CN100518824C - 重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗，利用人工合成的方法获得TT_830-843-B7-H1IgV区基因片段，将其插入pQE-30原核表达载体，转化大肠杆菌。在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到His-TT-B7-H1IgV蛋白，本发明的重组人His-TT-B7-H1IgV蛋白通过免疫小鼠产生抗B7-H1抗体，并且该抗血清能够在体外依赖补体杀伤表达B7-H1的肿瘤细胞。应用该蛋白免疫小鼠不仅可对荷瘤小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长起到一定的抑制作用，同时还可延长荷瘤小鼠的生存期。从而有可能为肿瘤的免疫治疗提供一种新的蛋白质药物。该肿瘤疫苗的应用目的在于以B7-H1为靶点获得一种能够促使小鼠体内产生针对B7-H1分子的中和抗体的肿瘤疫苗，从而研究应用主动免疫的方法进行肿瘤的免疫治疗。

Description

重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、动物免疫实验、诱导抗血清的体外活性检测以及抑瘤实验等技术。进一步涉及在体内能够诱导出针对B7-H1分子的自身抗体的重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗及其制备方法。

背景技术

20多年以来，有关人类肿瘤免疫反应研究结果显示肿瘤细胞表达的抗原可引起特异性细胞与体液免疫反应。但能够通过内源性免疫机制自发清除肿瘤的病例却极为罕见。2004年，Giorgio Parmiani指出应用以肽为基础的疫苗在治疗IV期黑色素瘤患者的临床I-II期过程中，仅有12％的患者在治疗后出现临床反应。近年来，与上述方法相比，在使用自体树突状细胞(DCs)与肽或肿瘤裂解物一同进行治疗的病例中，虽然患者产生疫苗特异性T细胞的概率增加，但有关临床反应仍未得到显著改善。免疫系统不能引起肿瘤消退是肿瘤疫苗研究中所面临的一个巨大困难。大量的研究证据表明，肿瘤存在着许多逃逸免疫系统识别和攻击的机制，包括：HLA-I类抗原和免疫共刺激分子的表达下调或丢失；肿瘤抗原的表达下调、丢失或突变；肿瘤细胞分泌免疫抑制性可溶性因子；肿瘤细胞膜上表达免疫抑制性分子；诱导具有免疫抑制功能的调节性T淋巴细胞等。其中，肿瘤组织中的免疫反应抑制是肿瘤细胞逃逸免疫攻击的重要因素。许多证据表明，存在于肿瘤组织中的特异性活化T淋巴细胞可发生凋亡。将体外活化的肿瘤特异性T淋巴细胞输入肿瘤组织后，其杀伤活性消失。这些现象都说明在肿瘤微环境中存在着保护肿瘤细胞的免疫逃逸机制。同时，还有许多具有免疫抑制功能的可溶性因子(TGF-β、IL-10、前列腺素E2、Fas、TRAIL和RACS1等)和细胞膜分子(CTLA4、B7-H1等)在肿瘤细胞表达上调。因此，研究肿瘤组织内有关针对免疫攻击的逃逸机制对于提高肿瘤疫苗的治疗效果具有重要意义。

1、B7-H1简介

B7-H1(因为可与受体PD-1结合，故又被称为PD-L1，2004年12月第八届国际人类白细胞分化抗原会议上被命名为CD274)是1999年，HaidongDong等人发现的B7家族新成员。B7-H1不与CD28、CTLA-4和ICOS结合，参与共刺激T细胞针对同种异体抗原刺激所产生的反应，并进一步刺激T细胞产生IL-10和IFN-γ。虽然在此过程中仅产生少量的IL-2，但它在B7-H1的共刺激过程中起到重要作用。近年来，越来越多的资料表明，B7-H1可能与肿瘤免疫逃逸、炎症、自身免疫性疾病、移植耐受和病毒感染等的发病机理和治疗有关。

