CN101636415B

CN101636415B - 用于富集、除去和检测革兰氏阳性细菌的方法和手段

Info

Publication number: CN101636415B
Application number: CN200780051424.9A
Authority: CN
Inventors: 马丁纳·贝辛格; 斯蒂芬·米勒; 安贾·菲利普; 迈克尔·许茨
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: EP2121765A2; US20100092968A1; CN101636415A; WO2008077397A2; JP5693848B2; DE102006061002A1; US9394534B2; EP2121765B1; WO2008077397A3; JP2010512761A

Abstract

本发明涉及包含内溶素或另一种细胞壁溶解酶的无酶促活性细胞壁结合结构域和依照SEQ ID NO：1的序列或其衍生物的多肽，以及其制备手段，其中除所述细胞壁结合结构域之外，所述多肽不包含别的内溶素结构域。本发明还涉及用于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测细菌(特别是革兰氏阳性细菌)的方法。

Description

用于富集、除去和检测革兰氏阳性细菌的方法和手段

发明领域

本发明涉及包含内溶素(endolysin)或另一种细胞壁溶解酶(lysing enzyme)的无酶促活性细胞壁结合结构域和依照SEQ ID NO：1的序列或其衍生物的多肽，以及其制备手段，其中除所述细胞壁结合结构域之外，所述多肽不包含内溶素或另一种细胞壁溶解酶的别的结构域。本发明还涉及用于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测细菌(特别是革兰氏阳性细菌)的方法。

发明背景

革兰氏阳性细菌在环境中广泛传播。它们不仅可在土壤、水、植物材料、粪便等样品中找到，而且还可在人和动物中找到。利斯特氏菌(listeria)、杆菌(bacillus)、梭菌(clostridium)、葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌(streptococcus)、肠球菌(enterococcus)、微球菌(micrococcus)或分枝杆菌(mycobacteria)等种类的整个病原体细菌系列在食物方面以及在人和动物的感染疾病的预防、诊断和治疗中有显著的关联性。

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)群的细菌代表具有重要的经济和医学价值以及在生物恐怖主义方面具有突出关联性的微生物。这些细菌在群内彼此密切相关；大量的所述细菌已经被测序(Rasko等，FEMS Microbiol.Reviews，2005，29，303-329)。它们在自然界中广泛传播，而且存在于不同种类的食物(大多数为植物来源)之中。它们是需氧生存的、活动的、杆状革兰氏阳性细菌。由于其抗逆性内生孢子，它们能够经受加工处理食物所使用的不同方法，例如如干燥或加热。通常，受污染的食物主要是含有淀粉的食物、谷类、稻、香料、蔬菜和即食(ready-to-eat)产品。肉类可通过使用受污染的香料而受污染。因为孢子能幸免于巴氏灭菌法，随后无限制的增殖是有可能的，所以乳制品经常受到污染。蜡状芽孢杆菌群由6种密切相关的种组成，除食物病菌蜡状芽孢杆菌外，还包括极端危险的人病原体细菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(其在生物恐怖主义方面具有极大的关联性)、昆虫病原体苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(通过基于苏云金芽孢杆菌的微生物学杀虫剂而广泛传播)、根状样蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)以及假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)和韦氏芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)。

利斯特氏菌是人和动物病原体细菌，通常存在于食物中，特别是在鱼、肉和乳制品中。利斯特氏菌属包含6个不同种，其中有16个不同的血清型。虽然食物相关疾病的仅小部分是由利斯特氏菌引起的(在美国约1％)，但是每年几乎30％的由食物病原体引起的致命疾病是由该病菌引起的。染病者主要是免疫抑制人群，例如老年人、糖尿病患者、癌症患者和/或AIDS患者。孕妇和尚未出生的孩子占所有的利斯特氏菌病患者病例的25％。

目前，葡萄球菌和肠球菌是与感染疾病有关的最难解决的病原体，因为它们日益形成多种耐药性病菌(例如MRSA——多耐药性金黄色葡萄球菌和VRE——万古霉素耐药性肠球菌)，导致主要在固定健康护理方面的显著发展，即不良的疾病预后以及费用的激增。

潜在的病原体通常以很少的细胞数目存在于感染状态和食物区域中，另外还伴随有干扰性背景菌群。一方面，需要用于有效除去相关革兰氏阳性病菌的方法，另一方面，需要用于选择性富集这些病菌的方法，以便例如实现灵敏检测。

好检测方法的标准是灵敏性、快速、可靠性以及简单和划算的应用。

开始，基本上始终有应当检测的生物体的富集。一般而言，这是以常规方法在多步过程中实现的。初次富集通常用非选择性或低选择性液体营养培养基发生。随后，发生选择性再次富集，接着是通常在选择性琼脂上发生的初次分离。在传代培养物中再次富集单一菌落，随后用不同检测方法检测。这些常规方法在检测出阳性病菌之间花费很长的时间。利斯特氏菌的标准检测时间为依照ISO 11290-1：1996/FDAM 1：2004(E)的超过4-7天和依照FDA和USDA/FSIS的4-7天。蜡状芽胞杆菌群的细菌的富集依照标准方法(USFDA方法，章14；ISO 7932：2004)需花费1.5至2.5天，随后的检测花费2天，在蜡状芽胞杆菌群内再次进行的更为详细的鉴别花费2-3天。

在食品工业中，检测时间对于一些种类的食物的短货架期和成本密集的(cost intensive)存储是重要的方面，其在已确定样品没有受到污染之前是必须的。此外，若在收到对照结果之前提前投递受污染的商品，则成本密集的产物召回可一贯地遵守。在健康护理中，长检测时间也是成问题的，因为以安全性为基础的合适的特定治疗方法也不可在鉴定出病原体病菌之前进行。

作为与传统富集和检测方法相比更快的备选，通常使用基于抗体的方法(例如US 6,699,679，US 2004/0197833，UA 2006/0211061，Fluit等，1993，ApplEnviron Microbiol.，59，1289-1293，Jung等，2003，J Food Prot.，66，1283-1287，Hawkes等，2004，Biosens.Bioelectron.，19，1021-1028)。糖结合凝集素作为细菌表面碳水化合物部分的受体的应用也有考虑。然而，这些通常过于非特异性以致于不能从混合的培养物中选择某些细菌，而且往往展现出基于其多聚体结合性质的凝集问题。使用基于抗体的方法，细菌的回收率也是比较差的，比率范围在5％至25％。除回收率差之外，免疫磁性分离方法(IMS)的别的缺点在于在低污染率的灵敏性不足、与其它细胞的交叉反应和通常关于抗体包被珠的凝集问题。另外，获得针对完整细菌的抗体是比较难的。虽然在纯培养物的情况中这些方法是非常有前途的，但是它们在混合培养物或复合基质(诸如食物)的情况中显现出重大的问题。

作为抗体的备选，来自噬菌体肽聚糖水解酶的细胞壁结合结构域(CBD)结合革兰氏阳性细菌的应用在本领域的现有技术中是已知的(Loessner等，2002，Mol.Microbiol.，44，335-349)。EP 1147419和WO2004/088321使用CBD以检测细胞，其中CBD结合至固相，而且一般携带标志物。

EP 1399551描述了一种使用噬菌体壳体蛋白质或噬菌体尾部蛋白质来选择性纯化革兰氏阴性细菌细胞或细胞片段的方法。在这种情况中，以2步方法结合细菌，结合分子首先结合靶细胞，接着该复合物固定化至固体载体。借助于His标签、生物素或Strep标签来偶联噬菌体尾部蛋白质与固体载体的官能化表面，从而发生固定化。特别是对于所述2步方法，结合蛋白-靶细胞复合物与官能化载体的高效、快速和非共价偶联具有至关重要的关联性，特别是在靶细胞应当与样品和固体载体分开时。

US 5,252,466披露了一种制备包含供体内生物素化用的标签并因此易于纯化的融合蛋白的方法。在这种情况中，生物素化结构域是例如谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)转羧酶(transcarboxylase)的1.3S亚基、番茄生物素蛋白质、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)草乙酸脱羧酶(oxalacetate decarboxylase)的α-亚基或大肠杆菌(Escherichia coli)生物素羧基载体蛋白，它们与质粒的生物素连接酶一起在相同的读码框中表达，因此在体内被生物素化。借助于噬菌体展示系统，开发了在蛋白水解方面更稳定的最小限度型式的克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的生物素化结构域，其适于纯化和检测相应的融合蛋白(Stolz等，1998，FEBS-Lett.440，213-217)。US 5,874,239也要求保护一种用于融合蛋白生物素化的方法，其提示许多所谓“Avi-标签”的标签，所述标签(长度为13至50个氨基酸，优选约20个氨基酸)短于克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的生物素化结构域。

如此，本发明要解决的问题在于提供更有效和更具生产性的方法和实施所述方法的手段来，以便快速、简单和高效结合、富集、除去、捕获和检测革兰氏阳性细菌。

专利权利要求书中限定的主题解决了该问题。

附图简述

下列附图阐明本发明。

图1：具有JS标签的噬菌体尾部蛋白质。

图1A：具有不同标签的P22样噬菌体尾部蛋白质的表达和功能性装配的比较。

克隆在N端有Strep-标签、Avi-标签和JS-标签的来自沙门氏菌(Salmonella)的P22样噬菌体尾部蛋白质，并分别在大肠杆菌HMS174(DE3)和大肠杆菌JM83中表达。在12％SDS凝胶上加载样品，并用考马斯(Coomassie)染色。在实施例1中描述了该实验。M：标志物，P：沉淀；S：上清液；+：经诱导的；-：未诱导的；ng：未煮沸的。箭头分别指示噬菌体尾部蛋白质单体和三聚体的位置。

图1B：三种具有JS标签的来自沙门氏菌噬菌体的噬菌体尾部蛋白质的克隆和表达。

以具有JS标签的融合蛋白克隆三种不同的来自沙门氏菌噬菌体的噬菌体尾部蛋白质(Tsp)，并在大肠杆菌HMS174(DE3)中表达。在12％SDS凝胶上加载来自细胞溶胞产物(cell lysate)的样品，并用考马斯染色。第1道：标志物(自顶部起的分子量：118kDa、85kDa、47kDa、36kDa、26kDa、20kDa)；第2道：沉淀物(P)，未诱导的；第3道：上清液(S)，未诱导的；第4-12道(均在诱导后)，第4道：Felix样尾部蛋白质(Felix-Tsp，48kDa)，P；第5道：Felix-Tsp，S，经煮沸的；第6道：Felix-Tsp，未煮沸的；第7道：P22样尾部蛋白质(P22-Tsp，67kDa)，P；第8道：P22-Tsp，S，经煮沸的；第9道：P22-Tsp，S，未煮沸的；第10道：ε15样尾部蛋白质(ε15-Tsp，93kDa)，P；第11道：ε15-Tsp，S，经煮沸的；第12道：ε15-Tsp，S，未煮沸的。箭头指示噬菌体尾部蛋白质单体和SDS耐受的三聚体的预期位置(在未煮沸的样品中)。

图1C：分别具有Avi标签和JS标签的来自弯曲杆菌(campylobacter)噬菌体的尾部蛋白质的比较克隆和表达。

在质粒pET21d中克隆分别具有N端Avi标签和JS标签(型式5b)的弯曲杆菌噬菌体尾部蛋白质(推定为空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的尾部纤维蛋白H，登录号ZP01067412)，并分别在大肠杆菌HMS174(DE3)和大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在实施例1中描述了该实验。描绘了经9％考马斯染色的SDS凝胶，其中含有来自表达和溶解度测试的不同的样品。P：沉淀物(Pellet)；S：上清液；(i)经诱导的；-：未煮沸的；M：标志物。箭头分别指示诱导后噬菌体尾部蛋白质的单体和三聚体的位置(在未煮沸的样品中)。

图2：利斯特氏菌CBD在化学生物素化后变得完全失活。

描绘了化学生物素化之后在结合测定法中哪部分的引入利斯特氏菌仍被结合。在测试中使用0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml的蛋白质浓度。与NHS-生物素一起温育0分钟、20分钟、60分钟和120分钟。Avi-CBD起对照作用。

图3：1步方法和2步方法的比较

图3A描绘了依照1步方法和2步方法以及ISO方法从卡门培尔干酪(camembert)中检测利斯特氏菌的比较。比较分析时间依赖性，依照所述时间依赖性用不同方法在卡门培尔干酪中可检测出很低浓度的单核细胞增生利斯特氏菌。用0、2、4、15和46CFU(集落形成单位)污染5份卡门培尔干酪(每份25g)，并在依照1步方法、2步方法或ISO(ISO：11290-1：1996 FDAM1)方法浓缩4小时、6小时和24小时后测试。对于1步方法和2步方法，使用Strep-标签-GFP-CBD511_f2作为特异性配体。各从4个实验中测定数值(0：平板上没有菌落，X：＜10个菌落，XX：10-30个菌落，XXX：＞30个菌落)。

图3B描绘了使用融合蛋白JS-GFP-CBD511_f2在莫泽雷勒干酪(mozzarella)中检测单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)(菌株EGDe，黑色柱形；和ScottA，阴影柱形)的1步方法和2步方法中的浓度依赖性。实施例3b中描述了实验实施。在每种情况中，描绘了从1ml莫泽雷勒干酪样品中回收多少百分比的总共应用的利斯特氏菌相应菌株细胞。各从2个实验中测定数值。

图4：JS标签与Avi标签的比较

图4A：JS标签和Avi标签构建体的细胞结合能力的比较

依照2步方法用利斯特氏菌菌株ScottA测试不同构建体的细胞结合能力。使用下列构建体：JS-GFP_CBD511_f3(圆圈)、JS-CBD511_f3(方框型)和Avi-GFP_CBD511_f3(三角形)。以使用细胞的百分比给出附着于磁珠的利斯特氏菌的比例。所有实验进行两次，并测定平均值。

图4B：Avi-GFP-CBD511_f2和JS-CBD511_f2的比较纯化

左图描绘了Avi-GFP-CBD511_f2纯化的考马斯染色凝胶，右图描绘了JS-CBD511_f2纯化的终产物。在实施例4b中描述了该实验。M：标志物；L：柱上加载；F：流过物；W：清洗级分；3-8：含有Avi-GFP-CBD511_f2的级分。10、1、0.1μg/ml：JS-CBD511_f2的加载蛋白质浓度。指示Avi-GFP-CBD511_f2和JS-CBD511_f2以及BirA条带位置。

