CN105039349A - 一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因及其医用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，本发明还涉及利用该诊断基因蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体，可用于建立犬细粒棘球绦虫粪抗原的检测方法，进一步讲是提供了用于犬的细粒棘球绦虫ELISA检测的蛋白基因，并应用于犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA方法的建立中，属于犬科动物疾病检测技术领域。

Description

一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因及其医用用途

技术领域

本发明提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，此外，本发明还涉及利用该诊断基因蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体，可用于建立犬细粒棘球绦虫粪抗原的检测方法，进一步讲是提供了用于犬的细粒棘球绦虫ELISA检测的蛋白基因，并应用于犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA方法的建立中，属于犬科动物疾病检测技术领域。

背景技术

犬细粒棘球绦虫病是细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus）成虫寄生于犬的小肠内，使患犬食欲减退、消化紊乱，导致消化系统遭受严重损伤的一种寄生虫病。其虫卵或者节片可随犬粪排出体外，感染牛、羊、猪等动物以及人。至今，犬细粒棘球绦虫病已在世界范围内流行，尤其是牧业国家。已严重威胁人类健康和畜牧业的快速发展，给世界经济造成了严重的损失。犬是细粒棘球绦虫的主要终末宿主，也是细粒棘球蚴病的重要传染源。因此对犬感染该虫情况的动态监测、诊断并及时治疗对预防和彻底根除细粒棘球绦虫病具有重大的意义。目前，细粒棘球绦虫成虫诊断抗原包括成虫虫体粗提抗原、囊液抗原、原头节虫体抗原及其分泌物抗原等许多种类。用于诊断的成虫粗抗原虽然敏感性较高，但是特异性很低。纯化后的抗原虽然特异性较粗提抗原高，但是敏感性同时也降低了。有些抗原又具有时限性，有些抗原处理与制备操作复杂。对于重组抗原，应用于诊断领域的主要为Ag5和AgB，但其常与其他寄生虫发生交叉反应。因此目前还有针对犬细粒棘球绦虫诊断的金标准抗原。粪抗原的检测方法主要有槟榔碱导泻法、ELISA方法、PCR方法等，但是槟榔碱导泻法的反应率具有一定的局限性；ELISA方法常出现敏感性低，并伴有一定的交叉反应；PCR方法常出现假阳性，并对仪器要求较高。至今也没有检测犬细粒棘球绦虫的金标准方法。因此，选择高特异性的抗原，建立具有高敏感性、高特异性的犬细粒棘球绦虫粪抗原的诊断方法十分必要。

发明内容：

本发明公开了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，采用细粒棘球绦虫兔高免血清对本实验室保存的细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选，筛选出具有价值开放性阅读框的基因。

本发明所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，如SEQIDNO1所示。

该序列具有864bp的开放性阅读框，编码288个氨基酸，基因序列经NCBIBLAST氨基酸同源性分析与多房棘球绦虫诊断抗原gp50（Echinococcusmultilocularisdiagnosticantigengp50）的氨基酸序列（CDJ06164.1）有92%同源性，是一个未知的新基因，命名为：EdiagA864。

对本发明基因的编码蛋白经Sopma在线分析预测二级结构，其α-螺旋占10.07%，延伸链占33.33%，无规则卷曲占56.60%。延伸链和无规则卷曲共占89.93%；CBS在线预测TMHMM跨膜结构分析，该基因编码蛋白为胞外蛋白；该蛋白具有含有B细胞表位的结构基础。经CBSPredictionServersLinearB-cellepitopes预测分析及DNAMAN亲水性及疏水性分析，为构建有效的疫苗或诊断方法奠定基础，也为制备单克隆抗体与多克隆抗体提供高特异性的抗原，建立了快速、特异性的检出犬细粒棘球绦虫粪抗原的双抗夹心ELISA检测方法，对犬细粒棘球绦虫的防治提供新的依据或工具。