1.1 B7-H1的结构

经查找美国NCBI蛋白质数据库，人源性B7-H1为I型跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白样家族成员，含有290个氨基酸。在二级结构上，B7-H1与B7-1和B7-2分子极为相似，可分为三个区：胞外区、跨膜区和胞内区。其中，胞外区含有1个IgV样区和1个IgC样区。鼠源性B7-H1分子也是I型跨膜蛋白，含有290个氨基酸，与人源性B7-H1有69％的同源性。其中，胞外区的结构特征及氨基酸组成与人源性B7-H1完全相同。

1.2 B7-H1的分布

1999年，Dong等人在经常发生炎症或免疫反应保护的正常组织中(如肺脏和胎盘)发现大量B7-H1mRNA，且B7-H1与受体结合后可以刺激IL-10与IFN-γ的产生，并增加T细胞的凋亡。同时，他们通过Northern blot实验分析了B7-H1mRNA在组织中的分布。2002年，Masayoshi Ishida等人发现B7-H1主要分布在：淋巴造血细胞、前B细胞、骨髓细胞、胸腺细胞亚型和部分干细胞。并且在丝裂原刺激下，几乎所有的淋巴细胞均可以表达B7-H1。2003年，经免疫组化等实验分析，曹旭东等人发现B7-H1主要分布在T细胞、B细胞、单核细胞、角质细胞(经诱导后表达)、心脏、胎盘、肺脏、脾脏、淋巴结、胸腺、肾脏、骨骼肌和胎肝组织。2002年，Dong等人报道，尽管在许多组织中均发现存在B7-H1 mRNA的转录，相比之下，B7-H1蛋白大量表达于肺癌、黑色素瘤和卵巢癌等人源性肿瘤组织中。同时，肿瘤相关B7-H1可以增加抗原特异性T细胞的凋亡，继而导致体内肿瘤组织的生长。

1.3 B7-H1与PD-1之间的负调节作用

在B7-H1分子受体PD-1的胞内区含有酪氨酸抑制性基序，通过募集含有酪氨酸磷酸酶活性及SH2结构域的蛋白因子传递负调节信号。2000年，据Freeman等人报道，B7-H1与PD-1结合可减少T细胞增殖；2002年，Iwai等人研究发现B7-H1与PD-1结合可以促进肿瘤细胞的免疫逃逸。虽然，通过接种或过继转移的方法均可以增加循环血液中肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的数量，但随着肿瘤的不断进展，肿瘤组织常常会出现对CD8+T细胞效应功能的抵抗特性。PD-1仅是B7-H1的受体分子之一，二者结合后可能通过抑制细胞周期的进展来介导T细胞活化反应的抑制效应。2004年，Shengdian Wang等人通过突变实验研究发现，B7-H1通过其IgV样区与PD-1的IgV样区相互结合发挥作用。同时，Christian Blank等人发现干扰B7-H1与PD-1间的相互作用，可以增强这种肿瘤抗原特异性CD8+T细胞在肿瘤微环境中的功能。在此期间，有很多文献资料表明，阻断B7-H1，可以诱导肿瘤组织的退行性发展，但并不仅仅依赖PD-1途径。

1.4 阻断B7-H1产生的作用

与小鼠相似，阻断人肿瘤细胞表面的B7-H1不仅可导致肿瘤抗原相关特异性CTL细胞裂解靶细胞的活性增强，同时还可增加肿瘤相关抗原特异性T辅助细胞有关细胞因子的产生。同种异体反应中的T-T细胞作用体系中，阻断B7-H1/PD-1通路可显著提高T细胞增殖和同种反应性T细胞产生IFN-γ和IL-2的水平。实验结果还显示T细胞相关B7-H1可通过T-T细胞之间相互作用阴性调节T细胞反应。

