CN101921800A

CN101921800A - 启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN101921800A
Application number: CN201010195054XA
Authority: CN
Inventors: 尚广东; 朱宇鹏; 赵碧玉; 董慧青
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2010-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-06-08
Also published as: CN101921800B

Abstract

本发明涉及一种将来源自大肠杆菌的启动因子(trigger factor)作为融合标签来使用的大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128。该载体是通过将编码六个组氨酸的核苷酸序列、启动因子基因、编码烟草蚀纹病毒蛋白酶的切割位点的碱基序列以及一段用来克隆使用的填充片段克隆至大肠杆菌表达载体pET30a而得到。通过基因克隆手段，将目的基因克隆在启动因子基因下游后，两者经诱导而表达融合蛋白，启动因子行使伴侣蛋白的功能，促使目的蛋白正确的折叠而使之呈现可溶性的状态。本发明所述的载体可广泛运用与目的基因的表达和提高目的蛋白的可溶性，可在遗传学、分子生物学、生物化学等研究及工业化生产目的蛋白方面有着广泛应用。

Description

启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一个启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体。

背景技术

以大肠杆菌作为宿主菌来表达目的基因而大量获得目的蛋白是现代生物技术的重要组成部分。所得到的蛋白可以用来进行功能研究、作为催化合成具有重要价值的产物的酶，也可以作为蛋白质药物而直接用于疾病的治疗。

依据蛋白质三维结构的正确折叠与否，所表达的蛋白可分为正确折叠的可溶性蛋白组份以及错误折叠的不可溶性蛋白(包涵体)组份，它们分别位于经超声波破碎再离心后的上清和沉淀中。可溶性蛋白组份由于正确折叠而保持生物学活性，是人们所需要的蛋白形式。而包涵体是细胞内凝集、无活性的固体蛋白颗粒。为使包涵体形式的蛋白呈现水溶性和生物学活性，需要进行变性和复性的处理。变性是指将包涵体组份经过变性剂如6M的盐酸胍或者8M尿素的处理，复性是指将变性蛋白通过加入共溶剂如PEG 6,000～20,000、去污剂及表面活性剂如Trition X-100或氧化-还原剂如还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽等形式的处理使之形成正确折叠的三维结构。这种变性和复性的过程不仅耗时，烦琐，而且造成蛋白产量的损失，更重要的是蛋白的活性会急剧减少甚至完全丧失。

鉴于蛋白可溶性性质的重要性，增加目的蛋白表达为可溶性蛋白组份的比例成为分子生物学和生物化学研究中的重要工作。改变诱导表达的条件如温度、诱导剂(常见的是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，英文缩写：IPTG)等等常常不能奏效。加入融合标签和伴侣蛋白是两种有效的方式，前者是指将目的蛋白与融合标签融合为融合蛋白，常用的融合标签有6xHis(6个组氨酸)，MBP(麦芽糖结合蛋白)，NusA(氮源利用物质A)等。由于融合标签有着很好的表达可溶性蛋白组份的性质，将目的基因与之融合后，可促进目的蛋白表达成为可溶性组份。第二种方法是指利用伴侣蛋白来促进目的蛋白的正确折叠。伴侣蛋白的主要类型有GroES-EL，DnaK及启动因子(trigger factor)等。大肠杆菌(Escherichia coli)的启动因子为48.2KD的蛋白，研究证明启动因子能有效地促进靶蛋白正确折叠而增加其可溶性，其作用机理是：1.在新生肽链的合成和起始折叠过程中以其长的疏水区域保护新生肽链，2.加速肽脯氨酰顺反异构化。

