CN113801864B - 一种用于编码溶酶菌lysin6的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于编码溶酶菌lysin6的基因及其应用，所述用于编码溶酶菌lysin6的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供了一种用于编码溶酶菌lysin6的基因，由该基因编码所得的溶酶菌lysin6的N端序列具有疏水性和正电荷的特点，同时具有菌内和菌外裂解活性，可以用于天然裂解大肠杆菌等革兰氏阴性菌。

Description

一种用于编码溶酶菌lysin6的基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于编码溶酶菌lysin6的基因及其应用。

背景技术

多重耐药抗性菌近年来在全球范围内造成越来越大的威胁，大肠杆菌广泛存在于自然界中，作为条件致病菌，严重威胁人畜健康，是世界卫生组织公布的十大严重耐药菌之一。因此，迫切需要寻找一种新的、有效的方法来防控日益严重的耐药细菌。噬菌体及其衍生物为抗击多重耐药菌和严重耐药菌感染提供了新的策略。

溶菌酶是噬菌体在增殖周期后期产生的一种裂解酶，可通过破坏细菌的肽聚糖层而引起细菌细胞快速裂解。由于其裂解机制与抗生素截然不同，因而不受细菌耐药性的影响。受细菌细胞壁结构的影响，溶菌酶可以有效地裂解革兰氏阳性菌，目前已经实现了广泛的商业化应用。而由于革兰氏阴性菌外膜的屏障作用，溶菌酶对革兰氏阴性菌的裂解效果不好，大多数溶菌酶均需要透膜剂(如EDTA、乳酸等)与细菌外层脂多糖作用，使细菌的细胞膜失去稳定性，进而使溶菌酶穿过外膜，作用于革兰氏阴性菌的肽聚糖层，因此，目前应用溶菌酶防控革兰氏阴性菌在临床上难以实现大规模应用。目前，仅有少数可以天然裂解革兰氏阴性菌溶菌酶的报道，其裂解机制尚不明确。因此，本领域人员一直致力于寻找可以天然裂解革兰氏阴性菌的噬菌体溶菌酶。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种用于编码溶酶菌lysin6的基因及其应用，旨在提供一种可编码得到可以裂解革兰氏阴性菌的溶菌酶的基因。

为实现上述目的，本发明提出一种用于编码溶酶菌lysin6的基因，所述用于编码溶酶菌lysin6的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，本发明还提出一种溶酶菌lysin6，所述溶酶菌lysin6由如上所述的用于编码溶酶菌lysin6的基因编码所得，所述溶酶菌lysin6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，本发明还提出一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如上所述的用于编码溶酶菌lysin6的基因。

进一步地，本发明还提出一种重组表达菌株，所述重组表达菌株包括如上所述的用于编码溶酶菌lysin6的基因。

可选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为原核细胞。

可选地，所述原核细胞为大肠杆菌细胞。

进一步地，本发明还提出一种溶酶菌lysin6的制备方法，包括以下步骤：培养如上所述的重组表达菌株，获得溶酶菌lysin6。

进一步地，本发明还提出一种溶酶菌lysin6在制备用于预防、抑制和/或治疗由革兰氏阴性菌引发的疾病的药物中的应用。

可选地，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌。

本发明提供了一种用于编码溶酶菌lysin6的基因，由该基因编码所得的溶酶菌lysin6的N端序列具有疏水性和正电荷的特点，同时具有菌内和菌外裂解活性，可以用于天然裂解大肠杆菌等革兰氏阴性菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1获得的用于编码溶酶菌lysin6的基因的PCR扩增图；

图2为本发明实施例4获得的溶酶菌lysin6蛋白的SDS-PAGE图；

图3为本发明实施例4获得的溶酶菌lysin6的体内活性测定结果图；

图4为本发明实施例4获得的溶酶菌lysin6的体外活性测定结果图；

图5为本发明实施例4获得的溶酶菌lysin6的N端20个氨基酸特征图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

溶菌酶是噬菌体在增殖周期后期产生的一种裂解酶，可通过破坏细菌的肽聚糖层而引起细菌细胞快速裂解。由于其裂解机制与抗生素截然不同，因而不受细菌耐药性的影响。受细菌细胞壁结构的影响，溶菌酶可以有效地裂解革兰氏阳性菌，目前已经实现了广泛的商业化应用。而由于革兰氏阴性菌外膜的屏障作用，溶菌酶对革兰氏阴性菌的裂解效果不好，大多数溶菌酶均需要透膜剂(如EDTA、乳酸等)与细菌外层脂多糖作用，使细菌的细胞膜失去稳定性，进而使溶菌酶穿过外膜，作用于革兰氏阴性菌的肽聚糖层，因此，目前应用溶菌酶防控革兰氏阴性菌在临床上难以实现大规模应用。目前，仅有少数可以天然裂解革兰氏阴性菌溶菌酶的报道，其裂解机制尚不明确。因此，本领域人员一直致力于寻找可以天然裂解革兰氏阴性菌的噬菌体溶菌酶。