2、B7-H1在肿瘤免疫逃逸中的作用

B7-H1广泛表达于多种肿瘤细胞系，促炎因子IFN-γ可以上调B7-H1在肿瘤细胞的表达。大多数局灶性表达B7-H1的肿瘤组织中，邻近的正常组织无B7-H1的表达，且有研究发现淋巴结中的转移性骨髓瘤细胞表面B7-H1表达呈阳性。在肿瘤免疫反应中，B7-H1不仅可以通过PD-1依赖和非依赖机理促进肿瘤特异性T细胞的程序性死亡，而且，肿瘤细胞表面的B7-H1还可通过促使效应性细胞毒性T细胞的凋亡而活化抑制性免疫反应，且B7-H1的促凋亡效应主要由非PD-1受体途径介导。2002年，在进行B7-H1阻断研究时，Iwai等人发现表达B7-H1的肿瘤可能对肿瘤疫苗产生的抵抗作用更强，且应用特异性单抗或可溶性抑制物阻断B7-H1后可能会加强CTL杀伤已存在肿瘤细胞的活性。

大量具有侵袭性的人类肿瘤细胞均可以在不同程度上诱导机体产生细胞与体液免疫反应，但这样的免疫反应常常在被应用于阻止肿瘤细胞的进行性生长中而落败。长期以来人们推测肿瘤抗原可能因为没有经过有效的抗原呈递加工，所以不能引发足够强的免疫反应。但现有资料表明通过肿瘤抗原引发的免疫反应或继发转移已活化的T淋巴细胞尽管可以增强肿瘤患者体内的免疫反应，却在限制肿瘤组织的生长方面仅起到微弱影响。这些发现说明，即使加强了体内免疫反应的“武器装备”，但其仍不足以控制肿瘤的生长。新研究提出侵袭性肿瘤逃避免疫反应的机理与正常蛋白的异常表达相关，而目前受到普遍关注的就是B7-H1。

2005年，Hirano F等人发现肿瘤细胞组成性或经诱导表达B7-H1可以使其在体内对抗CD137抗体所产生的治疗作用产生抵抗。这种抵抗作用不损伤CTL细胞的功能，但抗原特异性CD8+CTL细胞却不能杀伤肿瘤细胞。用抗B7-H1或PD-1单抗则可去除这种抵抗作用，并进一步加强肿瘤治疗效果。所以研究人员认为B7-H1与PD-1通过相互作用形成一个分子屏障，从而阻止CTL细胞的杀伤作用。越来越多的研究表明B7-H1在肿瘤的免疫逃逸机理中可能占有重要地位，并极有可能成为未来肿瘤免疫治疗的新靶标。以下就近几年来的主要研究结果进行分类分析。

2.1 在治疗鳞状细胞癌中的应用

B7-H1在约66％新鲜分离的头颈部鳞状细胞癌(简称为SCC)组织中呈组成性表达。研究发现，所有的动物模型即使在接受继发性转移T细胞免疫治疗后，仍然会受到SCCVII/B7-H1+(鳞状细胞癌)细胞的攻击。2003年，Scott E.Strome等人，将B7-H1阻断性抗体与活化T细胞一起输入表达B7-H1的鼠鳞状细胞癌的荷瘤小鼠体内，治愈率达到60％。结果显示B7-H1的阻断可以增强T细胞免疫治疗的功效。

经免疫组化染色显示人的原发性口腔SCC细胞表面大量表达B7-H1。小鼠SCC细胞NR-S1不表达B7-H1，但在经过IFN-γ刺激的体外培养或体内输入IFN-γ后可被诱导表达B7-H1。尽管经刺激后的NR-S1肿瘤在具有免疫能力的小鼠体内表现为进行性生长，然而使用抗B7-H1单抗或抗PD-1单抗可显著抑制该肿瘤组织的生长。所以其中的B7-H1/PD-1通路可能对宿主体内的抗肿瘤免疫反应起到阴性调节作用。