通常是将伴侣蛋白基因和目的蛋白基因克隆在不同的质粒上，二个质粒在细胞内共存，并经不同的诱导剂诱导所克隆的基因表达。已报道的将启动因子作为伴侣蛋白来增加目的蛋白可溶性的为日本Takara公司的双质粒系统，其中一个质粒表达启动因子，如pTf16经L-阿拉伯糖诱导后表达启动因子，pG-Tf2经热失活的氯四环素诱导后表达启动因子和GroES-GroEL，另外一个质粒经IPTG受诱导后表达目的蛋白，目的蛋白经启动因子的作用而增加可溶性。两个质粒的因抗性不同和复制子不同而可以共存于一个细胞中(文献：Nishihara K，Kanemori M，Yanagi H et al.Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinantproteins in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 2000；66(3)：884-9)。这种双质粒系统的缺点在于：1.需要将两个质粒分别转化至蛋白表达的宿主菌，这样增加了操作步骤。2.由于目的基因和伴侣蛋白基因是在不同的质粒上，并且由不同的诱导剂进行诱导表达，因此伴侣蛋白和目的蛋白的摩尔数难以保持一致，导致伴侣蛋白对目的蛋白的作用难以完全。3.如果伴侣蛋白和目的蛋白大小相近，则难以分辨，也导致对目的蛋白的纯化困难。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明构建了启动因子作为融合标签的融合表达载体，在此载体中，启动因子行使融合标签和伴侣蛋白的双重作用。NcoI和BamHI可作为目的基因5′端的克隆位点，HindIII、NotI和XhoI可作为目的基因3′端的克隆位点。填充片段的加入是为了克隆方便，目的基因取代填充片段后克隆至pLS1128，并与启动因子基因融合。填充片段中的NcoI位点不影响目的基因的克隆，如以NcoI和HindIII双酶切pLS1128，则将填充片段酶切为NcoI-NcoI 390bp和NcoI-HindIII 955bp的两个片段，而载体两端的酶切位点为NcoI和HindIII，这样目的基因可以通过NcoI和HindIII位点克隆至载体。这种克隆方式较酶切出单一片断的克隆方式更加有效。如果目的基因中含有NcoI位点，那么可以在其5′端设计AflIII或BsaI的酶切位点。AflIII的作用于5′-A↓CRYTG-3′位点，其中R为A或G碱基，Y为C或T碱基，↓表示酶切的位置；BsaI作用于5′-GGTCTC(N)1↓-3′位点，其中N指AGCT任一碱基。我们可以将AflIII的作用位点设计为5′-A↓CATGA-3′，将BsaI的作用位点设计为5′-GGTCTCG↓CATGAGC-3′，这样，AflIII或BsaI酶切的目的片段就可以和NcoI酶切的载体相连。载体3′端的XhoI的酶切序列为5′-C↓TCGAG-3′，SaII的的酶切序列为5′-G↓TCGAC-3′，可见XhoI和SaII为同尾酶，即目的基因的3′端也可以设计为SaII位点进行基因克隆。由此可见，本专利的启动因子融合型大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128有着良好的克隆选择，几乎任何基因都可以进行克隆和表达。

本发明所说的启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体，是pLS1128，它具有编码六个组氨酸的核苷酸序列、来源于大肠杆菌的启动因子基因、烟草蚀纹病毒蛋白酶的切割位点以及一段用来克隆使用的填充片段，其结构如图1所示。

本发明还公开了构建上述启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128的方法，是通过将编码六个组氨酸的核苷酸序列、来源于大肠杆菌的启动因子基因、编码烟草蚀纹病毒蛋白酶的切割位点的碱基序列以及一段用来克隆使用的填充片段克隆至大肠杆菌表达载体pET30a而得到。

所说的填充片段的具体序列没有特别要求，原则上应不含常用的酶切位点。我们选择的填充片段，大小在1.5kb，容易分离；中间有个NcoI位点以利克隆，此外没有其他常用的酶切为点。

本发明还公开了用权利要求1所述表达载体表达融合蛋白的方法，是目的基因通过取代填充片段而克隆至pLS1128与来源于大肠杆菌的启动因子基因融合，经诱导后表达融合蛋白。

上述表达载体中，所编码的六个组氨酸可用于亲和层析以分离融合蛋白或剪切后的蛋白。

上述载体中，启动因子发挥伴侣蛋白的功能可促使目的蛋白正确的折叠而使之呈现可溶性的状态。

上述载体中，所说的烟草蚀纹病毒蛋白酶可作用于启动因子与目的蛋白之间的特异性酶切位点，将启动因子与目的蛋白分开。

与利用启动因子来增加蛋白可溶性的双质粒系统相比较，本专利的启动因子融合型大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128的优点在于：

