CN102012432A - 基于重组ul51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明特别涉及基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，所述胶体金免疫层析试纸中硝基纤维膜上的测试线由浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，金标垫由胶体金标记的≥2mg/mL重组UL51蛋白和≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白的混合液包被而成；试纸的制作方法包括硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制、金标垫的制备及胶体金免疫层析试纸条的组装；本发明还涉及试纸在检测鸭瘟病毒抗体中的运用；本试纸用于检测鸭瘟病毒抗体的检测灵敏度和特异性高，本制备方法操作简单实用，本运用首次将抗重组UL51蛋白制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗体。

Description

基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及动物医学领域中鸭瘟病毒抗体的检测，特别涉及基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用。

背景技术

鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV)，DPV是一种泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4～5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，而导致许多假阳性结果出现。

随着分子生物学的飞速发展，对蛋白功能的研究日趋增强，特别是对有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病毒抗血清的ELISA方法和胶体金免疫层析法已被大量报道。但是，基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法尚未报到，重组UL51蛋白是否与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应、是否可用于鸭瘟病毒抗体的检测尚需证实。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的胶体金免疫层析试纸检测鸭瘟病毒抗体，所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化并发酵培养，收集到了大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀；为保证包被蛋白成分单一，降低非特异性结合，接着对重组UL51蛋白进行了纯化；且将纯化的蛋白再依次分步梯度透析，以降低尿素浓度使该蛋白恢复其空间结构，复性后的蛋白具有较好的抗原性；同时，用Western blotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定重组UL51蛋白标记浓度、兔免疫球蛋白的包被浓度及金标垫的包被参数后，制备了胶体金免疫层析试纸，该试纸检测鸭瘟病毒抗体的特异性、灵敏性较高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。

进一步，所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。

本发明的目的之二在于提供所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，该方法简单实用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述胶体金免疫层析试纸的制备步骤具体步骤为：

a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制：将浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；

b金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸于由胶体金标记的浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；

c胶体金免疫层析试纸条的组装：分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫、吸收垫依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存；

进一步，所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线距硝基纤维膜的边距分别为0.9厘米。

本发明的目的之三在于提供所述胶体金免疫层析试的运用，所述运用能够保证在灵敏性和特异性较高的情况下快速检测鸭瘟病毒抗体。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的胶体金免疫层析试纸在制备鸭瘟病毒抗体检测试纸中的运用。

有益效果：本胶体金试纸敏感性高，即使将DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到128倍，也可以被本胶体金免疫层析试纸检测到；运用该试纸分别检测非免疫鸭阴性血清、鸭DPV阳性血清、鸭DHV阳性血清、鸭RA阳性血清和鸭E.coli阳性血清，结果显示仅鸭DPV阳性血清可见两条清晰的红色条带，其它血清均仅在C线处出现一条清晰的红色条带，表明本试纸具有很好的特异性；另外，运用本试纸检测鸭瘟病毒具有良好的批内及批间重复性；本方法制备的试纸至少可在4℃或25℃保存一年，本运用首次将重组UL51蛋白制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗体。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1-A为DPV UL51基因的PCR扩增：M指DL2000相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图1-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图1-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III；1指重组表达载体pET28a-UL51，2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。

图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准；1为阴性对照(未加I PTG诱导)；2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-7的IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L；图2-C为不同温度诱导pET28a-UL51表达结果：1-3的温度分别为20、30和37℃；图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果：1-7的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。

图3为重组UL51蛋白的检测：(a)SDS-PAGE分析：M为蛋白标准(KD)；1为1mL发酵培养的菌液；2为包涵体洗涤法纯化的重组UL51蛋白；0为透析复性后的重组UL51蛋白；(b)Western blotting分析：1是以兔抗DPV抗体为一抗检测重组UL51蛋白(约为34KD)。

图4为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图。

图5为胶体金免疫层析试纸条的判定结果。

图6为所述胶体金免疫层析试纸的敏感度。

图7为所述胶体金免疫层析试纸的特异性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例鸭瘟病毒UL51胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用

一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及产物纯化

1、材料方法

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.1菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.2试验鸭胚

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性.

