH为每毫升金溶液加入6μl0.2mmol/LK₂CO₃溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记10μgA抗BIgG。

本发明的有益效果在于：本发明通过优化密码子获得了密码子优化型VP1基因，将该密码子优化型VP1(optiVP1)基因的重组蛋白制备成胶体金试纸，并将其用于检测I型鸭甲肝病毒抗体，获得了性能更高的检测DHAV-1抗体的胶体金试纸。本发明使用密码子优化型VP1(optiVP1)基因的重组蛋白作检测试剂可克服使用全病毒作为检测试剂时由于受病毒培养困难(操作复杂，成本高)和纯度有限(会不同程度掺杂有许多宿主细胞成分)等方面的技术限制而导致的成本高、稳定性差、难以标准化、检测结果的准确性差(如掺杂的宿主细胞成分有可能会导致假阳性结果出现)等不足；本发明所述试纸条敏感性高，将DHAV-1弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到16～32倍，也可以被其检测到；运用该试纸条检测非免疫鸭阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭疫里默氏菌阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清、鸭甲型肝炎病毒阳性血清及鸭大肠杆菌阳性血清，结果显示只有鸭甲型肝炎病毒阳性血清可见两条清晰可见的两条红色条带，呈阳性结果，而其他血清只在C线处可见一条红色条带，呈阴性结果，表明本发明所述试纸条具有很好的特异性；应用本发明所述试纸条检测I型鸭甲肝病毒抗体具有良好的批内和批间重复性；本发明制备的试纸条可在4℃或室温(25℃)保存数月。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1密码子优化结果，其中，红色氨基酸进行了密码子优化。

图2为重组表达载体pET28a(+)-optiVP1的双酶切鉴定结果；其中，1泳道为重组质粒pET28a(+)-optiVP1用EcoRI单酶切得到的产物；2泳道为重组质粒pET28a(+)-optiVP1用EcoRI和XhoI双酶切得到的两个片段(所示小片段的分子量大小约为714bp)；3泳道为DL15000相对分子质量标准。

图3为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定结果；其中，图中1泳道为表达的optiVP1蛋白(箭头所示蛋白质分子量大小约为32KD)；2泳道为pET28a(+)空载体表达产物；3泳道为蛋白质相对分子质量标准。

图4为optiVP1重组蛋白可溶性分析，M泳道为蛋白质相对分子质量标准；1泳道为包涵体，2泳道为上清，3泳道为pET28a(+)空载体表达产物。

图5为不同IPTG浓度诱导pET28a(+)-optiVP1表达结果；M泳道为蛋白质相对分子质量标准，1～7泳道依次为IPTG浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L时载体表达产物，8泳道为pET28a(+)空载体表达产物。

图6为不同温度诱导pET28a(+)-optiVP1表达结果；1泳道为蛋白质相对分子质量标准，2～4泳道依次为温度16、25和37℃时载体表达产物，5泳道为pET28a(+)空载体表达的产物。

图7为不同时间诱导pET28a(+)-optiVP1表达结果；M泳道为蛋白质相对分子质量标准，1～7泳道依次为诱导时间0、2、4、6、8、10和12h载体表达产物，8泳道为pET28a(+)空载体表达的产物。

图8为optiVP1重组蛋白的纯化结果；1泳道为未纯化的蛋白，2泳道为纯化的optiVP1蛋白，3泳道为蛋白质相对分子质量标准。

图9为optiVP1重组蛋白免疫原性检测结果；1泳道为以兔抗DHAV-1作为一抗检测optiVP1重组蛋白(约为32KD)，2泳道为预染蛋白质相对分子质量标准，3泳道为阴性对照pET28a(+)空载体。

图10为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图。

图11为胶体金免疫层析试纸条的判定结果。

图12为试纸条上各物质工作浓度优化结果，其中，A图为优化NC膜T线上optiVP1重组蛋白包被浓度；B图为优化NC膜C线上兔IgG包被浓度；C图为优化金标optiVP1重组蛋白和金标羊抗兔IgG工作浓度。