2.2 有关肾细胞癌的研究

使用抗B7-H1抗体进行免疫组化研究发现1990年到1994年间进行肾透明细胞癌肾切除手术的306例患者中73例患者(23.9％)的肿瘤组织中有B7-H1的表达。通过研究10年随访病例发现，经统计学分析肿瘤组织中表达B7-H1的患者肾细胞癌的致死率和总体死亡率均有显著升高。肿瘤组织表达和不表达B7-H1的患者的5年生存率分别为41.9％和82.9％。在一个多变量模型中，调整肿瘤淋巴结转移分期、分级和特征后，肿瘤细胞表达B7-H1的情况仍与肿瘤特异性死亡率相关。2005年，Thompson RH等人对2000年到2004年间经肾切除治疗的196例肾细胞癌患者(其中26例患者经转移性透明肾细胞癌切除治疗)进行研究发现原发性肿瘤细胞和/或淋巴细胞高表达B7-H1的患者肾细胞癌死亡率显著高于低表达B7-H1的患者。经多变量分析发现高表达B7-H1的肾细胞癌患者更易于死亡。肿瘤相关B7-H1的表达情况与肾透明细胞癌患者的不良预后相关。肿瘤细胞异常表达B7-H1可能与肿瘤的抑制T细胞功能和降低生存期，从而导致宿主抗肿瘤免疫缺陷有关。所以B7-H1可能在肾细胞癌的发展过程中起到重要作用。同时，Thompson RH等人还通过使用单抗阻断B7-H1和传统免疫疗法联合治疗肾细胞癌荷瘤小鼠，结果显示阻断B7-H1可能是肾细胞癌免疫治疗的一种新策略。

2.3 有关胃癌和食管癌的研究

2006年，Zhu B等人通过对102例人胃癌组织进行免疫组化实验分析，检测其中的B7-H1表达情况和免疫学定位，从而深入讨论了B7-H1的表达与胃癌预后和临床致病性之间的关系。研究结果发现正常胃组织中未检测到B7-H1的表达，胃腺瘤组织中仅有弱表达，但在42.2％的胃癌组织中检测到了B7-H1的表达。B7-H1的免疫学组织定位与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤位置和肿瘤的分化程度无关，但B7-H1的表达与肿瘤的体积、侵袭性、淋巴结转移以及患者的生存时间呈显著相关。当肿瘤组织浸润入深肌层，并伴有淋巴结转移或患者生存期少于2年时，B7-H1的表达显著增强(P<0.01)。且经过多变量分析显示B7-H1的表达可被作为评估胃癌预后的独立因素。

2005年，Ohigashi Y等人对41例食管切除术患者的肿瘤组织进行了B7-H1基因表达PCR分析，并检测其蛋白表达水平。研究发现B7-H1阳性患者与阴性患者相比较表现为预后不良，且经过多变量分析显示B7-H1的表达情况也是评估食管癌预后的独立因素。

3、治疗性疫苗研究进展

近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，既用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点，涉及很多疾病，如：慢性病毒感染、过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。

治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两大类：一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生细胞免疫反应，产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。

绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明通过诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展就要缓慢的多，直到近几年治疗性疫苗才看到成功的希望。同时，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着能够在体内诱导抗体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如：阻断TNF-α以治疗炎症性疾病。

人源化的抗TNF-α单克隆抗体已经被证明在治疗类风湿性关节炎和Crohn’s病方面十分有效。目前已经有几种TNF-α的阻断剂上市，包括两种单克隆抗体(infliximab，adalimumab)和一种受体阻断剂(etanercept)，它们正在帮助成千上万的病人减轻痛苦，而且年收入达到20亿美元。所以阻断过量表达的TNF-α能够达到治疗疾病的效果。在动物试验中已经证实通过主动免疫可以特异性诱导出TNF-α的中和性抗体，而且诱导的抗体滴度足以治疗动物关节炎模型。

其他的动物试验表明可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病：针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1(NMDAR1)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotro-pinHCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(GnRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。

那么，治疗性疫苗的研究中存在哪些问题呢？最近在针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗的研制过程所发生的情况似乎对这个问题做了回答。阿尔海默茨病是一种看起来非常适合用治疗性疫苗进行治疗的疾病，这种病的发病过程长达数年甚至数十年。如果能用治疗性疫苗诱导出持续时间较长的抗体的话，那么无疑是一种理想的治疗方法，尤其是这种病人经常忘记吃药。