2实验方法

2.1DPV UL51基因的克隆

2.1.1引物设计

利用Primer Premier5.0软件，参考UL51基因序列(GenBank登录号：DQ072725)，由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL51F：5’-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3’(划线部分为EcoRI位点)；引物DPV-UL51R：5’-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’(划线部分为XhoI位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

2.1.2DPV基因组DNA的提取

2.1.2.1DEF的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用5％碘酒和75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2.5％的胰蛋白酶)150μl/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

2.1.2.2DPV增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2～3mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附120min后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

2.1.2.3DNA提取方法：直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60％～70％的DEF(100mL细胞瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10min；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60min；(6)13000r/min离心20min，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30min，-20℃保存备用。

2.1.3PCR扩增DPV UL51基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取4μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，设DL2000和空白对照，观察扩增片段的长度。

2.1.4UL51基因PCR产物的回收

按北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。

2.1.5纯化的UL51基因与pMD18-T的连接

连接反应体系如下：

将上述试剂加入0.2mL的EP管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

2.1.6DH5a感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5a株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5a单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2)取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃200r/min振荡培养2.5～3h，使OD₆₀₀＝0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃4000r/min离心8min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为200μL/管，直接用于转化或置于-70℃冰箱中保存备用。

2.1.7转化感受态细胞

将10μL连接体系全部取出加到200μL DH5a感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入0.8mL LB培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μL涂于含(X-gal/IPTG/Kan)的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于5mL LB(含50μg/mL Kan)中，37℃水浴振荡培养18h后进行质粒抽提。

2.1.8质粒的抽提

按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。

2.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD18-UL51，分别以EcoR I/XhoI双酶切消化与Xho I单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

2.1.10UL51基因序列测定

将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

2.2原核表达质粒pET28a-UL51的构建、诱导表达与表达条件优化

2.2.1原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定

2.2.1.1目的片段的酶切与连接：限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切pMD18-UL51质粒和原核表达载体pET28a(+)，酶切体系均为：

37℃水浴4h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

2.2.1.2重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5a感受态细胞。之后，取连接液15μL加到含200μL感受态DH5a的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90sec，然后迅速冰浴2min；加入不含Kan的LB液体培养基800μL，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μL培养物涂布于含100μg/mL Kan的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，同时设立空载体转化组(空载体10μL+感受态DH5a200μL)、无载体对照组(灭菌超纯水10μL+感受态DH5a 200μL)。

2.2.1.3重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL的LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用Xho I单酶切、EcoR I和Xho I双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下：

然后，以上述重组质粒为模板，利用方法2.1.1中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET28a-UL51。

2.2.2重组表达质粒pET28a-UL51的诱导表达

2.2.2.1重组质粒pET28a-UL51的提取：挑取2.2.1.3已鉴定含阳性重组质粒pET28a-UL51的DH5a菌种划线接种于含Kan 50g/mL的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于5mL LB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16h，离心收集菌液，按UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

2.2.2.2重组质粒pET28a-UL51转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coliBL(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET28a-UL51转化到表达宿主菌E.coli BL(DE3)中，方法同2.2.1.2。

2.2.2.3重组质粒pET28a-UL51的诱导表达：从上述LB固体培养基(含Kan50μg/mL)上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1∶50的比例接入5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀＝0.4时，分别加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导3h后，收集1mL培养菌液，4℃13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

2.2.2.4重组质粒pET28a-UL51表达产物的可溶性分析：将诱导表达的100mL菌液和未诱导表达的100mL菌液，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃，10000r/min离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用10mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入80μL超纯水和20μL5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和Quantity One软件分析诱导菌液中重组蛋白在胞浆(上清①，可溶性)和沉淀中(沉淀②，包涵体形式)的相对百分含量。

2.2.3重组质粒pET28a-UL51诱导条件的优化

2.2.3.1诱导剂IPTG的浓度优化：按2.2.2.3方法，取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取其中7只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L 37℃诱导培养4h后，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.2.3.2温度条件优化：按2.2.2.3方法，取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，分别置于20℃、30℃、37℃诱导培养4h，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.2.3.3诱导时间优化：取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)上，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)上，继续培养至OD₆₀₀值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养，分别于诱导后0、1、2、3、4、5、6、7、8h，吸取1mL培养液，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3重组UL51蛋白的大量制备、纯化与复性