图13为胶体金免疫层析试纸条特异性试验结果。

图14为胶体金免疫层析试纸条敏感性试验结果。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例首先对所述VP1基因进行密码子优化并人工合成密码子优化型VP1(optiVP1)基因，随后通过构建原核表达重组质粒pET28a(+)-optiVP1、转化表达菌、大量表达、超声破碎、切胶纯化来获得optiVP1重组蛋白，同时用Westernblotting分析证实该蛋白可与抗DHAV-1阳性血清发生强烈的免疫反应，进一步确定了optiVP1重组蛋白和兔IgG包被浓度，金标optiVP1蛋白和金标羊抗兔IgG工作浓度，进而制备了检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸条。

一、1型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆、原核表达及VP1蛋白的纯化

1材料方法

1.1菌株、质粒和毒株

pMD19-T-simple，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coliDH5a、表达宿主菌E.coliBL21(DE3)和DHAV-1H毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.2试验鸭胚和血清

9～11日龄鸭胚，兔抗DHAV-1血清，由四川农业大学禽病防治研究中心保存。

1.3主要试剂

RNA提取相关试剂，反转录相关试剂，琼脂糖、2×PCRMix、DNA连接酶Mix、限制性内切酶EcoRI和XhoI、质粒抽提试剂盒及DNA胶回收试剂盒；其它试剂均为分析纯，购自万科试剂有限公司。

2实验方法

2.1DHAV-1VP1基因的密码子优化

用分子生物学软件DNAstars分析1型鸭甲肝病毒H株VP1(wtVP1)基因的碱基含量、密码子的分布情况、AT组成及(G+C)％等；利用http://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.html在线分析VP1基因密码子偏爱性，计算出大肠杆菌相对同义密码子数(RSCU)值，预测VP1基因密码子在大肠杆菌中的密码子适应指数CAI；利用分子生物学软件、生物信息学在线软件等分析VP1基因的mRNA5’及3’端非翻译区、二级结构、起始密码子的旁侧序列及自由能△G等生物学信息。

根据分析结果，将DHAV-1的VP1全基因密码子按照大肠杆菌密码子偏爱性进行优化(具体优化结果见图1，野生型和密码子优化型VP1基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示)，在不改变VP1编码氨基酸序列的前提下，将VP1基因在大肠杆菌中表达的低频密码子替换为大肠杆菌高频密码子，并消除AT富含区避免转录提前终止，提高(G+C)％含量；分析optiVP1的mRNA5’及3’端非翻译区，调节起始密码子的旁侧序列，以避免起始密码子包裹于发夹结构中，人工合成基因长度为714bp的optiVP1，并在该基因上游5’端引入EcoRⅠ酶切位点，下游3’引入XhoⅠ酶切位点。优化后的VP1基因(optiVP1)由上海英骏生物技术有限公司合成，克隆至pMD-19T-simple载体上，获得质粒pMD-19T-simple-optiVP1。

2.2引物设计

根据GenBank中登录的DHAV-1全基因组序列(登录号：JQ301467)，设计特异性扩增wtVP1全长基因的引物(上海英骏生物技术有限公司合成)，引物如下：

上游引物：5’-gaattcatgggtgataccaaccagct-3’，(SEQIDNo.1)，

下游引物：5’-ctcgagttattcaatttccagatcgagttc-3’，(SEQIDNo.2)；

在上下游引物的5’端分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点(下划线所示)，扩增目的片段大小为714bp，序列如SEQIDNo.3所示。

2.3原核重组表达载体pET28a(+)-optiVP1的构建、诱导表达及表达条件的优化

2.3.1原核表达质粒pET28a(+)-optiVP1的构建与鉴定

2.3.1.1目的片段的酶切与连接：限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD19T-simple-optiVP1质粒和原核表达载体pET28a(+)，酶切体系均为表1所示：

表1酶切体系

pMD19T-simple-optiVP1/原核表达载体pET28a(+)	28μl
		EcoR I	2μl
Xho I	2μl
		10×H bμffer	4μl
ddH2O	4μl