阿尔海默茨病的特征是大脑中斑块的沉积，这种斑块中含有Aβ-肽，这种Aβ-肽是从淀粉样蛋白的前体蛋白(amyioid precursor protein，APP)衍生来的。在编码APP的基因发生突变导致Aβ-肽的生成增加的人群中，阿尔海默茨病在早年就开始发生了。表达这种突变的APP的转基因小鼠大脑内有大量的斑块沉积，这种斑块与阿尔海默茨病病人脑中发现的斑块相似。用Aβ-肽加上强免疫佐剂来免疫这种转基因小鼠会使小鼠脑中的斑块减少，小鼠的精神表现明显好转。随后，一种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗开始了临床试验，在临床I期试验证明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的临床II期紧跟着开始了，但是没有想到的是6％的试验对象由于产生无菌性脑炎而被迫停止试验。随后研究证实，这种副作用与抗体的滴度没有关系，实际上，一名没有产生抗体反应的受试病人也得了无菌性脑炎。另外，在一名病人的大脑中发现有大量的淋巴细胞浸润。这些研究结果与一种假说相一致，那就是在病人中发现的副作用是由于Aβ-肽特异性的T淋巴细胞引起的，而不是由于抗体引起的。这就要求能够研制出不引起T淋巴细胞介导的自身免疫的第二代疫苗。那么，这种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗的效果如何呢？在前面提到的临床II期试验中，在诱导出抗Aβ-肽抗体的病人中有一部分认知力的减弱确实推迟了，有一些病人甚至在接受治疗的这一年中意识状态有了好转。如果在疫苗设计时能够解决其安全性问题，那么在不久的将来，针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗就会出现。

另一类稍有不同的疫苗对安全性的要求更低一些，那就是针对上瘾药物的疫苗。在动物试验中针对可卡因和尼古丁的疫苗降低了这些药物在大脑中的水平，消除了它们的成瘾症状，试验动物在接受了免疫后对药物不再依赖。在临床I期试验中，可卡因疫苗被证明有良好的耐受性，并且可以诱导出良好的抗体反应，现在，人们正在翘首以待它的有效性结果。

4、诱导自身抗体的理论研究

针对自身蛋白的治疗性疫苗是如何诱导自身免疫系统产生针对自身蛋白的抗体呢？要产生足够高的滴度的特异性抗体以治疗相关疾病，治疗性疫苗必须克服三个障碍：T细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效制剂的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别“非我”与“自我”的能力。免疫系统的这种特性通常被称为耐受或无反应性。耐受发生在B细胞和T细胞水平。一般来说，T细胞耐受更严格一些。对许多抗原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上，有三种机制导致了免疫耐受：细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导耐受和无能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但诱导耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中诱导，但也可在外周诱导。通常，对于普遍表达的丰富抗原的免疫耐受更容易阐明。

在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生抗体：当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHC II类分子的复合物。通常，B细胞不能激活Th细胞。要激活Th细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHC II类分子的复合物，激活Th细胞。激活后的Th细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHC II类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏Th细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一起，就有可能绕过Th细胞耐受：自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHC II类分子的复合物，由于Th细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。

与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和Th细胞的共同作用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。实际上，利用这种策略，针对多种自身激素的抗体反应已经被诱导出来了。

发明内容

综上所述，本发明的目的在于，提供一种以B7-H1IgV区蛋白为靶点构建的能够在体内诱导出针对B7-H1分子的重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗，为B7H1高表达的肿瘤免疫治疗提供一种新的治疗药物。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗，其特征在于，利用人工合成的方法获得TT_830-843-B7-H1IgV区基因片段，将其插入pQE-30原核表达载体，转化大肠杆菌，在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白，在体外能够竞争性抑制B7-H1/Fc蛋白与抗B7-H1单抗的结合。