为解决上述技术问题，本发明提出一种用于编码溶酶菌lysin6的基因，所述用于编码溶酶菌lysin6的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体地，所述用于编码溶酶菌lysin6的基因的获取方式如下：对GenBank数据库中的噬菌体溶酶菌序列(Gene ID：14008099)进行修饰和改造，在其N端添加设计好的特定序列，使其N端序列具有疏水性和正电荷的特点，再合成引物，通过搭桥PCR方式，最终获得如SEQ ID NO：1所示的用于编码溶酶菌lysin6的基因序列，序列长度549bp。

本发明提供了一种用于编码溶酶菌lysin6的基因，由该基因编码所得的溶酶菌命名为溶酶菌lysin6，其N端序列具有疏水性和正电荷的特点，同时具有菌内和菌外裂解活性，可以用于天然裂解大肠杆菌等革兰氏阴性菌，所述溶酶菌lysin6在菌内抑菌试验中，可使菌落数下降3个数量级，在体外抑菌试验中，可使菌落数下降一个数量级，具有广阔的应用前景。

进一步地，本发明还提出一种溶酶菌lysin6，所述溶酶菌lysin6由上述如SEQ IDNO：1所示的用于编码溶酶菌lysin6的基因编码所得，所述溶酶菌lysin6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述溶酶菌lysin6的分子了为72kD，经过氨基酸序列特征分析，其N端序列具有疏水性和正电荷的特点，同时具有菌内菌外裂解活性，可以用于天然裂解大肠杆菌等革兰氏阴性菌，解决了现有技术中缺少可以天然裂解革兰氏阴性菌的溶菌酶的问题。

进一步地，基于上述提供的用于编码溶酶菌lysin6的基因，本发明还提出一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如上所述的用于编码溶酶菌lysin6的基因。将所述用于编码溶酶菌lysin6的基因连接至载体上，即可构建得到所述重组表达载体，所述连接方式例如可以为通过同源重组的方式进行连接，所述载体的类型不做限定，可以采用基因工程领域常用的基因载体，在本发明实施例中包括但不限于为pColdTF载体等。

更进一步地，基因上述提供的用于编码溶菌酶lysin6的基因，本发明还提出一种重组表达菌株，用于表达本发明提供的所述溶酶菌lysin6，所述重组表达菌株包括如上所述的用于编码溶酶菌lysin6的基因，或者也可以是所述重组表达菌株包括本发明上述提供的重组表达载体。所述重组表达菌株的载体细胞类型不做限定，可以采用基因工程领域常用的载体细胞，在本发明实施例中优选为原核细胞，更进一步地，所述原核细胞更优选为大肠杆菌细胞，来源易得，有利于所述用于编码溶菌酶lysin6的基因的表达，且也有利于表达所得的溶酶菌lysin6对革兰氏阴性菌具有较好的抑菌性能，尤其是对大肠杆菌具有良好的抑菌性能。在构建所述重组表达菌株时，例如可以将上述提供的重组表达载体通过热激法转化到大肠杆菌细胞中。

另外，本发明还提出一种溶酶菌lysin6的制备方法，包括以下步骤：在允许表达所述溶酶菌lysin6的条件下培养如上所述的重组表达菌株，获得溶酶菌lysin6。具体地，在本发明实施例中，例如可以将构建得到的所述重组表达菌株涂布在含有氨苄霉素的营养琼脂上，37℃下培养，然后挑选含有所述重组表达载体的大肠杆菌克隆菌株，于含有50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃下培养过夜，再将培养过夜的阳性克隆菌株进行稀释后接种到LB液体培养基中，37℃下培养至OD₆₀₀(波长600nm处的吸光度)达到0.6～1.0，然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在16℃下诱导，实现溶酶菌lysin6的诱导表达。此外，在进行诱导表达后，还可以包括对所述溶酶菌lysin6进行纯化的步骤，以获得纯化后的溶酶菌lysin6蛋白。