37℃水浴4h，按DNA胶回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照表2所示连接体系16℃连接过夜。

表2连接体系

目的片段optiVP1	4.5μl
		pET28a(+)双酶切回收片段	3μl
Solution I	7.5μl

2.3.1.2重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5a感受态细胞。之后，取连接产物7.5μL加到含100μL感受态DH5a的EP管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90s，然后迅速冰浴2min；加入不含抗生素的LB液体培养基400μL，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μL培养物涂布于含100μg/mLKan的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养12～16h。

2.3.1.3重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL的LB液体培养基(含Kan100μg/mL)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用XhoⅠ单酶切、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如表3：

表3重组质粒鉴定酶切体系

	重组表达质粒	EcoR I	XhoI	10×H Buffer	ddH2O
						单酶切	2μl	1μl	——	1μl	6μl
双酶切	2μl	0.5μl	0.5μl	1μl	6μl

将鉴定正确的阳性克隆质粒送上海英骏生物有限公司测序。

2.3.2重组表达质粒pET28a(+)-optiVP1的诱导表达

2.3.2.1重组质粒pET28a(+)-optiVP1的提取：挑取2.3.1.3已鉴定含阳性重组质粒pET28a(+)-optiVP1的DH5a菌种划线接种于含Kan100μg/mL的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于5mLLB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16h，离心收集菌液，DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取。

2.3.2.2重组质粒pET28a(+)-optiVP1转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coliBL21(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET28a(+)-optiVP1转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)中，方法同2.3.1.2。

2.3.2.3重组质粒pET28a(+)-optiVP1的诱导表达及可溶性分析：从上述LB固体培养基(含Kan100μg/mL)上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)中，剧烈振荡培养至OD_600nm＝0.4时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导过夜后，收集培养菌液，4℃8000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加入5ml20mMTris-HCl悬浮，于冰上超声破碎，再12000r/min离心10min，上清取出80μl加入20μL5×SDS上样缓冲液，沉淀用8M尿素溶解，4℃8000r/min离心10min弃沉淀后取80μl加入20μL5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

2.3.3重组质粒pET28a(+)-optiVP1诱导条件的优化

2.3.3.1诱导剂IPTG浓度的优化：按2.3.2.3方法，取含重组质粒pET28a(+)-optiVP1的表达宿主菌BL21(DE3)，接种50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日取7个100ml锥形瓶，按1:50转接种于50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)中，37℃培养至OD600值约0.4时，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L和1.2mmol/L，37℃诱导培养过夜后，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3.3.2温度条件优化：按上述方法，取含重组质粒pET28a-optiVP1的表达宿主菌BL21(DE3)，接种50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日取3个100ml锥形瓶，按1:50转接种于50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)中，37℃培养培养至OD_600nm值约0.4时，分别加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，分别置于16℃、25℃和37℃诱导培养过夜，按2.3.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3.3.3诱导时间优化：取含重组质粒pET28a(+)-optiVP1的表达宿主菌BL21(DE3)，接种50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)上，37℃振摇培养过夜。次日取7个100ml锥形瓶，按1:50转接种于50mLLB液体培养基(含Kan100μg/mL)上，继续培养至OD_600nm值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导培养，分别诱导0、2、4、6、8、10和12h，按2.3.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.4optiVP1重组蛋白的大量制备、纯化

2.4.1菌体的大量培养

(1)将含pET28a(+)-optiVP1质粒的表达菌E.coliBL21(DE3)接种于100mLLB液体培养基(含100μg/mLKan)中，37℃培养16h，作为种子液；(2)配制2LLB液体培养基，密封后121℃灭菌30min，待液体冷却后加入kan至终浓度为100μg/mL，再按1:50接入种子液，37℃培养至OD_600nm值约0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导培养过夜；(3)收集培养好的菌液，取其中1mL进行SDS-PAGE分析，其余的菌液8000r/min离心10min后收集菌体沉淀，用适量Tris-HCl(20mmol/L，pH8.0)重悬后，-20℃保存备用。