图4C：利斯特氏菌结合的浓度依赖性

分析了在哪个浓度的特异性结合蛋白开始实现最大限度细胞结合。作为结合蛋白，以0μg/ml、0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和3μg/ml浓度引入JS-CBD511_f3。在实施例4b中描述了该实验。

图5：BirA的共表达对JS-标签CBD结合功效的影响

显示了结合细菌细胞(利斯特氏菌ScottA)的比例依赖于特异性结合蛋白JS5b-CBD511_f2的引入(introduced)量。对于一部分的蛋白质，在别的质粒中共表达BirA(三角形)，对于另一部分，不与BirA发生共表达(菱形)。此外，在2个实验中额外添加生物素(实心符号)，而这在2个实验中保持未进行(空心符号)。

图6：JS-标签-CBD对链霉抗生物素蛋白珠的特异性结合与His-标签-CBD对镍-NTA珠的结合的比较

使用2步方法用两种不同的CBD(CBDBa和CBD21)将蜡状芽胞杆菌细菌或是经由6个His的标签结合至镍-NTA磁珠或是经由JS标签结合至链霉抗生物素蛋白磁珠。描绘了特异性结合细菌与总共的引入细菌(浓度3×10³CFU/ml)相比的比例。

图7：在不同培养基中细菌分别与Strep-标签和JS-标签CBD的结合

通过依照本发明的方法，分别从不同培养基和PBST缓冲液中浓缩单核细胞增生利斯特氏菌EGDe细胞。在实施例8中描述了该实验。

图7A：使用Avi-CBD511_f2(5μg/ml)来浓缩利斯特氏菌。

图7B：使用JS-CBD511_f2(5μg/ml)来浓缩利斯特氏菌。

图8：在含有生物素的样品中的细菌结合

用构建体Strep-标签-CBDBa和JS-标签-CBDBa在0.01μM、0.1μM和1μM的生物素浓度比较分析特定浓度的蜡状芽胞杆菌。

图9：在不同条件下的JS-标签CBD的长期稳定性

在-20℃至37℃的温度范围中温育JS-CBD511_f3以及链霉抗生物素蛋白磁珠，随后引入含有单核细胞增生利斯特氏菌ScottA的细胞结合测试中。

图9A：在磷酸钠，pH7，2mM EDTA中的温育。在1天(实心圆圈)、14天(空心三角形)、60天(实心三角形)、和126天(叉形记号)后给出在给定浓度的JS-CBD511_f3的结合利斯特氏菌的比例。

图9B：在咪唑，100mM NaCl，pH7，+30％AS中的温育。在0天(圆圈)、33天(长方形)和74天(三角形)后给出在给定浓度的JS-CBD511_f3的结合利斯特氏菌的比例。

图10：从不同食物中用JS-CBD511构建体捕获利斯特氏菌

图10A：单核细胞增生利斯特氏菌ScottA从牛奶和奶酪中的浓度依赖性除去。使用不同浓度的JS4b-CBD511_f2来结合。给出了在相应蛋白质浓度有多少百分比的引入细菌被结合至磁珠。

图10B：无害利斯特氏菌(Listeria innocua)从萨拉米香肠(Salami)和熏制鲑鱼的除去。

图11：从食物中浓缩利斯特氏菌及随后用NASBA技术进行的检测。

通过使用JS5b-CBD511_f2从萨拉米香肠浓缩利斯特氏菌，所述萨拉米香肠用少量单核细胞增生利斯特氏菌ScottA(5CFU/25g)污染，并在LEB-FDA培养基中分别预温育17小时和20小时后进行。在图11A中，描绘了在用利斯特氏菌特异性引物进行的酶反应之后出现的荧光信号。图11B描绘了用JS5b-CBD511_f2可从样品中结合多少百分比的引入细菌。

图12：从细菌混合物中特异性结合蜡状芽胞杆菌

使用特异性JS-标签-CBDBa从细菌混合物(蜡状芽胞杆菌(DSMZ345)、田纳西沙门氏菌(Salmonella tennessee)、单核细胞增生利斯特氏菌(ScottA)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌HMS174(DE3))中浓缩蜡状芽胞杆菌。以百分比分别给出了与结合至磁珠(黑色柱形)或在上清液和清洗级分中(阴影柱形)的总回收细胞相比的结合蜡状芽胞杆菌细胞的数目。一方面，将细胞在完全培养基(CASO，Merck)上铺板以同样维持来自混合培养物的其他细胞；另一方面，将细胞在针对蜡状芽胞杆菌的选择性培养基(PEMBA)上铺板。作为对照，进行添加磁珠而没有结合蛋白的实验。

图13：从食物中浓缩蜡状芽胞杆菌

来自蜡状芽胞杆菌群的病原体细菌的出现是一个问题，特别是对于预煮的、高度含有碳水化合物的食物(如即食产品或再次加热的米饭)。为此，使用预煮的米饭作为食物样品，其仅需要在微波炉中加热2分钟来完成蒸煮。将食物样品用培养基稀释，均浆化，并掺入10²、10³或10⁴CFU/ml浓度的蜡状芽胞杆菌细胞。使用TSPB培养基作为对照。图13A以珠级分中的(黑色柱形)和上清液中的(阴影柱形)回收细胞的百分比显示了结合细胞的数目。图13B例示性描绘了其上铺有具有结合细胞的珠级分的PEMBA平板。蜡状芽胞杆菌菌落可以其花朵形状和扩展生长来识别。比较而言，图13C描绘了其上铺有含有细胞的上清液级分的PEMBA平板。

图14：借助于CBD 21和磁珠从血液中浓缩蜡状芽胞杆菌

向人血液掺入10³CFU/ml浓度的蜡状芽胞杆菌(DSMZ345)。先前向血液样品中添加柠檬酸盐、EDTA或肝素以抑制血液凝固，并用PBST缓冲液稀释1∶1。JS-标签-CBD21(10μg/ml)(黑色柱形)，不含蛋白质的对照(阴影柱形)。

图15：用JS-标签-CBD3626特异性结合产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)

本文中使用作为标志物的间隔区GFP的绿色荧光来显现JS-标签-GFP-CBD3626对梭菌细菌和对磁珠的结合。图15A例示性描绘了JS-标签-GFP-CBD3626对产气荚膜梭菌细胞的结合。图15B例示性描绘了JS-标签-GFP-CBD3626对磁珠的结合。

图16：在细胞结合测试中测量的依照本发明的JS-标签-CBD构建体对不同葡萄球菌菌株的特异性细胞结合。

使用依照本发明的JS-标签-CBD构建体JS-CBDPitti20(灰色柱形)、JS-CBDOpf(白色柱形)和JS-CBDUSA(黑色柱形)。描绘了多少百分比的引入细胞在细胞结合测试中被特异性结合。在实施例20中，描述了该实验的实施。给出的数目是来自PROFOS菌株保藏中心的数目。葡萄球菌菌株分别分离自亲株以及DSMZ和ATCC菌株。

图16A：对不同金黄色葡萄球菌菌株(在MRSA菌株和非MRSA菌株中划分)的细胞结合

图16B：对不同非金黄色葡萄球菌菌株的葡萄球菌细菌的细胞结合

菌株：C＝肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)，D＝表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，E＝马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)，F＝溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)，G＝腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，H＝松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)，I＝模仿葡萄球菌，J＝沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)，K＝木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。

图17：在过氧化物酶测试中依照本发明的JS-标签-CBD构建体对不同葡萄球菌菌株的特异性细胞结合

在实施例21中描述了过氧化物酶测试的进行和原理。

图17A描绘了JS-标签-构建体JS-CBDALE-1(阴影柱形)和JS-CBDLS(溶葡萄球菌素)(白色柱形)对两种不同的葡萄球菌菌株的的特异性结合。还描绘了没有添加蛋白质的缓冲液对照(黑色柱形)的背景吸收。在该测试中使用下列葡萄球菌菌株：S459-金黄色葡萄球菌(患者样品)，S1546-表皮葡萄球菌(DSMZ 20044)，S1548-溶血葡萄球菌(DSMZ 20228)，S464-金黄色葡萄球菌(患者样品)，S1501-金黄色葡萄球菌MRSA(患者样品)，S1502-金黄色葡萄球菌MRSA(患者样品)，S27溶血葡萄球菌。

图17B描绘了别的葡萄球菌特异性JS-标签构建体对一组葡萄球菌种类的特异性结合以及对作为非特异性对照的大肠杆菌菌株的结合。缓冲液对照(黑色柱形)，JS-CBDALE-1(阴影的)，JS-CBDLS(白色的)，JS-CBDPitti20(水平条带的)，JS-CBDOpf(灰色的)，JS-CBDUSA(垂直条带的)。在该测试中引入下列细菌菌株：S683-大肠杆菌(ECOR01)，S1603-变异链球菌(Streptococcus mutans)(DSMZ 20523)，S464-金黄色葡萄球菌(患者样品)，S1513-金黄色葡萄球菌(患者样品)，S1502-金黄色葡萄球菌MRSA(患者样品)，S1501-金黄色葡萄球菌MRSA(患者样品)，S27溶血葡萄球菌。

图18：在过氧化物酶测试中自肠球菌内溶素衍生的依照本发明的多肽构建体的特异性细胞结合

实施例22中描述了该测试的实施。引入两种依照本发明的JS-标签-CBD构建体：JS-CBDEF0355(灰色柱形)和JS-CBDEF1293(白色柱形)。还描述了没有添加蛋白质的缓冲液对照(黑色柱形)。给出的数目是来自PROFOS菌株保藏中心的菌株数目。其涉及肠球菌和葡萄球菌种类的患者分离物以及DSMZ和ATCC菌株的问题。

图18A描绘了对不同粪肠球菌菌株的特异性结合。

图18B描绘了对不同屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株以及对不同金黄色葡萄球菌菌株的特异性结合。

发明概述

下文描述本发明。

术语“细菌除去”在用于本文时指从样品材料中完全或部分除去细菌。

术语“细菌富集”在用于本文时指根据存在于样品中的初始浓度浓缩细菌。一般而言，必须实施富集以使得相应的检测步骤得到明确的阳性结论或明确的阴性结论。

术语“捕获”细菌指借助于“CBD”特异性结合来自样品的细菌的能力从样品中提取和结合细菌的过程。

术语“样品材料”或“样品”在用于本文时包含其中应当检测出细菌或应当从中除去细菌的所有溶液。合适样品的例子是：水溶液及水和有机溶剂的混合物、食物、培养基、血液、血产品、血浆、血清、尿、其它体液、诊断性样品、蛋白质溶液、水乙醇混合物、过程溶液(处理液)(process solution)诸如用于分析医疗器械的污染或食品加工中的清洗溶液。此外，还包括其中溶解有非水固体物质的溶液，所述非水固体物质有待分析或有待分离，例如蛋白质、DNA、RNA、糖、盐类、食物、食物-培养基匀浆、药物、疫苗、环境样品、粪便、有机的和无机的化学品，例如NaCl、MgCl₂、嘌呤、嘧啶。

术语“内溶素”在用于本文时指在其最初的功能中起到在相应噬菌体复制周期末期释放新噬菌体作用的酶。在自然界中，此类内溶素可以是例如由噬菌体基因组所编码的。这些内溶素各由至少一个有酶促活性的结构域和结合相应宿主细胞细胞壁的无酶促活性的结构域组成。另外，内溶素必须理解为还包括类似组成的自溶素。这些在自然界中是细菌编码的，并且也由至少一个有酶促活性的细胞壁水解结构域和结合靶细菌细胞壁的无酶促活性的结构域组成。噬菌体编码的内溶素和细菌编码的自溶素通常是彼此同源的(Garcia等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，914-918)，而且来自细菌和噬菌体编码序列的模块(module)是可互换的，甚至可在嵌合物中彼此结合(Diaz等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.87，8125-8129)。因此，除来自噬菌体内溶素的细胞壁结合结构域之外，依照本发明还可使用来自其它细胞壁溶解酶(例如自溶素、细菌素或噬菌体尾部蛋白质)的相应无酶促活性的细胞结合结构域。

术语“CBD”在用于本文时指分别自内溶素或其它细胞壁溶解酶衍生的，并且负责内溶素或其它细胞壁溶解酶对细菌细胞壁特异性结合的多肽结构域和序列。这些是无酶促活性的。

术语“依照本发明的多肽”在用于本文时指包含内溶素或另一种细胞壁溶解酶的无酶促活性的细胞壁结合结构域(CBD)和依照SEQ ID NO：1的序列或其衍生物的多肽，其中除所述细胞壁结合结构域之外，所述多肽不包含内溶素或另一种细胞壁溶解酶的别的结构域，特别是不包含内溶素的有完全酶促活性的结构域(EAD)。

术语“JS标签”在用于本文时指包含依照SEQ ID NO：1的序列或其衍生物的多肽序列。JS标签衍生自肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的α-亚基的生物素受体结构域，而且包含共有序列MKM(K是生物素化的)，使得该多肽可由蛋白质生物素连接酶在体内生物素化。与肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的完整α-亚基相比，JS标签是截短的。一种可能的最低限度JS标签序列包含与肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的氨基酸529至594对应的66个氨基酸(SEQ IDNO：2)。术语“JS标签”还包含依照SEQ ID NO：1的序列的衍生物。衍生物在用于本文时包括与SEQ ID NO：1仍有至少80％同源性的此类序列。SEQ IDNO：2-18中描绘了此类衍生物的例子。

术语“定向的固定化”在用于本文中时指CBD经由作为特定偶联剂的生物素而固定化于合适的表面上，例如经由提供有链霉抗生物素蛋白或亲合素的磁性颗粒或其它载体。

术语“表面”或“载体”在用于本文时包括CBD分子和依照本发明的多肽分别有可能直接或间接偶联或粘附的所有材料，例如玻璃表面、层析材料(诸如琼脂糖、Sepharose、丙烯酸酯)、塑料表面(诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯)、过滤材料或滤膜(诸如纤维素、乙酸纤维素、硝酸纤维素、PVDF)、由玻璃、胶乳、塑料、金属、金属氧化物制成的磁性或非磁性颗粒。

术语“1步方法”在用于本文时指其中在添加样品之前已经将特异性结合蛋白(例如依照本发明的多肽)固定化至合适的载体或表面(定向的或不定向的)的方法。在将固定化的结合蛋白与样品一起温育后，将细菌-结合蛋白-载体复合物与样品分开，然后任选地，进行清洗。

