CN110117587B

CN110117587B - 一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用

Info

Publication number: CN110117587B
Application number: CN201910393897.1A
Authority: CN
Inventors: 危宏平; 李小红; 杨航
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2039-05-13
Also published as: CN110117587A

Abstract

本发明涉及一种能杀灭葡萄球菌，特别是能杀灭金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌等葡萄球菌属的裂解酶及其保存方法和应用。该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该葡萄球菌裂解酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酶发挥作用的pH范围宽，在pH 6‑10都保持有裂解葡萄球菌的活力，采用编码基因构建的重组蛋白酶能在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达。该酶能用作治疗体内、体外葡萄球菌感染的抗生素，也能快速裂解葡萄球菌的细胞壁并释放胞内的物质，从而用来核酸提取、制备葡萄球菌检测和鉴定的药剂。试验证实，将该葡萄球菌裂解酶冻干后，其蛋白杀菌活性没有降低，因此，可以制成冻干粉保存。

Description

一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种能杀灭葡萄球菌，特别是能杀灭金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌等葡萄球菌属的裂解酶及其保存方法和在葡萄球菌杀灭、检测等方面的应用。

背景技术

葡萄球菌是一种能够形成葡萄状细菌群落形态的革兰氏阳性细菌，能引起人和动物的多种疾病。金黄色葡萄球菌一直是医源性感染排名仅次于大肠杆菌的致病菌，能够引起脑膜炎、肺炎、脓毒症等症状，可通过食物、人群等传播，具有耐酸耐碱、高温、低温等特点，能在多种复杂环境中生存。多耐药性金黄色葡萄球菌的流行，使得开发新的抗菌剂迫在眉睫。

噬菌体裂解酶是噬菌体在感染宿主菌后期产生的一种水解细菌细胞壁肽聚糖的水解酶，裂解酶大小通常为25kD～40kD，在结构上由两个独立的功能域构成，分别为N-端的催化功能域和一个决定细胞结合位点的C-端细胞壁结合功能域(CBD)，二者之间由一个小片段链接。因为其靶作用位点为细菌保守的成分，所以细菌很难对其产生抗性，目前也没有报道细菌对噬菌体裂解酶产生耐药。

噬菌体裂解酶作为一种蛋白制剂，在体内用药必定有一定的免疫原性，而且具有半衰期短的缺点，大多数蛋白长期保存后，活性会降低很多。因此研发同时具有杀菌活性好、保存活性好的葡萄球菌噬菌体裂解酶可能会使葡萄球菌裂解酶的应用将受到更少的限制。

发明内容

针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用。这种裂解酶能在体外、体内杀灭葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌等葡萄球菌属。为了叙述方便，将该葡萄球菌命名为ClyC。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的一种葡萄球菌裂解酶ClyC，该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

编码所述葡萄球菌裂解酶ClyC的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种葡萄球菌裂解酶ClyC的可溶性表达与纯化方法，将SEQ IDNO.2所示基因克隆表达后连接到pET28a载体上，然后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所表达的蛋白质经镍柱纯化，再用Tris-HCl或PBS透析处理。

本发明还公开了葡萄球菌裂解酶ClyC的保存方法，将所述裂解酶ClyC冻干成蛋白冻干粉保存。本发明试验证实，将葡萄球菌裂解酶ClyC冻干后，其蛋白杀菌活性没有降低。

进一步地，所述蛋白冻干粉中添加钙离子，所述钙离子的添加量确保裂解酶工作时钙离子的浓度为10-1000μM。本发明试验了ClyC对钙离子的敏感程度，初步证实了钙离子可以显著提高ClyC的杀菌活性，并减少ClyC的使用剂量。

本发明还进一步公开了裂解酶ClyC在制备体内和体外杀灭葡萄球菌的药剂中的用途。证实了该葡萄球菌裂解酶ClyC的高活性和对葡萄球菌的广谱性。

进一步地，所述葡萄球菌选自金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌。本发明还初步试验了裂解酶ClyC对实验动物模型小鼠感染金黄色葡萄菌后的保护效果，以及对细胞毒性的测试，初步证实了其用于抗葡萄球菌感染药物开发的潜能。