2.4.2重组optiVP1蛋白的切胶纯化

2.4.2.1蛋白样的制备：取出-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化后，超声波(冰浴)间歇超声破碎菌体，4℃，12000r/min离心10min。将沉淀用8M尿素溶解，4℃，8000r/min离心10min，按1:4加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮5～10min。

2.4.2.2切胶纯化：按宝生物公司配SDS-PAGE配制40ml大板胶，每板胶加入3～5ml制好的蛋白样，按150V1h、200V4h程序进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后将胶的浓缩胶及溴酚蓝部分去除，余下的胶置于预冷的0.25MKCl中，大约10min后取出胶，切下银白色的目的条带，-20℃保存。

2.4.3optiVP1重组蛋白的浓缩及检测

切下的胶装入透析袋中，在冰水中100V透析至胶变透明，超滤管浓缩至1ml左右，取其中20μl进行SDS-PAGE分析，并以纯化的兔抗DHAV-1为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Westernblotting检测。其余蛋白液测定蛋白浓度后，分装备用。

3实验结果

3.1DHAV-1VP1基因的密码子优化

在不改变wtVP1基因编码氨基酸序列的基础上，根据大肠杆菌密码子偏爱性，优化并人工合成了optiVP1基因，序列如SEQIDNo.4所示。

3.2原核表达质粒pET28a(+)-optiVP1的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET28a(+)-optiVP1的构建与酶切鉴定

以EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET28a(+)表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET28a(+)-optiVP1(理论大小约为6083bp)，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370bp和714bp(见图2)，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建。

3.2.2重组表达质粒pET28a(+)-optiVP1的诱导表达

3.2.2.1重组质粒pET28a(+)-optiVP1的诱导表达：将重组质粒pET28a(+)-optiVP1转化表达菌株BL21(DE3)，在含Kan(100ug/mL)的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET28a(+)-optiVP1的表达宿主菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达、空载体pET28a(+)转化菌株诱导表达，结果表明：空载体pET28a(+)转化菌株诱导未出现特异性蛋白条带；重组表达质粒pET28a(+)-optiVP1表达的重组optiVP1蛋白在32KD处(图3)。

3.2.2.2重组质粒pET28a(+)-optiVP1表达产物的可溶性分析：诱导表达的50mL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示：表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中主要以不溶的包涵体形式存在(图4)。

3.2.2.3重组质粒pET28a(+)-optiVP1诱导表达条件的优化

3.2.2.3.1IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L和1.2mmol/L诱导培养过夜，结果显示0.4mmol/L时诱导的蛋白表达量是最高的(图5所示)。

3.2.2.3.2温度的优化：取3个灭菌锥形瓶，37℃培养至OD_600nm值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，分别置于16℃、25℃和37℃诱导培养4h，结果显示37℃时诱导的蛋白表达量是最高的(图6所示)。

3.2.2.3.3时间的优化：在IPTG浓度为0.4mmol/L，37℃条件下，采用0、2、4、6、8、10和12h不同诱导时间进行诱导表达，结果显示：过夜(12h)诱导表达量是最高的(图7所示)。

3.3重组optiVP1蛋白纯化结果

通过切胶纯化得到optiVP1重组蛋白，通过SDS-PAGE分析显示纯化的optiVP1重组蛋白具有较高的纯度(图8所示)，Westernblotting分析显示该optiVP1重组蛋白能与抗DHAV-1阳性血清发生强烈的免疫反应(图9)，表明该蛋白可作为胶体金免疫层析试纸条的包被抗原用以检测DHAV-1抗体。

二、基于optiVP1重组蛋白的胶体金免疫层析试纸条的制备及应用

1实验材料

1.1菌株、毒株和血清

含pET28a(+)-optiVP1质粒的表达菌E.coliBL21(DE3)，非免疫鸭阴性血清、DHAV-1阳性血清、鸭瘟病毒(DPV)阳性血清、鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestiferinfectious，RA)阳性血清、鸭大肠杆菌(DμckE.coliinfectious,E.coli)阳性血清及鸭沙门氏菌阳性血清和139份待检鸭血清，由四川农业大学禽病防治研究中心提供。