术语“2步方法”在用于本文时指其中将非固定化的特异性结合蛋白(例如依照本发明的多肽)与样品接触并一起温育的方法。随后将形成的细菌-结合蛋白复合物与合适的载体或表面接触，使得细菌-结合蛋白复合物经由结合蛋白借助于生物素化的亲和标签而结合至载体或表面。随后，将细菌-结合蛋白-载体复合物与样品分开，并且任选地，进行清洗。如下用多肽或化学基团修饰结合蛋白，该修饰方式使得它们特异性结合提供有所述多肽或化学基团的相应结合配偶体的载体或表面。

术语“多肽”在用于本文时指有至少5个氨基酸的多肽链。

术语“细菌-多肽复合物”或“多肽-细菌复合物”在用于本文时指其中存在细菌和依照本发明的多肽(依照本发明的多肽)的复合物。

术语“载体-多肽-细菌复合物”在用于本文时指其中存在细菌、依照本发明的多肽(依照本发明的多肽)以及载体(载体材料)的复合物。

本发明涉及一种多肽，其包含

i)内溶素或另一种细胞壁溶解酶的无酶促活性的细胞壁结合结构域(CBD)，和

ii)依照SEQ ID NO：1的序列或其衍生物，

其中除所述细胞壁结合结构域之外，所述多肽不包含内溶素或另一种细胞壁溶解酶的别的结构域。

本发明具体涉及一种生物素化的依照本发明的多肽。在一个具体的实施方案中，依照本发明的多肽内的内溶素或另一种细胞壁溶解酶的细胞壁结合结构域(CBD)具有特异性结合革兰氏阳性细菌的能力。依照本发明的多肽适于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测细菌。

因此，本发明涉及依照本发明的多肽用于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测细菌的用途。

相应，本发明进一步涉及一种用于结合、富集、除去、捕获和/或检测来自样品的细菌的方法，其包括以下步骤：

a)使样品与生物素化的依照本发明的多肽接触和/或一起温育，

b)使步骤a)中获得的多肽-细菌复合物与提供有生物素结合物质的载体接触和/或一起温育，

c)将步骤b)中获得的载体-多肽-细菌复合物与所述样品分开，

d)任选地，自载体-多肽-细菌复合物清洗非特异性附着的样品成分，

e)任选地，将载体与多肽-细菌复合物分开，并

f)任选地，检测所述细菌。

在依照本发明的方法中，样品与相应的依照本发明的多肽一起温育(步骤a)的持续时间或细菌-多肽复合物与载体材料一起温育(步骤b)的持续时间分别必须针对相应的样品进行调整，并且在一个实施方案中，可在数秒和约24小时之间变化。依照本发明的方法的步骤a)(其中官能化的，即生物素化的依照本发明的多肽结合至细菌)一般快于步骤b)(其中将生物素化的多肽-细菌复合物固定化于生物素结合载体上)。适于依照本发明的方法的步骤a)的温育时间具体是约0.1分钟至约10分钟，适于步骤b)的温育时间具体是约10分钟至约60分钟或者在需要时还可过夜。然而在依照本发明的方法的步骤a)中，其一般是足以充分混合所添加的依照本发明的多肽和样品，而在与载体材料一起温育(步骤b)期间，例如添加载体材料之后，必需在水平位置滚动样品容器以实现对载体尽可能有效的结合。

起始材料中细菌处于非常低的浓度时，在合适营养培养基中的预温育阶段是必需的，以便实现高效富集，因此获得适用于依照本发明的方法的样品。含有固体成分的样品(诸如食物样品)可在用于依照本发明的方法前进行匀浆化，并在它们被用于依照本发明的方法前再次吸收于、溶入合适的溶液中。

在依照本发明的方法中，使用提供有生物素结合物质的载体，即载体是官能化的。生物素结合物质应当能够以高亲和力结合生物素。具体地，载体表面上的合适结合配偶体(即生物素结合物质)是例如链霉抗生物素蛋白、亲合素及其生物素结合变体，诸如单体亲合素、具有部分乙酰化氨基或部分酯化羧基的亲合素。与疏水表面相比，优选亲水表面，因为它们一般更适于结合蛋白质，而且趋于以更小的程度凝集。

通过将细菌与样品的剩余部分分开来富集细菌。细菌可在例如以磁性为基础的所述方法中、经由层析方法、或在分批方法中富集。优选磁性富集，因为与其它方法相比，该方法是非常快的，可以小型化，而且还可以自动化。但是也可使用层析方法或分批方法，特别是若该方法主要不是用于后续细菌检测，而是瞄准例如较大量细菌的分离，并且将继续对这些所分离的细菌进行操作。

在以磁性为基础的富集过程中，在依照本发明的方法的步骤b)中将多肽-细菌复合物与作为载体的合适磁性颗粒一起温育。在某些实施方案中，磁性颗粒可具有的直径范围为约0.1μm至约100μm。然而，优选直径在约0.5μm至约5μm之间的更小颗粒，特别优选直径为约0.8μm至约2μm的颗粒，因为与较大的颗粒相比，较小的颗粒以较小速度沉降，因此提供较好的混合物，并且具有相对较大的表面，以及具有高的回收率。合适磁性颗粒的例子是MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)、链霉抗生物素蛋白磁性颗粒(Roche)、链霉抗生物素蛋白珠(Dynal)、经链霉抗生物素蛋白偶联的硅珠(MicroCoat)、经链霉抗生物素蛋白偶联的聚乙烯醇珠(PA-链霉抗生物素蛋白珠，Microcoat)。在依照本发明的方法的步骤b)之后，通过应用磁场用磁性方法将载体-多肽-细菌复合物与样品分开。合适的磁力分离器可购自例如Ambion、Ademtech、Bilatec、BioLabs、Dynal、Polysciences和Promega等公司。

借助于分批方法进行的富集过程中，最初将包含细菌的样品与依照本发明的多肽一起温育，随后添加适于结合高亲和力生物素的载体材料，混合，并再次一起温育。随后，可从样品中离心出、沉降出或过滤出载体-多肽-细菌复合物。优选经由批次方法进行的浓缩，特别是在细菌处于非常低的浓度时。

或者，可通过在含有生物素结合柱材料的层析柱上应用多肽-细菌复合物来将它们与样品分开，并富集。

可如下将多肽-细菌复合物与官能化载体分开，即通过置换，例如通过添加合适量的生物素；或者通过调节条件(其高度地使蛋白质变性，诸如约8M盐酸胍或约pH1.5)和添加生物素酰胺酶，自肽切割生物素。还有可能的是，通过选择条件仅将细菌与生物素化的依照本发明的多肽分开，在所述条件依照本发明的多肽不再结合其位于细菌表面上的受体。因为本发明可使用依照本发明的不同多肽，因此必须在个体情况中测试准确的条件。例如，这可通过引入荧光标志物并在荧光显微镜下监测来实施，其中先前结合的细菌仍发荧光，因为它们的表面覆盖有依照本发明的多肽。然而，一般而言，离子强度向很高或很低的离子强度的变化、pH向很酸或很碱的变化(例如50mM磷酸钠和pH11，达5分钟)、去污剂或化学变性剂(诸如尿素或盐酸胍)的添加、或所述可能性的组合适于阻止CBD细菌结合，因为这是特异性的蛋白质-蛋白质相互作用。然而，对于许多应用，例如随后的铺板和自所结合细菌衍生的菌落的计数，磁性颗粒与细菌的分离是完全没有必要的。

本发明进一步涉及用于检测样品中的细菌的方法。细菌的检测包括上文所述用于富集的方法步骤之后的别的步骤。根据应当检测的细菌种类，本领域技术人员知晓一套技术，产生期望的结果。下文提及合适检测方法的选择。例如，细菌可在复合物中连同载体和生物素化的依照本发明的多肽一起检测，或者可在经由选择性生长条件(例如在选择性培养基平板上铺板和温育)自载体材料释放后检测。此外，细菌检测有可能通过基于核酸的方法进行，即检测细菌的核酸，所述基于核酸的方法例如PCR、RT-PCR、PCR-RFLP、rep-PCR指纹法、NASBA、DNA杂交方法(例如对于某些毒素或其它致病性因子)、多基因座序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)和rRNA比较。还可能分别检测细菌细胞壁及其成分(例如经由内溶素或抗体的细胞结合结构域或经由FTIR)，或分别检测细菌成分，例如蛋白质经由ELISA检测或酶经由其活性或多位点酶电泳(multi-locus enzyme electrophoresis，MEE)检测。细菌检测还有可能经由细菌中包含的ATP进行，例如在经由使用细菌特异性噬菌体进行的检测的生物发光测定法中，例如对于利斯特氏菌A511-luxA(参见US 5,824,468)。细菌可经由另一种偶联有标志物的特异性CBD在载体-多肽-细菌复合物中或在从载体材料中除去后进行进一步检测。因此，在EP1147419中描述了一组例子。微生物学、形态学和/或生化检测方法的组合的常规检测也是有可能的。

细菌成分(例如蛋白质)的检测优选经由ELISA或类似的技术(例如VIDAS)进行。对于这些方法的实施，必需在实际检测之前破坏细菌。例如，这可用溶胞蛋白质诸如溶菌酶或细菌特异性内溶素来进行。溶胞蛋白质例如可选自下组(括弧中的参考或是NCBI数据库的登录号(数字-字母组合)或是出版物引文)：

-对于利斯特氏菌属：Ply511(Q38653)、Ply500(Q37979)、Ply118(Q37976)、PlyPSA(1XOV_A)、菌株EGDe的自溶素(NP_466213)，

-对于炭疽芽孢杆菌：PlyL(1YB0_A，B和C)、PlyG(YP_891193)、PlyPH(Yoong等，J.Bac.2006，188，2711-2714)、PlyB(2NW0_A和B)，

-对于蜡状芽胞杆菌：PlyBa(CAA72266)、Ply21(CAA72267)、Ply12(CAA72264)，

-对于产气荚膜梭菌：Ply3626(WO 03/066845)和来自产气荚膜梭菌菌株13的溶素(lysines)(BAB81921)和来自菌株SM101的溶素(YP_699489)，

-对于酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)：ΦP1溶素(lysine)(EP1300082)，

-对于肠球菌属：PlyV12(NP_049942)，

-对于链球菌属：PlyC(NP_852017)、PlyGBS(AAR99416)、Cpl-1(P15057)、Cpl-7(P19385)、Cpl-9(P19386)、来自噬菌体Dp1的Pal酰胺酶(P19386)、B30内溶素(AAN28166)和LytA(CAJ34420)，

-对于葡萄球菌属：Twort酰胺酶(CAA69021)、葡萄球菌噬菌体P68酰胺酶(NP_817332)、LysK(O`Flaherty等，J.Bac.，2005，187，7161-7164)、ΦSA2usa溶素(YP_494080)、Phi11酰胺酶(NP_803306)和细胞壁水解酶(NP_803302)或Phi12内溶素(NP_803355)、以及来自金黄色葡萄球菌的自溶素Atl(BAA04185)、来自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的AtlE(CAI59555)、来自头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)的ALE-1(BAA13069)以及自金黄色葡萄球菌菌株PS47衍生的肽聚糖水解酶(AAA26662)或来自模仿葡萄球菌的溶葡萄球菌素(AAB53783)。

不同的别的添加剂可支持细胞溶解，诸如蛋白酶例如蛋白酶K的添加和加热的应用，优选在约56℃5分钟，随后在约94℃5分钟，或者诸如添加去污剂，优选Triton、SDS、Tween、脱氧胆酸钠或溶剂，诸如DMSO、异丙醇、乙醇、丁醇、氯仿。

依照本发明的多肽包含分别在内溶素和自溶素中所谓CBD的多肽结构域/序列，其中依照本发明的多肽不再展现出有酶促活性的细胞壁水解区。缺乏酶活性对于功能性地分开复合物中的细菌与载体是必需的。优选地，仅在分开之后(若这对于例如随后的检测反应是必需的话)有目的地溶解所结合的细菌，因此释放细胞内容物。因此，在一个具体的实施方案中，依照本发明的多肽除包含细胞壁结合结构域之外不包含内溶素的别的结构域，特别是不包含内溶素的有酶促活性的结构域(EAD)，在一个具体的实施方案中，也不包含内溶素的别的序列。然而，在某些条件下，所使用多肽片段的较小的水解剩余活性是可容忍的。然而，这取决于相应的应用，即必须检查何等程度的细胞水解酶速率可与应用的总持续时间相符合以使得足够量的完整细胞被捕获。在例如Loessner等(1996，Appl.Environ.Microbiol.62，3057-3060)中描述了在水解测定法中可如何检测CBD的潜在剩余活性。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的多肽所示SEQ ID NO：1的衍生物。在SEQ ID NO：2-18中描述了此类衍生物的例子，作为SEQ ID NO：1例示性变异的所述例子显示如下：

