CN102174087B

CN102174087B - 检测鸭瘟病毒抗体的ul55重组原核表达蛋白及制备方法

Info

Publication number: CN102174087B
Application number: CN201110047060.5A
Authority: CN
Inventors: 程安春; 吴英; 汪铭书; 陈孝跃
Original assignee: ENGINEERING AND TECHONLOGY CENTER FOR LABORATORY ANIMALS OF SICHUAN AGRICULTURAL UNIVERSITY
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2031-02-28
Also published as: CN102174087A

Abstract

本发明公开了一种用于检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达蛋白及制备方法，该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表定义；是SEQID NO：1核苷酸序列的原核表达产物。制备方法包括：(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；(4)将UL55基因定向亚克隆至pET32a原核表达载体；(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；(6)UL55基因表达蛋白的纯化；(7)重组UL55蛋白的复性和检测。本产品可以作为检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA和Western Blot方法的检测抗原，也可以作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。

Description

检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及动物医学领域，涉及一种基因工程制品和其制备方法。具体地说是一种应用基因工程技术制备检测鸭瘟抗体的DPV-UL55基因重组原核表达检测抗原蛋白及其制备方法。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病。鸭瘟自上世纪20年代首先在荷兰被发现以来，已有80多年的历史了。该病在世界各养鸭地区都有分布，给世界各国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失。其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。

临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法大多是基于DPV全病毒作为抗原的检测方法。但其存在以下不足：一是在操作过程中不可避免造成散毒；二是由于DPV全病毒作为诊断抗原其制备的复杂性以及纯度不够理想使其不易推广。阻碍了以全病毒作为诊断抗原监测DPV抗体的大规模应用。利用原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可以保持必要的抗原性，而且其制备和纯化过程相对简单，能够用于病毒感染抗体的检测。因此研究和应用DPV UL55基因原核表达产物对于DPV预防和控制具有重要的理论和临床意义。

发明内容

本发明提供一种DPV UL55基因原核表达蛋白及其制备方法。其目的在于提供一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低，制备方法简单易于推广的检测鸭瘟病毒抗体的原核表达检测抗原及其制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白，该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表定义；是SEQ ID NO：1核苷酸序列的原核表达产物。

一种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；

(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；

(4)将UL55基因定向亚克隆至pET32a原核表达载体；

(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；

将重组表达质粒pET32a-UL55转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达；

(6)UL55基因表达蛋白的纯化；

(7)重组UL55蛋白的复性和检测。

所述的制备方法，步骤(6)具体做法为：

①待纯化样的制备

离心收集表达菌液：收集诱导表达的菌液离心取沉淀，将菌体沉淀用20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮，直接进行包涵体洗涤法纯化重组ULL55蛋白的或-20℃保存备用。

②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化

取出离心收集并用20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮的表达菌(-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化)，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min离心10min。将沉淀用20ml洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+1％Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4℃10000r/min离心10min后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8M尿素+50mM Tris-HCl+50mMNaCl+10％甘油)溶解沉淀，4℃保存备用。

所述的制备方法，步骤(7)具体做法为：将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0+0.15M NaCl+1mM EDTA+1mMGSSG+10mM GSSH)中，使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0.1～1mg/ml的范围内。4℃复性24～48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4℃透析(透析缓冲液：50mM Tris-HCl pH 8.0+50mM NaCl+0.5mMEDTA+10％甘油+1％甘氨酸)24～48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20μl进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。

本发明制备的DPV UL55重组原核表达检测抗原，是利用基因工程技术制备的基因工程制品。该产品的表达形式是一种融合蛋白。表达的融合蛋白的分子量为40KDa。将该产品的获得设计为融合表达主要鉴于便于融合表达蛋白的纯化和免疫原性的提高。该融合蛋白在表达时，大部分以非可溶性的包涵体形式表达，在纯化之前对包涵体采用了较为温和的包涵体裂解方式，因此包涵体蛋白裂解后又经复性处理后，经Western blot鉴定后表明其具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。经裂解的包涵体蛋白经12个月仍保持良好的均质胶体状态，无析出和沉淀现象，表明状态稳定。