本发明还提供了该基因蛋白的原核表达载体，其特征在于：

通过PCR方法扩增编号为EdiagA864的目的基因，其大小为864bp，回收该DNA后连接pMD-18T克隆载体，载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pET-32a载体连接，成功构建表达载体。表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌感受态后，诱导其表达可得到51kDa左右的蛋白条带，经WesternBlot检测分析其具有良好的反应原性，为研制犬细粒棘球绦虫成虫的诊断抗原或疫苗奠定了基础。

本发明所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：

首先采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选。对文库λ噬菌体进行平板培养，去除交叉抗体反应后用IPTG诱导其表达，用兔抗细粒棘球绦虫成虫高免血清、HRP标记的羊抗兔IgG对所表达的蛋白进行阳性筛选。对其筛选出的阳性噬菌斑进行插入基因的克隆及分析，获得基因并命名。然后对其进行开放性阅读框PCR扩增，连接pMD-18T构建克隆载体，经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pET-32a载体连接，成功构建表达载体。表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌感受态后，诱导其表达。最后对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳及WesternBlot检测分析其反应原性。

本发明进一步提供了基于该基因蛋白的犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA检测方法，用于检测犬科动物是否感染犬细粒棘球绦虫，解决了槟榔碱导泻法的反应局限性及危险性，检测血清特异性检测循环抗原及抗体等方法的不足，快速、特异性地检出犬细粒棘球绦虫的感染，适用于工业化生产。

所用捕获抗体为利用在大肠杆菌E.coli（DE3）表达的EdiagA864蛋白作为抗原，经免疫、细胞融合获得了杂交瘤细胞株，经腹水收集纯化而得的单克隆抗体；所用抗体稀释液为pH值7.4的磷酸盐缓冲液；包被液为pH值9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液为5%的脱脂奶粉PBST液；洗涤液为Tween-20含量为0.5%的0.01mol/L的pH值7.4的PBST溶液；终止液为2mol/LH₂SO₄溶液；酶标抗体为以重组蛋白EdiagA864为抗原，辣根过氧化物酶标记免疫后的兔多克隆抗体；底物溶液为pH值5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液和H₂O₂配置的邻苯二胺(OPD)；样品稀释液为Tween-20含量为0.3%的0.01mol/L的pH值7.4的PBST溶液。

本发明的积极效果在于：提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的编码蛋白，经Sopma分析其二级结构，具有含有B细胞表位的结构基础。经CBS在线预测TMHMM跨膜结构分析，该基因编码蛋白为胞外蛋白。大部分抗原决定簇都位于亲水区。以在大肠杆菌E.coli(DE3)表达的EdiagA864蛋白作为抗原，经免疫、细胞融合获得了杂交瘤细胞株，经腹水收集纯化而得了单克隆抗体；以EdiagA864重组蛋白为抗原，经辣根过氧化物酶标记，获得了酶标兔抗EdiagA864多克隆抗体，建立了检测犬细粒棘球绦虫的双抗体夹心ELISA方法。

本发明采用单克隆抗体与多克隆抗体，增加了双单克隆抗体夹心ELISA的敏感性，减少了双多克隆抗体夹心ELISA反应的假阳性率。以该蛋白为基础建立的犬细粒棘球绦虫检测方法特异性高、敏感性强、重复性好。具有操作简单、检测快速，易于判断等优点，适合于临床的快速诊断和牧区、村镇等流行病学调查大规模应用。

利用本发明的基因蛋白建立的双抗夹心ELISA可用于制备试剂盒，且所有试剂均为已配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测待检样品中的细粒棘球绦虫抗原，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境；且样本用量小，采集方便，试剂保存时间长，对操作者无毒性，对环境无污染等；因此本发明筛选出的基因蛋白与应用制备的单克隆抗体及多克隆抗体建立的双抗夹心ELISA检测方法均具有重大的社会意义和广阔的市场前景。且该犬细粒棘球绦虫基因蛋白不仅可用于建立诊断方法，还应用与疫苗等领域，具有很大应用前景。