i)与SEQ ID NO：1相比在第60位用Asp代替Glu，

ii)在C末端添加Val或Val-Asp，和/或

iii)在N末端添加M或MVGA。

证明上文所述SEQ ID NO：1的衍生物对于在依照本发明的方法中的应用是有益的。

1990年Garcia等(1990，Gene，86，81-88)已经描述了在负责特异性细胞结合的C端结构域(CBD)和包括酶促活性中心的N端结构域(EAD)中的内溶素模块组织。CBD的概念在Loessner等，2002，(Mol.Microbiol.，44，335-349)和Loessner，2005，(Curr.Opin.Microbiol，8，480-487)中获得延伸。大量的CBD已经记载于本领域的现有技术之中。通常，有酶促活性的结构域(EAD)位于N端，而CBD位于C端——但是，也有例外(例如Garcia等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，914-918；Loessner，2005，Curr.Op.Microbiol.，8，480-487)。EAD一般是明确限定的，而且可相对容易地找到并定位，这通过用序列分析软件(在本领域的现有技术中是已知的)和具有保守序列基序的相应数据库(例如CDD(Marchler-Bauer等，2005；Nucleic Acids Research，33，D192-D196)；Pfam(Finn等，2006，Nucleic Acids Research 34，D247-D251)或SMART(Schultz等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864，Letunic等，2006，Nucleic Acids Res 34，D257-D260))与其它水解酶(诸如酰胺酶、内肽酶、糖苷酶、糖基转移酶、溶菌酶)进行序列和同源性比较来实现。在内溶素CBD部分的鉴定过程中，找到了许多情况中细胞结合结构域的已知基序，这为提供依照本发明的多肽的CBD序列提供了合理的指示。在结合链球菌的内溶素组中，CBD相对容易找到，因为通常出现长度为约20个氨基酸的、具有保守芳香残基的胆碱结合基序(CW_binding_1，pfam01473)，其通常以多个重复发生(参见Garcia等，1990，Gene，86，81-88)。长度为约40个氨基酸的LysM结构域(pfam01476)也可在CBD中部分地被找到。这是一种广泛分布的具有保守二级结构的肽聚糖结合模块(Bateman和Bycroft，2000，J.Mol.Biol.，299，1113-1119)。SH3b结构域和SH3_3、SH3_4或SH3_5结构域(smart00287、pfam08239、pfam06347、pfam08460)(分别为真核生物和病毒Scr同源性结构域SH3的原核生物对应物)(Ponting等，1999，J.Mol.Biol.，289，729-745)通常也可作为细胞结合基序在CBD中找到(主要在葡萄球菌和肠球菌中)。肽聚糖结合结构域(PG_binding_1，pfam01471；PG_binding_2，pfam08823)由3个螺旋组成，通常也可在EAD的N端找到。然而，时常找不到CBD部分与其它相关噬菌体内溶素的直接关系或者也找不到CBD部分与其它碳水化合物结合蛋白质的直接关系，而且几乎不可限定指明CBD的独特序列基序或结构模块。在此类情况中，可经由EAD来确定关系。作为本发明多肽的基础，在该情况中，除从本领域的现有技术中已知的CBD起作用之外，还有内溶素中不被EAD占据的部分起作用。该内溶素的剩余部分(即减去EAD的内溶素)可直接理解为并用作CBD，只要其展现出细胞结合功能。然而，在本发明的一些实施方案中，使用较短的片段是有用的(例如因为它们展现出较高的稳定性)，只要它们仍展现出细胞结合功能。CBD的功能性测试是检测对相应细菌的细胞结合。适于该目的的不同例示性测定法记载于实施例和附图中。除有效细胞结合之外，还应当考虑涉及定义发挥CBD功能的肽部分的别的特征表达率、溶解度、稳定性和简单纯化。本领域技术人员可从本领域的现有技术中知晓测试这些特征的方法。因此，在下文实施例中还描述了一些例子。例如，依照结构标准来确定有目的设计的CBD部分的取向，其可由本领域技术人员基于二级结构预测、潜在的结构域接头和3D模型来评估。合适的例示性方法记载于例如下组出版物：Garnier等，1996，Methods in Enzymology 266，540-553；Miyazaki等，2002，J.Struct.Funct.Genomics，15，37-51；Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.17，3389-3402；Schwede等，2003，Nucleic AcidsResearch 31，3381-3385.Lund等，CPHmodels 2.0：X3M a Computer Program toExtract 3D Models.CASP5会议文摘A102，2002。

基本上所有自本领域的现有技术知晓的CBD和所有依照上文所述方法自内溶素衍生的CBD可用于本发明的多肽，并用于本发明的方法。

在本发明的一个具体实施方案中，依照本发明的多肽的细胞壁结合结构域选自下列内溶素的和其它细胞壁溶解酶的细胞壁结合结构域，所述内溶素和其它细胞壁溶解酶包括：Ply511(Q38653)、Ply 500(Q37979)、Ply 118(Q37976)、PlyPSA(1XOV_A)、EGDe(NP_466213)、PLyL(1YB0_A，B和C)、PlyG(YP_891193)、PlyPH(Yoong等，J.Bac.2006，188，2711-2714)、PlyB(2NW0_A和B)、PlyBa(CAA72266)、Ply21(CAA72267)、Ply12(CAA72264)，粪肠球菌V583原噬菌体内溶素、Ply3626(WO 03/066845)、来自产气荚膜梭菌菌株13(BAB81921)和菌株SM101(YP_699489)的溶素、ΦP1溶素(EP1300082)、PlyV12(NP_049942)、PlyC(NP_852017)、PlyGBS(AAR99416)、Cpl-1(P15057)、Cpl-7(P19385)、Cpl-9(P19386)、Pal酰胺酶(P19386)、Twort酰胺酶(CAA69021)、金黄色葡萄球菌噬菌体PVL酰胺酶(UniProt 080064)、P68 lys16(NP_817332)、ΦSA2usa内溶素(YP_494080)、Phi11(NP_803306)和Phi12内溶素(NP_803355)、金黄色葡萄球菌噬菌体Phi11的细胞壁水解作用(NP_803302)、噬菌体B30内溶素(AAN28166)、噬菌体168内溶素(M J Loessner等，J Bacteriol.1997May；179(9)：2845-2851)、LysK(O`Flaherty等，J.Bac.，2005，187，7161-7164)、模仿葡萄球菌(S.simulans)溶葡萄球菌素(AAB53783)、头状葡萄球菌ALE-1内肽酶(BAA13069)、噬菌体PhiNIH1.1细胞壁水解酶(NP_438163)、LytM(AAB62278)、Atl(BAA04185)，来自肺炎链球菌的LytA(CAJ34420)、自金黄色葡萄球菌菌株PS47衍生的肽聚糖水解酶(AAA26662)，来自粪肠球菌的肠溶素A(Q9F8B0)、来自单核细胞增生利斯特氏菌的ami自溶素(Milohanic等；Infection and Immunity，August 2004，p.4401-4409，Vol.72，No.8)、乳杆菌溶素例如噬菌体A2的溶素(AJ251788.2或Q9MCC8)、噬菌体PL-1酰胺酶(Q9MCC6)(均为干酪乳杆菌(L.casei)的)等。

特别适于结合利斯特氏菌的是内溶素Ply511的片段，特别适于结合杆菌的是内溶素PlyBa、Ply21、和Ply12的片段，特别适于结合梭菌的是Ply2636的片段，特别适于结合葡萄球菌的是ΦSA2usa内溶素的片段、葡萄球菌细菌素溶葡萄球菌素的片段、溶葡萄球菌素样(如ALE-1)的片段、葡萄球菌自我分离的(self-isolated)plyOpf、plyPitti20、plyPitti26和同源原噬菌体的类似蛋白质的片段，特别适于结合肠球菌的是来自粪肠球菌V583原噬菌体内溶素的片段、以及CBDEF0355和CBDEF129。

可在依照本发明的多肽中出现的CBD序列的例子是：

SEQ ID NO：19：CBD21；

SEQ ID NO：20：CBDBA；

SEQ ID NO：21：CBDUSA；

SEQ ID NO：22：Ply511型式1；

SEQ ID NO：23：Ply511型式2；

SEQ ID NO：24：Ply511型式3；

SEQ ID NO：25：Ply3626型式1；

SEQ ID NO：26：Ply3626型式2；

SEQ ID NO：27：CBDPitti20；

SEQ ID NO：28：CBDPitti26；

SEQ ID NO：29：CBDLS；

SEQ ID NO：30：CBDALE-1；

SEQ ID NO：31：CBDOpf；

SEQ ID NO：32：CBDEF0355；

SEQ ID NO：33：CBDEF1293。

在一个具体的实施方案中，除细胞壁结合结构域之外，依照本发明的多肽不包含别的内溶素序列。优选地，依照本发明的多肽由仅一个CBD和另外的依照SEQ ID NO：1的多肽序列或其衍生物组成，任选地，它们由接头或间隔区偶联。

本领域技术人员具有分别关于结构域接头序列的序列和结构及关于它们的预测的知识(例如George和Heringa，2003，Protein Eng.15，871-879；Bae等，2005，Bioinformatics，21，2264-2270)。结构域接头序列以相对高比例的亲水氨基酸为特征，因为它们一般结构较少，并且暴露于溶剂，所述结构域接头序列诸如利斯特氏菌内溶素PlyPSA的短接头序列AAKNPN(SEQ ID NO：37)(等，2006，J.Mol.Biol.，364，678-689)。传统上也使用聚甘氨酸接头，然而，它们通常是蛋白酶敏感的。一种特殊的亲水性非结构化接头是富含脯氨酸和苏氨酸的序列(也以天然接头存在)，例如来自肠溶素A(Enterolysin A)的TPTPPNPGPKNFTT(SEQ ID NO：36)。富含脯氨酸和苏氨酸的接头序列可简单地以共有基序(PT)xP或(PT)xT描述，其中x是从1至10的整数。Croux等(1993，Molec.Microbiol.，9，1019-1025)描述了在N端和C端结构域之间，如此在内溶素的EAD和CBD之间的所谓连接区。这些通常比较短的区域是天然接头序列，而且也适于将CBD模块在借助于用JS标签重组的切割位点下连接至依照本发明的多肽。在例如SEQ ID NO：34-38中描述了特别适于特定接头的例子。

依照本发明的多肽的序列可由下组序列组成：

i)选自SEQ ID NO：1-18的JS标签序列，

ii)选自SEQ ID NO：19-33的CBD序列，

iii)选自SEQ ID NO：34-38的接头序列，

和任选地

iv)作为间隔区的GFP、GST或MBP的序列。

在SEQ ID NO：39-53中描述了数个例示性的依照本发明的多肽序列。

本发明进一步涉及无酶促活性的细胞壁结合结构域，即Ply21的CBD。令人惊讶的是，无水解活性的CBD21在细菌结合中具有如下宿主谱，所述宿主谱除包括几乎所有的杆菌群细菌(多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)除外)之外，还进一步包括来自革兰氏阳性细菌的重要群体的代表，诸如葡萄球菌、肠球菌、链球菌，甚至利斯特氏菌。因为CBD通常展现出相对小的宿主谱(Loessner 2005，Curr.Opin.Microbiol，8，480-487)，所以CBD的这种广泛宿主特异性特征是很不寻常的。因此，CBD21能够结合所有来自蜡状芽胞杆菌群的测试细菌，另外还能够解决一般性富集革兰氏阳性细菌的问题，特别是那些自其中可找到许多病原体病菌的群体(诸如葡萄球菌、链球菌、肠球菌、微球菌、杆菌和利斯特氏菌)衍生的革兰氏阳性细菌。因此，另一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：19所示序列的多肽，但是除此细胞壁结合结构域之外，其不包含别的内溶素结构域。优选地，所述多肽不包含内溶素的有完全酶促活性的结构域。更优选地，包含SEQ ID NO：19所示序列的多肽不包含别的内溶素序列。

由于CBD21的广泛适用性，本发明还涉及依照本发明的CBD21用于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测选自下组属的细菌的用途：葡萄球菌、链球菌、肠球菌、微球菌、杆菌和/或利斯特氏菌(参见表3)；所述依照本发明的CBD21包含依照SEQ ID NO：19的序列，但是除此细胞壁结合结构域之外，其不包含别的内溶素结构域。

另外，依照本发明的多肽中限定合适CBD的多肽部分还可与充当间隔区，同时任选地充当标志物的多肽部分连接。因为CBD表示来自较大蛋白质(内溶素)的区域，所以它们一般相对较小，具有约100至300个氨基酸或者对于某些细胞结合基序甚至更少。因此，在一个优选的实施方案中，在CBD结构域和负责固定化至载体的基团之间引入间隔区是有用的。这可阻止CBD由于固定化而变性，并阻止其丧失对细胞的结合能力。对于2步方法中对多肽-细菌复合物的结合，重要的是，负责固定化至表面的基团变得更易接近，若它们不与CBD直接偶联的话。优选地，间隔区是明确限定的、可表达良好的稳定蛋白质模块，其与其它蛋白质和表面尽可能小的相互作用(例如GFP(绿色荧光蛋白)、MBP(麦芽糖结合蛋白)、GST(谷胱甘肽S转移酶))。特别合适的例子是GFP及其变体。因为GFP是高度荧光性的，其作为标志物也是合适的。为此，例如可在方法过程中监测依照本发明的多肽。在功能性测试即结合测试中，CBD的结合和依照本发明的多肽对细菌的结合以及对载体的结合可容易地检出。别的修饰也可充当标志物，如例如EP 1147419中所提出的。

为了使CBD成为依照本发明的多肽，CBD必需存在有融合蛋白内的所谓JS标签的标签。生物素与其结合配偶体链霉抗生物素蛋白或亲合素(10^-15M；Gonzales等，1997，J.Biol.Chem.，272，11288-11294)之间的非常强的键对于上文所述2步方法的运转是有益的，从本领域的现有技术知晓所述2步方法甚至比已知的1步方法更好(例如EP1147419)。其它也适于将蛋白质结合至官能化表面的标签是例如His标签或Strep标签(His-标签10^-6-10^-8M；Nieba等，1997，Anal.Biochem.，252，217-228；Strep标签，约10^-6M，Voss和Skerra，1997，ProteinEng.，10，975-982)。细菌-多肽复合物与载体的结合在2步方法中更高效，所述2步方法影响结合时间，并导致在困难条件(例如在食物样品中)下细菌丢失的可能性降低，以及导致灵敏性升高。在可能的生物素化偶联基团的选择中，证明JS标签是更优选的。一方面，化学生物素化没有导致在某个位置结合蛋白的官能性想要的限定生物素化，通过在这些限定的生物素化，CBD定向固定化至载体将是有可能的。另一方面，由此蛋白质通常是失活的。这特别可应用于相对较少的CBD蛋白质结构域。证明Avi标签(大体代表最低限度序列，其中所述最低限度序列仍将在体内在融合蛋白中被生物素化)也没有JS标签合适，因为必须引入更高的蛋白质量以实现细菌与磁珠的有效结合。与Avi标签相比，US 5,252,466中提出的用于与蛋白质融合的生物素化结构域相对较大。如此，例如肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的生物素化结构域包含595个氨基酸，这对于表达产率是不利的，而且大的融合蛋白相对而言是蛋白酶敏感的，因此是相对不稳定的(which is disadvantageous concerningboth the expression yield and insofar that the large fusion portion is relativelyprotease sensitive and therefore relatively unstable)。

证实JS标签及其衍生物为与CBD结合以便结合、富集、除去、捕获和检测样品中的细菌的非常好的生物素化标签。这些是来自肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的α亚基的、包含供体内生物素化用的共有基序(MKM)的区段及其衍生物。与完全生物素化结构域相比，所述多肽变得对例如蛋白水解更稳定，而且作为亲和标签更易于在例如克隆、表达和纯化中操作。JS标签的最低限度序列的长度为66个氨基酸，这些氨基酸对应于加有作为起始的甲硫氨酸的肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的氨基酸529至594。特别合适的是SEQ IDNO：1-18所示的序列。在Cronan(1990，J.Biol.Chem.，265，10327-10333)中强调位于MKM基序N端的富含保守脯氨酸和丙氨酸的区域应当在生物素连接酶进行的溶素生物素化方面发挥重要的结构功能。肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的α亚基的该区域甚至特别形成有长度为22个氨基酸的P和A区域。然而，已经证明该区域对于在所述系统中的生物素化不是必需的，因为上文所述最低限度序列不包含该区域，但是非常高效地被生物素化。已经证明，向肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的氨基酸529至594添加很短的肽(MVGA)可提供非常好的N端起始序列(参见SEQ ID NO：8-10和16-18)。