采用本发明方法生产的产品可用于：

(1)可作为检测鸭瘟病毒抗体的Dot-ELISA和间接ELISA等方法的检测抗原。

(2)可作为预防鸭瘟病毒感染的基因工程亚单位疫苗。

本产品的优点体现在：

(1)由于所制备的检测抗原是DPV UL55基因的原核表达重组蛋白，并非全病毒，因此应用此产品作为检测抗原无散毒危险。

(2)所制备的产品作为ELISA抗原检测DPV抗体具有检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应的特点。

(3)制备工艺简单、产品性能稳定，成本低，产品附加值高，适合工厂化生产，易于推广，市场应用前景广阔。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，凡是涉及蛋白表达的均同时提供原始彩照和黑白照。图中涉及标记及含义如下：

图1-A为DPV UL55基因的PCR扩增：M指Maker III相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为799bp)；

图1-B为重组质粒pMD18-UL55的双酶切鉴定：M1指相对分子质量标准III，M2为DL2000相对分子质量标准；1指重组质粒pMD18-UL55用BamH I和Xho I双酶切得到的两个片段：2指UL55 PCR扩增产物(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp)；

图1-C为重组表达载体pET32a-UL55的单酶切和双酶切鉴定：M1为DL2000相对分子质量标准；M2指相对分子质量标准DL15000；1是UL55基因的PCR产物；2指重组表达载体pET32a-UL55用BamH I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为799bp)；3指重组表达载体pET32a-UL55用BamH I单酶切后得到的线性质粒。

图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准；1为以BL21为表达宿主的pET32a空载加IPTG诱导；2、3分别为未加诱导剂的UL55表达产物的上清和包涵体；4、5分别为IPTG诱导所产生的上清和包涵体(箭头所示的蛋白质分子量大小约为40KD)；

图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-6的IPTG浓度分别为1.0、0.8、、0.6、0.4、0.2、和0.1mmol/L；

图2-C为不同温度诱导pET32a-UL55表达结果：1-3的温度分别为37、30和25℃；

图2-D为不同时间诱导pET32a-UL55表达结果：1-5的诱导时间分别为4、5、6、7和8h。

图3为重组UL55蛋白纯化效果和免疫原性的检测：A，SDS-PAGE分析：M为蛋白标准(KD)；1为包涵体洗涤法纯化后透析复性的重组UL55蛋白；2为5次洗涤后的重组UL55包涵体蛋白；B，Western blotting分析：箭头所指是以兔抗DPV抗体为一抗检测复性的重组UL55蛋白(约为20KD)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达检测抗原及制备方法

1、材料方法

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.1菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET32a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.2试验鸭胚和血清

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；兔抗DPV抗体，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.3主要试剂

琼脂糖、2×傻瓜PCR Mixture、DNA连接酶Mixture、限制性内切酶BamH I和XhoI、UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPureTM DNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad公司；其它试剂均为分析纯，购自上海生工生物技术有限公司。

2实验方法

2.1 DPV UL55基因的克隆

2.1.1引物设计

利用Primer Premier5.0软件，参考UL55基因序列(GenBank登录号：EU071034)，由宝生物生物技术有限公司合成。引物序列：

F：5’-GGATCCATGGCCGACGCGAAGGCGGT-3’(划线部分为BamH I位点)；

R：5’-CTCGAGGCTTGGGTCTTTACTTTTTGCGCGGAAC-3(划线部分为Xho I位点)。

合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

2.1.2DPV基因组DNA的提取

2.1.2.1DEF的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用5％碘酒和75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2.5％的胰蛋白酶)150μl/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

2.1.2.2 DPV增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2～3mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附120min后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

2.1.2.3 DNA提取方法：直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60％～70％的DEF(100mL细胞瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μl的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10min；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μl的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚/氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60min；(6)13000r/min离心20min，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μl RNA酶，37℃作用30min，-20℃保存备用。

2.1.3PCR扩增DPV UL55基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性10min；94℃变性40s，66.2℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取4μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，设Maker III和空白对照，观察扩增片段的长度。