附图说明：

图1筛选结果；

图2阳性噬菌斑的插入片段PCR扩增；

图3为二级结构预测；

图4为跨膜结构分析；

图5为抗原决定簇预测分析；

图6为疏水性分析；

图7为亲水性分析；

图8为ORFEdiagA864基因PCR扩增；

图9为EdiagA864-pMD-18T克隆载体双酶切鉴定结果；

图10为EdiagA864-pET-32a表达载体双酶切鉴定结果；

图11为EdiagA864-pET-32a重组蛋白SDS-PAGE电泳结果；

图12为EdiagA864-pET-32a重组蛋白Westernblot鉴定结果；

图13为EdiagA864蛋白纯化SDS-PAGE结果，1:Marker；2-5：1-4号收集管；

图14为SDS-PAGE验证腹水抗体的纯化效果；

图15为多克隆抗体的纯化，1-2：纯化后；M：Marker；3：未纯化；

图16为多克隆抗体Westernblot鉴定结果，1-2:上样量为10μL；3-4：上样量为2μL；M：Marke。

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1:

免疫相关抗原基因的筛选鉴定及原核表达

1．λ噬菌体平板培养

取30μLXL1-Blue菌种接于含四环素LB液体的试管中，37℃摇床过夜；取4mL菌液5000g离心5min，弃上清，加入200μL高压灭菌的10mM硫酸镁重悬细菌；加入重悬菌液200μL，1×λBuffer100μL和细粒棘球绦虫cDNA文库100μL混合均匀，于37℃水浴20min；加入48℃的LB/MgSO₄顶层琼脂3mL，混匀倒入提前预热的LB平板上并铺平，凝固后倒放于37℃培养箱，直至平板上长出针尖样大小的噬菌斑。

2．去除交叉抗体反应

将XL1-Blue接种于含四环素抗性的LB液体培养基里，放于37℃摇床培养过夜；离心弃去上清后，用PBS重悬沉淀，超声破碎；对XL1-BlueE.coli裂解液12000g离心10min；取1mL上清加入20μL的兔高免血清于4℃过夜反应。

3．噬菌斑的蛋白诱导表达

向90mm培养皿中加入19mLTNT溶液，加入1mLIPTG；取硝酸纤维素膜（NC膜）浸泡入培养皿10min；滤纸吸取膜上面残留的液体，平板倒放于37℃培养箱培养8h；将取出的NC膜放入含2mL灭菌胎牛血清的20mLTNT缓冲液中，振荡片刻后，放入4℃冰箱中，过夜封闭。

4．检测噬菌斑中表达的融合蛋白

取出封闭后的NC膜，弃去封闭液后，TNT缓冲液洗涤3次/5min；将NC膜放入含有50μL去处交叉抗体（兔高免血清终含量为1μL）的20mLTNT缓冲液中，孵育5h；TNT缓冲液洗涤3次/5min；将NC膜放入含有6μL羊抗兔IgG的20mLTNT缓冲液中，孵育2h；加入各一滴DAB显色液显色，再用蒸馏水终止反应；将NC膜上的呈阳性的斑点与平板上的阳性噬菌斑对应，吸取出噬菌体，加入200μL含氯仿的SM缓冲液，放于4℃进行过夜反应（见图1）。