JS标签和CBD(和另外的在中间引入的间隔区模块)之间的融合既可在CBD的N端实施又可在CBD的C端实施(The fusion between the JS-tag and theCBD，and an additional intermediately introduced spacer module，respectively，can be carried out N-terminally as well as C-terminally of the CBD)。对于依照本发明的多肽，N端融合物是优选的，因为内溶素的CBD部分通常是位于C端，而JS标签(任选地加上间隔区模块)可在结构上替换内溶素中缺失的EAD。因为蛋白质中在体内被生物素化的生物素化结构域几乎仅位于C端，所以不显而易见的是，这些结构域若在N端使用也能运行良好。为此，在Cronan(1990，J.Biol.Chem.，265，10327-10333)中，仅使用具有谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)转羧酶的1.3S亚基的生物素化结构域的C端蛋白质融合物。若没有使用间隔区分子，则可经由接头连接JS标签与CBD(参见上文的实施方案)，或者也可没有接头，则可引入仅1至3个氨基酸以获得用于克隆的限制性切割位点。序列AGAGAGAGS或AGAGAGAGSEL(SEQ IDNO：34或35)证明是例示性的合适接头肽。然而，其它具有已知结构的蛋白质接头序列和相对非结构化肽的接头序列(例如富含脯氨酸和苏氨酸的接头诸如(PT)₃T(PT)₃T(PT)₃)也可使用。富含PT的接头的例子是TPTPPNPGPKNFTT(SEQ ID NO：36)。(短的)亲水接头的例子是AAKNPN(SEQ ID NO：37)。可在本发明中使用的接头的另一个例子是AGAGAGAEL(SEQ ID NO：38)。

在依照本发明的方法中使用的依照本发明的多肽可以被生物素化，由此其借助于生物素连接酶在本领域技术人员已知的条件下在体外被生物素化。令人惊讶的是，还证明了与US 5,252,466中所述发明相比，在细菌细胞中制备生物素化的依照本发明的多肽中生物素化的融合蛋白与生物素连接酶(BirA)的共表达不是必需的，因为生物素化也在没有外部生物素连接酶的情况下进行。有趣的是，在完全培养基(诸如LB)中，甚至一次也没必要向培养基中添加生物素。在没有额外的BirA共表达的情况中或者甚至在不添加生物素的情况中，JS标签和CBD的融合蛋白在商品化的大肠杆菌表达菌株(例如BL21(DE3)、HMS174(DE3)、JM83)中有效地受到生物素化。与US5,525,466中提出的生物素化标签的用途(作为用于较容易地纯化蛋白质的手段)相比，没有必要经由针对生物素的亲和柱来纯化本文所述JS标签和CBD的融合物，而是可以常规方式纯化，诸如经由阳离子或阴离子交换层析、疏水层析、分级硫酸铵沉淀等进行。一方面，这是有益的，因为针对生物素的相应亲和材料是很贵的，而且经常仅为低容量，例如携带偶联的链霉抗生物素蛋白或Streptactin的层析材料；另一方面，融合蛋白难以自亲和材料释放，因为生物素与其结合配偶体之间的结合是非常高效的。这导致所述纯化方法中的问题。如此，靶蛋白质从该柱中延迟洗脱(“拖尾”)，而且在洗脱过程中有可能变性。

依照本发明的构建体的稳定性在某种程度上取决于所使用的CBD的特定特性。由JS标签、CBD和任选的接头、间隔区和标志物组成的融合构建体以及官能化载体(诸如磁珠)可在不丧失它们的结合能力的情况下在较长的一段时间里贮存。贮存的温度范围有可能在约-20℃至约37℃。优选的是在约-20℃至约10℃的温度贮存。通常，贮存应当在约中性pH值(pH6-7)实施，但是若CBD部分容许，pH值高达10的贮存也是有可能的。适于贮存的缓冲系统是例如100mM磷酸钠缓冲液，pH6至pH10，2mM EDTA或10mM咪唑，100mM NaCl，pH7。一般而言，稳定剂诸如甘油或硫酸铵(例如30％饱和)的添加对贮存能力有积极的影响。

通过依照本发明的方法，在依照本发明的多肽构建体的应用下，基本上可结合所有的革兰氏阳性细菌(诸如梭菌、杆菌、利斯特氏菌、葡萄球菌、乳杆菌、肠球菌、气球菌、足球菌、链球菌、分枝杆菌、明串珠菌)，因此可进行富集、捕获、固定化，和任选地，进行检测。如上文所限定的，应用方式依赖于所使用样品的类型。特别合适的是富集和检测来自食物样品的潜在病原体细菌的方法。然而，该方法也适用于富集和检测来自医学或诊断性样品的病原体细菌。此外，其适用于除去或检测来自下述样品的革兰氏阳性细菌，在所述样品中它们不是想要的，例如在药学或化妆用制品和过程溶液中。与常规富集方法(诸如ISO方法)相比，依照本发明的方法在富集方面节省许多时间。与使用官能化磁性颗粒以捕获细菌-多肽复合物的磁性分离组合时，可替换复杂的，而且难以自动化的分离方法，例如离心步骤。

本发明进一步涉及编码依照本发明的多肽的核酸以及载体，以及表达所述核酸和载体的细胞。本领域技术人员能够用本领域情形中已知的规程来制备编码依照本发明的多肽的合适核酸和载体。依照本发明的多肽的氨基酸序列可以衍生自例如基于遗传密码的合适核酸序列。任选地，密码子的优化使用在这里视为取决于所选的表达系统。本领域技术人员还能够选择合适的载体，例如以便确保经由上文所述核酸来表达依照本发明的多肽。

令人惊讶的是，证明了翻译多肽序列的JS标签的N端部分中的核酸序列对于有效表达是重要的。在维持氨基酸序列的前提下，与富含GC的序列相比，富含AT的序列显示显著更高效的表达。假设的是，二级结构元件在转录RNA开端的形成影响翻译效率。这些富含AT的序列的3种变体(SEQ ID NO：54至56)证明为特别适用于JS标签和随后的CBD之间的融合物(参见表1)。因此，在一个优选的实施方案中，编码依照本发明的多肽中的JS标签的核酸序列部分以选择SEQ ID NO：54至56的序列开始。

依照本发明的方法和依照本发明的多肽片段分别以如下优势为特征：

·具有JS标签与内溶素的CBD的组合的融合物一般适于快速而有效地结合革兰氏阳性细菌。

·CBD和JS标签的融合物非常适于在高效的2步方法中富集细菌，因为作为偶联基团的生物素容许CBD细菌复合物非常好的固定化。

·与CBD和JS标签的融合物组合的2步方法容许载体材料的投入变小，并且主要是特异性结合蛋白的投入(input)变小，这在经济方面是有益的。该方法中的生物素化是非常高效而精确限定的，使得与其它方法相比可获得非常高比例的功能性结合蛋白。与事先固定化在表面上的结合蛋白(其中经常发生空间问题、作为副反应的非特异性结合、和非功能性固定化)相比，细菌与游离结合蛋白的结合也有效地多。

·依照本发明的方法还适用于固定化不同的CBD细菌复合物与同一种载体。

·CBD和JS标签的融合物证明为高度稳定性的构建体，特别是以在温度高达约30℃时的长期稳定性和蛋白酶稳定性为特征。

·JS标签具有适于操作的长度，因为一方面，其不是太长，而另一方面，其足够长以使得不再必需间隔区。

·用于制备依照本发明的多肽的依照本发明的方法甚至在没有BirA共表达的情况中也起作用。

本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含提供有作为功能性基团的生物素结合物质(诸如链霉抗生物素蛋白或亲合素)的载体，还包含至少一种具有融合有JS标签的CBD的依照本发明的多肽片段的变体，以及富集和任选的检测革兰氏阳性细菌必需的缓冲溶液，例如清洗缓冲液、洗脱缓冲液和/或溶胞缓冲液。

实施例

下列实施例阐明本发明，并且不会视为对本发明的限制。除非另有说明，根据例如Sambrook等，1989，Molecular cloning：A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York所述使用分子生物学标准方法。

实施例1：具有生物素化标签的噬菌体尾部蛋白质的表达、溶解度和功能性装配

图1中描绘了实验结果。依照标准方法，在pET21a或pET21d中克隆图1所示来自沙门氏菌或弯曲杆菌噬菌体的噬菌体尾部蛋白质，并在给定的表达菌株中在IPTG诱导(每种方法1ml)后在30℃表达。3至4小时后，将细胞离心(台式离心机，5分钟，13,000rpm)，并将沉淀物溶解于缓冲液(例如20mMTris，5mM EDTA，pH8)中。使用超声来溶解细胞，并再次离心(20分钟，13,000rpm，4℃)。取出含有可溶性蛋白质的上清液，并煮沸5分钟或不进行煮沸。在未煮沸的样品内，应当形成SDS耐受的天然三聚体，其可在较高分子量处找到。将含有不溶性蛋白质的沉淀物重悬于相同体积的缓冲液(例如20mM Tris，pH9，50mM NaCl，5mM EDTA)中。将样品缓冲液添加至所有的样品，并分别在12％和9％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上加载样品，并用考马斯染色。

在所有三个子实验中显示了，利用具有特定生物素化标签噬菌体尾部蛋白质不可获得有效量的功能性蛋白质。部分地，表达率是非常差的，部分地，大部分的蛋白质是不可溶的，并且不可能获得高比例的以SDS耐受的寡聚体形式为特征的天然蛋白质。仅对于P22样噬菌体尾部蛋白，可在SDS凝胶上检测出单体和天然三聚体的条带。对于其它两种蛋白质，在Western印迹上仅可检测出很弱的单体条带，使得可确定位置，并可检验诱导和表达的基本运行。

实施例2：CBD的化学生物素化

各制备1mg/ml CBD511(在PBS中；20mM磷酸钠pH7.4，120mM氯化钠)和NHS-生物素(在DMSO中)的储液。将120μl NHS-生物素溶液添加至1200μl蛋白质溶液并充分混合。立即(0分钟数值)取出或在20分钟、60分钟或120分钟后取出300μl的每种样品，并添加至在冰上的30μl 1M Tris，pH8以停止反应。针对PBS缓冲液透析所有样品。通过测量吸收来测定所有样品的蛋白质浓度，并使用HABA测试来测定生物素化的程度。生物素化的程度是每个CBD分子1.5至2.5个生物素分子。用菌株单核细胞增生利斯特氏菌Scott A进行细胞结合测试，该菌株以10⁴CFU/ml的浓度引入500μl测试样品(缓冲液PBST；20mM磷酸钠pH7.4，120mM氯化钠，0.1％Tween 20)中。随后，分别以浓度0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml添加生物素化的CBD511，并温育1分钟。JS标签CBD511起对照的作用。将MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)添加至50μg/ml，并将样品在室温在顶置旋转器(overhead rolator)中温育20分钟。磁性分离5分钟后，取出上清液，并用500μl PBST缓冲液清洗磁性颗粒1次(10分钟)。第2次磁性分离之后，将磁性颗粒添加于1个缓冲液体积中，并在Oxford板上铺板(未稀释的和稀释1∶10的)。作为对照，将第1次和第2次磁性分离后合并的上清液铺板，并在1夜后计数。图2中描绘了该实验。可看出的是，通过化学生物素化，所有的CBD变得失活，而用通过JS标签而特异性生物素化的CBD进行的细胞结合测试正常运行。

实施例3a：用1步方法、2步方法和ISO方法检测卡门培尔干酪(camembert)中的利斯特氏菌

在无菌条件下以25g的分配单位(portion unit)分开300g来自超市的卡门培尔干酪，并在-80℃贮存在Stomacher袋中。依照规则ISO：11290-1：1996FDAM 1，对1个分配(portion)单位分析利斯特氏菌的存在。若没有检测出利斯特氏菌污染，则在室温解冻5个分配单位，并用不同量的单核细胞增生利斯特氏菌ScottA感染。因此，将过夜培养物稀释1∶5，并在37℃温育至OD₆₀₀为约1。随后，在无菌PBST(20mM磷酸钠pH7.4，120mM氯化钠，0.05％Tween)中制备连续稀释物。以0、1-10、11-50、50-100和100-500CFU/25g卡门培尔干酪污染分配单位，并在4℃过夜贮存。为了精确测定细胞数目，将一式两份的稀释物铺于Oxford琼脂(Profos AG)上，将平板在37℃温育24小时，并计数。在无菌条件下将225ml Fraser ¹/₂培养基(Profos AG)添加至分配单位，在Stomacher中均浆化1分钟，并在30℃培育。温育时间达4小时、6小时和24小时后，取出1ml的每种样品。

1步方法：将300μg/ml经Strep-标签-CBD511_f2包被的磁性颗粒(Dynabeads Epoxy)添加至1ml均浆，并将样品在室温在顶置旋转器中温育20分钟。

2步方法：将5μg Strep-标签-GFP-CBD511_f2融合蛋白添加至1ml均浆，并立即混合。随后将MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)添加至50μg/ml，并将样品在室温在顶置旋转器中温育20分钟。

随后在磁场中在管壁上收集颗粒-利斯特氏菌复合物，并除去上清液。将颗粒-利斯特氏菌复合物在顶置旋转器中在1ml PBST(20mM磷酸钠pH7.4，120mM氯化钠，0.05％Tween)中清洗3次达10分钟，在磁场中在管壁上收集，并弃去每次的上清液。将颗粒-利斯特氏菌复合物重悬于100μl PBST中，并在Oxford琼脂(Profos AG)上铺板。在37℃在24小时和48小时后，对平板计数，并以引入细胞的百分比计算附着于磁性颗粒的利斯特氏菌的比例。平行地，依照规则ISO：11290-1：1996 FDAM 1，对受污染的样品分析利斯特氏菌。因此，在给定的时间点将100μl添加至10ml Fraser培养基(Profos AG)，在37℃在旋转器中温育24小时，随后在Oxford琼脂(Profos AG)上铺板。一式四份进行所有的样品。