1、填充片段两侧的克隆位点利于目的基因的克隆。

2、单个诱导剂(IPTG)进行诱导，更加简便。

3、目的基因和启动因子基因协同表达，保证了剂量效应。

4、避免了共表达蛋白的干扰，如pTf16表达48.2KD的启动因子，pG-Tf2表达48.2KD的启动因子和57.3KD的GroES-GroEL。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率的制约，5KD之内的蛋白难以分辨。如果目的蛋白的大小与共表达蛋白难以分辨，则影响目的蛋白的确定以及后续的蛋白纯化工作。

5、在启动因子和目的基因之间设计烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virusprotease，TEV蛋白酶)的作用位点，这样可通过TEV蛋白酶将目的蛋白从融合蛋白中切出。高活性的TEV蛋白酶可以在实验室自制，这就大大地降低了蛋白表达和纯化的成本。

表达来源于鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120的all3695基因和表达来源于红小梨形菌Rhodopirellula baltica SH1的RB3348基因(两个基因均编码为N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶)的优选实施例表明，pLS1128有着很好的使的目的基因主要表现为可溶性蛋白的能力。这两个目的基因通过改变表达条件、以别的融合表达或伴侣蛋白辅助表达等形式均不能得到高可溶性比例的蛋白。高度可溶性表达为后续的蛋白分离、酶学性质研究以及催化应用等奠定了坚实的基础。

附图说明

图1是8137个碱基对的启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128的质粒图谱。其中：

219-235是T7启动子序列；

310-327是编码6个组氨酸位点的核苷酸序列；

328-1623是启动因子基因(trigger factor，tf)的开放阅读框序列；

624-1644是TEV蛋白酶的作用位点序列，以S表示；

1657-3190是填充片段序列，在基因克隆过程中为目的基因所取代；

3212-3229是6个组氨酸位点的核苷酸序列；

3282-3300是T7终止子序列；

3380-3835是噬菌体侵染后而得到单链DNA的功能区域f1序列；

3928-4743是卡那霉素抗性基因开放阅读框kan的序列；

4865-5453是质粒复制子区域ori的序列；

6883-7965是编码调控蛋白基因的开放阅读框lacI的序列；

SphI，ClaI，XbaI等为限制性酶切位点，括号内的数字表示限制性酶切位点在质粒上的位置。

图2是all3695基因表达以及all3695基因与启动因子基因融合表达的SDS-PAGE图谱。其中：

1.蛋白质分子量标准，大小在左侧显示；

2.all3695基因表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1130诱导表达的总蛋白；

3.all3695基因表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1130诱导表达的可溶性蛋白；

4.all3695基因表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1130诱导表达的不溶性蛋白；

5.all3695基因与启动因子基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1132诱导表达的总蛋白；

6.all3695基因与启动因子基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1132诱导表达的可溶性蛋白；

7.all3695基因与启动因子基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1132诱导表达的不溶性蛋白。

图3是RB3348基因表达以及RB3348基因与启动因子基因融合表达的SDS-PAGE图谱。其中：

1.蛋白质分子量标准，大小在左侧显示；

2.RB3348基因表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1131诱导表达的总蛋白；

3.RB3348基因表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1131诱导表达的可溶性蛋白；

4.RB3348基因表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1131诱导表达的不溶性蛋白；

5.RB3348基因与启动因子基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1133诱导表达的总蛋白；

6.RB3348基因与启动因子基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1133诱导表达的可溶性蛋白；

7.RB3348基因与启动因子基因融合表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1133诱导表达的不溶性蛋白。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1.E.coli MG155。大肠杆菌基因组测序菌株。基因型：F^-，LAM^-，rph^-。文献：Blattner FR，Plunkett G，3rd，Bloch CA et al.The complete genome sequence ofEscherichia coli K-12.Science 1997；277(5331)：1453-62.