2.3.1菌体的发酵培养

发酵的具体步骤为：(1)将含pET28a-UL51质粒的表达菌E.coli BL21(DE3)接种于200mL LB液体培养基(含50μg/mL Kan)中，37℃培养16h，作为种子菌；(2)向发酵罐中注入10L的LB液体培养基，密封后115℃灭菌30min，之后待液体冷却至37℃；(3)从加样孔处向发酵罐中加入终浓度为50μg/mL Kan、1mL消泡剂和200mL种子菌(2％v/v)；(4)在640r/min，37℃，pH 7.0，和50％溶氧量的条件下培养，待培养至菌液OD₆₀₀＝0.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养3h；(5)收集培养好的菌液(约10L)，取其中1mL进行SDS-PAGE分析，其余的菌液8,000r/min离心10min后收集菌体沉淀，用适量Tris HCl(20mmol/L，pH 8.0)重悬后，-20℃保存备用。

2.3.2重组ULL51蛋白的包涵体洗涤法大量纯化

取出-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化后，按1mg/mL加溶菌酶，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃，10000r/min离心10min。将沉淀用20mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用20mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀，4℃保存备用。

2.3.3重组UL51蛋白的复性和检测

将包涵体洗涤纯化得到的重组UL51蛋白，于4℃在不同浓度的尿素溶液(6、4、3、2、1、0mol/L)中梯度透析，使变性蛋白逐渐复性，收集透析好的蛋白液，取其中20μL进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定浓度后，稀释成2mg/mL，分装后，4℃保存备用。

3实验结果

3.1DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

3.1.1UL51基因的PCR扩增结果

以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对UL51基因进行PCR扩增，其产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约760bp的特异性DNA条带，而以正常DEF基因组DNA为模板进行PCR扩增，无特异性条带，这与预期结果一致(图1-A)。

3.1.2UL51基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-UL51。对pMD18-UL51进行PCR、酶切(图1-B)和测序鉴定，结果表明，T克隆获得的UL51基因序列同已知的DPV UL51基因序列完全一致。

3.2原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET28a-UL51的构建与酶切鉴定

以EcoRI和Xho I双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET-28a(+)表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET28a-UL51(理论大小约为6130bp)，经EcoR I和Xho I双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370bp和760bp(见图1-C)，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建。

3.2.2重组质粒pET28a-UL51的诱导表达

3.2.2.1重组质粒pET28a-UL51的诱导表达：将重组质粒pET28a-UL51转化表达菌株BL21(DE3)，在含Kan的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达、未用IPTG诱导、空载体pET-28a(+)转化菌株诱导表达，结果表明：空载体pET-28a(+)转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋白条带；重组表达质粒pET28a-UL51表达的重组UL51蛋白在34KD处(图2-A)。

3.2.2.2重组质粒pET28a-UL51表达产物的可溶性分析：诱导表达的100mL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示：表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中大量以不溶的包涵体形式存在。同时Quantity One软件分析显示：诱导菌液中重组蛋白在胞浆上清(可溶性)和沉淀中(包涵体形式)的相对百分含量分别为6.72％和93.28％。

3.2.3重组质粒pET28a-UL51诱导表达条件的优化

3.2.3.1IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L诱导培养4h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量逐渐增加，当增加到0.8mmol/L蛋白表达量达到最大；其后再增大IPTG浓度到1.0mmol/和1.2mmol/L时，其蛋白表达量与0.8mmol/L时没有明显差别(图2-B)。因此，可选择0.8mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

3.2.3.2诱导温度条件的优化：37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取3只灭菌试管，分装5mL/管，分别加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，分别置于20℃、30℃、37℃诱导培养4h，结果：温度在20℃时，诱导蛋白量较少，37℃时最高(图2-C)，说明随着温度升高，蛋白诱导量逐渐增加。因此，选择温度37℃为最佳诱导温度。

3.2.3.3诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.8mmol/L，37℃条件下，采用1～8h不同诱导时间进行诱导表达，结果1h时几乎无特异的蛋白条带产生；诱导1～3h的重组蛋白表达量均低于4h诱导组；诱导5～8h，其重组蛋白表达量同4h相比无明显变化(图2-D)。因此，选择4h作为最佳诱导时间。

3.3重组UL51蛋白的纯化结果

通过发酵培养，收集到了大量含有重组UL51蛋白的菌体沉淀，经溶菌酶裂解、超声破碎、洗涤和溶解包涵体、变性蛋白透析复性等过程获得了大量纯化的重组UL51蛋白，通过SDS-PAGE分析显示纯化的重组UL51蛋白具有较高的纯度(图3-a)，Western blotting分析显示该重组UL51蛋白能与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应(图3-b)，表明该重组蛋白可作为UL51-ICS法检测DPV抗体的包被原。

