CN112979780A - 一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗glep及其制备方法与应用 - Google Patents

一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗glep及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP及其制备方法与应用，疫苗GLEP的活性成分是一条多肽，主要由多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽序列构成。通过基因合成技术合成多房棘球蚴疫苗GLEP基因序列，以及双酶切连接至表达载体中，然后将表达载体转化进Arctic Express进行融合蛋白的表达。蛋白经Ni‑NTA亲和层析纯化后，获得多房棘球蚴疫苗GLEP。该多房棘球蚴疫苗GLEP能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，从而有效预防小鼠感染多房棘球蚴，可用于预防多房棘球蚴感染相关性疾病。

Description

一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP的应用及制备方法。
背景技术
多房棘球蚴病是一种严重的疾病，临床症状复杂，可伴肝区疼痛、呼吸急促、胸疼等症状。由于其呈恶性浸润性生长，有虫癌之称。晚期产生严重并发症，危及患生命，若得不到及时治疗，10年病死率高达94％，严重危害广大牧民群众的身心健康。目前主要的治疗手段包括外科手术和药物治疗。外科手术治疗是目前的首选的治疗方案，但存在术后复发率较高，胆汁瘘、肝功能异常等较为严重的并发症。药物治疗主要应用阿苯达唑、吡喹酮和奥苯达唑等，但据统计，药物对棘球蚴病的治愈率仅为30％～40％，对人体棘球蚴病的治疗效果欠佳、副作用较大，且存在耐药性等潜在风险。因此采用疫苗的方式是控制多房棘球蚴病的一种更有效措施和手段。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，第一个目的是提供一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗。
本发明第二个目的是提供多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗的制备方法。
本发明第三个目的是提供多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗的用途。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP，其特征在于：其活性成分是一条多肽，其氨基酸序列如序列1所示。其核苷酸序列如序列2所示。
一种表达载体，其特征在于：包含前述的核苷酸序列(序列2)。
一种转基因细胞系，其特征在于：包含前述的核苷酸序列(序列2)。
一种宿主菌，其特征在于：包含前述的核苷酸序列(序列2)。
该多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP的制备方法，通过基因合成技术合成多房棘球蚴多表位肽GLEP的核苷酸序列，构建含有融合基因GLEP的重组表达载体pCzn1-GLEP及其重组基因工程菌株Arctic Express；重组基因工程菌株Arctic Express发酵后，经Ni-IDA镍离子交换层析纯化，获得该疫苗的融合蛋白GLEP。
其技术路线详述如下：
重组表达质粒pCzn1-GLEP(含有融合基因GLEP)的构建。
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因GLEP，通过双酶切连接至pCzn1载体的Nde I和Xba I之间，获得的重组质粒pCzn1-GLEP。
融合蛋白GLEP的原核表达及纯化。
将重组表达载体pCzn1-GLEP转化进大肠杆菌Arctic Express中，构建重组基因工程菌株Arctic Express/pCzn1-GLEP。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-IDA镍离子亲和层析获得电泳纯度的融合蛋白GLEP，即为多房棘球蚴多肽疫苗GLEP。
该多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP能够激发机体产生针对多房棘球蚴B细胞及T细胞的免疫应答。
该多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP还包括在制备预防和治疗多房棘球蚴感染的药物组合中的应用，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关疾病。
本发明采用多房棘球蚴摄取宿主营养所必须的葡萄糖转运蛋白EmGLUT1作为抗原蛋白，葡萄糖是维持各种生物细胞内的能量代谢和生命活动的主要物质，但作为一种极性分子它不能以自由扩散的方式通过细胞膜脂质双层结构的疏水区，多数情况下需要葡萄糖转运蛋白(GLUT)的协助。自1977年GLUT1蛋白质被从人的红细胞膜中分离，葡萄糖转运蛋白的研究便有了快速发展。GLUT1是目前所发现的分布最广泛的转运体，负责各种组织与血液间葡萄糖的转运，是红细胞和上皮样屏障细胞的主要葡萄糖转运蛋白，对于维持血糖浓度的稳定和大脑供能起关键作用。棘球蚴在寄生过程中以葡萄糖为主要的能量来源，需要从宿主中摄取，维持其生命活动所需。2018年Jun Matsumoto教授研究发现多房棘球绦虫摄取宿主葡萄糖的过程依赖EmGLUT1，如若以葡萄糖转运蛋白未抗原，能切断多房棘球蚴能量来源从而抑制其增值。因EmGLUT1为12次跨膜蛋白，较难量产，本发明对其在表位鉴定的基础上，筛选氨基酸序列中非跨膜区进行串联，既保留其活性肽段又能够量化生产。