2.1.4UL55基因的pMD18-T克隆、鉴定与测序

在优化好的PCR条件下用保真PCR Mixture扩增UL55基因，产物按大连宝生物公司的T克隆试剂盒说明书进行T克隆并送大连宝生物公司测序确认。

将T克隆菌种接种于5ml的LB液体培养基(含Amp 50μg/ml)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日提取重组质粒，提取方法按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，抽提的重组质粒命名为pMD18-UL55。然后分别以BamH I/Xho I双酶切消化与BamH I单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。酶切体系如下：

2.2原核表达质粒pET32a-UL55的构建、诱导表达与表达条件优化

2.2.1原核表达质粒pET32a-UL55的构建与鉴定

2.2.1.1目的片段的酶切与连接：限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切pMD18-UL55质粒和原核表达载体pET32a(+)，酶切体系均为：

37℃水浴4h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

2.2.1.2重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5a感受态细胞。之后，取连接液10μl加到含200μl感受态DH5a的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90sec，然后迅速冰浴2min；加入不含Amp的LB液体培养基800μl，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μl培养物涂布于含100μg/mLAmp的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，同时设立空载体转化组(空载体10μl+感受态DH5a 200μl)、无载体对照组(灭菌超纯水10μl+感受态DH5a 200μl)。

2.2.1.3重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5ml的LB液体培养基(含Amp 50μg/ml)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用Xho I单酶切、BamH I和Xho I双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下：

然后，以上述重组质粒为模板，利用方法2.1.1中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-UL55。

2.2.2重组表达质粒pET32a-UL55的诱导表达

2.2.2.1重组质粒pET32a-UL55的提取：挑取2.2.1.3已鉴定含阳性重组质粒pET32a-UL55的DH5a菌种划线接种于含Amp 50g/mL的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于5mL LB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16h，离心收集菌液，按UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

2.2.2.2重组质粒pET32a-UL55转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli BL(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET32a-UL55转化到表达宿主菌E.coli BL(DE3)中，方法同2.2.1.2。

2.2.2.3重组质粒pET32a-UL55的诱导表达：从上述LB固体培养基(含Amp50μg/mL)上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1∶50的比例接入5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，剧烈振荡培养至OD600＝0.4时，分别加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导3h后，收集1mL培养菌液，4℃13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入80μl超纯水和20μl 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

2.2.2.4重组质粒pET32a-UL55表达产物的可溶性分析：将诱导表达的100mL菌液和未诱导表达的100mL菌液，分别按以下步骤处理：4℃10000r/min离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃10000r/min离心10min，取上清备用；沉淀用10mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用10mL洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀，低温保存备用。分别取适量的上清和尿素溶液溶解的沉淀，向其中加入80μl超纯水和20μl5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。

2.2.3重组质粒pET32a-UL55诱导条件的优化

2.2.3.1诱导剂IPTG的浓度优化：按2.2.2.3方法，取含重组质粒pET32a-UL55的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中6只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L 37℃诱导培养4h后，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.2.3.2温度条件优化：按上述方法，取含重组质粒pET32a-UL55的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导培养4h，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.2.3.3诱导时间优化：取含重组质粒pET32a-UL55的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)上，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)上，继续培养至OD600值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养，分别于诱导后4、5、6、7、8h，吸取1mL培养液，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3重组UL55蛋白的大量制备、纯化与复性

2.3.1菌体的大量培养

具体步骤为：(1)将含pET32a-UL55质粒的表达菌E.coli BL21(DE3)接种于200mlLB液体培养基(含50μg/ml Amp)中，37℃培养16h，作为种子菌；(2)向已灭菌的LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中加入种子菌(按5％v/v的比例加)；(3)在180r/min，37℃，pH 7.0的条件下培养，待培养至菌液OD₆₀₀＝0.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，37℃诱导培养4h；(4)收集培养好的菌液(约5L)，8000r/min离心10min后收集菌体沉淀，用适量Tris-HCl(20mmol/L，pH 8.0)重悬后，加入溶菌酶使其终浓度为1mg/ml，-20℃保存备用。

