CN101475938A - 包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用 - Google Patents

包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用 Download PDF

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曹春宝
马秀敏
吾拉木﹒马木提
朱明�
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温浩
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本发明涉及抗原基因技术领域，是一种包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用，该基因具有序列1的核苷酸序列。本发明从细粒棘球蚴中得到的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白，通过egG1Y162基因的克隆，转化，诱导表达，动物实验进一步表明egG1Y162重组蛋白疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠有保护作用，可以成为防治包虫病的候选基因疫苗，为开发实用性的疫苗发展提供一条新的途径。

Description

包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用
一、技术领域
本发明涉及抗原基因技术领域，是一种包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用。
二、背景技术
包虫病(cystic echinococcosis；CE)又称棘球蚴病，是细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus；Eg)的幼虫棘球蚴寄生于人体及某些动物肝、肺等脏器所致的一种严重的人畜共患慢性寄生虫疾病。预防棘球蚴病的措施是控制传染源和切断传播途径。目前重组疫苗的研制虽然有了一定进展，但是还没有取得理想的效果。
日本学者Katoh[1，2]等在研究多房棘球蚴绦虫时，发现一些疫苗候选蛋白具有分泌功能和膜表面锚定作用，它们通常都具有位于氨基末端疏水的信号肽和羧基末端疏水的跨膜区域，并与寄生虫和宿主的相互作用有关。这些跨膜蛋白质有利于寄生虫穿透宿主的细胞膜侵入宿主的体内和调节宿主的免疫应答。因此，可以将这些分泌型蛋白质作为候选疫苗或用于诊断疾病并命名为EMY162抗原。EMY162由日本学者Katoh等，在2007年底发现的，同时发表了两篇相关文章：[1]Y.Katoh，H.Kouguchi，J.Matsumoto，et al.Characterization ofemY162 encoding an immunogenic protein cloned from an adult worm-specific cDNAlibrary of Echinococcus multilocularis[J].Biochim.Biophys.Acta.2007，1780(1)：1-6.(从多房棘球绦虫成虫的cDNA文库中克隆的emY162基因及编码免疫蛋白的特点)。[2]H.Kouguchi，J.Matsumoto，Y.Katoh，et al.The vaccinationpotential of EMY162 antigen against Echinococcus multilocularisinfection[J].Biochim.Biophys.Acta.2007，363(4)：915-920.(EMY162抗原成为预防多房棘球蚴感染疫苗可能性)。
从上述两篇相关文章可知Katoh等发现的emY162(在多房棘球绦虫Echinococcusmultilocularis；Em，中发现的一种抗原基因)重组抗原可以诱导大鼠产生74.3％的免疫保护作用，同时EMY162重组抗原在泡型包虫病患者血清中阳性率也明显高于em95，在多房棘球蚴绦虫的四个发育阶段(原头节，续绦期，幼虫，成虫)均有emY162抗原蛋白表达。用多房棘球蚴病犬的血清进行Western blots分析显示，该抗原产生很强的IgG免疫反应。现在已经证明emY162是分泌型蛋白质，能够刺激犬的免疫系统产生有效的免疫应答，因此emY162抗原被认为是理想的多房棘球蚴病的候选疫苗。
三、发明内容
本发明提供了一种从细粒棘球蚴中得到的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用，特别是在制备防治人或畜包虫病的疫苗或诊断试剂中的应用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种从细粒棘球蚴中得到的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因，其特征在于具有序列1的核苷酸序列。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或改进：
上述核苷酸序列两端设计一对引物，该引物的
上游引物(Primer)：5’-ccgaattcatggtacttcgattctgt-3’，
下游引物(Primer)：5’-ccagcttagtaagtaataggagccca-3’。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：上述的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因的重组蛋白。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：上述的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因在制备防治人或畜包虫病的疫苗或诊断试剂中的应用。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：上述的重组蛋白在制备防治人或畜包虫病的疫苗或诊断试剂中的应用。