本发明采用分子克隆技术将GLEP核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化后克隆到质粒pCzn1中，经原核系统表达并纯化获得重组蛋白GLEP；继而将多肽疫苗GLEP免疫小鼠后经ELISA、小鼠脾淋巴细胞增殖实验等技术考察多肽疫苗GLEP的免疫原性及生物活性。
本发明具有以下优点：1、多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白是该寄生虫生命活动所必须蛋白。2、多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP筛选EmGLUT1中非跨膜区进行串联，保留了其具有表位抗原优势肽段。3、多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP，安全性高、产量高、纯度高，稳定性强。4、葡萄糖转运蛋白具有较强的免疫原性，能够诱发针对多房棘球蚴抗原蛋白葡萄糖转运蛋白及总蛋白高滴度的特异性抗体产生。
附图说明
图1：重组表达载体pCzn1-GLEP的双酶切鉴定。泳道1：pCzn1-GLEP酶切前质粒；泳道2：pCzn1-GLEP/Nde I+Xba I；泳道M：DNA Marker。
图2：重组表达载体pCzn1-GLEP载体构建图谱。
图3：多房棘球蚴多肽融合蛋白的原核表达。泳道M：蛋白质Marker；泳道1：未加IPTG诱导菌液蛋白；泳道2：加IPTG诱导后菌液蛋白；泳道3：加入0.5mM IPTG 36℃诱导后菌液离心后上清；泳道4：加入0.5mM IPTG 36℃诱导菌液离心后沉淀。
图4：多房棘球蚴多肽融合蛋白GLEP的Ni-IDA亲和层析纯化。泳道M：蛋白质Marker；泳道1：GLEP未纯化蛋白；泳道2：20mM咪唑洗脱的杂蛋白和部分目的蛋白；泳道3，4：纯化后的GLEP蛋白样品。
图5：多房棘球蚴多肽GLEP诱发抗GLEP IgG抗体的检测。多房棘球蚴多肽疫苗GLEP能诱发产生较高滴度抗GLEP的IgG抗体，并具有较高的抗体效价。
图6：多房棘球蚴多肽疫苗GLEP特异性IgG抗体随时间增加抗体水平增加。多房棘球蚴多肽疫苗GLEP免疫后小鼠抗体随免疫次数的增加抗体水平增加，第三次后能够维持一定滴度的抗体水平。
图7：多房棘球蚴多肽疫苗GLEP诱发抗多房棘球蚴总蛋白IgG抗体的检测。多房棘球蚴多肽疫苗GLEP能够产生一定滴度抗多房棘球蚴总蛋白的IgG抗体。
图8：多房棘球蚴多肽疫苗GLEP致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，当然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，并不意味着对本发明的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料
1、IPTG溶液：称取2.4g IPTG溶于10mL无菌水，用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。
2、氨苄青霉素(Amp)贮液(100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素(Amp)溶于10mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。
3、培养基：(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1L，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。(2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100mL LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。
4、DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H2O和57.1ml冰乙酸，加水至1L，使用时稀释50倍。
5、SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS 5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
6、考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮蓝G-250 100mg溶解在50mL 95％乙醇中，然后加入86％磷酸100mL，用蒸馏水稀释至1000mL。(2)脱色液：250mL乙醇、80mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。
8、实验动物：Balb/c小鼠：为SPF级，雄性，6～8周龄，购自西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2018-001。
9、ELISA试剂：(1)包被液：1.6g Na2CO3，2.9g NaHCO3，0.2g NaN3，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。(2)洗涤液：分别称取0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH2O定容至1L(PBST)。(3)封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。(4)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液：量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸21.7mL(1M H2SO4)。