2.3.2重组UL55蛋白的包涵体洗涤法大量纯化

取出-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化后，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min离心10min。将沉淀用20ml洗液(10mmol/LPBS+2mol/L尿素+1％Triton X-100+20mM Tris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4℃10000r/min离心10min后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(10mmol/LPBS+8M尿素+50mM Tris-HCl+50mM NaCl+10％甘油)溶解沉淀，4℃保存备用。

2.3.3重组UL55蛋白的复性和检测

将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HClpH 8.0+0.15M NaCl+1mM EDTA+1mM GSSG+10mM GSSH)中，使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0.1～1mg/ml的范围内。4℃复性24～48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4℃透析(透析缓冲液：50mM Tris-HCl pH 8.0+50mM NaCl+0.5mM EDTA+10％甘油+1％甘氨酸)24～48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20μl进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。

再重复大量表达两次并分别纯化UL55重组蛋白，共得到3批不同表达和纯化的UL55重组蛋白。

3实验结果

3.1 DPV UL55基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

3.1.1UL55基因的PCR扩增结果

以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对UL55基因进行PCR扩增，其产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约799bp的特异性DNA条带，而以正常DEF基因组DNA为模板进行PCR扩增，无特异性条带，这与预期结果一致(图1-A)。

3.1.2UL55基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-UL55。对pMD18-UL55进行PCR、酶切(图1-B)和测序鉴定，结果表明，T克隆获得的UL55基因序列同已知的DPV UL55基因序列完全一致。

3.2原核表达质粒pET32a-UL55的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET32a-UL55的构建与酶切鉴定

以BamH I和Xho I双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET-32a(+)表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET32a-UL55(理论大小约为6169bp)，经BamH I和Xho I双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370bp和799bp(见图1-C)，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建。

3.2.2重组质粒pET32a-UL55的诱导表达

3.2.2.1重组质粒pET32a-UL55的诱导表达：将重组质粒pET32a-UL55转化表达菌株BL21(DE3)在含Amp的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET32a-UL55的表达宿主菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达、未用IPTG诱导、空载体pET-32a(+)转化菌株诱导表达，结果表明：空载体pET-32a(+)转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋白条带；重组表达质粒pET32a-UL55表达的重组UL55蛋白在40KD处(图2-A)。

3.2.2.2重组质粒pET32a-UL55表达产物的可溶性分析：诱导表达的100mL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示：表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中大量以不溶的包涵体形式存在。

3.2.3重组质粒pET32a-UL55诱导表达条件的优化

3.2.3.1 IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L诱导培养4h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量没有明显差别(图2-B)。但是比较而言，IPTG浓度为0.2mmol/L时，蛋白表达量略高。因此，可选择0.2mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

3.2.3.2诱导温度条件的优化：37℃培养培养至OD600值约0.4时，取3只灭菌试管，分装5mL/管，分别加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导培养4h，结果：温度在25℃时，诱导蛋白量较少，37℃时最高(图2-C)，说明随着温度升高，蛋白诱导量逐渐增加。因此，选择温度37℃为最佳诱导温度。

3.2.3.3诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.2mmol/L，37℃条件下，采用4～8h不同诱导时间进行诱导表达，结果随着时间的增加诱导产生的重组蛋白表量降低。诱导5～8h的重组蛋白表达量均显著低于4h诱导组；而诱导6～8h，其重组蛋白表达量低于5h且彼此间相比无明显变化(图2-D)。因此，选择4h作为最佳诱导时间。

3.3重组UL55蛋白的纯化结果

通过大量扩大培养，收集到了大量含有重组UL55蛋白的菌体沉淀，经溶菌酶裂解、超声破碎、洗涤和溶解包涵体、变性蛋白透析复性等过程获得了大量纯化的重组UL55蛋白，通过SDS-PAGE分析显示纯化的重组UL55蛋白具有较高的纯度(图3-A)，Western blotting分析显示该重组UL55蛋白能与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应(图3-B)，表明该重组蛋白具有较高的免疫原性，可作为临床上检测鸭瘟抗体的检测抗原。