本发明还进一步公开了裂解酶ClyC在制备抗葡萄球菌感染药物中作为活性成分的用途。

本发明还进一步公开了裂解酶ClyC在制备葡萄球菌核酸提取试剂中的用途。用裂解酶ClyC与细菌作用后，释放菌内的三磷酸腺苷(ATP)或DNA等胞内物质。

本发明还进一步公开了裂解酶ClyC在制备葡萄球菌检测和鉴定的试剂中的用途。用裂解酶ClyC试剂与待测细菌作用后，以释放菌内的三磷酸腺苷ATP作为荧光素酶激活荧光素产生较高荧光信号的能量来源来鉴定待测细菌。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：

本发明提供的葡萄球菌裂解酶ClyC能在体内、体外杀灭各种葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌等菌属；裂解酶ClyC细胞毒性低，具有应用于抗葡萄球菌感染药物开发的潜能。裂解酶ClyC在大肠杆菌中表达量高，适合于发酵生产；裂解酶ClyC对EDTA很敏感，在pH 6-10内都具有很高的活性。

本发明的葡萄球菌裂解酶ClyC还可以快速裂解葡萄球菌的细胞壁并释放胞内的物质，从而用来核酸提取、制备葡萄球菌检测和鉴定的药剂。

本发明提供的葡萄球菌裂解酶ClyC冻干后，其蛋白杀菌活性没有降低，因此可以作为冻干粉保存。并且试验证实，ClyC对钙离子的敏感程度，钙离子可以显著提高ClyC的杀菌活性，并减少ClyC的使用剂量。

附图说明

图1为ClyC基因PCR扩增结果。图中M为蛋白Marker，箭头所指处为750bp。R为扩增ClyC的条带。

图2为ClyC的杀菌谱。纵坐标表示25μg/ml ClyC与各葡萄球菌株以及其他菌株孵育10min后浊度降低的变化值。

图3为ClyC在不同pH下对细菌的杀菌活性测试结果，其中纵坐标表示25μg/mlClyC在不同pH中相对活性。

图4为不同浓度ClyC在PBS(图4B)和5％BSA(图4A)的缓冲液中杀菌能力的CFU计数。

图5为ClyC体内杀灭金黄色葡萄球菌的结果。每组6只小鼠，分别注射致死剂量的金黄色葡萄球菌后，实验组于1小时后腹腔注射0.1mg ClyC。对照组于1小时后腹腔注射等体积的PBS溶液。每天观测各组小鼠的存活率。

图6为ClyC对于细胞毒性的测试结果。分别用浓度为15.625、31、62、125、250和500μg/mL的ClyC作用于CHO-K1细胞，在低于125μg/mL没有观察到明显的细胞毒性。

图7为ClyC对钙离子敏感度结果。其中图7A为50μg/ml ClyC、100μM钙离子、ClyC-Ca²⁺分别与细菌孵育不同时间后的CFU计数，纵坐标为log值。图7B为1mM Ca²⁺与不同浓度ClyC的杀菌曲线。图7C为25μg/ml ClyC对不同浓度钙离子敏感程度的结果。

图8为冻干粉蛋白的活性，PlySs2(图8A)、ClyH(图8B)和ClyR(图8D)作为对照，图8C为ClyC蛋白冻干前加1mM Ca²⁺、ClyC蛋白冻干后加1mM Ca²⁺、以及ClyC蛋白不加Ca²⁺三种情况下对细菌的杀菌曲线图。

图9为ClyC用于基于ATP释放的葡萄球菌快速检测结果。图中横坐标表示ClyC蛋白和菌液的混合物加入荧光反应底物后的检测时间，纵坐标表示荧光值。虚线连接符号×代表空白对照，◇和▕代表阴性对照，上升的曲线代表金黄色葡萄球菌菌株。

具体实施方式

下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。以下说明中提到的其它裂解酶ClyR、ClyH、PlySs2等均为申请人实验室前期设计构建或参考文献序列表达纯化，仅为说明ClyC与其它裂解酶的性质差异。

实施例1：葡萄球菌裂解酶ClyC的构建

通过查阅文献以及实验验证，我们发现了一个与金黄色葡萄球菌肽聚糖亲和能力很高的噬菌体裂解酶结合域蛋白，将它和另外一个具有部分催化活性的噬菌体裂解酶催化域蛋白融合表达，得到一个新的葡萄球菌噬菌体裂解酶ClyC。本实验中的引物由上海生工公司完成。