1.2主要试剂

牛血清白蛋白(BSA)，购自美国Sigma公司；兔免疫球蛋白，羊抗兔免疫球蛋白，购自杭州纽龙生物科技有限公司；20nm胶体金溶液，玻璃纤维素膜，PVC底板，购自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC)膜，购自美国Millpore公司；金标复溶液：含3％蔗糖和5％海藻糖及1％BSA的0.2MTris-HCl；样品垫处理液：含3％蔗糖和1％BSA及0.5％Tween-20的0.2MTris-HCl；其他试剂如0.01mol/L的PB(pH＝7.6)缓冲液均按常规方法配制。

2optiVP1重组蛋白-胶体金免疫层析试纸条(optiVP1-ICS)的制备

2.1I型鸭甲肝病毒optiVP1重组蛋白胶体金免疫层析试纸条的组装

组装试纸条具体操作步骤如下：(1)NC膜测试线(T线)、质控线(C线)划膜：将纯化的optiVP1重组蛋白和兔IgG用0.01mol/L的PB(pH7.6)缓冲液适当稀释后，用加样枪将其分别点膜于NC膜上，形成T线和C线，T线与C线相距0.6cm，置37℃干燥2h，4℃密封保存备用。(2)对纯化的optiVP1重组蛋白和羊抗兔IgG分别进行胶体金标记；(3)将玻璃纤维素膜剪切成2.5cm×1.5cm规格，用金标复溶液对胶体金标记的optiVP1重组蛋白及羊抗兔IgG复溶，确定最佳复溶体积，并将这两种金标物混合后均匀地铺在玻璃纤维素膜上，4℃冻干过夜，制成金标垫，4℃密封保存备用。(4)样品垫的处理：将玻璃纤维素膜剪切2.5cm×10cm规格，置于样品垫处理液中室温浸泡数小时，然后置于37℃烘干，即为样品垫；(5)将PVC底板剪切成2.5cm×7.5cm规格，吸水纸剪切成2.5cm×10cm规格，分别将NC膜、金垫、样品垫、吸收垫粘在PVC底板上(图10所示)，并剪切成0.5cm宽的试纸条，内置干燥剂，4℃密封保存。

2.2I型鸭甲肝病毒optiVP1重组蛋白胶体金免疫层析试纸条的原理及结果判定

2.2.1胶体金免疫层析试纸条的原理

将纯化的optiVP1重组蛋白包被于NC膜T线，兔免疫球蛋白包被于C线；将胶体金标记的optiVP1重组蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG混合后固化于金垫上；当鸭血清中的鸭抗DHAV-1抗体流经金垫时，与金垫上胶体金标记的optiVP1重组蛋白结合形成“鸭抗DHAV-1抗体-胶体金标记的optiVP1重组蛋白”复合物，该复合物继续流动，与T线上的optiVP1重组蛋白抗原结合形成“重组optiVP1蛋白抗原-鸭抗DHAV-1抗体-胶体金标记的重组optiVP1蛋白”复合物而被截留下来，胶体金颗粒在此富集而形成肉眼可见的红色，且T线呈红色的深浅程度与血清中鸭抗DHAV-1抗体含量呈正比；而金垫上的胶体金标记的羊抗兔IgG继续向前流动，到达C线时与C线上的兔IgG结合形成“胶体金标记的羊抗兔IgG-兔IgG”复合物而被截留下来，胶体金颗粒在此富集形成肉眼可见的红色。

2.2.2结果判定

当向水平放置的试纸条上滴加约100μl待检血清后，15min内观察检测结果：若出现C、T两条红线，则表示呈阳性结果，若只有C线呈红色，则表示呈阴性结果，若T线呈红色C线不显色或C、T线均不显色，则表示试纸条无效(图11所示)。