本发明提供的溶酶菌lysin6可用于天然降解大肠杆菌等革兰氏阴性菌，对该类细菌具有抑菌性，基于此，本发明还进一步提出一种溶酶菌lysin6在制备用于预防、抑制和/或治疗由革兰氏阴性菌引发的疾病的药物中的应用。以所述溶酶菌lysin6作为预防、抑制和/治疗由该类细菌所引发的疾病的相关药物的活性成分，能够有效裂解革兰氏阴性菌，起到预防、抑制和/或治疗的效果，此外，所述药物中还可以添加制药领域常用的辅料、药物载体等，均属于本发明的保护范围。

进一步地，所述溶酶菌lysin6对大肠杆菌具有良好的裂解效果，在菌内抑菌试验中，可使菌落数下降3个数量级，在体外抑菌试验中，可以使菌落数下降1个数量级，因此，作为本发明提供的溶酶菌lysin6的应用的优选实施例，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌。所述溶酶菌lysin6在作为预防、抑制和/治疗由大肠杆菌所引发的疾病的相关药物的活性成分时，具有更好的疗效。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1用于编码溶酶菌lysin6的基因的获得

对GenBank数据库中的噬菌体溶酶菌序列(Gene ID：14008099)进行修饰和改造，在其N端添加设计好的特定序列，使其N端序列具有疏水性和正电荷的特点，再合成引物，通过搭桥PCR方式(PCR扩增图如图1所示，图1中，泳道1为阴性对照，泳道M为标准核酸分子量，泳道2为搭桥PCR扩增后的产物)，最终获得用于编码溶酶菌lysin6的基因序列，如SEQ IDNO：1所示，序列长度549bp。

实施例2重组表达载体的构建

将实施例1获得的用于编码溶酶菌lysin6的基因序列通过同源重组的方式连接至pColdTF载体上，构建得到重组表达载体pColdTF-lysin6。

实施例3重组表达菌株的构建

将实施例2构建的重组表达载体pColdTF-lysin6利用热激法转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，并将转化后的BL21(DE3)涂布于含有氨苄霉素的营养琼脂上，于37℃下培养16h，获得含有重组表达载体pColdTF-lysin6的BL21(DE3)克隆菌株，即为重组表达菌株。

实施例4溶酶菌lysin6的诱导表达

(1)将实施例3培养获得的含有重组表达载体pColdTF-lysin6的BL21(DE3)克隆菌株于含有50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养过夜；

(2)将过夜培养后的BL21(DE3)阳性克隆菌株以1:50的稀释比例接种到500mL的LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄霉素)，在37℃、220rpm下震荡培养至OD₆₀₀(波长600nm处的吸光度)达到0.6～1.0，加入终浓度为1mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在16℃下诱导12h，进行溶酶菌lysin6的诱导表达，获得含有溶酶菌lysin6的菌液。

对实施例4制备的溶酶菌lysin6的蛋白表达、活性及抑菌性等进行分析鉴定，方法和结果如下：

1、溶酶菌lysin6的超声及SDS-PAGE鉴定

对诱导表达后的菌液进行超声处理：先将菌液倒进50mL的离心管中，12000rpm离心2min，弃液，再用25mL PBS重悬沉淀，混匀后离心，将上清液倒掉，重复一次，弃液，最后加入3mL PBS重悬并将液体转移至5mL烧杯中，置于冰上，超声3s，间歇2s，直至溶液清亮，将溶液转移至15mL离心管内，12000rpm、4℃离心10min，用枪头将上清液吸出分装1.5mL离心管内，每管1mL，-20℃保存。取上清液30μL于1.5mL的离心管中，加入5×SDS上清缓冲液7μL，混匀后煮沸7min，12000rpm离心5min，得到纯化后的溶酶菌lysin6，对该纯化后的溶酶菌lysin6以及实施例4获得的菌液进行SDS-PAGE电泳分析，电泳检测结果如图2所示。

图2中，泳道M为标准蛋白分子质量，泳道1为纯化后的重组lysin6蛋白，泳道2为空质粒，泳道3为菌液。由图2可以看出，本发明实施例制得的溶酶菌lysin6在大肠杆菌中得到了高效的表达，其分子量大小与预计分子量一致，为72kD。

2、溶菌酶lysin6的体内活性测定

将过夜培养的BL21(DE3)阳性克隆菌株以1:50的稀释比例接种到500ml的LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄霉素)，37℃，200rpm震荡培养至OD₆₀₀达到0.6～1.0，加入终浓度为1mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在16℃下诱导表达。取诱导5h的菌液，点样进行菌落计数。同时设未诱导的菌液进行对照。体内活性测定结果如图3所示。