二、鸭瘟病毒重组UL51胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用

1实验材料

1.1菌株、毒株和血清

含pET28a-UL51质粒的表达菌E.coli BL21(DE3)、DPV强毒CHv株(DPV-CHv)由四川农业大学禽病研究中心提供；非免疫鸭阴性血清(DPV抗体检测阴性)、DPV阳性血清(为弱毒疫苗免疫后14d的免疫鸭血清，中和效价为1∶8)、鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis，DHV)阳性血清、鸭传染性浆膜炎(Riemerella anatipestifer infectious，RA)阳性血清、鸭大肠杆菌病(Duck E.coli infectious，E.coli)阳性血清和110份待检鸭血清(采集自四川省各养鸭场)，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.2主要试剂

牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司产品；兔免疫球蛋白、胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白、金标蛋白稀释液、玻璃纤维素膜处理液，由上海金标生物科技有限公司提供；其它常规试剂如0.01mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2)均按常规方法配置。

2组UL51蛋白抗原-胶体金免疫层析试纸法(UL51-ICS)的制备

2.1鸭瘟病毒重组UL51胶体金免疫层析试纸的组装

参考文献进行胶体金免疫层析试纸条的组装，具体步骤如下：(1)将纯化的重组UL51蛋白抗原和兔免疫球蛋白分别用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2)适当稀释后，用XYZ-3000三维喷点仪将稀释好的重组UL51蛋白和兔免疫球蛋白分别喷点于NC膜上，形成检测线(test line，T线)和质控线(control line，C线)，T线与C线相距0.7cm，距NC膜的边距分别为0.9cm，置37℃干燥2h后，4℃密封保存备用。(2)对纯化的重组UL51蛋白做胶体金标记；(3)用金标蛋白稀释液分别对胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白作适当稀释后混合，将玻璃纤维素膜浸于以上两种胶体金标记物的混合液中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中以封闭非特异性结合位点，37℃干燥过夜，制成金标垫。(4)分别将NC膜、样品垫(吸水棉)、金标垫(玻璃纤维素膜)、吸收垫(吸水纤维素膜)依次粘在白色塑料板上，组装成检测试纸板(图4)，并用LN-5000切割机切割成0.4cm宽的试纸条，将其装入塑料盒中，密封包装，内置干燥剂，4℃保存。

2.2鸭瘟病毒重组UL51胶体金免疫层析试纸的原理和结果判定

胶体金免疫层析试纸的原理：将纯化的重组UL51蛋白包被于T线，兔免疫球蛋白包被于C线；再将胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白混合后，共同固化于金标垫上；当鸭血清样品中的鸭抗DPV抗体流经金标垫上固化的胶体金标记的重组UL51蛋白时，与胶体金标记的重组UL51蛋白结合形成“鸭抗DPV抗体-胶体金标记的重组UL51蛋白”复合物，该复合物继续流动，与T线上的重组UL51蛋白抗原结合形成“重组UL51蛋白抗原-鸭抗DPV抗体-胶体金标记的重组UL51蛋白”复合物，胶体金颗粒在T线上富集而呈现红色，并且T线呈红色的强度与鸭抗DPV抗体的含量成正比；而固化于金标垫上的不与鸭抗DPV抗体结合的胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白则继续向前流动，与固化在C线上的兔免疫球蛋白形成“兔免疫球蛋白-胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体”复合物，胶体金颗粒在C线上富集而呈现红色。因此，当向水平放置的试纸条的样品垫上滴加约100μL的待检血清样品后，在15min内观察反应结果：若出现C线、T线两条红线，为阳性(图5-a)；若只在C线上有一条红线，为阴性(图5-b)；若仅在T线上有一条红线或无任何红线出现，则试验无效。