实施例2、UL55-ELISA法检测DPV抗体方法的建立和应用

上述实施例获得的重组UL55蛋白，抗DPV鸭血清(为弱毒疫苗免疫后14d的免疫鸭血清，中和效价为1∶8)，抗DHV(鸭肝炎病毒)、RA(鸭里默氏杆菌)、Salmonella(沙门氏菌)、鸭肿头出血症病毒、流感病毒和E.coli(大肠杆菌)鸭血清及非免疫鸭阴性血清，由四川农业大学禽病研究中心提供；羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺(TMB)均购自美国KPL公司；牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司产品。

1 UL55-ELISA法检测DPV抗体方法的建立

1.1重组UL55蛋白包被浓度和血清稀释度的确定

采用方阵方法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度，用包被液对浓度为4mg/mL的复性后的重组UL55蛋白进行系列稀释(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320)，包被酶标反应板，每孔包被100μl，每个滴度平行包被两列，将鸭血清(抗DPV阳性血清或非免疫鸭阴性血清)按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320的稀释度进行系列稀释，羊抗鸭IgG-HRP作1∶2000稀释，用间接ELISA方法测定，选择阳性血清的OD_450nm值接近1.0，阴性血清的OD_450nm值较小，P/N值最大的UL55蛋白和鸭血清的稀释度为此ELISA的抗原抗体反应的最适工作浓度。

重组UL55蛋白抗原用包被液作系列稀释后，再加1∶10-1∶320稀释的阳性血清或阴性血清；另加1∶2000稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，加底物显色液，用全自动酶标仪测定OD_450nm值。纯化抗原包被浓度在0.4mg/ml～0.0125mg/ml之间时，阳性血清的稀释度为1∶10-1∶320时，不同稀释度的抗体的OD_450nm值见表1。当P/N值最大为9.667的时候，由方阵滴定所得的最佳抗原包被浓度为2.0μg/100μl时，阳性血清的稀释度为1∶160。各抗原抗体浓度对应的P/N值见表2。

表1方阵滴定的OD_450nm结果

表2 DPV-UL55表达蛋白最佳包被浓度与血清浓度(P/N值)的确定

1.2酶标二抗最佳稀释度的确定

把纯化的重组UL55蛋白抗原按0.2mg/ml的浓度包被于ELISA反应板，每孔100μl，再加1∶160稀释的阳性血清或阴性血清。之后将酶标抗体做1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000系列稀释后进行捕获ELISA测定，同时检测正常细胞培养物替代鸭瘟病毒作阴性对照的OD_450nm值，选择P/N值最大时酶标抗体浓度作为最适工作浓度。本实施例中的稀释均按照体积比进行稀释。

酶标板用包被浓度为0.2mg/ml的重组UL55蛋白抗原包被，血清做1∶160稀释，酶标抗体做系列稀释，进行间接ELISA检测，结果为各待检血清和酶标二抗浓度下的P/N值均大大地大于2.1。当酶标二抗的稀释度在1∶2000，检测血清浓度1∶160时，P/N值最大；因此选择的最佳二抗稀释度为1∶2000。

1.3UL55-ELISA阴阳性临界值的确定及UL55-ELISA方法的检测程序

取非免疫鸭阴性血清30份，每个样本平行包被1次。对重组UL55蛋白包被浓度、待检血清和酶标二抗最佳稀释度进行间接ELISA测定，以确定鸭血清在无DPV感染时其吸收值范围。同时以BSA/PBS溶液作空白对照。将30份血清样品的OD_450nm值的平均值(X)和3倍标准方差(SD)之和作为阴性血清的上限，即待检血清样品的OD_450nm值＞X+3SD时，判断为阳性；否则为阴性。

通过对30份DPV阴性血清进行检测(表3)，结果表明，健康鸭血清OD值最高为0.347，X值为0.148，SD值为0.061，临界值(X+3SD)为0.330。即待测样品的OD值大于0.330为阳性，小于或等于0.330则为阴性。