(1)在上海生工生物工程有限公司全序列合成能表达裂解酶ClyC的DNA序列。以ClyC基因为模板，在目的基因的两端分别加入NcoI和XhoI的酶切位点，引物设计如下：

SEQ.ID.NO.3正向引物：TATACCATGGGCATGGCACTGCCTAAAACGG

SEQ.ID.NO.4反向引物：ATATCTCGAGCGCCCATTCGATGGTGCCCCAG

以2μl基因为模板，各加入引物1μl进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：1)94℃，3min；2)94℃，30sec，68℃，30sec，72℃，45sec，30个循环；3)72℃，10min；将产物进行凝胶电泳回收，电泳图谱如图1，ClyC的基因大小为750bp。与所设计的裂解酶基因片段的大小一致。

(2)将ClyC基因连接到表达质粒pET28a上并转入到BL21(DE3)中表达。

(3)ClyC的诱导表达以及纯化

过夜培养5ml的ClyC表达菌株，转接到500ml LB中，加入终浓度为50μg/ml的硫酸卡那霉素，37℃，200rpm，2h。待菌长到对数期时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃，120rpm，诱导16h。收集菌液，将菌液重悬到蛋白纯化缓冲液中，超声破碎并离心过滤，将上清使用镍柱纯化，纯化后的蛋白透析到PBS或者Tris-HCl中。

实施例2：ClyC体外杀灭多种葡萄球菌以及对不同种类菌株的特异性验证

为了验证ClyC的杀菌谱，我们选择了几种发明人实验室保存的非葡萄球菌菌株和临床分离的金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及其它菌株一起测试。首先将待测试菌株分别过夜培养，离心收集后用PBS洗涤一次，然后重悬于溶于PBS中。取一定量的ClyC与上述菌液混合，同时用酶标仪检测10min内混合液在600nm吸收值的变化值。用OD600降低的数值表示不同菌株的裂解效果。试验得到的杀灭效果见图2。结果表明ClyC对临床分离的所有金黄色葡萄球菌以及松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌有很强的裂解效果，但对其他菌株没有裂解效果。

实施例3：ClyC对pH耐受能力的测试

将金黄色葡萄球菌T23过夜培养物，离心收集后用PBS洗涤一次，然后溶于不同pH值的缓冲液中。取一定量的ClyC与所有上述菌液混合，同时用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化。检测结束后计算每组与空白组相比较OD 600降低的数值，将OD 600降低最多的值定义为100％，其它组OD 600的降低值与之作比较，得到相对酶活数值。最后得到的ClyC的相对活性见图3。结果显示ClyC在pH4-10的范围内具有较好的活性，在pH 6-10内都具有很高的活性。

实施例4：ClyC在BSA和PBS中的杀菌活性的验证

将金黄色葡萄球菌T23过夜培养，离心收集后用PBS洗涤一次，然后分别溶于PBS、5％BSA中。接着将两种菌悬液等分为多份，分别加入不同浓度的ClyC，37℃孵育1h后稀释平板计数。结果如图4所示，结果显示ClyC的酶活不但不受BSA的抑制，反而具有很大的促进作用。

实施例5：ClyC体内杀灭葡萄球菌的验证

试验中所用小鼠为6周大的BALB/C雌性鼠，重约20-21克。在实验小鼠(12只)腹腔注射3×10⁸金黄色葡萄球菌菌株。1h后，将小鼠分为两组，每组6只。实验组小鼠腹腔注射ClyC 100μg，对照组则注射PBS缓冲液。每天观测小鼠的存活率，结果如图5所示，结果表明ClyC能提高小鼠66-83％的存活率。

实施例6：ClyC细胞毒性的测试

将CHO-K1细胞以每孔5×10³的浓度接种到96孔板中，培养24小时后，向孔板中加入一定浓度的ClyC(0-250μg/mL),然后继续培养24小时。培养结束后，向孔板中加入MTT(终浓度5mg/mL)，再培养4小时。培养结束后，弃掉上清液，每孔加入200μL DMSO溶解细胞，在酶标仪上读取570nm吸光值。所得到的结果见图6。结果显示ClyC在125μg/mL的浓度下具有较小的细胞毒性，在250μg/mL以上显示了很高的细胞毒性。然而在有钙离子添加的条件下，ClyC的作用浓度远远低于125μg/mL(见图7)。