5．插入基因的克隆及分析

使用该噬菌体的插入片段扩增引物进行PCR，以含有噬菌体的SM缓冲液为模板，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图2）。对PCR扩增获得的插入片段基因序列进行NCBIBLAST分析，得到了属于绦虫属有关的基因序列，该序列具有864bp的开放性阅读框，编码288个氨基酸，经NCBIBLAST同源性分析与多房棘球绦虫诊断抗原gp50（Echinococcusmultilocularisdiagnosticantigengp50）的氨基酸序列（CDJ06164.1）有92%同源性，是一个未知的新基因，本研究将其命名为：EdiagA864。经Sopma在线分析预测二级结构（见图3），其α-螺旋占10.07%，延伸链占33.33%，无规则卷曲占56.60%。因α-螺旋具有氢键，化学键能较高，不易发生变化，能够较稳定的维持蛋白质的结构，且常位于蛋白质内部，不容易形成抗原表位，很难与相应的抗体结合。而延伸链和无规则卷曲结构较分散，容易发生变化出现在蛋白质的表面，易形成表面抗原。本发明基因编码蛋白的延伸链和无规则卷曲共占89.93%；CBS在线预测TMHMM跨膜结构分析，该基因编码蛋白为胞外蛋白（见图4）；经CBSPredictionServersLinearB-cellepitopes预测分析及DNAMAN亲水性及疏水性分析，大部分抗原决定簇都位于亲水区（见图5-7）。

6．开放性阅读框PCR扩增

根据开放性阅读框查找后所得的基因序列，用Primer5.0软件进行酶切位点查找并引物设计：

F5’-GGATCCGGAATTGTCGTCTTCCTTCT-3’限制性内切酶为BamHI

R5’-AAGCTTACCAATAAGTCTTCTCCAATGC-3’限制性内切酶为HindⅢ

以EdiagA864PCR扩增产物为模板进行PCR扩增，PCR产物经电泳鉴定（见图8）。

7．构建ORFEdiagA864克隆载体

回收的目的片段与pMD-18TVector连接，4℃连接过夜。

8．连接产物的转化

将连接产物连接至感受态（TOP10）。

9．重组质粒鉴定

挑取单个菌落2-3个，分别于Amp抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养10-12h；对菌液进行质粒提取，操作步骤按质粒小提试剂盒进行；对提取成功的质粒进行双酶切鉴定（见图9），恒压电泳显示目的片段的大小为864bp。

10．构建ORFEdiagA864表达载体

对pET-32a空质粒菌进行培养，提质粒，并对其进行BamHI和HindⅢ双酶切，电泳回收；与pET-32a质粒连接；连接产物转化入感受态、菌液涂在LB平板培养、挑菌后提取质粒、双酶切（见图10）；双酶切验证表达质粒构建成功后，将质粒转化入（DE3）感受态；对菌液进行质粒提取和双酶切验证，结果显示转入的质粒正确。

11．ORFEdiagA864重组蛋白鉴定

诱导重组蛋白表达，进行SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定（见图11-12）。

12．重组蛋白的纯化

将重组蛋白用上海生物工程有限公司的Ni-NTASefinose^TMResin进行纯化。SDS-PAGE电泳检验蛋白纯化效果（见图13）。纯化后浓度为2.8μg/μL。

实施例2：

EdiagA864单克隆抗体与多克隆抗体的制备

1．动物免疫

取EdiagA864蛋白，加入等量佐剂，完全充分乳化后背部皮下多点注射，免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。三次免疫后利用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，效价达20万，3天后进行细胞融合。

2．细胞融合

取健康小鼠的腹腔细胞作为饲养层细胞铺于96孔细胞培养板，取小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞，在PEG的作用下，进行细胞融合。

3．阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆

取融合后第5天和第10天的细胞培养上清进行抗体检测。选择检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株进行克隆。最终得到了4株单克隆抗体，分别命名为2D12、3H4、4A6和6E5，染色体数量分别为97、101、98、96，均在正常范围内。

4．单克隆抗体亚型分析鉴定

采用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒中的对单克隆抗体亚型进行鉴定。四株单克隆抗体的重链亚型均为IgG1，轻链亚型均为Kappa。

5．单克隆抗体的大量制备——腹水的制备

选择健康的雌性Balb/c小鼠，接种石蜡后第7-10天，选择生长状态良好旺盛、处于对数期的2D12杂交瘤细胞腹腔注射。待腹部膨大明显，触摸有紧张感，可采集腹水。4000g，离心10min，吸取上清，用间接ELISA检测腹水中的抗体效价，可达20万，后放于-80℃保存。