已经显示了，与依照ISO：11290-1：1996的方法(用于检测卡门培尔干酪中较少的利斯特氏菌污染)相比，用1步方法以及2步方法所必需的浓缩时间显著更短。对于富集时间缩短，2步方法的结果比1步方法的结果更好。

实施例3b：从莫泽雷勒干酪(mozzarella)检测利斯特氏菌

将225ml FDA培养基添加至每块25g的莫泽雷勒干酪，并将各份额在无菌条件下在Stomacher袋中匀浆化。将样品在30℃温育过夜。以500CFU/ml的浓度添加利斯特氏菌菌株EGDe(血清型1/2a)和ScottA(血清型4b)。在检测利斯特氏菌之前，各用1/10个体积的PBST对样品进行缓冲。

1步方法：将300μg/ml经JS-标签-GFP-CBD511_f3包被的磁性颗粒(Dynabeads M270 Epoxy)添加至1ml均浆，并将样品在室温在顶置旋转器中温育20分钟。

2步方法：将0.5、2、5或10μg JS-标签-GFP-CBD511_f3融合蛋白添加至1ml均浆，并短暂混合。随后将MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)添加至50μg/ml，并将样品在室温在顶置旋转器中温育20分钟。

随后在磁场中在管壁上收集颗粒-利斯特氏菌复合物，并除去上清液。将颗粒-利斯特氏菌复合物在顶置旋转器中在1ml PBST中清洗1次达10分钟，在磁场中在管壁上收集，并弃去每份上清液。将颗粒-利斯特氏菌复合物重悬于100μl PBST中，并在Oxford琼脂(Profos AG)上铺板。在37℃在24小时后，对平板计数，并以使用细胞的百分比计算附着于磁性颗粒的利斯特氏菌的比例。所有方法进行两次。

已经显示了借助于JS-标签-GFP-CBD511_f3融合蛋白，可从食物中分离利斯特氏菌。对于莫泽雷勒干酪，这对菌株EGDe的效果显著好于对ScottA的效果。在食物中应当使用些微较高的蛋白质浓度以实现高结合效率。

实施例4：JS-标签-CBD的细胞结合能力

实施例4a：JS-标签和Avi-标签构建体的细胞结合能力比较

依照2步方法，用利斯特氏菌菌株ScottA测试不同构建体的细胞结合能力。使用下列构建体：JS-GFP_CBD511_f3、JS-CBD511_f3和Avi-Tag-GFP_CBD511_f3。因为构建体具有不同长度，所以使用等摩尔量的结合蛋白。将给定量的融合蛋白添加至1ml测试样品(10⁴CFU/ml浓度的来自新鲜预培养物(pre-culture)的利斯特氏菌，PBST缓冲液)，并短暂混和。随后，将MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)添加至50μg/ml，并将混合物在室温在顶置旋转器中温育20分钟。随后在磁场中在管壁上收集颗粒-利斯特氏菌复合物，并除去上清液。将颗粒-利斯特氏菌复合物在顶置旋转器中在1mlPBST中清洗1次达10分钟，在磁场中在管壁上收集，并弃去每份上清液。将颗粒-利斯特氏菌复合物重悬于100μl PBST中，并在Oxford琼脂(Profos AG)上铺板。在37℃在24小时后，对平板计数，并以引入细胞的百分比计算附着于磁性颗粒的利斯特氏菌的比例。所有方法进行两次，并计算均值。在图4A中描绘了该实验。可以看出JS-标签构建体比Avi-标签构建体更好地结合。这里必须引入显著较多的蛋白质以实现最大限度的细胞结合。

实施例4b：Avi-GFP-CBD511_f2和JS-CBD511_f2的纯化

在大肠杆菌HMS174中表达、细胞收获、溶胞和硫酸铵沉淀之后，经由阳离子交换层析来纯化两种蛋白质。共表达Avi-GFP-CBD511_f2和BirA。

实施例4c：细胞对磁性颗粒结合的浓度依赖

已经分析哪个浓度开始的特异性结合蛋白获得最大限度的细胞结合。以0μg/ml、0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml和3μg/ml浓度使用作为结合蛋白的JS-CBD511_f3。以类似于实施例4a的方式进行该实验。在图4B中描绘了结果。已经显示，在0.5μg/ml的很低蛋白质浓度已经实现基本上100％所有引入细胞的最大限度细胞结合。

实施例5：JS-标签的N端区域中的核苷酸序列的优化

虽然已经显示了包含肺炎克雷伯氏菌草乙酸脱羧酶的C端部分的核苷酸序列的JS-标签CBD构建体在体内被生物素化，但是它们展现非常差的蛋白质表达产率(还可参见表2)。因此，在不改变氨基酸序列的情况下针对表达产率优化编码克雷伯氏菌序列的前一些氨基酸的核苷酸序列和我们的细胞中额外引入的起动肽(MVGA)的核苷酸序列。从一整套不同的序列提议中，证明编码3种不同核苷酸序列的5种变体为是特别适合的。所有变体共同具有的是，与原始序列相比它们是富含AT的，若密码子的选择容许这针对相应的氨基酸的话。在表1中汇总了变体(以灰色突出显示变异)。

表1：JS-标签的N端序列区域的核苷酸变体

证明变体JS4a、JS5b、JS5d、JS10a和JS10c为特别适于表达JS-标签和CBD的融合构建体。对于单一变体之间依赖于所使用CBD部分的表达有些微的差异。然而，基本上所有的都可被使用。

实施例6：JS-标签-CBD构建体与BirA的共表达

已经测试了BirA(生物素连接酶)的共表达对于在体内有效生物素化JS-标签构建体是否为必需的。

在表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中在载体Pet21a中表达构建体JS5b-CBD511_f2。若共表达BirA，则额外存在质粒pACYC184-BirA。用表达菌株的过夜培养物接种新鲜的LB培养基(在2L烧瓶中，总量4L至10L)，在OD₆₀₀为约0.4至0.6用1mM IPTG诱导细胞，并在4小时后收获。诱导期间将50μM生物素额外添加至一部分样品。每个构建体测试两次。收获后，将细胞离心，并溶解。通过分级硫酸铵沉淀和随后的阳离子交换层析来实施纯化。在SDS凝胶中证明蛋白质的纯度。

表2：不同JS-标签-CBD构建体的表达和纯化产率

构建体	BirA共表达	表达温度	蛋白质mg/g细胞
				JS-(原始的)	+	37℃	1.1

JS-(原始的)	+	37℃	0.4
				JS-(5b-变体)	+	30℃	5.0
JS-(5b-变体)	+	37℃	7.0
				JS-(5b-变体)	-	37℃	3.8
JS-(5b-变体)	-	37℃	6.9

与来自肺炎克雷伯氏菌的原始序列相比，对于在核苷酸序列上优化的构建体JS-5b(参见实施例5)，表达产率显著的更好。BirA的共表达基本上没有提高基于引入的细菌细胞量的蛋白质产率。

在有BirA共表达的情况中和在没有BirA共表达的情况中用JS-标签构建体进行细胞结合测试。

在具有利斯特氏菌菌株ScottA的细胞结合测试中引入JS5b_CBD511_f2。使用1ml具有10³CFU/ml利斯特氏菌浓度的样品。作为磁性颗粒，使用0.05mg/ml浓度的链霉抗生物素蛋白-磁性颗粒(Roche)。其它方面依照实施例3b中所述的2步方法实施该实验。分析在有BirA和没有BirA的情况中以及在添加额外的生物素(50μM)和不添加额外的生物素的情况中表达的构建体。在图5中描绘了结果。

实施例7：细菌与His-标签-CBD和JS-标签-CBD的结合的比较

自预培养物新鲜接种蜡状芽胞杆菌(DSM345)，并在30℃在TS培养基中培养至OD₆₀₀为约1。在测试样品(1ml)中引入3×10³CFU/ml浓度的细菌。对于His-标签构建体，缓冲液是镍缓冲液A(20mM磷酸钠，500mM NaCl，20mM咪唑，0.1％Tween 20，pH7.4)；对于JS-标签构建体，缓冲液是PBST。以1μg/ml的浓度添加His-标签-CBDBa和JS-标签-CBDBa，以0.12μg/ml的浓度添加His-标签-CBD21和JS-标签-CBD21，并在室温温育5分钟。随后，以约8×10⁶个颗粒/ml的浓度分别添加Ni-NTA-琼脂糖珠(Qiagen)和MagPrep-链霉抗生物素蛋白珠，滚动温育20分钟，并用磁力分离器分离5分钟。用1个样品体积的缓冲液清洗磁性颗粒。将含有未结合细菌的清洗溶液和上清液以及取出的含有结合细菌的磁性颗粒在CASO完全培养基平板上铺板。在27℃约18小时后，对菌落计数。各进行2次实验。不含所添加蛋白质的方法起对照作用。在图6中描绘了该实验。

在给定的条件下用JS-标签构建体非常特异性地结合细菌，而用His-标签构建体，对于结合细胞的产率是完全不足的。基本上没有细菌对两种磁性颗粒的非特异性结合。

实施例8：分别从不同培养基和缓冲液中富集利斯特氏菌

分别用Avi-CBD511_f2和JS-CBD511_f2(各5μg/ml)从不同培养基和PBST缓冲液中富集单核细胞增生利斯特氏菌EGDe。将利斯特氏菌在TB培养基中温育至OD₆₀₀为约1，并在给定的培养基或缓冲液中制备其预稀释物(predilution)。在测试中使用10⁴CFU/ml浓度的利斯特氏菌。依照2步方法实施细胞结合测试，其中与50μg/ml MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)一起滚动温育20分钟，并用PBST清洗1次。将结合的和未结合的细胞在Oxford琼脂上铺板，并在1晚后计数。给出两个实验的相应均值。在图7中描绘了该实验的结果。

实施例9：在含有生物素的样品中细菌与Strep-标签-CBD和JS-标签-CBD的结合的比较

食物样品中通常包含生物素。因为JS标签以及Strep-标签对链霉抗生物素蛋白的结合与生物素竞争，所以分析哪个系统在含有生物素的样品中更为合适，以便特异性富集细菌。自预培养物新鲜接种蜡状芽胞杆菌(DSM345)，并在30℃在TS培养基中培养至OD₆₀₀为约1。以1×10³CFU/ml的浓度将细菌引入测试方法(1ml)中。作为测试溶液，使用含有给定生物素浓度(0.01μM、0.1μM、1μM)的PBST。以20μg/ml的浓度分别添加JS标签和Strep标签CBDBa，并在室温与细菌一起温育约2分钟。以50μg/ml的浓度添加链霉抗生物素蛋白-PA珠，滚动温育20分钟，并用磁力分离器分离5分钟。用1个样品体积的缓冲液清洗磁性颗粒。将含有未结合细菌的清洗溶液和上清液以及取出的含有结合细菌的磁性颗粒在CASO完全培养基平板上铺板，并在室温温育过夜。在30℃再温育4小时后，对菌落计数。各进行2次实验。不含所添加蛋白质的样品起对照作用。在图8中描绘了结果。已经显示了，与较差的结合Strep-标签系统相比，在含有生物素的样品中用JS标签系统进行的细胞结合起显著更好的作用。在1μM生物素浓度用JS标签仍可检测出特异性结合，而这在相同条件下用Strep标签是不可能的。

实施例10：在不同条件下JS-标签-CBD构建体的长期稳定性

将JS-CBD-511_f3(约1mg/ml)和链霉抗生物素蛋白磁性颗粒(约1mg/ml)的储液在给定的条件下温育，并引入含有利斯特氏菌的细胞结合测试中。1ml测试(PBST缓冲液)中的磁性颗粒浓度是50μg/ml，蛋白质浓度如给定的，而所使用的细菌数目是10⁴CFU/ml。

实施例10a：将结合蛋白和磁珠在-20℃、4℃、RT(约23℃)和37℃在100mM磷酸钠，pH6-7，2mM EDTA中贮存长达126天，并在利斯特氏菌结合测试中以给定浓度使用。可看出，仅在126天后且主要在37℃温育的该情况中，结合功效显著降低。

实施例10b：将结合蛋白和磁性颗粒在-20℃、4℃、RT(约23℃)和37℃在加有30％硫酸铵的10mM咪唑，pH7，100mM NaCl中贮存长达74天，并在利斯特氏菌结合测试中以给定浓度使用。可看出，温育74天后结合功效在所有的温度均些微降低，但仍超过50％。

看来两种缓冲系统都适于JS-CBD构建体和合适的链霉抗生物素蛋白磁性颗粒的长期温育。

在图9中描绘了结果。

实施例11：从不同食物中富集利斯特氏菌

在图10中描绘了该实验。

实施例11a：将单核细胞增生利斯特氏菌ScottA的过夜培养物在FDA-Oxoid培养基中以1∶5稀释，并在37℃培养至OD₆₀₀为约1。分别将牛奶和均浆化奶酪在PBST中以1∶10稀释，并用10⁴CFU/ml浓度的利斯特氏菌接种。以给定的浓度将JS4a-CBD511_f2添加至Eppendorf杯，并与各1ml样品溶液混合。作为磁性颗粒，以50μg/ml的浓度使用链霉抗生物素蛋白磁性颗粒(Roche)，并将样品在顶置旋转器中温育10分钟。在磁力分离器中将磁性颗粒分离5分钟，随后用1ml PBST缓冲液清洗1次，并在1ml缓冲液中处理。将100μl未稀释的和1∶10稀释的珠级分和合并的上清液(在第1次磁性分离和清洗步骤之后)在Oxford琼脂上铺板，并在37℃温育过夜。第2天对利斯特氏菌进行计数，并计算多少百分比的所发现细菌经由JS4a-CBD511_f2结合至磁珠。已经显示了，在0.2μg/ml特异性结合蛋白浓度的JS4b-CBD511_f2已经从牛奶以及从奶酪中基本上完全除去引入的利斯特氏菌细胞。在0.02μg/ml的很低蛋白质浓度已经可除去50％的细菌。

实施例11b：将各25g熏制鲑鱼和萨拉米香肠均浆化，用LEB-FDA培养基稀释1∶10，并用10⁴CFU/ml浓度的无害利斯特氏菌接种，并在室温在Stomacher袋中温育1小时。将所使用的细菌稀释物作为对照铺板。取出Stomacher袋中的各1ml滤液样品，并与JS5b-CBD511_f3(1μg/ml)混合。不向对照添加蛋白质。随后立即添加400μg/ml PA-链霉抗生物素蛋白珠，并在顶置旋转器中温育20分钟。将磁性颗粒在磁力分离器中分离5分钟，随后用PBST缓冲液清洗1次，并再次在1ml缓冲液中处理。