实施例7：ClyC对钙离子敏感的验证

将金黄色葡萄球菌T23过夜培养，离心收集后用PBS洗涤一次，然后溶于PBS中备用；将菌悬液和50μg/ml ClyC、100μM钙离子混合，对不同培养时间点的细菌悬液进行稀释平板计数(图7A)。在酶标仪上检测1mM Ca²⁺和不同浓度ClyC对金黄色葡萄球菌T23的杀菌曲线(图7B)。在酶标仪上检测25μg/ml ClyC和不同浓度钙离子在1min内对金黄色葡萄球菌T23的裂解曲线，相对活性％＝(蛋白和钙离子处理组OD600的变化值/蛋白处理组OD600的变化值)*100％，纵坐标为相对活性值(图7C)。结果表明钙离子可以显著提高ClyC的杀菌活性，并减少ClyC的使用剂量。

实施例8：ClyC冻干粉活性以及钙离子对蛋白冻干粉活性稳定的验证

1、ClyC冻干粉活性验证

将ClyC(图8C)按照标准冻干蛋白程序冻干，然后测试蛋白对金黄色葡萄球菌T23的杀菌曲线，结果表明，ClyC冻干前后，其蛋白杀菌活性没有发生变化。

2、钙离子对蛋白冻干粉活性稳定的验证

将PlySs2(图8A)、ClyH(图8B)和ClyR(图8D)按照标准冻干蛋白程序冻干，然后测试冻干粉蛋白以及冻干粉蛋白加钙对金黄色葡萄球菌T23和无乳链球菌S12的杀菌曲线，同时我们将ClyC(图8C)使用两种冻干方式冻干，第一种为蛋白溶液直接冻干，第二种为蛋白溶液加入1mM钙离子冻干，然后测试冻干粉蛋白以及冻干粉蛋白加钙对金黄色葡萄球菌T23的杀菌曲线。结果表明，钙离子对PlySs2的杀菌活性具有部分提高，对ClyH杀菌活性提高最为明显，对ClyR杀菌活性没有任何影响，对ClyC的杀菌活性也具有提高作用。

实施例9：ClyC用于葡萄球菌快速检测

利用ClyC蛋白能特异性的裂解金黄色葡萄球菌并快速地释放ATP，可使荧光素酶利用这一过程产生的ATP催化荧光素产生高强度的荧光信号这一现象作为快速检测原理。检测过程如下：将金黄色葡萄球菌株T23、大肠杆菌和李斯特菌株43251分别转接到5mL液体培养基中，长到对数期后，离心收菌并用PBS洗涤3次后重悬到PBS中，调菌液OD600的读数值为0.77(约有1×10⁹CFU/mL)，并稀释10³倍备用。取100μL菌液和ClyC蛋白(终浓度为150μg/mL)在酶标板上孵育1min，然后加入100μL荧光反应液，读取荧光值。金黄色葡萄球菌株T23不加ClyC蛋白为空白对照组，大肠杆菌和李斯特菌为阴性对照组，所检测的细菌浓度为5×10⁵CFU/mL。结果如图9，只有ClyC和金黄色葡萄球菌孵育组在加入荧光反应液50s后，测得荧光值开始显著上升，表明ClyC可以用于快速、特异检测葡萄球菌。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Lys Thr Gly Lys Pro Thr Ala Lys Gln Val Val Asp

1 5 10 15

Trp Ala Ile Asn Leu Ile Gly Ser Gly Val Asp Val Asp Gly Tyr Tyr

20 25 30

Gly Arg Gln Cys Trp Asp Leu Pro Asn Tyr Ile Phe Asn Arg Tyr Trp

35 40 45

Asn Phe Lys Thr Pro Gly Asn Ala Arg Asp Met Ala Trp Tyr Arg Tyr

50 55 60

Pro Glu Gly Phe Lys Val Phe Arg Asn Thr Ser Asp Phe Val Pro Lys

65 70 75 80

Pro Gly Asp Ile Ala Val Trp Thr Gly Gly Asn Tyr Asn Trp Asn Thr

85 90 95

Trp Gly His Thr Gly Ile Val Val Gly Pro Ser Thr Lys Ser Tyr Phe

100 105 110

Tyr Ser Val Asp Gln Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ser Tyr Val Gly Ser