2.3I型鸭甲肝病毒optiVP1重组蛋白胶体金免疫层析试纸条件的优化

2.3.1纯化的optiVP1重组蛋白在NC膜上包被浓度的确定

将optiVP1重组蛋白用0.01mol/L的PB缓冲液(pH＝7.6)稀释成以下不同浓度：2mg/ml、1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.75mg/ml和0.5mg/ml，点膜于NC膜上，在其他条件不变的情况下，组装成试纸条，检测血清，根据反应结果确定重组optiVP1蛋白在NC膜上的包被浓度。

2.3.2兔IgG在NC膜上的包被浓度的确定

将兔IgG用0.01mol/L的PB缓冲液(pH＝7.6)稀释成以下不同浓度：1mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.5mg/ml、0.4mg/ml和0.2mg/ml，点膜于NC膜上，在其他条件不变的情况下，组装成试纸条，检测血清，根据反应结果确定兔IgG在NC膜上的包被浓度。

2.3.3金垫上胶体金标记的optiVP1重组蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG稀释度的确定

胶体金标记的optiVP1重组蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG溶液，分别离心后，混在一起，按以下体积加入金标复溶液：200μl、300μl、400μl、500μl，在其他条件不变的情况下，组装成试纸条，检测血清，根据反应结果确定最优加入金标复溶液体积。此处加的金标复溶液体积是按1ml金标optiVP1重组蛋白和1ml金标羊抗兔IgG来计算的。

2.3.4优化结果

经过优化和筛选，本发明建立的试纸条的最优条件为：(1)NC膜上T线上的重组optiVP1蛋白浓度≥1mg/ml，C线上的兔IgG包被浓度≥0.4mg/ml(如图12中A图和B图所示)；(2)金垫上胶体金标记的optiVP1重组蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG所加金标复溶液体积为300μl(如图12中C图所示)。

3试纸条的应用

3.1特异性试验

用上述建立的optiVP1-ICS法分别检测非免疫鸭阴性血清、DHAV-1阳性血清、DPV阳性血清、RA阳性血清、E.coli阳性血清，沙门氏菌阳性血清，观察该法的特异性。

结果显示，仅DHAV-1阳性血清可见两条清晰可见的红色条带，其他血清仅在C线处见一条红色条带(图13所示)，表明本试纸具有很好的特异性。

3.2敏感性试验

将DHAV-1阳性血清1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512倍稀释，用上述建立的optiVP1-ICS法检测。

结果显示，当阳性血清稀释到1:16时，仍可见两条清晰可见的红色条带，当阳性血清稀释到1:32时，T线隐约可见红色条带，C线可见清晰红色条带(图14)。此方法可检测到1:16～1:32倍稀释的DHAV-1阳性血清，具有较强的敏感性。

3.3重复性试验

批内重复试验：用上述建立的optiVP1-ICS法检测非免疫鸭阴性血清(1份)和DHAV-1阳性血清(1份)，作3次重复，观察反应结果。批间重复性试验：用3个不同批次制备的试纸条，分别检测非免疫鸭阴性血清(1份)和DHAV-1阳性血清(1份)，观察结果。

结果显示，批内及批间可重复性检测结果一致，说明制备的试纸条具有良好的批内及批间可重复性。

3.4对临床待检血清样本的检测

用本研究建立的optiVP1-ICS法检测139份鸭血清，检出阳性血清98份，阴性血清41份。

3.5稳定性试验

将试纸条干燥密封后，分别于4℃、室温(25℃)、37℃保存，其中，室温(25℃)、37℃保存的试纸条每隔一周、4℃保存的试纸条每隔15天取出6张分别检测非免疫鸭阴性血清(3份)和鸭DHAV-1阳性血清(3份)，观察结果。