本发明从细粒棘球蚴中得到的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白，通过egG1Y162基因的克隆，转化，诱导表达，动物实验进一步表明egG1Y162重组蛋白疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠有保护作用，可以成为防治包虫病的候选基因疫苗，为开发实用性的疫苗发展提供一条新的途径。
四、附图说明
附图1为本发明PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，其中，1为DL-2000，2，3为原头蚴本发明egG1Y162基因cDNA。
附图2为本发明egG1Y162重组蛋白SDS-PAGE电泳分析结果，其中，1.蛋白分子量标志物，2至5为0.5Mm IPTG诱导2、4、6小时(h)后本发明egG1Y162重组蛋白表达产物。
附图3为本发明egG1Y162重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳分析结果，其中，1为蛋白分子量标志物，2为超声以后的上清，3为100毫摩尔/升咪唑洗脱结果，4为200毫摩尔/升咪唑洗脱结果，5为300毫摩尔/升咪唑洗脱结果，6为500毫摩尔/升咪唑洗脱结果。
五、具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1：利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增本发明egG1Y162抗原基因
首先RNA(核糖核酸)的提取及PCR扩增本发明egG1Y162基因：取100毫克原头蚴(来源于感染细粒棘球蚴的羊的肝脏)，加入1毫升Trizol(可以破坏细胞壁使核糖核酸释放出来的一种裂解液)充分匀浆，室温静置5分钟；加入0.2毫升氯仿，振荡15秒，静置2分钟；4度离心，12000克×15分钟，取上清；加入0.5毫升异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟；4度离心，12000克×10分钟，弃上清；加入1毫升75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4度，7500克×5分钟，弃上清，晾干，加入30微升的焦磷酸二乙酯(一种强烈的RNA酶抑制剂)溶解。其次利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒将RNA反转录合成cDNA(反向转录脱氧核糖核酸)，总反应体系20微升，RNA模版250纳克，RT反应体系48度孵育30分钟，最后加热95度5分钟。根据emY162 cDNA序列(世界核苷酸数据库序列号：AB303298)，利用DNAman软件(DNAMAN美国Lynnon Biosoft公司开发的高度集成化的分子生物学应用软件)，设计特异性引物。引物的设计如下：
上游引物(Primer)：5’-ccgaattcatggtacttcgattctgt-3’
下游引物(Primer)：5’-ccagcttagtaagtaataggagccca-3’
PCR扩增本发明egG1Y162基因cDNA：反应条件：94度5分钟，40循环包括93度30秒，56度30秒and70度30秒，最后70度，7分钟。利用iCyclerPCR扩增仪(B io-Rad)进行PCR扩增，利用含有EB(可以和DNA分子氢键结合，在紫外灯下琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下观察DNA条带的大小，初步判断是否为自己的条带，通过电泳图可以看出，扩增的条带为495bp，如附图1所示。
实施例2：大量获取本发明egG1Y162基因序列
将本发明egG1Y162基因与PUCm-T载体(一种通用的克隆载体)在T4DNA连接酶作用下，16度连接过夜。将本发明egG1Y162目的基因构建到PUCm-T载体上，构建PUCm-T/egY162重组质粒，将重组质粒转化至E.Coli DH5α(用于克隆大肠杆菌)中，然后进行涂板，37度培养过夜，使重组质粒在细菌中大量复制。随机各挑选5个菌落，提取质粒，进行基因测序，其结果与网上基因数据库比对发现，本发明egG1Y162基因是在细粒棘球绦虫中发现的一种新基因。
实施例3：得到本发明egG1Y162重组蛋白
需要构建PET-41a/egG1Y162原核表达质粒，利用EcoR I/Hind III双酶切PUCm-T/egG1Y162重组质粒及原核表达质粒pET41a，经回收、连接、转化至E.coli BL21(具有表达功能的一种大肠杆菌)中，37度培养过夜。重组质粒经PCR扩增、EcoRI/Hind III双酶切鉴定后，测序。测序正确的PET-41a/egG1Y162原核表达质粒，30度，经IPTG(终浓度为0.5毫摩尔/升的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，蛋白诱导剂)诱导0小时，2小时，4小时，6小时，收集菌体，经4度、12000转/分钟离心10分钟后，利用12％ SDS-PAGE(聚丙烯凝胶电泳分析)检测，分子量不同的蛋白质其迁移率不同，然后用考马斯亮蓝进行染色(可以与蛋白质结合显色)，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导0小时，2小时，4小时，6小时后，在44KDa(kilodalton千道尔顿，蛋白分子量)处可见本发明egG1Y162重组蛋白表达，其如附图2所示，表明本发明egG1Y162重组蛋白成功表达。