该融合蛋白疫苗的特点是，用该蛋白进行免疫后，小鼠体内可产生高滴度的抗B7-H1抗体，并且该抗血清能够在体外依赖补体杀伤表达B7-H1的肿瘤细胞。并且，应用该蛋白免疫小鼠不仅可对荷瘤小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长起到一定的抑制作用，同时还可延长荷瘤小鼠的生存期。

上述重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)rhHis-TT-B7-H1IgV基因的克隆及原核表达载体的构建

将GeneBank中人B7-H1IgV基因序列上游引入BamHI酶切位点和破伤风类毒素表位，即TT_830-843表位；其氨基酸序列为Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser LysPhe Ile Gly Ile Thr Glu，以引发体内较强的细胞免疫反应，下游引入SalI酶切位点，并克隆入载体pGEX-4T-1中；

将上述载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切；上述pGEX-4T-1获得的小片段与从pQE-30中获得的大片段相连接。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段；测序正确的质粒命名为pQE-30(+)-rhHis-TT-B7-H1IgV，工程菌命名为pQE-30(+)-rhHis-TT-B7-H1IgV/DH5α；

插入片段TT_830-843-B7-H1IgV区的基因序列为：

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(2)重组蛋白表达

挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液中，培养液含Amp100mg/L，37℃摇床培养过夜，次日以1：100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37℃摇床培养3h至对数生长中期，即OD₆₀₀为0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4h，离心收集菌体；

(3)表达产物的鉴定

SDS-PAGE电泳：取30μl裂菌上清，加入30μl的2×载样缓冲液，混匀；另取其他样品加入30μl水，混悬后再加入30μl的2×载样缓冲液混匀；沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μl上清加样于18％分离胶6％浓缩胶，上样后电压为60V约20min，样品进入分离胶后电压升至100V约4-5h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2-3h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存；

免疫印迹反应：SDS-PAGE结束后，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜靠近阳极一侧，置转移缓冲液中，缓冲液的配方为：25mmol/L Tris、192mmol/LGlycine、20％甲醇，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至硝酸纤维膜上，电转移结束后，取出硝酸纤维膜，用洗涤液室温洗3次，该洗涤液含0.02mol/L pH为7.4的TBS、0.4％的Tween20，浸入封闭液中，该封闭液含2％的BSA洗涤液，37℃，1h，封闭液中取出后用洗涤液室温洗3次，加小鼠抗人B7-H1 mAb，37℃孵育1h，孵育后用洗涤液室温洗膜3次，加入羊抗小鼠IgG-AP二抗，37℃孵育1h，孵育后用洗涤液室温洗膜3次，再用Tris-HCl缓冲液洗3次，硝酸纤维膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应；

融合蛋白的纯化和复性：取含pQE-30-TT-B7-H1IgV重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4℃，12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀；将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，4℃下静置溶解；将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析；在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀；按1g菌体加10mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌，12000rpm，离心15min，弃上清，1g沉淀加10ml的6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH8.0的0.01M Tris，4℃搅拌2h，12000rpm，离心15min，共离心2次，收集上清待用；

用6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH 8.0的0.01M Tris充分平衡Ni柱，先用含10mmol咪唑的6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH 8.0的0.01M Tris洗脱杂蛋白，再用含250mmol咪唑的6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH 8.0的0.01MTris洗脱目的蛋白；收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素、0.1M NaH₂PO₄、pH 8.0的0.01M Tris复性，终浓度1mg/ml；最后透析入pH 9.5的0.01M Tris中，PEG8000浓缩后，用Bradford法测定蛋白浓度，即可得到重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗。

本发明中rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白的制备方法是：人工合成TT_830-843-B7-H1IgV基因片段，将该片段插入pQE-30载体中构建rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白基因；含有目的基因rhHis-TT-B7-H1IgV的原核表达载体的构建及重组蛋白表达；表达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白免疫小鼠后产生的抗血清竞争性抑制B7-H1/Fc蛋白与抗B7-H1单抗的结合作用；该抗血清在体外可以与表达B7-H1的肿瘤细胞相结合并依赖补体杀伤肿瘤细胞，且这两种作用均可以被B7-H1/Fc蛋白所阻断；rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白免疫小鼠后可以抑制小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长，并且可以延长荷瘤小鼠的生存期。