结果显示，4℃保存的试纸条保存时间最长，可保存至少3个月以上，室温(25℃)保存时间次之，可保存至少2个月，而37℃保存的试纸条在保存1个月后，显色不是很清晰。

4讨论

胶体金标记VP1和羊抗兔IgG的工作浓度的确定以及NC膜上optiVP1蛋白和兔IgG的包被浓度是保证试纸条灵敏度及特异性的关键。浓度过高，一方面会使NC膜背景色加深，不利于检测带显色的观察，另一方面也可能会增强非特异性反应；而浓度过低，可能会降低灵敏度。在本发明中，经过优化和筛选，确定了optiVP1重组蛋白、兔IgG、胶体金标记的羊抗兔IgG和胶体金标记的optiVP1重组蛋白的最优工作浓度分别是≥1.0mg/ml、0.4mg/ml、0.06mg/ml、0.06mg/ml。

胶体金免疫层析试纸这种检测方法，其检测下限可达1纳克，与ELISA法相当。但其所具有的优势是ELISA等检测方法所不具备的，即成本低，耗时短，无需特殊设备及专业技术人员，特别适合于野外、养殖场等的现场诊断。

本发明中，将DHAV-1阳性血清稀释到1:16时，检测结果仍呈阳性，说明其具有很好的灵敏度。大致原因如下：NC膜具有很好的吸附作用和滤过水分以及浓缩作用，因此，尽管抗原的包被量很少，但在NC膜T线上的抗原浓度实际上是很高的；所有样品均经过NC膜持续反应，金颗粒持续聚集而使得颜色逐渐加深，实际上是对待测抗体起到浓缩作用，从而提高了灵敏度。

本研究中发明的金标试纸条在运用过程中，同时检测DHAV-1阳性血清、RA阳性血清、DPV阳性血清及鸭沙门氏菌阳性血清，结果只能检测出DHAV-1阳性血清，说明该方法特异性好。批内和批间重复性试验证实了该方法具有良好的可重复性。此外，对制备的试纸条的稳定性做了评估，结果表明，该试纸条在4℃条件下保存时间最久，可达数月，在25℃条件下保存时间次之，而在37℃条件下保存时间最短，只有2个月。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。

2.根据权利要求1所述1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因，其特征在于，所述基因为针对大肠杆菌表达进行密码子优化获得的VP1基因。

3.权利要求1或2所述1型鸭甲肝病毒密码子优化型VP1基因编码的重组蛋白在制备检测I型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸中的应用。

4.胶体金免疫层析试纸，由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度≥1.0mg/ml的权利要求1所述基因编码的重组蛋白包被而成，质控线由浓度≥0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度≥0.06mg/ml的权利要求1所述基因编码的重组蛋白和胶体金标记的浓度≥0.05mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述A抗BIgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另一种任一种动物IgG。

5.根据权利要求4所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度为1.0mg/ml的权利要求1所述基因编码的重组蛋白包被而成，质控线由浓度为0.4mg/ml的A抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度为0.06mg/ml的权利要求1所述基因编码的重组蛋白和胶体金标记的浓度为0.05mg/ml的A抗BIgG包被而成。

6.根据权利要求4或5所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述A抗BIgG为羊抗兔IgG。

7.权利要求4～6所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)硝酸纤维素膜上质控线和测试线的喷制：将权利要求1所述基因编码的重组蛋白点于硝酸纤维素膜上形成测试线，将A抗BIgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，37℃干燥后低温密封保存；

(2)金标垫的制备：将胶体金标记的权利要求1所述基因编码的重组蛋白和胶体金标记的A抗BIgG均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4℃冻干后低温密封保存；

(3)试纸的组装：分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在底板上，硝酸纤维素膜上所述质控线一端靠近吸收垫，所述测试线一端靠近金标垫，切割成试纸条后，干燥密封低温保存。

8.根据权利要求7所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述测试线和质控线之间的距离为0.6cm，测试线和质控线距硝酸纤维素膜边缘0.2cm。

9.根据权利要求7所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述胶体金标记重组蛋白和A抗BIgG时，金标重组蛋白的最佳标记pH为每毫升金溶液加入8μl0.2mmol/LK₂CO₃溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记12μg重组蛋白；金标A抗BIgG的最佳标记pH为每毫升金溶液加入6μl0.2mmol/LK₂CO₃溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记10μgA抗BIgG。