实施例4：免疫动物需要纯化的本发明egG1Y162重组蛋白，利用镍-His柱纯化目的蛋白。
PET-41a/egG1Y162原核表达质粒具有编码His.Tag的核苷酸序列，表达的His.Tag序列(6、8或10个连续的组氨酸残基)与镍-His柱上的His结合树脂的二价阳离子镍结合，然后洗去未结合蛋白后，最后用咪唑缓冲液洗脱并回收目标蛋白。具体如下：第一，先用超纯水10毫升洗柱，1毫升硫酸镍过柱，再用5毫升超纯水洗柱。第二，Bind Buffer(58.44毫摩尔/升Nacl2，358.14毫摩尔/升Na2Hpo4.12H2O，156.01毫摩尔/升NaH2po4.2H2O，68.08毫摩尔/升10mMImidazole)平衡His柱3次后，加入粗蛋白结合1h，再用平衡缓冲液(pH7.6，20毫摩尔/升Na3PO4，500毫摩尔/升NaCl，10毫摩尔/升咪唑)洗涤10次后。第三，用含不同浓度(100、200、300、500毫摩尔/升，PH7.4)的洗脱缓冲液分步多管洗脱，检测洗脱物纯度。本发明egG1Y162重组蛋白纯化以后，进行SDS-PAGE电泳分析结果，500mM咪唑的浓度为最佳的洗脱液，其如附图所示，得到纯化的本发明egG1Y162重组蛋白。
实施例5：利用本发明egG1Y162重组蛋白对继发性细粒棘球蚴感染小鼠的免疫保护性实验
5.1细粒棘球原头蚴感染模型的制备
取感染细粒棘球蚴的羊肝，无菌取原头蚴，用生理盐水漂洗5次，去沉淀物，直到洗液清亮，吸去上清液，用0.5％伊红染色计数原头蚴的着色率及形态，原头蚴的存活率>90％，用含青霉素500单位/毫升和链霉素100单位/毫升的生理盐水，配成含1 x 105了个原头蚴/毫升悬液，每只小鼠腹腔注射0.1毫升上述悬液，即每只小鼠接种约1000个活原头蚴。于感染70天后，随机检查小鼠的感染状况，以感染率>90％，为造模成功。
5.2免疫接种方法
本发明egG1Y162重组蛋白：重组蛋白抗原加福氏完全佐剂1:1均匀乳化后，背部皮下多点注射免疫接种小鼠，每鼠接种重组蛋白抗原剂量为50微克，2周后以相同剂量加等量福氏不完全佐剂相同法注射。以后每隔2周静脉和腹腔各注射20微克纯化的重组蛋白抗原。
5.3动物试验方法
动物分为以下3组：免疫接种重组蛋白egG1Y162预防接种组(n＝16)组，生理盐水对照组(n＝16)，佐剂对照组(n＝16)，在连续接种4次后，第14天，腹腔注射0.1ml原头蚴(1000个)。
各组小鼠分别在腹腔注射原头蚴后第140天，摘眼球取血，分离血清，-70℃保存。小鼠取血之后，短颈处死观察腹腔棘球蚴囊生长状况。
5.4观察指标
肉眼观察细粒棘球蚴囊发育的外观形态，光滑性、透明度、囊团体积大小等生长状况。摘取腹腔全部细粒棘球蚴囊称重，计算抑制率：
囊湿重抑制率％＝(C-T)/Cx100％(C：对照组小鼠囊湿重均值；T：每个试验组小鼠囊湿重)。
5.5 实验结果
佐剂组和生理盐水对照组各16只小鼠腹腔均有细粒棘球蚴囊生长，囊壁光滑透明，张力高，数量多，常单个或成堆游离于腹腔，或附着于肠系膜或肝表面。本发明egG1Y162预防组囊数量明显减少，体积明显变小，有6只(7/16)小鼠腹腔及肝表面未见包虫囊肿，表明这7只小鼠获得了完全保护。
囊湿重抑制率结果各组小鼠均取出细粒棘球蚴囊分别称重，计算囊湿重抑制率。与生理盐水对照组比较，本发明egG1Y162重组蛋白预防组的囊湿重抑制率分别为92.3％。与佐剂对照组比较，本发明egG1Y162重组蛋白预防组的囊湿重抑制率分别为90.8％和79.6％。
实验结果表明，重组蛋白预防组囊湿重抑制率可达90.8％，并且有7/16只小鼠得到完全保护，表明本发明egG1Y162重组蛋白疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠有保护作用。
通过对本发明egG1Y162重组蛋白空间结构的预测分析表明，本发明egG1Y162与emY162氨基酸序列有92.16％同一性，而且发现本发明egG1Y162与EMY162抗原具有共同的结构特征，在N端区域有一个信号肽序列，在中间有一个纤维结合蛋白区域和羧基端有一个疏水区编码的跨膜螺旋域，本发明egG1Y162与EMY162重组蛋白具有高度的相似性，所以本发明egG1Y162重组抗原可以诱导宿主产生显著的免疫保护作用。
通过以上实验表明，本发明egG1Y162重组蛋白疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠有保护作用，可以成为防治包虫病的候选基因疫苗。
综上所述，通过egG1Y162基因的克隆，转化，诱导表达，动物实验进一步表明egG1Y162重组蛋白疫苗对继发性细粒棘球蚴感染小鼠有保护作用，可以成为防治包虫病的候选基因疫苗，为开发实用性的疫苗发展提供一条新的途径。
本发明egG1Y162抗原基因序列1如下：
SEQUENCE LISTING核苷酸序列1
<110>The college of pre-clinine Xinjiang Medical UniversityDing，Jian bing新疆医科大学
<120>The application of egGlY162 antigen gene and its recombinantprotein包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用
<130>[1]Y.Katoh，H.Kouguchi，J.Matsumoto，et al.Characterizationof emY162 encoding an immunogenic protein cloned from an adultworm-specific cDNA library of Echinococcus multilocularis[J].