2.3鸭瘟病毒重组UL51胶体金免疫层析试纸的条件优化

以下条件逐一组合，确定鸭瘟病毒重组UL51胶体金免疫层析试纸检测(UL51-ICS法)的最佳试验条件。

纯化的重组UL51蛋白在NC膜上的包被浓度的确定：将重组UL51蛋白用0.01mol/L的PB缓冲液(pH 7.2)作A：不稀释(2mg/mL)、B：2倍稀释(1mg/mL)、C：4倍稀释(0.5mg/mL)、D：8倍稀释(0.25mg/mL)后，用XYZ-3000三维喷点仪将其喷点于NC膜上，形成T线。按制备好的胶体金免疫层析试纸，在其它条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适重组UL51蛋白的稀释度，为工作浓度。本实施例中的稀释方式均按照体积比进行。

b兔免疫球蛋白在NC膜上的包被浓度的确定：将兔免疫球蛋白用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH 7.2)作A：不稀释(4mg/mL)、B：2倍稀释(2mg/mL)、C：4倍稀释(1mg/mL)、D：8倍稀释(0.5mg/mL)后，用XYZ-3000三维喷点仪将其喷点于NC膜上，形成C线。在其它条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适兔免疫球蛋白的稀释度，为工作浓度。

c胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白的稀释度的确定：将胶体金标记的重组UL51蛋白作A：不稀释(2mg/mL)、B：2倍稀释(1mg/mL)、C：4倍稀释(0.5mg/mL)、D：8倍稀释(0.25mg/mL)；再将胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白作A：不稀释(4mg/mL)、B：2倍稀释(2mg/mL)、C：4倍稀释(1mg/mL)、D：8倍稀释(0.5mg/mL)；对以上两种标记物的不同稀释度进行逐一组合，用同样大小的玻璃纤维素膜分别浸于组合后的混合物中，在其它条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记物的稀释度，即为工作浓度。

d胶体金免疫层析试纸的条件优化：经过优化和筛选，UL51-ICS法的最佳条件为：(1)用XYZ-3000三维喷点仪将稀释好的重组UL51蛋白和兔免疫球蛋白分别以2mg/mL和1mg/mL喷点于NC膜上，形成T线和C线，置37℃干燥2h后，4℃密封保存备用。(2)将玻璃纤维素膜浸于2mg/mL的胶体金标记的重组UL51蛋白和2mg/mL的胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白的混合液中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中以封闭非特异性结合位点，37℃干燥过夜，制成金标垫。(3)分别将NC膜、样品垫(吸水棉)、金标垫(玻璃纤维素膜)、吸收垫(吸水纤维素膜)依次粘在白色塑料背板上，组装成检测试纸板，并用LN-5000切割机切割成0.4cm宽的试纸条，将其装入塑料盒中，密封包装，内置干燥剂，4℃保存。

3胶体金免疫层析试纸的应用

3.1敏感性试验

将DPV阳性血清作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512，9个稀释度，用上述建立的UL51-ICS法进行检测。

将DPV阳性血清作一系列倍比稀释后，用上述建立的UL51-ICS法进行检测。结果当阳性血清稀释到1∶128时，仍可见两条清晰的红色条带；当阳性血清稀释到1∶256时，仅可见C线出现清晰的红色条带(图6)。表明此方法能够检出1∶128倍稀释的DPV阳性血清，具有较强的敏感性。

3.2特异性试验

用上述建立的UL51-ICS法分别检测非免疫鸭阴性血清、DPV阳性血清、DHV阳性血清、RA阳性血清、E.coli阳性血清，观察该法的特异性。

用上述建立的UL51-ICS法分别检测非免疫鸭阴性血清、DPV阳性血清、DHV阳性血清、鸭RA阳性血清、鸭E.coli阳性血清，结果显示仅DPV阳性血清可见两条清晰的红色条带，其它血清均仅在C线处出现一条清晰的红色条带(图7)，表明本试纸具有很好的特异性。

4.3重复性试验

批内可重复性试验：用上述建立的UL51-ICS法分别检测非免疫鸭阴性血清(1份)和DPV阳性血清(1份)，作3次重复，观察结果；(2)批间可重复性试验：用3个不同批次制备的试纸条分别检测非免疫鸭阴性血清(1份)和DPV阳性血清(1份)，观察结果。

批内可重复性试验结果显示：非免疫鸭阴性血清和DPV阳性血清的3次重复检测结果均一致；批间可重复性试验结果显示：用3个不同批次制备的试纸条分别检测非免疫鸭阴性血清和DPV阳性血清，得到的结果也均一致。表明建立的UL51-ICS法具有良好的批内及批间重复性。