本发明的重组人His-TT-B7-H1IgV蛋白(rhHis-TT-B7-H1IgV)疫苗，通过免疫小鼠产生抗B7-H1抗体，从而有可能为肿瘤的免疫治疗提供一种新的蛋白质药物。

该肿瘤疫苗的应用目的在于以B7-H1为靶点获得一种能够促使小鼠体内产生针对B7-H1分子的中和抗体的肿瘤疫苗，从而研究应用主动免疫的方法进行肿瘤的免疫治疗。

附图说明

图1是重组表达质粒pQE-30-TT-B7-H1IgV的酶切鉴定；

图2是rhB7-H1IgV的表达，其中标号分别为：1、分子量蛋白质标准(从上至下分子量依次为：116000Da；66200Da；45000Da；35000Da，25000Da，18400Da，14400Da)，2、pQE-30，3、rhB7-H1IgV，4、诱导后的rhB7-H1IgV，5、裂菌上清，6、裂菌沉淀；

图3是rhB7-H1IgV的免疫印迹鉴定，其中标号分别为：1、分子量蛋白质标准，12、未诱导rhB7-H1IgV，13、诱导rhB7-H1IgV，14、纯化后rhB7-H1IgV；

图4是rhB7-H1IgV的纯化，其中标号分别为：1、分子量蛋白质标准(从上至下分子量依次为：116000Da；66200Da；45000Da；35000Da，25000Da，18400Da，14400Da)，21、复性后的rhB7-H1IgV蛋白；

图5是rhB7-H1IgV免疫小鼠后抗血清滴度检测，其中标号分别为：31、非佐剂免疫组抗体平均滴度：8.4×10⁴，32、佐剂免疫组抗体平均滴度：1.0×10⁵；

图6是抗B7-H1抗血清抑制B7-H1/Fc与抗B7-H1单抗的结合；

图7是免疫细胞化学实验检测抗rhB7-H1IgV抗血清中多克隆抗体与肿瘤细胞的结合，其中1：阴性对照组(DAB染色，20×)，2：抗B7-H1单抗(DAB染色，20×)，3：抗血清(DAB染色，20×)；

图8是流式细胞术检测抗rhB7-H1IgV抗血清中多克隆抗体与肿瘤细胞的结合；

图9是流式细胞术检测B7-H1抑制抗rhB7-H1IgV抗血清与人(HT-29)和小鼠(SP2/0)肿瘤细胞表达的B7-H1的结合；

图10是抗B7-H1单抗和抗rhB7-H1IgV抗血清对表达B7-H1的HT-29肿瘤细胞的杀伤作用；

图11是抗B7-H1单抗和抗rhB7-H1IgV抗血清对表达B7-H1的SP2/0肿瘤细胞的杀伤作用；

图12是B7-H1抑制抗B7-H1单抗和抗rhB7-H1IgV抗血清杀伤表达B7-H1的HT-29肿瘤细胞；

图13是B7-H1抑制抗B7-H1单抗和抗rhB7-H1IgV抗血清杀伤表达B7-H1的SP2/0肿瘤细胞；

图14是持续免疫组和常规免疫组小鼠体内抗B7-H1抗体滴度变化情况；

图15是分组显示每只荷瘤小鼠肿瘤体积变化，其中C组(对照组)小鼠肿瘤体积(共6只，成瘤率100％，死亡率83.3％)，A组(持续免疫组)小鼠肿瘤体积(共6只，成瘤率66.7％，死亡率33.3％)，B组(常规免疫组)小鼠肿瘤体积(共6只，成瘤率83.3％，死亡率33.3％)；