2.E.coli DH10B。基因克隆宿主菌。基因型：F-mcrAΔ(mrr-sdRMS-crBC)80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ ara，leu)697 galU galKrpsL endA1nupG.。文献：Life Technologies，Inc.Focus(1990)12，19。购自美国Invitrogen公司。

3.E.coli BL21(DE3)pLys。蛋白表达宿主菌。基因型：B F^-dcm ompT hsdS(rB^-mB^-)galλ(DE3)[pLysS Cam^r]。购自美国Stratagen公司。

4.pBluescript KS(-)。文献：Alting-Mees，M.A.and Short，J.M.(1989)pBluescript II：gene mapping vectors.Nucleic Acids Res，17，9494。购自美国Novagen公司。

5.pET30a。大肠杆菌表达载体。购自美国Novagen公司。

实施例

实施例1.启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128的构建

1.E.coli DH10B的电转化感受态细胞的制备，DNA转化和重组克隆的筛选

自平板上接种新鲜划线培养的E.coli DH10B单菌落至2ml LB液体培养基中37℃振荡过夜，1ml转接至50ml LB液体培养基，振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4℃，5,000rpm离心5分钟，弃上清。以10％的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200μl的10％甘油中，每管50μl分装所制备的电转化感受态细胞。

将DNA加至50μl置于冰上的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，电击转化。电转化条件：1mm电转杯，200Ω，1800V，Bio-Rad公司Gene Pulser II电转化仪。电击后，加1ml LB液体培养基吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml eppendorf管中，37℃振荡培养60分钟后，取100μl转化液涂布于含相应抗生素的LB抗性平板上，37℃培养过夜。

将所得单菌落挑至含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期后，提取质粒，酶切鉴定和测序验证。序列正确的质粒即为重组克隆。

2.PCR(聚合酶链式反应)和目的DNA的回收

PCR扩增的体系为：50μl反应体系。

37.7μl dd H₂O；

5μl 10×PCR反应缓冲液；

4μl 25mM MgCl₂；

1μl 10mM dNTP；

0.5μl上游引物(终浓度0.5mM)；

0.5μl下游引物(终浓度0.5mM)；

1μl模板(质粒50ng，基因组DNA200ng)；

0.3μl Pfu聚合酶(5U/μl)。

PCR反应：首先在97℃变性处理5分钟，循环的条件为：97℃45秒，60℃1分钟，72℃1-2分钟(视目的产物大小而定)，共30个循环。最后在72℃延伸10分钟。使用仪器为Bio-rad公司的PTC-200型号的PCR仪。

反应结束后，以加入20μg/ml的溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物的胶回收：大连宝生物公司的凝胶回收试剂盒进行。切下所需片段凝胶至eppendorf管，加溶胶液于70℃融化。溶液加至回收柱，以500μl洗涤液洗涤二次，室温风干，加入适量TE，13,200rpm，离心2分钟，以新的eppendorf管收集。

PCR产物的沉淀回收：加1/10体积3M pH 5.2醋酸钠及2倍体积冰乙醇，混匀，-80℃冷冻分钟，13,200rpm离心10分钟，弃上清，加500μl 70％乙醇洗涤，13,200rpm离心5分钟，弃上清，室温至干，加适量体积的无菌水溶解。

3.启动因子作为融合标签的大肠杆菌表达载体的构建

以格尔德霉素基因组DNA(GenBank登录号AY179507)为模板，以GSF1和GSF2为引物PCR扩增出1.5kb的DNA片段(作为填充片段来使用，为AY179507序列的第50594-32533)，以BamHI-HindIII双酶切后与以BamHI-HindIII双酶切的pKS(-)于16℃连接，连接产物转化E.coli DH10B的感受态细胞，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上筛选重组克隆。质粒经酶切和测序验证正确后，命名为pSN101。

引物序列如下：

GSF1：5′-GGGGGATCCCGCCTCCTTCCCGGTCATGCG-3′，(SEQ ID NO.1)

GSF2：5′-GGGAAGCTTACCCCCGGCCAGGCCAACTAC-3′，(SEQ ID NO.2)

以E.coli MG1655基因组DNA作模板，以TGC1和TGC2为引物PCR扩增出1,293bp的启动因子基因。大肠杆菌基因组序列的GenBank登录号为U00096，启动因子的基因编号为b0436，在开放阅读框在基因组上的位置为454357-455655-455655，本专利申请中选取的序列为454357-455652，即不包含终止密码子TAA。PCR扩增产物以XbaI-BamHI双酶切，回收后与以XbaI-BamHI酶切的pKS(-)于16℃连接，连接产物转化E.coli DH10B的感受态细胞，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上筛选重组克隆。质粒经酶切和测序验证正确后，命名为pLS1127。