3.4对临床待检血清样品的检测

用本研究建立的UL51-ICS法、UL51-LISA法、DPV-ELISA法和NT试验分别检测110份待检血清样品，结果如表1所示：UL51-ELISA法检出阳性率为39.09％(43/110)，UL51-ICS法检出阳性率为37.27％(41/110)，两者符合率为95.35％(41/43)；UL51-ELISA法与DPV-ELISA检测试剂盒的符合率为91.49％(43/47)，与NT试验的符合率为58.14％(25/43)；UL51-ICS法与DPV-ELISA检测试剂盒的符合率为87.23％(41/47)，与NT试验的符合率为60.98％(25/41)。以上结果表明，本研究建立的UL51-ELISA法与UL51-ICS法有最高的符合率，并且UL51-ELISA法与DPV-ELISA检测试剂盒也有较高的符合率。

表14种检测DPV抗体方法的比较

3.5稳定性试验

将试纸条干燥密封后分别置于4℃、25℃和37℃，并分别在3月、6月、9月和12月检测非免疫鸭阴性血清(1份)和DPV阳性血清(2份)，观察结果。

将试纸条干燥密封后，分别在4℃和25℃放置3～12月，仍能检测到强阳性结果；在37℃放置3～6月，也能检测到阳性结果，但当放置9～12月时，检测到的阳性结果减弱。表明该试纸条至少可在4℃或25℃保存1年。

4讨论

标记物工作浓度的确定是保证试纸条灵敏度和特异性的关键因素，为保证定性诊断的准确性，需严格控制金标垫上免疫胶体金与NC膜上的抗原或抗体的标记浓度。浓度过高，一方面会使NC膜背景加深，使检测带显色结果不清晰，另一方面会使非特异反应增强，影响定性结果的特异性；浓度过低虽然减少了非特异反应，但同时又降低了反应的灵敏度。在本实施例中，经优化和筛选，我们确定了ICS法中的重组UL51蛋白、兔免疫球蛋白、胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔免疫球蛋白的最佳工作浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和2mg/mL；当然，在高于上述最佳工作浓度的条件下同样可以实现鸭瘟病毒抗体的检测功能。

公知常识中体金免疫层析试纸条及其方法的检测下限为1个纳克左右，与ELISA法相当，相对于原理相近的斑点免疫金渗滤试验更为灵敏。本实施例将DPV标准阳性血清作1∶128倍稀释时，仍呈阳性，证明了本试纸具有较高敏感性，原因可能有如下几个方面：(1)NC膜有很好的吸附蛋白、滤过水分和浓缩聚焦等作用，因此，尽管抗原的包被量很少，但NC膜检测线上的抗原浓度却较高，使该试纸具有较高的敏感性。(2)本试纸的运用集免疫反应与层析的特点，待测样品中的鸭抗DPV抗体与金标垫上的胶体金标记的重组UL51蛋白不断结合，形成“鸭抗DPV抗体-胶体金标记的重组UL51蛋白”复合物；再经层析作用持续通过NC膜，与NC膜上的固相抗原结合，由于所有样品均经过条状纤维素膜发生持续性反应，金颗粒持续聚集而使检测线逐渐加深，实际上是对待测抗体起到了一个浓缩作用，从而提高了试纸的敏感性；(3)在其它免疫学方法中，由于血清中抗体水平过高常会导致带现象的产生，即个别强阳性样品呈阴性结果的假阳性现象，而ICS方法的抗原抗体反应是持续性的，从而克服了这一现象，提高了敏感性。并且，在试纸的运用过程中，通过与鸭源的DHV阳性血清、RA阳性血清和E.coli阳性血清对比，结果表明该ICS法与这几种血清均无交叉反应性，具有较好的特异性；批内和批间可重复性试验证实了该方法具有良好的重复性；稳定性试验表明该试纸条在4℃或25℃保存1年，仍可用于样品检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (5)

1.基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。

2.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。

3.权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸制作方法，其特征在于：具体步骤为：

a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制：将浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；

b金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸于由胶体金标记的浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；

c胶体金免疫层析试纸条的组装：分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫、吸收垫依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存。

4.根据权利要求3所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸制作方法，其特征在于：所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线距硝基纤维膜的边距分别为0.9厘米。

5.权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸在制备鸭瘟病毒抗体检测试纸中的应用。

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