115 120 125

Pro Ala Ala Lys Ile Lys His Ser Tyr Phe Gly Val Thr His Phe Val

130 135 140

Arg Pro Ala Tyr Lys Ala Glu Pro Lys Pro Thr Pro Pro Ala Asp Lys

145 150 155 160

Ile Thr Trp Asn Trp Lys Gly Val Phe Tyr Pro Asn Pro Glu Lys Ala

165 170 175

Ile Arg Val Arg Lys Thr Ala Gly Leu Thr Gly Thr Val Val Glu Glu

180 185 190

Asp Ser Trp Leu Tyr Thr Lys Asp Asp Trp Val Lys Phe Asp Gln Val

195 200 205

Ile Lys Lys Asp Gly Tyr Trp Trp Ile Arg Phe Lys Tyr Gln Arg Glu

210 215 220

Gly Ser Ser Thr Asn Asn Phe Tyr Cys Ala Val Cys Arg Ile Thr Asp

225 230 235 240

Lys Glu Gln Lys Ile Lys Asn Glu Lys Tyr Trp Gly Thr Ile Glu Trp

245 250 255

Ala

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcactgc ctaaaacggg taaaccaacg gcaaaacagg tggttgactg ggcaatcaat 60

ttaatcggca gtggtgtcga tgttgatggt tattatggtc ggcaatgttg ggatttacct 120

aactatattt ttaatagata ctggaacttt aagacaccag gcaacgcaag agatatggca 180

tggtatagat atcctgaagg gtttaaagtg tttagaaaca cttctgattt tgtccctaaa 240

ccaggtgata tagcagtgtg gacaggtggt aattacaatt ggaacacttg gggacacact 300

ggtattgttg taggtccatc aactaaaagt tacttttata gtgtagatca gaattggaat 360

aactctaact cttacgttgg tagtcctgca gcaaagataa aacatagtta ttttggtgta 420

actcattttg ttagacccgc atacaaagca gaaccgaaac ctacaccacc agcggacaag 480

atcacctgga actggaaagg tgtgttctac ccgaacccgg agaaggcgat tcgtgttcgt 540

aaaaccgcgg gtctgaccgg taccgtggtt gaggaagata gctggctgta taccaaggac 600

gattgggtga aatttgacca ggttatcaag aaagatggtt actggtggat tcgtttcaag 660

tatcaacgtg agggcagcag caccaacaac ttttactgcg cggtgtgccg tatcaccgac 720

aaggagcaga agatcaagaa cgaaaagtac tggggcacca tcgaatgggc g 771

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tataccatgg gcatggcact gcctaaaacg g 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atatctcgag cgcccattcg atggtgcccc ag 32

Claims

1.一种葡萄球菌裂解酶，其特征在于，该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述葡萄球菌裂解酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶的可溶性表达与纯化方法，其特征在于，将权利要求2所述基因克隆表达后连接到pET28a载体上，然后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所表达的蛋白质经镍柱纯化，再用Tris-HCl或PBS透析处理。

4.权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶的保存方法，其特征在于，将所述裂解酶冻干成蛋白冻干粉保存。

5.根据权利要求4所述的葡萄球菌裂解酶的保存方法，其特征在于，所述蛋白冻干粉中添加钙离子，所述钙离子的添加量确保裂解酶工作时钙离子的浓度为10-1000μM。

6.权利要求1所述的裂解酶在制备体内和体外杀灭葡萄球菌的药剂中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述葡萄球菌选自金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌。

8.权利要求1所述的裂解酶在制备抗葡萄球菌感染药物中作为活性成分的用途。

9.权利要求1所述的裂解酶在制备葡萄球菌核酸提取试剂中的用途。

10.权利要求1所述的裂解酶在制备葡萄球菌检测和鉴定的试剂中的用途。