由图3可以看出，本发明实施例制得的溶酶菌lysin6在体内抑菌试验中，用IPTG诱导溶酶菌lysin6表达后，比未诱导的表达菌BL21(DE3)数量下降了3个数量级，说明溶酶菌lysin6在大肠杆菌体内具有良好的抑菌作用。

3、溶菌酶lysin6的体外活性测定

将菌液E.coli BL21摇到对数期，50μL溶菌酶lysin6蛋白加上50μL稀释了103的菌液E.coli BL21，混匀后每隔1h取10μL点样进行菌落计数，连续测4h，最后一次取50μL铺平板进行菌落计数。同时设pColdTF空载体标签蛋白作为对照。体外活性测定结果如图4所示。

由图4可以看出，本发明实施例制得的溶酶菌lysin6在体外抑菌试验中，与pColdTF空载体蛋白对照相比，可使菌落数下降1个数量级，说明溶酶菌lysin6能够在体外抑制大肠杆菌的增殖。

4、溶菌酶lysin6的N端活性分析

用Protean软件对溶菌酶lysin的N端氨基酸序列进行分析，溶菌酶lysin6的N端20个氨基酸特征结果如图5所示。

由图5可以看出，本发明实施例制得的溶酶菌lysin6的N端氨基酸具有疏水性和带有正电荷的特点，该序列特征能够使溶酶菌lysin6具备天然裂解大肠杆菌的活性。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 一种用于编码溶酶菌lysin6的基因及其应用

<130> 20210805

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccgctaacct gcgcttccgg tgtcacgaca agttacggca taggtttcca ggccaagtac 60

atggatattt ttgatatgtt acgtcaagac gaaggtcttg atttaaatct ttataaagac 120

actgaaggtt attggactat tggtattggc cagttagtta ccaagaaccc atctaaagat 180

gttgctcgtg ctgaacttga taagcttatg ggtcgagttt gcaatggtcg tattactatg 240

gctgaagccg aacaactctt taaccggtcg gttgaaaatg ctcgtagagc tattctgcgt 300

aatcctaaat tgaaacctgt ttatgatgta ctggacgaag ttcgtcgttg tgctttaatt 360

aacatggtct tccaaatggg tgaagcaggt gtagcagggt tcactaactc tttacgtatg 420

ctccaacaga aacgttggaa tgatgcggca gttaacctgg cccaatcccg ttggtataaa 480

caaactccta atcgtgctaa gcgcgttatc gccaccttta aaacaggtac ttgggctgct 540

tatagataa 549

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Pro Leu Thr Cys Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Phe

1 5 10 15

Gln Ala Lys Tyr Met Asp Ile Phe Asp Met Leu Arg Gln Asp Glu Gly

20 25 30

Leu Asp Leu Asn Leu Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Trp Thr Ile Gly

35 40 45

Ile Gly Gln Leu Val Thr Lys Asn Pro Ser Lys Asp Val Ala Arg Ala

50 55 60

Glu Leu Asp Lys Leu Met Gly Arg Val Cys Asn Gly Arg Ile Thr Met

65 70 75 80

Ala Glu Ala Glu Gln Leu Phe Asn Arg Ser Val Glu Asn Ala Arg Arg

85 90 95

Ala Ile Leu Arg Asn Pro Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Val Leu Asp

100 105 110

Glu Val Arg Arg Cys Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu

115 120 125

Ala Gly Val Ala Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys

130 135 140

Arg Trp Asn Asp Ala Ala Val Asn Leu Ala Gln Ser Arg Trp Tyr Lys

145 150 155 160

Gln Thr Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Ala Thr Phe Lys Thr Gly

165 170 175

Thr Trp Ala Ala Tyr Arg

180

Claims (9)

1.一种用于编码溶菌酶lysin6的基因，其特征在于，所述用于编码溶菌酶lysin6的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种溶菌酶lysin6，其特征在于，所述溶菌酶lysin6由如权利要求1所述的用于编码溶菌酶lysin6的基因编码所得，所述溶菌酶lysin6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1所述的用于编码溶菌酶lysin6的基因。

4.一种重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株包括如权利要求1所述的用于编码溶菌酶lysin6的基因。

5.如权利要求4所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主细胞为原核细胞。

6.如权利要求5所述的重组表达菌株，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌细胞。

7.一种溶菌酶lysin6的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：培养如权利要求4至6任意一项所述的重组表达菌株，获得溶菌酶lysin6。

8.一种如权利要求2所述的溶菌酶lysin6在制备用于预防、抑制和/或治疗由革兰氏阴性菌引发的疾病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的溶菌酶lysin6在制备用于预防、抑制和/或治疗由革兰氏阴性菌引发的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌。