CN101948521A - 诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白(其氨基酸序列如SEQID NO：1所示)。此外，本发明还公开了上述重组抗原蛋白的制备方法，包括采用RT-PCR扩增EgEPC1基因，将其克隆到pGEM-T载体中，再将其与表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting对纯化后重组抗原进行鉴定。此外，本发明还公开了上述重组抗原蛋白的诊断用途。实验证明，本发明的重组抗原蛋白对细粒棘球蚴病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，在细粒棘球蚴病诊断方面具有广泛的应用前景。

Description

诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白；此外，本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。

背景技术

细粒棘球蚴病又称囊型包虫病(cystic echinococcosis，CE)是一种由细粒棘球绦虫的幼虫引起的严重危害人体健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病，且已成为世界范围的一个重要的公共卫生、经济问题。我国棘球蚴病流行严重，约占全国总面积的44％，据推算全国棘球蚴病患者数约为38万人，西部地区尤为严重。目前CE确诊主要是通过物理影像，如X线、B超、断层扫描及核磁共振等方法，但由于棘球蚴病患者早期无明显临床症状，这些方法也仅适用确诊中、晚期病患阶段，所以早期诊断对该病治疗和预后起着重要的作用。对临床早期可疑病患或对高风险人群进行大规模筛查采用免疫学检测显得尤为必要。目前广泛用于细粒棘球蚴病诊断抗原主要是囊液抗原及其组分抗原B和抗原5等，但受到不易标准化，特异性、敏感性不理想以及与其他带绦虫抗原存在交叉反应等问题的限制。寻找具有更高敏感性和特异性的抗原组分，提高对CE的诊断效率，是当前棘球蚴病免疫诊断研究任务中的重要内容之一，而研制特异性快速诊断试剂盒也是目前免疫诊断的发展趋势。随着分子生物学技术的发展，用基因工程技术制备重组抗原有助于解决上述问题。近年来，诸多重组抗原已用于CE免疫诊断效果的研究，其中EPC1在免疫诊断方面受到学者的关注。Li等通过感染细粒棘球绦虫六钩蚴的小鼠血清筛选细粒棘球蚴cDNA文库获得Epc1基因。通过免疫印迹实验方法证实rEPC1对细粒棘球蚴病患者血清的敏感性为92.2％，特异性为95.6％，是一种新的CE诊断抗原。

根据不完全统计，我国受细粒棘球蚴病威胁的人口在5000万人以上，但目前对于包虫病的治疗效果尚不理想，所以早期诊断对于人囊型包虫病(CE)的及时治疗至关重要，而具有特异的免疫学诊断对CE的确诊有其重要作用。EPC1是Li等从Eg原头节cDNA文库筛选得到一编码为8.4KDa的多肽。将EPC1分截成10段(P1-P10)，通过免疫印迹检测囊型包虫病患者血清和感染细粒棘球蚴的实验鼠血清确定EPC1蛋白的抗体结合部位主要存在于P1、P5螺旋结构的两多肽段和含P1和P5的EPC1蛋白中，这是EPC1具有特异性血清诊断的主要原因；另外，Epc1蛋白序列与猪带绦虫的氨基酸序列有86％的同源性，然而检测显示与囊虫病(猪肉绦虫囊尾蚴病)仅有9％的交叉反应，主要是EPC1具有B细胞抗原表位，不与囊虫病患者血清发生交叉反应。

因此，寻找具有更高敏感性和特异性的CE诊断抗原，提高对囊型包虫病的检测效率，是当前细粒棘球蚴病免疫诊断研究课题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的用途。

为了解决上述技术问题，本发明从我国青海省细粒棘球蚴分离原头节cDNA扩增了Epc1基因片段，克隆表达EgEPC1重组蛋白，通过ELISA方法评价分析重组抗原的诊断价值。

在本发明的一方面，提供一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码上述重组抗原蛋白的基因为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明提供一种重组质粒载体，其由上述编码重组抗原蛋白的基因与表达载体PET28a(+)连接构建。

所述的连接可以采用本领域常规或已知的方法进行，例如：所述的连接可以是将利用内切酶酶切处理含有在细粒棘球蚴抗原蛋白基因两侧带有限制性内切酶识别位点的克隆质粒得到的细粒棘球蚴抗原蛋白的基因，与经相同酶切处理的表达载体PET28a(+)连接，构建重组表达质粒。所述的内切酶可以是本领域通常使用的内切酶，例如BamH I、Sal I。所述克隆质粒可以是将所述细粒棘球蚴抗原蛋白基因与PGEM-T Easy载体连接而成的。所述的连接可以是将含所述细粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR产物与PGEM-T Easy载体连接构建成。所述细粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR产物可以通过抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA作为扩增模板，通过PCR法进行扩增而得。

本发明提供一种转化体，其由上述重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而得。所述的转化可以按照本领域的常规或已知的方法进行。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物，其序列为：

上游：5’-GCGGATCCATGAGTCTTCAGAAAAC-3’(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链；下游：5’-GCGTCGACTTAGAAGAGAGCCATTAAC-3’(如SEQ ID NO：4所示)或其互补链。

在本发明的另一方面，提供一种上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)Epc1基因扩增；

2)重组质粒构建和鉴定；

3)重组蛋白的诱导表达及纯化。

步骤1)具体为：设计SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增。所述RT-PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸5min。

步骤2)具体为：将步骤1)所得的PCR产物与PGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌JM109，筛选菌落、培养并提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的质粒和表达载体PET28a(+)分别经BamH I和Sal I双酶切、纯化回收连接，转入大肠杆菌DH5α，并培养过夜；筛选阳性菌落提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。

步骤3)具体为：将重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，分别收集诱导前及不同诱导时间菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；离心收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析；按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。

在本发明的另一方面，提供一种上述重组抗原蛋白在制备诊断细粒棘球蚴病药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种上述重组抗原蛋白在制备细粒棘球蚴病诊断试剂盒中的应用。

本发明从我国青海省细粒棘球蚴包囊中分离原头蚴，抽提总RNA，采用RT-PCR扩增EgEPC1基因，将其克隆到pGEM-T载体中，再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达重组蛋白，用SDS-PAGE及Western blotting对纯化后重组抗原进行鉴定分析，对60例囊型包虫病、37例泡型包虫病、16例囊虫病、7例肝吸虫病、4例血吸虫病、4例弓形虫病和33名健康人共161份血清进行ELISA检测，评价重组抗原的免疫诊断效果。双酶切鉴定及测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功，SDS-PAGE及Western blotting分析显示重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达，产物以可溶蛋白形式存在，重组蛋白相对分子质量约为11000，可被囊型包虫病患者混合血清识别；该重组抗原对CE血清的诊断敏感性为78.3％，特异性为96.9％(除泡型包虫病人血清)。实验证明，本发明的EgEPC1重组抗原对细粒棘球蚴病的诊断具有敏感性和特异性高等优点，具有较好的诊断价值，为研制相关诊断试剂盒奠定了基础，在细粒棘球蚴病诊断方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例中EgEpc1基因的RT-PCR扩增结果示意图，其中，M表示DNA标志物(100bp)，1表示阴性对照，2表示EgEpc1 PCR扩增产物；

图2是本发明实施例中重组质粒酶切鉴定结果示意图，其中，M、M1、M2表示DNA标志物(100-3000bp、100bp、1kb)，1表示EgEPC1-T质粒经BamH I和Sal I双酶切，2表示PET28a-EgEPC1质粒经BamH I和Sal I双酶切；

图3是本发明实施例中PET28a-EgEPC1重组蛋白的SDS-PAGE分析结果示意图，其中，M表示蛋白分子量标准，1表示PET28a/BL21诱导前，2表示PET28a/BL21诱导4h，3表示PET28a-EgEPC1/BL21诱导前，4表示PET28a-EgEPC1/BL21诱导4h，5表示PET28a-EgEPC1/BL21诱导表达的菌液超声后上清，6表示PET28a-EgEPC1/BL21诱导表达的菌液超声后沉淀，7表示纯化的PET28a-EgEPC1重组蛋白；

图4是本发明实施例中PET28a-EgEPC1重组蛋白的Western-blot分析结果示意图，其中，M表示蛋白分子量标准，1表示健康人混合血清，2表示CE患者混合血清，3表示AE患者混合血清。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1细粒棘球蚴重组抗原蛋白的制备

1材料

1.1细粒棘球蚴

从青海省屠宰场收集绵羊肝脏棘球蚴囊，无菌条件下分离并收集青海(羊源)细粒棘球蚴原头节。

1.2待检血清样本

青海省地方病预防控制所提供确诊CE患者血清60份、泡型包虫病(alveolar echinococcosis，AE)患者血清37份、囊尾蚴病患血清11份，及中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供健康人血清33份、囊虫病患血清5份、肝吸虫病患血清7份、血吸虫病患血清4份、弓形虫病患血清4份。

1.3主要试剂和工具酶

Total RNA Isolation kit购自德国Macherey-Nagel公司；AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、PGEM-T Easy载体试剂盒均购自美国promega公司；DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒购自北京博大泰克公司；Probond^TMPurification System购自Invitrogen公司；DNA Marker、蛋白预染Marker购自Fermentas公司；羊抗人IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP购自Ptglab公司。

2方法

2.1Epc1基因扩增与克隆

2.1.1基因扩增

根据报道的Epc1基因序列(登录号AF481884)设计引物，上游引物含BamH I酶切位点，下游引物含Sal I酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

上游P1：5’-GCGGATCCATGAGTCTTCAGAAAAC-3’(如SEQ ID NO：3所示)；

下游P2：5’-GCGTCGACTTAGAAGAGAGCCATTAAC-3’(如SEQ ID NO：4所示)；

利用总RNA提取试剂盒抽取原头蚴总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行PCR扩增。反应条件为95℃预变性5min；94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸5min。

2.1.2重组质粒构建和鉴定

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒回收，与PGEM-T Easy载体4℃条件下连接过夜，转化大肠杆菌JM109，经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，分别接种于含氨苄青霉素的液体培养基中培养，提取质粒，双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的菌样送Invitrogen上海生物技术有限公司进行测序分析；将测序正确的质粒和表达载体PET28a(+)分别经BamH I和Sal I双酶切、纯化回收连接，转入大肠杆菌DH5α，并在含有30ug/ml卡那霉素的LB平板中37℃培养过夜；筛选阳性菌落提取质粒，双酶切鉴定并测序。将测序无误的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。

2.2重组蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌接种于含卡那霉素(30ug/ml)的LB液体培养基中37℃培养过夜。按1％的比例接种于LB液体培养基中，于37℃振荡培养至菌液吸光度A₆₀₀≈0.4～0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L诱导表达4h，分别收集诱导前及不同诱导时间菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；大量诱导表达菌液经4℃，5000r/min离心15min收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴10分钟，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析。按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。

3结果

3.1EgEPC1基因扩增与克隆

3.1.1基因扩增

采用RT-PCR的方法，获取EgEpc1的cDNA片段并以其为模板，扩增出207bp与预期长度一致的目的片段(见图1)。经测序及与GenBank中Epc1基因序列blast分析，确定扩增片段正确。

3.1.2 EgEpc1基因克隆与亚克隆

目的基因片段与pGEM-T Easy载体TA克隆，构建重组质粒EgEPC1-T，经双酶切及测序鉴定，酶切片段及测序结果均与目的基因片段大小相符，其同源性100％；与表达载体PET28a构建重组表达质粒PET28a-EgEPC1，酶切鉴定获得与预期大小一致片段，测序结果表明序列无变异，开放阅读框正确，重组表达质粒构建成功(见图2)。

3.2 PET28a-EgEPC1重组蛋白的表达、纯化

将蛋白表达产物经SDS-PAGE分析，在诱导4h时，在11KDa处出现一最高量表达条带，与目的蛋白分子质量基本相符；蛋白以可溶性形式存在于上清中，经纯化后蛋白在11KDa位置得到一清晰条带，与目的蛋白相符(见图3)。

实施例2  PET28a-EgEPC1重组蛋白的Western-blot鉴定

1.Western-blot鉴定方法

将纯化后的PET28a-EgEPC1重组蛋白(由实施例1制得)经15％SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维素膜上；将膜剪成条状置于5％脱脂奶粉溶液封闭过夜，PBS-T洗3次，每次5min；分别与正常健康人混合血清和CE患者混合血清、AE患者混合血清(1∶100稀释)反应，室温轻摇2h，PBS-T洗3次，每次5min；加入羊抗人HRP-IgG(1∶1000)室温轻摇2h，PBS-T洗3次，每次5min；加入新鲜配制的DAB联合显色液，直到出现目的条带，去离子水终止反应。

2.重组蛋白的Western-blot鉴定分析结果

分析结果显示，PET28a-EgEPC1纯化重组蛋白可被CE患者混合血清特异性识别，在11KDa处出现特异性的条带，与健康人混合血清和AE患者混合血清无反应(见图4)。

实施例3  细粒棘球蚴重组抗原蛋白的诊断效果实验

1.重组抗原的ELISA血清学评价

将多份血清CE和健康人血清分别等量混合配制成阳性和阴性血清对照。血清按1∶100稀释，通过方阵滴定确定重组抗原(由实施例1制得)工作浓度0.5μg/ml，羊抗人IgG辣根过氧化物酶标记物工作浓度为1∶14000。邻苯二胺底物(OPD)显色，测A₄₉₀。以33例健康人血清的吸光度均值2倍SD作为阳性判断值。

2.数据统计分析

使用Excel电子表格处理软件对实验数据进行整理和统计分析。

3.重组抗原的血清学检测结果的分析评价

用重组抗原EPC1分别对CE、AE和其他寄生虫病感染及健康人血清进行ELISA的IgG检测，其敏感性为78.3％，特异性为96.9％(除泡型包虫病人血清)。由表1可见，除泡型包虫病患者血清外，重组抗原与CE患者血清有较好的特异性反应，与健康人血清和弓形虫患者血清仅1例交叉反应，但与囊虫病、血吸虫、肝吸虫病患血清均未发生交叉反应。经统计学处理比较分析显示，CE患者血清与AE、囊虫患者、肝吸虫、血吸虫及健康人血清检测结果之间存在显著性差异(P＜0.005)，与弓形虫患者之间差异无显著性(P＞0.05)。

表1  EPC1重组抗原ELISA检测不同血清结果

4.讨论

本发明从Eg原头节cDNA中扩增Epc1基因片段，成功克隆获得EgEpc1，与原核表达载体PET28a(+)构建重组质粒，并通过大肠杆菌系统高效表达了EPC1重组蛋白，纯化后的重组蛋白经Western-blot鉴定表明有较好的反应原性。

分子克隆技术为发展早期诊断及疗效评估的抗原检测方法提供了方便，然而分子诊断技术的快速发展受到经费等多方面的限制，特别是技术复杂性的制约，使其一些偏远地区或大范围研究不易推广，基于ELISA免疫诊断方法具有较高的实用性，且已广泛应用于包虫病辅助诊断和群体流行病学调查监测，所以本发明用该重组抗原对161份血清进行ELISA检测，结果表明EgEPC1重组抗原对囊型包虫病患者血清的敏感性为78.3％，除泡型包虫病患者血清外，其诊断特异性为96.9％；与囊虫病患者血清、肝吸虫病患者血清无交叉反应；与弓形虫病患者血清仅1例存在交叉反应。研究分析表明该重组抗原能够较好的检测囊型包虫病，是一种具有较好诊断潜能的抗原，在囊型包虫病单流行区有较好应用前景，但鉴于该重组抗原与泡型包虫病患者血清有一定的反应也显示出该抗原可能不适用于鉴别泡型包虫病和囊型包虫病，如要更有效的区分两型包虫病则需采用与泡型包虫病特异性抗原联合应用的诊断方法。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途

<130>NP-10-14307

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>102

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSMSLQKT VEKLFDELDK DKSGKISCAE    60

LKSALQSCSA EPLDDDHVKA FLDKLDSNKD GELSLDELMA LF                      102

<210>2

<211>207

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgagtcttc agaaaactgt tgagaagctt ttcgatgagt tggacaagga caagtcgggc     60

aagattagct gtgccgagct taaatccgca ctacagtcgt gctcagcaga gcctctcgat    120

gacgaccatg tgaaggcttt cttagataag ctcgactcca acaaggacgg cgaattaagc    180

ctagatgagt taatggctct cttctaa                                        207

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gcggatccat gagtcttcag aaaac                                    25

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gcgtcgactt agaagagagc cattaac                                  27

Claims (9)

1.一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物，其特征在于，其序列为：

上游：5’-GCGGATCCATGAGTCTTCAGAAAAC-3’(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链；

下游：5’-GCGTCGACTTAGAAGAGAGCCATTAAC-3’(如SEQ ID NO：4所示)或其互补链。

3.一种如权利要求1所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)Epc1基因扩增；

2)重组质粒构建和鉴定；

3)重组蛋白的诱导表达及纯化。

4.如权利要求3所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：设计SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或其互补链为引物，抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板进行RT-PCR扩增。

5.如权利要求4所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸5min。

6.如权利要求3所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)所得的PCR产物与PGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌JM109，筛选菌落、培养并提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的质粒和表达载体PET28a(+)分别经BamH I和Sal I双酶切、纯化回收连接，转入大肠杆菌DH5α，并培养过夜；筛选阳性菌落提取质粒，双酶切鉴定并测序，将测序无误的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。

7.如权利要求3所述的诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：将重组菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，分别收集诱导前及不同诱导时间菌液，进行SDS-PAGE电泳分析；离心收集菌体，用纯化缓冲液重悬，冰浴，后冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀进行可溶性分析；按纯化试剂盒纯化重组蛋白，测定吸光度计算蛋白浓度并用SDS-PAGE鉴定其纯度。

8.一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备诊断细粒棘球蚴病药物中的应用。

9.一种如权利要求1所述的重组抗原蛋白在制备细粒棘球蚴病诊断试剂盒中的应用。

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