引物序列如下：

TGC1：5′-GGGTCTAGACATATGCACCATCATCATCATCACATGCAAGTTTCAGTTGAAACC-3′，(SEQ ID NO.3)

TGC2：5′-GGGGGATCCCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTCCGCCTGCTGGTTCATCAGCTC-3′，(SEQ ID NO.4)

将pLS1127以NdeI-BamHI酶切后，回收含启动因子基因的DNA片段；将pSN101以BamHI-HindIII酶切后，回收1.5kb的DNA片段，二者与以NdeI-HindIII酶切的pET30a相连，连接产物转化E.coli DH10B的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选重组克隆。质粒经酶切验证正确后，命名为pLS1128。pLS1128即为本专利中的启动因子作为融合标签的大肠杆菌表达载体。

实施例2.all3695基因与启动因子基因的融合表达

1.all3695基因表达菌株的构建

鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120基因组序列的GenBank登录号为NC_003272，all3695基因的开放阅读框的序列为4461641-4462807的反向互补序列。鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120的基因组DNA由日本Kazusa DNA Research Institute的Takakazu Kaneko教授惠赠，以之作模板，PCA1和PCA2为引物，扩增出1,167bp的all3695基因，PCR产物以BamHI-HindIII双酶切回收后与BamHI-HindIII双酶切的pET30a于16℃连接，连接产物转化E.coli DH10B的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选重组克隆。质粒经酶切、测序验证正确后，命名为pLS1130。将pLS1130转化E.coli BL21(DE3)plys菌株的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选得到all3695基因的表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1130。

引物序列如下：

PCA1：5′-GGGGGATCCATGGGGAAAAACTTACAAGCACTG-3′，(SEQ IDNO.5)

PCA2：5′-GGGAAGCTTTTAACTCAAGGCCTCGAATTGTTG-3′，(SEQ IDNO.6)

2.all3695基因与启动因子基因融合表达菌株的构建

将pLS1130以BamHI-HindIII酶切后，回收all3695基因片段，将pLS1128用BamHI-HindIII酶切后，回收6.6kb的载体片段，二者相连后，转化E.coliDH10B的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选重组克隆。质粒经酶切、测序验证正确后，命名为pLS1132。将pLS1130转化E.coliBL21(DE3)plys菌株的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选得到all3695基因与启动因子基因融合表达的菌株E.coliBL21(DE3)plys/pLS1132。

3.基因表达菌株的培养，蛋白的诱导表达和SDS-PAGE电泳

将蛋白表达菌株在含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取新鲜单菌落至3ml含30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，200μl转接到10ml相同培养基中，在37℃培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，加IPTG至终浓度为1mM，30℃诱导6h。

取1ml菌液，13,200rpm离心1分钟，用300μl裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)悬浮，在冰上超声处理(10秒×3次，10秒间隔)以裂解细胞。取50μl混悬液作为总蛋白，剩余溶液13,200rpm离心10分钟后，取上清液作为可溶性蛋白组份，沉淀以250μl裂解缓冲液悬浮后，作为不可溶性蛋白组份。将三种蛋白溶液分别与2×加样缓冲液等量混合后，100℃变性处理5分钟，各取10μl上样，进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，浓缩胶和分离胶的浓度分别为5％和12.5％。

4.all3695基因的表达以及all3695基因与启动因子基因的融合表达

分别将单独表达all3695基因的菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1130和融合表达all3695基因与启动因子基因的菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1132按上述方法进行培养和蛋白表达，通过SDS-PAGE来分析蛋白的表达和可溶性的情况。结果见图2。

以分析蛋白表达相对比例的BandScan软件分析表明，all3695基因单独表达时，所表达的50.6KD蛋白大部分以不可溶性的包涵体形式存在，其可溶性蛋白的表达量占总表达蛋白的比例为7.1％；而当all3695基因与启动因子基因融合表达时，表达出95.5KD融合蛋白，所表达的融合蛋白几乎均为可溶性蛋白，其可溶性蛋白的表达量占总表达蛋白的比例为37.2％。可见，与启动因子融合表达后，目的蛋白的可溶性比例得以大幅度地提高。