表3 20份DPV阴性血清检测结果

1.4 UL55-ELISA方法的检测程序

根据上述优化结果，间接ELISA方法的检测程序如下：(1)固相抗原的制备：将重组UL55蛋白以0.2mg/ml浓度包被于酶标板中，100μl/孔，置4℃湿盒孵育过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；加入100μl/孔封闭液，37℃湿盒封闭1h，洗板机洗涤1次，5min/次，拍干；(2)一抗结合：将待检血清按1∶160的体积稀释度稀释后加入酶标板，100μl/，37℃湿盒孵育1h，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(3)二抗结合：以酶标二抗稀释液将酶标二抗(羊抗鸭IgG-HRP)以1∶2000的体积稀释度稀释后加入，100μl/孔，37℃反应45min，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(4)显色：加入TMB底物(色原底物四甲基联苯胺)100μl/孔，25℃避光显色30min后，加入50μl/孔2mol/L硫酸终止反应；(5)检测并判断：用酶标仪测OD_450nm值，当酶标仪测OD_450nm值，OD_450nm值大于0.330为阳性，小于或等于0.330则为阴性。同时以BSA/PBS溶液作平行空白对照。

2有益效果评价

2.1敏感性实验

将重组UL55蛋白按最佳包被浓度进行包被，将DPV弱毒疫苗免疫后14d、中和效价为1∶8的阳性血清做1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600，1∶51200共9个体积稀释度，其余条件按本实施例条件进行UL55-ELISA试验，结果如表4所示。当阳性血清稀释到1∶6400时，通过肉眼观察颜色变化难以判断阴性、阳性结果，但通过酶标仪仍然可以检出，按1∶12800稀释的阳性血清检测结果低于临界值0.330，表明此方法能够检出1∶6400倍稀释的弱毒疫苗免疫后14d的阳性血清，具有较强的敏感性。

表4敏感性试验检测结果

P为阳性，N为阴性；

2.2特异性试验结果

采用确立的ELISA条件，以纯化的UL55蛋白包被ELISA酶标板，用DPV阳性血清、DHV阳性血清、RA阳性血清、E.coli阳性血清、Salmonella阳性血清、肿头性出血症阳性血清、流感阳性血清各两份进行UL55-ELISA特异性试验，结果如表5所示。根据临界值判定标准，2份DPV阳性血清OD_450nm为0.925、0.896，均远大于0.330，判为阳性，其余各病毒病或细菌病，鸭血清OD_450nm值均小于临界值，则均为阴性，表明建立的检测DPV抗体的UL55-ELISA法具有很好的特异性。

表5 特异性试验结果

P为阳性，N为阴性；

2.3阻断性试验

将DPV阳性血清按最佳稀释度稀释，加入等量最佳稀释度的表达蛋白UL55，37℃作用1h后，作为一抗血清按确立的ELISA条件进行间接ELISA，用DPV阳性血清同时设对照组，比较结果。计算(N-P)/N＝(阻断前OD450nm值-阻断后OD450nm值)/阻断前OD450nm值，若此值大于0.5，则判为阻断阳性，否则为阴性。结果表明，鸭瘟病毒UL55蛋白抗原阻断的阳性血清OD_450nm值比未被阻断的对照阳性血清明显低，阻断后三份阳性OD450nm值平均分别为0.111、0.120、0.100，对照未阻断阳性血清的0D450nm值平均分别为0.708、0.675、0.637。此时表达蛋白的(N-P)/N值也分别为0.84、0.82、0.84，均大于0.5，判为阻断阳性，说明表达蛋白UL24抗原可以阻断阳性血清，结果见表6。

表6阻断性试验结果

3、讨论

在ELISA方法检测过程中，抗原包被浓度对试验结果影响较大，若抗原包被浓度高，由于抗原蛋白分子之间作用力较大而造成蛋白分子的多层化(stacking efect)，容易被洗涤，非特异性增加，若浓度太低，酶标板表面可能留下未吸附抗原但完全封闭的活性表面，非特异性也会增加，因此必须对包被蛋白抗原浓度的进行筛选。此外，抗体的纯度直接关系到ELISA试验的特异性和敏感性，纯度不高的抗体常常会有超量的与特异性抗原结合的宿主细胞高分子化合物，可与抗原竞争有限的载体表面位置而减少有效的吸附率，因此高纯度的抗体蛋白可以提高反应特异性，但间接ELISA方法通常检测血清中的抗体，血清成分复杂，生产中通常不逐一对被检血清进行纯化，只有通过摸索适当的血清稀释倍数，才能减少非特异结合。本实验方阵法确定血清(一抗)的最佳稀释倍数，从结果来看，虽血清稀释倍数从1∶10至1∶320，但血清浓度降低，OD_450nm值变小，根据OD_450nm值接近1.0，P/N最大来判定抗原抗体的最佳稀释度。因此确定的最佳抗原包被浓度为0.2mg/ml，血清的稀释倍数为1∶160。