将100μl未稀释的和1∶10稀释的珠级分和合并的上清液(在第1次磁性分离和清洗步骤之后)在Oxford琼脂上铺板，并在37℃温育过夜。第2天对利斯特氏菌进行计数，并计算各有多少百分比的找到细菌经由JS5b-CBD511_f3结合至磁性颗粒。已经显示了，可从熏制鲑鱼以及萨拉米香肠中结合超过90％的细菌。

实施例12：用NASBA技术从食物中检测利斯特氏菌

将单核细胞增生利斯特氏菌ScottA的过夜培养物在LEB-FDA培养基中稀释1∶5，并在37℃培养至OD₆₀₀为约1。制备其高达10²CFU/ml的连续稀释物。对2x 60g萨拉米香肠称重，并用5CFU/25g食物的浓度的利斯特氏菌污染。对于每块60g样品，添加540ml LX培养基(BioMerieux)，将样品均浆化，并在37℃在Stomacher袋中分别温育17小时和20小时。随后，在来自Stomacher袋的上清液的1ml样品中用JS5b-CBD511_f2捕获细菌。另外对上清液进行铺板，并作为对照计数。以1μg/ml的浓度添加结合蛋白，并与样品一起温育1分钟。随后，以400μg/ml的浓度添加PA链霉抗生物素蛋白磁性颗粒，并在过夜旋转器中温育20分钟。将磁性颗粒在磁力分离器中分离5分钟，随后每次用1ml TT缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，0.1％Tween 20)清洗3次。将一部分具有结合细菌的磁性颗粒在Oxford琼脂上铺板，并在温育15至20小时后计数以获得结合功效。在图(图11)的部分A中描绘了结果。引入一部分具有经由JS-标签-CBD结合的利斯特氏菌的磁性颗粒以在NASBA中检测。将珠子上的细胞用5μg/ml在100μl溶解缓冲液A(21％DMSO，57mM Tris，0.4％Triton X100)中的利斯特氏菌特异性内溶素在室温溶解15分钟。随后，在磁力分离器中对磁珠分离5分钟，并且每个NASBA反应使用14μl溶胞产物。使用已经携带预先制备的(precasted)利斯特氏菌特异性引物珠的测试纸条(各针对8个样品)。对于每个样品，添加5μl用于NASBA的酶溶液，并依照制造商的方案进行反应。作为NASBA系统，一起使用Nuclisens EasyQ分析器(BioMerieux)与相应的加热块(thermo-block)。以时间依赖性荧光信号评估数据。在成功的检测反应后，在约30分钟的检测时间之后荧光信号升高至较高的水平，并保持在那里。每个实验方法进行7个NASBA反应。在图11b中描绘了NASBA检测(在温育17小时后)。可看出在所有7个反应中检测出阳性荧光信号，因此经由特异性RNA引物进行的利斯特氏菌检测已经起作用。

已经显示了，在所述系统中在食物与5CFU/25g浓度的利斯特氏菌一起温育17小时后，已经可结合超过99％的细菌并可检出。检测经由常规选择性平板(参见图11a)以及经由如NASBA的基于核酸的方法(其在捕获细菌后仅持续约2.5小时)(参见图11b)常规地运行。

用熏制鲑鱼、虾、布里干酪(brie)、火鸡肉和猪肉香肠和来自山羊的奶油奶酪也成功地进行相当的实验。

实施例13：自杆菌内溶素衍生的JS-标签-CBD的特异性细胞结合

对于所有的细菌菌株，在完全培养基中培养过夜培养物。将过夜培养物在完全培养基(例如CASO、LB、TS、TY)中接种1∶20至1∶5，并进一步培养至OD₆₀₀为约1。所有杆菌细菌的生长温度是30℃，所有其它菌株的生长温度是37℃。自预培养物制备稀释系列。在测试方法(500μl的体积)中，以10³至10⁴CFU的浓度使用细菌。为了测定每个所使用稀释物的准确细胞数目，将相应的对照铺板，并计数。分别以10μg/ml和1μg/ml的浓度各将JS-标签-CBDBa和JS-标签-CBD21添加至测试方法(缓冲液PBST)，并与细胞一起温育约1分钟。随后，以50μg/ml的浓度添加先前用CASO-Tween(0.1％)溶液封闭的MagPrep-链霉抗生物素蛋白颗粒(Merck)。将含有细菌、结合蛋白和磁性颗粒的样品在顶置旋转器中在室温温育20分钟。将磁性颗粒在磁力分离器中分离5分钟，随后用1ml PBST清洗1次，随后在缓冲液中重悬。在磁性分离后将各100μl含有结合细胞的重悬珠级分和合并的上清液级分及清洗溶液铺板。干燥后，将平板在相应的生长温度温育过夜，在第2天早晨计数，并由相应的稀释因子校正。分别给出多少百分比的总结合细菌经由JS-标签-CBD而特异性结合至磁性颗粒和多少百分比的总结合细菌与样品分开。针对细菌对磁性颗粒的潜在非特异性结合，不含所添加特异性结合蛋白的样品起对照作用。作为进一步的对照，也进行铺板和计数的细菌预稀释物用作预期细胞数目。仅评估如下实验，其显示回收细胞的总数范围为总使用细胞的80％至120％。每个测试进行2至4个实验。

表3中描述了与不同杆菌菌株和其它革兰氏阳性细菌以及革兰氏阴性细菌的相应结合数据的概述。

表3：在细胞结合测定法中JS-CBDBa和JS-CBD21对不同细菌菌株的结合能力

如所预期的，两种CBD都没有显示对革兰氏阴性细菌的结合。然而，两者都自蜡状芽孢杆菌噬菌体分离的CBD的结合特异性是出乎预料的完全不同的。已经显示了，CBDBa对来自蜡状芽孢杆菌群的杆菌是非常特异的。除该群之外仅2种链球菌菌株被识别。然而，CBD21展现出对革兰氏阳性细菌特别宽的结合特异性。蜡状芽孢杆菌群的所有代表都受到结合，另外还有除球形芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌外的所有别的测试杆菌。特殊的是，来自其它科的革兰氏阳性细菌也受到结合。6种所测试的科均被识别，所述测试的科的特征在于它们展现出高的病原体潜力。因此，CBD21特别适于在病原体细菌造成问题的不同领域中富集、除去和检测所述病原体细菌。与进一步测试的片段(其也衍生自内溶素plyB21)相比，本文所述片段(SEQ ID NO：19)以提高的稳定性和降低的聚集易感性为特征。

实施例14：从细菌混合物中特异性结合蜡状芽孢杆菌

在下列细菌的完全培养基中培养过夜培养物：蜡状芽孢杆菌(DSM345)、田纳西沙门氏菌、单核细胞增生利斯特氏菌(ScottA)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌HMS174(DE3)。在新鲜培养基中接种过夜培养物，并分别在37℃和30℃(杆菌)培养约3小时，至OD₆₀₀为约1。在该测试中以约10³CFU/ml的稀释使用所述菌株。将相应的稀释物作为对照铺板，并计数。测试混合物具有1ml，并在PBST(20mM磷酸钠，120mM NaCl，pH7.4，0.1％Tween 20)中进行。作为特异性结合蛋白，以20μg/ml的浓度提供JS-标签-CBDBa。对于对照实验，仅添加PBST替代蛋白质。各添加10μl细菌预稀释物，使得在每种样品中的细菌浓度是约10³CFU/ml。将细菌与细胞一起温育1分钟。随后，添加100μg/ml PA-链霉抗生物素蛋白磁珠(Microcoat)，并将样品在室温滚动温育20分钟。将磁性颗粒在磁力分离器中收集5分钟，并取出上清液。用1ml PBST将分离的磁性颗粒清洗1次达5分钟。合并清洗溶液和上清液。再次用PBST将磁珠补足至1ml。将各来自不同稀释物的100μl铺板，一方面在CASO平板(酪蛋白、大豆提取物；完全培养基，Merck)上而另一方面在PEMBA平板(针对蜡状芽孢杆菌的选择性培养基，含有多粘菌素B、蛋黄、甘露醇)上，并在27℃温育约18小时，随后计数。从2个实验各测定2个均值。回收细胞的总数源自于结合至磁性颗粒的细胞和分别保留在上清液和清洗溶液中的细胞的总数。铺板的细胞稀释物用作对照。在图12中描绘了结果。已经显示了，仅在添加特异性CBD之后才从样品中富集蜡状芽孢杆菌，而在不添加蛋白质的情况中，细菌没有被结合至磁性颗粒。还显示了，仅蜡状芽孢杆菌经由珠子而被结合，而其它细菌仅在其上铺有上清液的CASO平板上生长。

实施例15：从含有碳水化合物的食物中富集蜡样芽胞杆菌

作为食物样品，使用预煮的快熟米(express rice)(上等的长粒度快熟米，Uncle Ben`s)。在无菌条件下将5g预煮的快熟米及50ml TSPB培养基(含有0.01mg/ml多粘菌素B的TS完全培养基)转移至Stomacher袋中，并均浆化1分钟。将蜡状芽孢杆菌(DSMZ345)的过夜培养物在30℃在TS培养基中温育。将2ml过夜培养物转移至10ml新鲜的TSPB培养基中，并温育，直至达到OD600＝0.8。向990μl来自Stomacher袋滤液的食物样品掺入10μl每种不同稀释度的杆菌预培养物，使得食物样品中的杆菌浓度是10²、10³、或10⁴CFU/ml。将TSPB培养基掺入作为对照。在室温温育5分钟后，每个样品添加10μg JS-标签-CBDBa，并充分混合。对照样品没有获得蛋白质。在约1分钟后，添加400μg链霉抗生物素蛋白PA磁珠(Microcoat)，并将样品在室温滚动温育20分钟。将磁珠在磁力分离器中收集5分钟，并取出上清液。用1ml PBST清洗分离的磁性颗粒2次每次5分钟。合并清洗溶液及上清液。再次用PBST将磁珠补足至1ml。将各100μl不同稀释度的样品与磁性颗粒及与上清液分别铺至选择性PEMBA平板上，随后在30℃温育过夜，然后进行计数。各平行铺于2块平板。在图13中描绘了结果。显示基本上所有来自食物样品以及来自TSPB培养基的蜡样芽胞杆菌细胞选择性结合至JS-标签-CBDBa，随后结合至磁性颗粒，而在上清液中和在清洗溶液中，几乎没有蜡样芽胞杆菌细胞剩余。在不含蛋白质的对照样品中，杆菌没有非特异性结合至磁性颗粒。

实施例16：从血液中富集蜡状芽孢杆菌

在TB培养基中在30℃培养蜡状芽孢杆菌(DSMZ345)过夜。将新鲜TB培养基接种1∶10，并培养细菌至OD₆₀₀为约1。将各0.5ml柠檬酸盐、EDTA或肝素血液各与0.5ml PBST混合。血液中的所有添加物起抗凝剂的作用。柠檬酸盐-血液：用血液将0.106M柠檬酸盐稀释1∶10。EDTA-血液：1.2-2mg EDTA/ml血液。肝素血液：10-30I.U.肝素/ml血液。将10μl蜡状芽孢杆菌预培养物掺入1ml缓冲血液样品，使得细菌浓度是约10³CFU/ml。因此，添加5μl JS-标签-CBD21蛋白质溶液(2mg/ml)，并短暂涡旋。对照没有获得蛋白质。随后，添加40μl磁性颗粒(链霉抗生物素蛋白-PA珠，Microcoat，10mg/ml)，并将样品在室温滚动温育20分钟。将磁性颗粒在磁力分离器中分离5分钟。取出含有未结合细菌的上清液，并用1ml PBST清洗珠子1次(5分钟)。在磁性分离后合并清洗溶液和上清液。将1ml PBST添加至含有JS-标签-CBD和细菌的结合复合物的磁珠。将各100μl 1∶10稀释的合并上清液和包含磁性颗粒的溶液在选择性PEMBA平板上铺板，并温育约18小时，并计数。各用2个实验形成均值。在图14中描绘了该实验的结果。已经显示了，借助于JS-标签-CBD21，几乎所有来自血液的杆菌都可被除去。在不含蛋白质的对照中已经显示了，仅对于包含肝素的血液样品，出现一定百分比(约25％)的对磁性颗粒的非特异性结合。对于柠檬酸盐血液和EDTA血液，非特异性结合的比例是非常低的。

实施例17：用CBD3626的JS-标签构建体结合梭菌

基于文献(Zimmer等，2002，Appl.Environm.Microbiol.，68，5311-5317)中所述产气荚膜梭菌噬菌体Φ3626的内溶素Ply3626，用分子生物学技术制备具有JS标签的潜在合适的CBD3626的不同变体。因为开始时所有构建体的表达是很差的，所以制备根据梭菌和大肠杆菌中不同的密码子应用而优化的合成基因。证明了用His标签克隆的常规变体仅具有很差的可溶性；然而，具有JS标签的变体具有较好的可溶性。在表4中汇总了如下变体，其证明为适于稳定表达，并为可溶的，使得它们随后可被纯化，并用于含产气荚膜梭菌细胞的功能性结合测试。在载体Pet21d中实施克隆。在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中在共表达另一个质粒上的birA的情况下在30℃在菌株大肠杆菌HMS174中实施表达。

表4

蛋白质捷径(Protein-Shortcuts)

Ply3626的部分(氨基酸)

JS-标签变体

GFP

分子量(kDa)

JS4a_GFP_CBD3626_150	150-347	JS(4a)	+	58
					JS10a_GFP_CBD3626_150	150-347	JS(10a)	+	58
Js4a_GFP-CBD3626_178	178-347	JS(4a)	+	55
					Js10a_GFP-CBC3626_178	178-347	JS(10a)	+	55
Js4a_CBD3626_150	150-347	JS(4a)	-	23
					Js10a_CBD3626_178	178-347	JS(10a)	-	20

对于结合测试，在厌氧盒中在TYG培养基(胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖)中在45℃培养产气荚膜梭菌的预培养物过夜。在室温在1ml PBST缓冲液中进行结合测试。以约10⁴CFU/ml的浓度提供梭菌细胞，并以25μg/ml的浓度添加不同的JS-标签-CBD3626构建体，混合，并温育约2分钟。随后，以100μg/ml的浓度添加PA-链霉抗生物素蛋白珠(Microcoat)，并滚动温育10分钟。从每个包含作为标志物的GFP的CBD构建体中取出样品，并在荧光显微镜下对结合进行分析。图15中描绘了结果。