6．单克隆抗体的纯化

采取正辛酸-饱和硫酸铵法和过滤HiTrapProteinGHP亲和层析柱结合的方法对腹水中的单克隆抗体进行纯化。SDS-PAGE检验腹水纯化效果，纯化后的抗体可见一条重链和一条轻链（见图14）。

7．兔多克隆抗体的制备

取EdiagA864蛋白，加入等量佐剂，完全乳化后免疫新西兰兔的颈部和背部，免疫间隔周期为15d。三次免疫后利用间接ELISA方法检测兔血清抗体效价，效价达10万，心脏采血。经4000g，10min离心，吸取上清液。经正辛酸-饱和硫酸铵法和过滤HiTrapProteinGHP亲和层析柱方进行纯化，SDS-PAGE验证纯化效果（见图15），抗体浓度为13.01μg/μL，经Westernblot鉴定该多克隆抗体能够特异性识别重组蛋白EdiagA864（见图16）。

实施例3:

双抗夹心ELISA方法的建立

1．辣根过氧化物酶标记兔抗EdiagA864多克隆抗体

取购自北京泰天和生物科技有限公司的辣根过氧化物酶，按说明书进行操作，成功标记了兔抗EdiagA864多克隆抗体。

2．样品的处理

对犬细粒棘球绦虫标准阳性与阴性样品进行预处理：称取1g粪便，加入5mLPBS(含有0.3%Tween-20)，充分混匀，超声3-4下，经3000g，离心10min取上清。

3．HRP标记抗体的检测

将标准阳性及阴性样品处理后用包被液包被于ELISA板中，5%脱脂奶粉封闭，不同比例稀释HRP标记的多克隆抗体作为二抗，经底物显色后终止反应，取OD值最接近1为判定标准。结果酶标抗体的最佳稀释比例为1:800（见表1）。

4．捕获抗体与抗原最佳工作浓度的检测

应用棋盘滴定法纵向包被捕获抗体，封闭剂均采用5%脱脂奶粉，将犬细粒棘球绦虫标准阳性样品横向稀释，将HRP标记抗体按照最佳浓度加入，显色测量OD₄₉₀。结果捕获抗体最佳包被浓度为1:50，抗原最佳稀释比例为1:5（见表2）。

5．最佳封闭剂

将捕获抗体按其最佳浓度进行包被，分别加入5%脱脂奶粉、10%胎牛血清及1%BSA作为封闭剂，再加入最佳比例稀释的标准阳性及阴性样品，加入最佳比例的HRP标记抗体后显色，测量OD₄₉₀。结果1%BSA为最佳封闭剂（见表3）。

6．特异性试验

用建立的双抗夹心ELISA方法检测犬细粒棘球绦虫标准阳性样品与犬贾第虫阳性样品、犬蛔虫阳性样品，结果均为阴性（见表4），该方法特异性强。

7．敏感性试验

将犬细粒棘球绦虫标准阳性样品按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160比例进行稀释，用建立的双抗夹心ELISA检测其反应的敏感性。结果敏感性为1:20（见表5）。

8．重复性试验

利用建立的双抗夹心ELISA方法对6份阳性样品与4份阴性样品进行了批间和批内的重复性检测，结果批内重复试验变异系数均值为4.6%，批间重复试验变异系数均值为5.3%，表明该方法具有可重复性。

9．双抗夹心ELISA结果判定标准的确定

取10份犬细粒棘球绦虫标准阴性样品进行ELISA反应，OD₄₉₀值平均值为0.068，标准差SD为0.009（见表6），因此阳性样品检出下限为+3SD=0.095。为了减少假阳性和假阴性的出现，将临界值加减一个标准差作为可疑区间。因此当OD₄₉₀≥0.104时，样品判定为阳性；当OD₄₉₀﹤0.086时，样品判定为阴性；当0.086≤OD₄₉₀﹤0.104时，样品判定为可疑，需要重新检测。若重检时，OD₄₉₀≥0.095，样品判定为阳性；OD₄₉₀﹤0.095，样品判定为阴性。