酶标二抗浓度的高低对试验结果也有较大的影响，浓度太高，非特异性结合的机会增多，可能出现假阳性，浓度太低，没有有效结合，则可能出现假阴性等现象。本实验在优化好的ELISA条件下进行间接ELISA来确定酶标二抗的最佳稀释倍数。根据OD_450nm值接近1.0，P/N最大来判定最佳稀释度，确定出酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶2000。封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。最常用的封闭剂是0.5％牛血清白蛋白，也有用脱脂奶粉明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。本实施例中选用BSA作封闭液，其成分单一，封闭效果较好。

在ELISA判定标准中，常用两种方法，一种是用测定样本的原始OD_450nm值和标准方差来确定临界值。另一种是计算待测样品相对于阴性对照的比值，通过测定大量样本效价的频次分布来确定临界值和可疑区间。本研究在确定阴阳性判定标准时，采用了第一种判定标准。根据大量的阴性样品的OD_450nm值，采用统计学方法确定阴阳临界值。依据的原理是样本的OD_450nm值＞阴性样本OD_450nm值的平均值(X)+3SD时，可以在99.9％的水平上判为阳性，根据统计学原则，大量实验证实了该判断标准是可靠的。此外，Alonso等报道利用大肠杆菌表达的蛋白作为包被抗原检测田间猪血清时，可能存在宿主蛋白干扰的问题，即猪血清中存在的大肠杆菌抗体有可能与表达蛋白中残存的宿主蛋白发生非特异性反应。因此，在建立UL55-ELISA方法的过程中，选择了鸭源的E.coli阳性血清做特异性实验，结果表明该UL55-ELISA方法与E.coli血清无交叉反应性，特异性好。同时又用DPV阳性血清、DHV阳性血清、RA阳性血清、E.coli阳性血清、Salmonella阳性血清、肿头性出血症阳性血清、流感阳性血清做特异性试验，结果都证实了建立的UL55-ELISA具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景，也为进一步组装成试剂盒奠定了基础。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；

(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(4)将UL55基因定向亚克隆至pET32a原核表达载体；

(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；

(6)UL55基因表达蛋白的纯化；

(7)重组UL55蛋白的复性和检测；

步骤(6)具体做法为：

①待纯化样的制备

离心收集表达菌液：收集诱导表达的菌液离心取沉淀，将菌体沉淀用20mMpH8.0的Tris-HC1悬浮，直接进行包涵体洗涤法纯化重组ULL55蛋白或-20℃保存备用；

②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化

取出离心收集并用20mM pH8.0的Tris-HC1悬浮的表达菌，冰浴下超声波间歇破碎菌体，200w，30sec/次，5～10次；4℃10000r/min离心10min；将沉淀用20ml洗液悬浮，洗液为：10mmol/L PBS+2mol/L尿素+1％Triton X-100+20mM Tris-HC1+2mM EDTA，4℃10000r/min离心10min后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液溶解沉淀，4℃保存备用；尿素溶液为：10mmol/L PBS+8M尿素+50mM Tris-HC1+50mM NaC1+10％甘油；

步骤(7)具体做法为：将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液中，复性缓冲液为：50mM Tris-HC1pH8.0+0.15M NaC1+1mM EDTA+1mM GSSG+10mM GSH，使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0.1～1mg/ml的范围内；4℃复性24～48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4℃透析24～48h，透析缓冲液：50mM Tris-HC1pH8.0+50mM NaC1+0.5mM EDTA+10％甘油+1％甘氨酸；透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20μl进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测，其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。