Biochim.Biophys.Acta.2007，1780(1)：1-6.从多房棘球绦虫成虫的cDNA文库中克隆的emY162基因及编码免疫蛋白的特点
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>459
<212>DNA
<213>Echinococcus granulosus细粒棘球绦虫
<220>
<221>exon
<222>(1)..(459)
<400>1
atg gta ctt cga ttc tgt ctt att ttg ctg gca act tca gtc atc gct       48
Met Val Leu Arg Phe Cys Leu Ile Leu Leu Ala Thr Ser Val Ile Ala
1              5                 10                15
gag gaa atc agg gta gac cca gag cta atg gca aag ttg aca aag gaa   96
Glu Glu Ile Arg Val Asp Pro Glu Leu Met Ala Lys Leu Thr Lys Glu
           20                25                 30
cta aag acc aca ctg cca gaa cac ttc cga tgg attcac gtg ggt tcc  144
Leu Lys Thr Thr Leu Pro Glu His Phe Arg TrpIle His Val Gly Ser
       35                 40               45
cgc tcc ctt gaa ttg ggt tgg aat gcc act ggt tta gcc aat ctc cac  192
Arg Ser Leu Glu Leu Gly Trp Asn Ala Thr Gly Leu Ala Asn Leu His
    50                55                60
gca gac cac att aaa ctg act gca aac ctt tat aca act tac gtt acc  240
Ala Asp His Ile Lys Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Thr Tyr Val Thr
65                70                75                 80
ttc aag tac aga aat gtt cct atc gaa cgt cag aaa ctc act ctt gag   288
Phe Lys Tyr Arg Asn Val Pro Ile Glu Arg Gln Lys Leu Thr Leu Glu
               85                90                 95
gga cta aag ccc agt aca ttc tac gaa gtg gtt gtg caa gca ttt aaa  336
Gly Leu Lys Pro Ser Thr Phe Tyr Glu Val Val Val Gln Ala Phe Lys
           100               105               110
gga ggt tcc caa gtt ttt aaa tac act gga ttc att aga aca ctg gct  384
Gly Gly Ser Gln Val Phe Lys Tyr Thr Gly Phe Ile Arg Thr Leu Ala
       115               120               125
cca ggg gaa gat ggc gct gac aga gct agc gga ttc gcc tta att ttt  432
Pro Gly Glu Asp Gly Ala Asp Arg Ala Ser Gly Phe Ala Leu Ile Phe
    130              135               140
gca atg gct ggg ctc cta tta ctt act                             459
Ala Met Ala Gly Leu Leu Leu Leu Thr
145               150

Claims (5)

  1. 【权利要求1】1、一种从细粒棘球蚴中得到的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因，其特征在于具有序列1的核苷酸序列。
  2. 【权利要求2】2、根据权利要求1所述的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因，其特征在于核苷酸序列两端设计一对引物，该引物的
    上游引物(Primer)：5’-ccgaattcatggtacttcgattctgt-3’，
    下游引物(Primer)：5’-ccagcttagtaagtaataggagccc-3’。
  3. 【权利要求3】3、一种含有权利要求1或2所述的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因的重组蛋白。
  4. 【权利要求4】4、一种根据权利要求1或2所述的包虫病抗原基因即egG1Y162抗原基因在制备防治人或畜包虫病的疫苗或诊断试剂中的应用。
  5. 【权利要求5】5、一种根据权利要求3所述的重组蛋白在制备防治人或畜包虫病的疫苗或诊断试剂中的应用。
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