实施例3.RB3348基因与启动因子基因的融合表达

1.RB3348基因表达菌株的构建

RB3348基因的GenBank登录号为NP_865454，含RB3348基因的粘粒由德国Max-Planck-Institute的Michael Kube教授惠赠，以之作模板，RB1和RB2为引物，PCR扩增出1,176bp的RB3348基因，PCR产物以NcoI-HindIII双酶切回收后，与NcoI-HindIII双酶切的pET30a连接，连接转化E.coli DH10B的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选重组克隆。质粒经酶切验证正确后，命名为pLS1131。将pLS1131转化E.coli BL21(DE3)plys菌株的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选得到RB3348基因的表达菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1131。

引物序列如下：

RB1：5′-GGGCCATGGATCCTCAGCAACGTCAAAC-3′，(SEQ ID NO.7)

RB2：5′-GGGAAGCTTTCAGACGAGGTCTTTTTCCAGC-3′，(SEQ ID NO.8)

2.RB3348基因与启动因子基因融合表达菌株的构建

将pLS1131以NcoI-HindIII酶切后，回收RB3348基因片段，将pLS1128用NcoI-HindIII酶切后，回收6.6kb的载体片段，二者相连后，转化E.coli DH10B的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选重组克隆。质粒经酶切、测序验证正确后，命名为pLS1133。将pLS1133转化E.coli BL21(DE3)plys菌株的感受态细胞，在含30μg/ml卡那霉素的LB平板上，筛选得到RB3348基因与启动因子基因融合表达的菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1133。

3.RB3348基因的表达以及RB3348基因与启动因子基因的融合表达

分别将单独表达RB3348基因的菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1131和融合表达RB3348基因与启动因子基因的菌株E.coli BL21(DE3)plys/pLS1133按上述方法进行培养和蛋白表达，通过SDS-PAGE来分析蛋白的表达和可溶性的情况。结果见图2。

BandScan软件分析表明，RB3348基因单独表达时，所表达的50.9KD蛋白可溶性的比例极少，其可溶性蛋白的表达量占总表达蛋白的比例仅为4.4％，绝大部分为不可溶性的包涵体形式；而当RB3348基因与启动因子基因融合表达时，表达出96.1KD融合蛋白，所表达的融合蛋白几乎均为可溶性蛋白，其可溶性蛋白的表达量占总表达蛋白的比例为53.0％。可见，融合表达大幅度地提高了目的蛋白的可溶性表达比例。

SEQUENCE LISTING

<110>南京师范大学

<120>启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gggggatccc gcctccttcc cggtcatgcg 30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gggaagctta cccccggccag gccaactac 30

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gggtctagac atatgcacca tcatcatcat cacatgcaag tttcagttga aacc 54

<210>4

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gggggatccc atggcgccct gaaaataaag attctccgcc tgctggttca tcagctc 57

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gggggatcca tggggaaaaa cttacaagca ctg 33

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gggaagcttt taactcaagg cctcgaattg ttg 33

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gggccatgga tcctcagcaa cgtcaaac 28

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gggaagcttt cagacgaggt ctttttccag c 31

Claims

1.一种启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体，是pLS1128，它具有编码六个组氨酸的核苷酸序列、来源于大肠杆菌的启动因子基因、烟草蚀纹病毒蛋白酶的切割位点以及一段用来克隆使用的填充片段，其结构如图1所示。

2.一种构建启动因子作为融合标签的大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128的方法，是通过将编码六个组氨酸的核苷酸序列、来源于大肠杆菌的启动因子基因、编码烟草蚀纹病毒蛋白酶的切割位点的碱基序列以及一段用来克隆使用的填充片段克隆至大肠杆菌表达载体pET30a而得到。

3.用权利要求1所述表达载体表达融合蛋白的方法，是目的基因通过取代填充片段而克隆至pLS1128与来源于大肠杆菌的启动因子基因融合，经诱导后表达融合蛋白。