实施例18：用特异性JS-标签-CBD构建体结合葡萄球菌

将葡萄球菌菌株的过夜培养物在BHI培养基中稀释1∶10，并在30℃温育至OD₆₀₀为约1。将细胞在培养基中稀释，并以10⁴CFU/ml的浓度在测试(测试方法500μl，PBST缓冲液)中使用。以10μg/ml的浓度添加特异性结合蛋白JS5b_CBDUSA，并在室温与细胞一起温育20分钟。随后，以200μg/ml的浓度添加PA-链霉抗生物素蛋白珠(Microcoat)，并在顶置旋转器中温育45分钟。将含有结合细胞的磁性颗粒在磁性分离器中分离5分钟，用1ml缓冲液清洗1次，并再次重悬于500μl缓冲液中。将磁性颗粒和合并的上清液在CASO平板上铺板，并在37℃温育过夜。可在16小时后对具有金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌的平板计数，直至24小时后才对具有表皮葡萄球菌的平板计数。与总共找到的细菌比较，分析结合葡萄球菌的比例。

表5

通过JS5b-CBDUSA构建体，可结合不同的葡萄球菌菌株，其中金黄色葡萄球菌最好地结合。

实施例19：在珠-sb-结合测试中具有CBD和JS标签的依照本发明的多肽构建体比具有Strep标签和His标签组合(NS-HIS)的CBD显著更好地结合葡萄球菌细胞

在细胞结合测试中与实施例18类似地实施该实验。与包含用于生物素结合的Strep标签以及His标签(组合NS-His)的构建体相比，使用CBDPitti26细胞结合结构域(SEQ ID NO：28)的依照本发明的JS-标签多肽构建体。CBD构建体分别具有在N端的NS-His标签和JS标签(变体5b)，接着有接头序列(AGAGAGAGSEL)和CBDPitti26序列。Pitti26是葡萄球菌噬菌体的自我分离株(self-isolate)。测试之前才透析多肽构建体，使用UV吸收测量来测定蛋白质浓度，并在测试中以10μg/ml的浓度使用蛋白质。在表6中描述了对3种不同的葡萄球菌菌株的结合行为。

表6

CBD构建体	金黄色葡萄球菌(患者分离物)	表皮葡萄球菌(DSMZ 20044)	溶血葡萄球菌(DSMZ 20263)
				NS-His-CBDPitti26	0％	1.1％	0.0％
JS-CBDPitti26	1.0％	61.3％	5.0％

通过依照本发明的JS-标签-CBD构建体，可在所有3种葡萄球菌菌株上检测出细胞结合，即使显著优选表皮葡萄球菌细胞，而对于仅针对表皮葡萄球菌细胞的具有Strep标签和His标签的构建体，在相同条件下仅可实现很弱的结合。这显示了依照本发明的构建体比偶联有其它标签的CBD显著更好地适用于结合细菌细胞。

实施例20：在细胞结合测试中通过葡萄球菌特异性JS-标签-CBD构建体检测葡萄球菌结合

与实施例18中所述实验设计类似地，在使用3种不同的葡萄球菌特异性JS-标签-CBD构建体的情况下测试许多不同的葡萄球菌菌株。不同构建体的CBD部分分别衍生自噬菌体ΦSA2usa-JS-CBDUSA和来自噬菌体自我分离株的内溶素PlyOpf-JS-CBDOpf；和PlyPitti20-JS-CBDPitti20。分别可在SEQID NO 21、31、和27下找到多肽序列。在图16中描绘了该实验的结果。

在珠结合测试中，依照本发明的多肽构建体JS-CBDUSA、JS-CBDOpf和JS-CBDPitti20特异性结合许多葡萄球菌菌株。由此，金黄色葡萄球菌MRSA菌株与非MRSA菌株类似良好地被结合(图16A)。然而，可注意到倾向性地，JS-CBDOpf更好地结合MRSA菌株，而JS-CBDUSA更好地结合非MRSA菌株。图16B总结了3种依照本发明的葡萄球菌JS-CBD构建体对一组别的葡萄球菌菌株(其不属于金黄色葡萄球菌种类)的结合。由此，肉葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和马胃葡萄球菌种类的菌株(具有一个例外)不被特异性结合，比较而言，表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌种类的菌株被特异性结合。这显示了所使用的依照本发明的JS-标签-CBD构建体适于特异地且高效地结合大量的人病原体葡萄球菌菌株。

实施例21：借助于过氧化物酶测试来检测细胞与JS-标签-CBD构建体的结合

过氧化物酶测试基于如下原理，即测量信号仅可在所使用的StrepTactin-HRP(辣根过氧化物酶)偶联物(IBA，)经由StrepTacin部分而结合至生物素时才检出。将此生物素共价结合至依照本发明的多肽构建体的生物素化JS标签，接着在实验方法中所述多肽构建体特异性结合至细菌细胞，因此存在于离心步骤中保留的沉淀级分中。未结合的JS-标签-CBD构建体会与相应的离心上清液一起弃去，因此不会给出信号。在过氧化物酶测试中使用前，将依照本发明的JS-标签-多肽构建体针对TE缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA；pH7.0)透析过夜，随后经由UV吸收依靠比消光系数测定蛋白质浓度。通过在37℃各与600μl PBST一起温育1小时来封闭微量滴定板(深孔)。随后，分别将各200μl细菌预培养物和BHI培养基(作为对照)移入孔中，并分别添加相应量的蛋白质溶液(蛋白质浓度10μg/ml)和缓冲液(作为对照)，并在室温温育15分钟。各进行三次测定。温育后，将平板在台式离心机中在4℃离心10分钟(3,600rpm)，取出上清液，弃去，并用200μl PBST再次清洗沉淀物。随后，将沉淀物重悬于200μl StrepTactin-HRP偶联物溶液(PBST中1∶5000稀释的)中，并在室温温育30分钟。再次离心样品，用各200μl PBST清洗2次，每次弃去由此获得的上清液。在第2次清洗步骤之后，将每个沉淀物在200μl ABTS反应溶液中处理，并且在最大限度30分钟里经由405nm处的吸收(通过600nm处的背景吸收校正)来测量颜色反应。ABTS反应溶液由如下成分组成：18ml Mc-Ilvains缓冲液(0.1M柠檬酸、0.2M Na₂HPO₄，pH5.0)加上2ml在水中的1％ABTS(2，2-连氮基-二(3-乙基)苯并噻唑啉-6-磺酸)(2，2azino-bis(3-ethyl)benzthiazolin 6-sulfon acid)加上100μl H₂O₂(1％溶液)。

在图17中描绘了通过使用不同的依照本发明的CBD构建体进行的过氧化物酶测试的结果。JS-CBDOpf和JS-CBDPitti20是来自葡萄球菌噬菌体自我分离株的CBD构建体。JS-CBDUSA衍生自噬菌体ΦSA2usa。构建体JS-CBDALE-1和JS-CBDLS中的溶葡萄球菌酶(staphylolytic enzyme)ALE-1和溶葡萄球菌素的CBD部分分别衍生自细菌菌株头状葡萄球菌EPK1和模仿葡萄球菌。然而，合成制备相应的基因，并使之适于大肠杆菌密码子用法以更好地表达蛋白质。

如图17A中所示，JS-CBDALE-1(SEQ ID NO：50)和JS-CBDLS(SEQ IDNO：49)特异性且以高功效结合不同的凝固酶阳性金黄色葡萄球菌菌株(MRSA和非MRSA)以及凝固酶阴性表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌。两种JS-标签构建体均以大体相似的功效结合葡萄球菌。

图17B描绘了在过氧化物酶测试中依照本发明的多肽JS-CBDALE-1(SEQ ID No 50)、JS-CBDLS(SEQ ID No 49)、JS-CBDPitti20(SEQ ID No 47)、JS-CBDOpf(SEQ ID No 51)以及JS-CBDUSA(SEQ ID No 46)特异性结合不同葡萄球菌菌株诸如金黄色葡萄球菌(MRSA和非MRSA)和溶血葡萄球菌菌株，而不结合革兰氏阴性的大肠杆菌菌株，而且也不结合革兰氏阳性病原体菌株变异链球菌。特别强调的是由多肽构建体JS-CBDPitti20产生了强烈细胞结合。

实施例22：借助于过氧化物酶测试来检测细胞与肠球菌特异性JS-标签-CBD构建体的结合

如实施例21中所述的那样实施过氧化物酶测试。在图18中描绘了通过使用不同的依照本发明的CBD构建体进行的过氧化物酶测试的结果。JS-CBDEF0355和JS-CBDEF293是2种依照本发明的JS-标签-CBD构建体，其中CBD衍生自2种推定的原噬菌体内溶素，它们分别可在完全公布的菌株粪肠球菌V583基因组(登录号NC_004668)中在基因座标签EF_0355和EF_1293下找到。然而，合成制备相应的基因，并使之适于大肠杆菌密码子用法以更好地表达蛋白质。这样获得CBD，使得从完整的内溶素序列中删除EAD的保守结构域，随后用序列分析软件寻找蛋白质内潜在的结构域接头。作为JS标签和CBD之间的新接头，随后引入序列AGAGAGAGSEL(SEQ ID No.35)。在测试中使用10μg/ml JS-标签-CBD构建体。在图18中描绘了该实验的结果。

图18A显示了在过氧化物酶测试中所有测试的粪肠球菌被特异性结合，因为没有添加JS-标签-CBD构建体的对照给出显著较低的测量信号。两种构建体JS-CBDEF0355和JS-CBDEF1293对大多数菌株都给出非常相似的结果。

图18B显示了测试的屎肠球菌菌株被特异性结合，虽然它们部分给出些微较低的吸收信号。还以良好的功效结合一种金黄色葡萄球菌菌株，因此对肠球菌种类的结合不是非常特异性的。然而，从Yoong等(J.Bact.，2004，186，4808-4812)中已经知道该行为，其中已经显示了除肠球菌之外，还结合链球菌和葡萄球菌。

Claims

1.由下述组成的多肽：

i)内溶素或另一种细胞壁溶解酶的无酶促活性的细胞壁结合结构域，其中所述无酶促活性的细胞壁结合结构域选自：SEQ ID NO：19、21、23-33，和

ii)JS标签，其选自SEQ ID NO：1-18，其中所述JS标签位于i)中所述的序列的C-或N-末端，并且任选地

iii)接头，其选自由SEQ ID NO：34-38组成的组的序列，其中接头位于i)中所述的序列和ii)所描述的序列之间，和/或

iv)间隔区序列，其选自GFP、GST或MBP组成的组，其中所述间隔区位于i)中所述的序列和ii)所描述的序列之间，

其中除i)中所述细胞壁结合结构域之外，所述多肽不包含内溶素或另一种细胞壁溶解酶的别的结构域，并且其中多肽能够结合革兰氏阳性细菌，但在SEQ ID NO：19的情况中多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)除外，和通过蛋白生物素连接酶而被体内生物素化。

2.根据权利要求1的多肽，其中所述多肽是生物素化的。

3.根据上述权利要求任一项的多肽，其显示由下组序列组成的序列：

i)选自SEQ ID NO：8的序列，

ii)选自SEQ ID NO：19的序列，

iii)选自SEQ ID NO：35的序列，和任选地

iv)作为间隔区的GFP、GST或MBP序列。

4.根据权利要求3的多肽，其为所示SEQ ID NO：42-43的序列之一。

5.编码根据权利要求1至4任一项的多肽的核酸。

6.根据权利要求5的核酸，其中编码SEQ ID NO：1-18的序列的N端序列以选自SEQ ID NO：54-56的序列开始。

7.编码根据权利要求1至4中任一项的多肽的载体。

8.表达根据权利要求5或6的核酸或依照权利要求7的载体的细胞。

9.根据权利要求1至4任一项的多肽之一用于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测细菌的用途，其中所述用途不是疾病的诊断或治疗方法。

10.用于富集、除去、捕获和/或检测来自样品的细菌的方法，其中所述方法不是疾病的诊断或治疗方法，其包括以下步骤：

a)使样品与生物素化的依照权利要求1至4任一项的多肽接触和/或一起温育，

b)使步骤a)中获得的所述多肽-细菌复合物与提供生物素结合物质的载体接触和/或一起温育，

c)将步骤b)中获得的所述载体-多肽-细菌复合物与所述样品分开，

d)任选地，自所述载体-多肽-细菌复合物清洗非特异性附着的样品成分，

e)任选地，将所述载体与所述多肽-细菌-复合物分开，并

f)任选地，检测所述细菌。

11.根据权利要求10的方法，其中所述生物素结合物质包含亲合素或链霉抗生物素蛋白。

12.根据权利要求11的方法，其中所述方法经由磁性、层析或分批方法来实施。

13.根据权利要求10至12任一项的方法，其中步骤f)中的所述检测经由选择性生长条件、基于核酸的方法；细菌细胞壁及其成分的检测，细菌成分的检测经由偶联有标志物的别的特异性细胞壁结合结构域，和/或经由微生物学、形态学和/或生化检测方法的组合来实施。

14.根据权利要求13的方法，其中所述基于核酸的方法选自下组：PCR、RT-PCR、PCR-RFLP、rep-PCR指纹法、NASBA、DNA杂交方法、多基因座序列分型(MLST)和rRNA比较。

15.根据权利要求13的方法，其中所述细菌细胞壁及其成分的检测分别经由内溶素、抗体的细胞结合结构域或经由FTIR来实施。

16.根据权利要求13的方法，其中所述细菌成分的检测经由ELISA、酶活性、多位点酶电泳(MEE)或生物发光测定法来实施。

17.权利要求1-4中任一项的多肽用于结合、富集、从样品中除去、捕获和/或检测细菌的用途，其中所述细菌选自下组：葡萄球菌、链球菌、肠球菌、微球菌、杆菌和利斯特氏菌，其中所述用途不是疾病的诊断或治疗方法。

18.用于权利要求1-4中任一项多肽生物素化的方法，其中在细菌细胞中表达所述多肽，其中没有共表达外源基因(exogene)生物素连接酶。

19.根据权利要求18的方法，其中没有添加生物素。

20.权利要求1-4中任一项所述的多肽用于制备药物或诊断剂/工具(means)的用途。

21.权利要求1-4中任一项所述的多肽在制备用于检测革兰氏阳性细菌的诊断剂/工具中的用途。

22.权利要求21的用途，其中所述细菌选自：葡萄球菌、链球菌、肠球菌、微球菌、杆菌和利斯特氏菌。