10、淋巴细胞增殖实验主要试剂(1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(购于CEDARLANE公司，CL5031)(2)RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。(3)RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO3，加去离子水至1L，pH 7.4，超滤除菌，分装。
实施例1：重组表达载体pCzn1-GLEP(含有融合基因GLEP)的构建
将GLEP的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因GLEP，通过克隆位点Nde I和Xba I连入表达载体pCzn1。
结果：利用Nde I和Xba I双酶切待检重组质粒pCzn1-GLEP，37℃反应2h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的DNA片段约为340bp，与融合基因GLEP的理论大小一致，如图1所示。重组表达载体pCzn1-GLEP的载体构建图谱如图2所示。将获得的重组质粒pCzn1-GLEP转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与预期序列完全一致，且无移码突变。
实施例2：多肽融合蛋白GLEP的原核表达
将验证正确的重组表达质粒pCzn1-GLEP转入到大肠杆菌Arctic Express菌株中。在预先制备好的含50μg/mL Amp的LB平板上，接种环划线基因工程菌株pCzn1-GLEP/ArcticExpress，倒置于37℃培养箱，过夜培养后，挑取单个菌落，接种于含50μg/mL Amp的LB培养基中，37℃，220rpm，培养过夜。以2％接种量分别接种重组菌于含50μg/mL Amp LB培养基中，37℃，220rpm，培养至至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)，加入IPTG使终浓度达到1mmol/L，37℃，220rpm诱导表达4h，以未加IPTG诱导的载体菌pCzn1-GLEP/Arctic Express作为阴性对照。
结果：与对照菌株对比，基因工程重组菌株pCzn1-GLEP/Arctic Express在约13.3KD处出现目的蛋白条带，与多肽融合蛋白GLEP的理论大小相符合，如图3所示。多肽融合蛋白GLEP在可溶蛋白中存在。
实施例3：多肽融合蛋白GLEP的纯化
(1)重组菌的细胞破碎
将菌体沉淀重悬于20ml lysis buffer(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSFand bacteria protease inhibitor cocktail,pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集上清；
(2)Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化
利用低压层析系统，蛋白溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜。
结果：经Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯，如图4所示。
实施例4：多肽疫苗GLEP的免疫原性和免疫特异性研究
(1)Balb/c小鼠的免疫
实验分组：将SPF级Balb/c小鼠随机分为3组，分别为多肽融合蛋白GLEP免疫组、和PBS免疫组。每组6只Balb/c小鼠，共18只，详细分组如表1所示：
表1：SPF级ICR小鼠分组及免疫方案
Figure BDA0002951870120000071
免疫方式：用75％酒精对小鼠腹部消毒，然后腹部注射多肽融合蛋白GLEP和铝佐剂的混合乳化剂；每隔10天加强免疫一次。
抗血清的采集：在末次免疫后第五天，收集小鼠血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，－80℃冻存备用。
(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测
将抗原GLEP分别用包被液稀释成10μg/mL，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清(鼠抗GLEP抗血清，每隔1天采血1次)和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μL/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:10000)，100μL/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入100μL/孔TMB底物显色液，室温避光反应10min，加50μL终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。
结果：经GLEP免疫后小鼠能产生针对GLEP特异性IgG抗体，且能获得较高效价(约110万)，如图5所示；IgG抗体水平随免疫次数的增加而增加，单次免疫可在10天内保持较高水平，第三次免疫后能够维持较高水平的IgG抗体，如图6所示；GLEP的包被浓度为10μg/mL，通过ELISA检测，多房棘球蚴亚单位疫苗GLEP能够产生针对GLEP的特异性IgG抗体，而PBS免疫组不能产生抗GLEP，如图7所示。
(3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验
将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75％酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏(暗红色)。在小平皿中放入2-3mL
Figure BDA0002951870120000081
淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约1mL的1640培养基；1000g-1500g离心20min。离心结束后淋巴细胞会在1640培养基下层悬浮。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液(5x 105/mL)。在96孔平底培养板中，每孔加入100μL细胞，同时加入GLEP抗原蛋白20μg/ml、GLUT1抗原表位肽(GLUT1453-509、GLUT1171-180和GLUT1287-300)和生理盐水各100μL，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃5％CO2培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTS溶液40μl，继续培养2h后用酶标仪读取OD570值。刺激指数(SI)≥2时，判断为阳性；刺激指数计算公式如下：
Figure BDA0002951870120000091
结果：多肽疫苗GLEP致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经GLEP、GLUT1抗原表位肽(GLUT1453-509、GLUT1171-180和GLUT1287-300)刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明多房棘球蚴多肽疫苗中抗原表位肽均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生针对各自Th抗原表位的细胞免疫应答，如图8所示。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。
序列表
<110> 青海大学
<120> 一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP其制备方法与应用
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
Thr His Leu Leu Asn Thr Thr Thr Leu Gly Ser Asn Ser Ser Glu Met
1 5 10 15
Leu Lys Gly Ala Asn Val Ser Ser Asp Gly Ser Asn Ser Asp Gly Val
20 25 30
Val Asn Lys Met Pro Phe Val Leu Val Lys Lys Pro Ser Leu Asn Gly
35 40 45
Leu Leu Lys Gly Gly Ser Met Pro Glu Thr Lys Asn Arg Thr Phe Asp
50 55 60
Glu Val Ala Arg Asp Leu Ala Phe Gly Ser Ile Val Val Gly Lys Arg
65 70 75 80
Thr Ala Ala Leu Gln Ser Pro Val Phe Thr Lys Glu Asp Glu Glu Ala
85 90 95
Ala Thr Ala Leu Arg Arg Thr Asp Asp Asp Ser Lys Val Asp Ala
100 105 110
<210> 2
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
catatgaccc atctgctgaa taccaccaca ctgggcagta atagcagcga aatgctgaaa 60
ggtgcaaatg tttccagtga tggcagcaac agcgatggtg tggttaataa aatgccattt 120
gttctggtta aaaagccgtc tctgaatggt ctgctgaaag gtggtagtat gcctgaaacg 180
aaaaaccgta cctttgatga agtggcacgc gatctggcgt ttggcagcat tgttgttggt 240
aaacgtacag cggcactgca gagcccggtt tttacaaaag aagatgaaga agcggcaacc 300
gcactgcgtc gtaccgatga tgatagcaaa gttgatgcgt aatctaga 348

Claims (8)

1.一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP，其特征在于：其活性成分是一条多肽，其氨基酸序列如序列1所示。
2.根据权利要求1所述的多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP，其特征在于：其核苷酸序列如序列2所示。
3.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种转基因细胞系，其特征在于：包含权利要求2所述的核苷酸序列。
5.一种宿主菌，其特征在于：包含权利要求2所述的核苷酸序列。
6.一种多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP的制备方法，其特征在于：通过基因合成技术合成多房棘球蚴多表位肽GLEP的核苷酸序列，构建含有融合基因GLEP的重组表达载体pCzn1-GLEP重组基因工程菌株Arctic Express；重组基因工程菌株Arctic Express发酵后，经Ni-IDA镍离子交换层析纯化，获得该疫苗的融合蛋白GLEP。
7.权利要求1、2或6所述的多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP，其特征在于能够激发机体产生针对多房棘球蚴B细胞及T细胞的免疫应答。
8.权利要求1、2或6所述的多房棘球蚴葡萄糖转运蛋白多肽疫苗GLEP，其特征在于：在制备预防多房棘球蚴感染的药物组合中的应用。
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