10．样品检测

利用建立的双抗夹心ELISA方法检测64份来自长春地区的犬粪样品和8份犬细粒棘球绦虫阳性样品，结果显示64份来自长春地区的犬粪样品均呈阴性，8份犬细粒棘球绦虫阳性样品均为阳性。

SEQno.1序列表

<110>吉林大学

<120>

<140>

<160>1

<210>1

<211>864

<212>DNA

<213>细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus）

<400>1

1GGAATTGTCGTCTTCCTTCTCGTCGTTGCCTACTGCTCAGGAGCGGAACCAGTGCCATGG

61GGTTCTCGGATTGTTGGAACACCAGCAGGAAAATCACCAACTATGTATTTACGTCTTCCC

121AAGGAGGCCTTGATAGTGGTGTTGAGAAATGGCAGCCAATCTCTAATCGAAATTAAAAAT

181GGCACGTGTTATCGTAATAATCAAGACTGGGGCTCTCCCTGCCAAATGGATGAAGGAAGT

241GCCAACATCACTCTGAATGACGTATCCCAACAGGAGGCATTACTAATATGGGATGGATCT

301TCATTCACTTCTACAGTATTCTTCGTGCCAAATTGTACTTTTCAGACACCACAGCAAGGT

361ACAGTCAATTTACAGACGTCGTTTCCACTTTCTCGATTTGGGAAAGGGCGATCGTATATC

421GAAGTCGCATTTGCTGCTCAAGGTGCAAACAACCAAACTGGGGCTTCAATTGAAGTGAAC

481GGCCGAGTTGCGTGTAGATGGACAGGGACTACTCTCGTTGCACATGACTCACCTTTCTGC

541CGTAACATGACGAATGACACAGGATCAGATCTGAGAACATTTGTCCTGAACATTACTCGA

601AATGACGCTACTAATTATACCACAATTGAATGGTCCGCCTTGACTACAGTATTAGTAGTT

661AATATTGACTGGACGCAAGAGGGTGAATCGCCAGAAATAGCGGAATGCAGCAGATATCGG

721GGTGAAACGACCACAACCTCTGCCGAACCTGGAGTGACGTCCACTTCCACGACCACGACC

781TCTTCCGGACATGAGGCGACTTCCACTTTCACGACTGTGATTGCACTGCTGTCGATGCTC

841ATGCATTGGAGAAGACTTATTGGT

<110>吉林大学

<120>

<140>

<160>1

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus）

<400>1

1GGATCCGGAATTGTCGTCTTCCTTCT26

<110>吉林大学

<120>

<140>

<160>1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus）

<400>1

1AAGCTTACCAATAAGTCTTCTCCAATGC28

Claims (4)

1.一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，如SEQIDNO1所示。

2.权利要求1所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：

首先采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选；

对文库λ噬菌体进行平板培养，去除交叉抗体反应后用IPTG诱导其表达，用兔抗细粒棘球绦虫成虫高免血清、HRP标记的羊抗兔IgG对所表达的蛋白进行阳性筛选；

对其筛选出的阳性噬菌斑进行插入基因的克隆及分析，获得基因并命名；

然后对其进行开放性阅读框PCR扩增，连接pMD-18T构建克隆载体，经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pET-32a载体连接，成功构建表达载体；

表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆菌感受态后，诱导其表达；

最后对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳及WesternBlot检测分析其反应原性。

3.权利要求1所述基因蛋白的原核表达载体，其特征在于：通过PCR方法扩增编号为EdiagA864的目的基因，其大小为864bp，回收该DNA后连接pMD-18T克隆载体，载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pET-32a载体连接，构建表达载体。

4.细粒棘球绦虫成虫诊断基因蛋白在制备犬细粒棘球绦虫成虫的诊断抗原或疫苗中的用途。