图16是每组荷瘤小鼠肿瘤体积的平均值；

图17是荷瘤小鼠死亡时肿瘤生长情况及瘤重；

图18是对照组、持续免疫组和常规免疫组荷瘤小鼠生存期统计，其中

表示阴性对照组；表示持续免疫组；

表示常规免疫组。

为了更清楚的理解本发明，以下结合附图和发明人完成的实施例对本发明作进一步的详细描述。

具体实施方式

依照本发明的技术方案，采用人工合成的方法获得rhHis-TT-B7-H1IgV基因，构建原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经溶解包涵体、Ni-NTA亲和层析柱的纯化，蛋白纯度可达82％以上。纯化后的rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白在体外能够竞争性抑制B7-H1/Fc蛋白与抗B7-H1单抗的结合。在小鼠体内经rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白免疫后，能够抑制小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长。将构建好的pQE-30-TT-B7-H1IgV质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中获得高效表达，经亲和纯化后得到rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白。

实现本发明重组人His-TT-B7-H1IgV蛋白(rhHis-TT-B7-H1IgV)疫苗，其制备方法按以下步骤进行：

1、rhHis-TT-B7-H1IgV基因的克隆及原核表达载体的构建

将GeneBank中人B7-H1IgV基因序列(购自上海生工生物技术有限公司)，上游引入BamHI酶切位点和破伤风类毒素表位(即TT_830-843表位：氨基酸序列为QYIKANS KFIGITE，以引发体内较强的细胞免疫反应，从而促进肿瘤疫苗更好发挥作用)，下游引入SalI酶切位点，并克隆入载体pGEX-4T-1中。

将上述载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切。上述pGEX-4T-1获得的小片段与从pQE-30中获得的大片段相连接。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段(图1)，进行测序。测序正确的质粒命名为pQE-30(+)-rhHis-TT-B7-H1IgV。工程菌命名为pQE-30-rhHis-TT-B7-H1IgV/DH5α。

其插入片段的基因序列为：

gga tcc cag tat atc aag gca aac agc aag ttc atc ggt att aca gaa gca gca gca gaa

ttc gac ctt tat gtg gta gag tat ggt agc aat atg aca att gaa tgc aaa ttc cca gta

gaa aaa caa tta gac ctg gct gca ctt att gtc tat tgg gaa atg gag gat aag aac att

att caa ttt gtg cat gga gag gaa gac ctg aag gtt cag cat agt agc tac cgt cag cgt

gcc cgt ctg ttg aag gac cag ctc tcc ctg gga aat gct gca ctt cag atc aca gat gtg

aaa ttg cag gat gca ggg gtg tac cgc tgc atg atc agc tat ggt ggt gcc gac tac aag

cgt att act gtg aaa gtc aat tga gtc gac

2、重组蛋白表达

挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液(含Amp 100mg/L)中，37℃摇床培养过夜，次日以1：100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37℃摇床培养3h至对数生长中期(OD₆₀₀为0.4～0.6)，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4h。离心收集菌体。

3、表达产物的鉴定

3.1 SDS-PAGE

取30μL裂菌上清，加入30μL 2×载样缓冲液，混匀。另取其他样品加入30μL水，混悬后再加入30μL 2×载样缓冲液混匀。沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μL上清加样于18％分离胶6％浓缩胶，上样后电压为60V约20min，样品进入分离胶后电压升至100V约4-5h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2-3h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存(图2)。

3.2 免疫印迹反应

SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓冲液中(25mmol/L Tris、192mmol/LGlycine、20％甲醇)，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02mol/L pH7.4TBS、0.4％Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2％ BSA的TBST)中37℃，1h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加小鼠抗人B7-H1 mAb，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，加入羊抗小鼠IgG-AP二抗，37℃孵育1h，TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应(图3)。

3.3 融合蛋白的纯化和复性

取含pQE-30-TT-B7-H1IgV重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4℃，12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀。将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，4℃下静置溶解。将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析。在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀(包涵体)。按1g菌体加10mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌。12000rpm，离心15min，弃上清，1g沉淀加10mL6M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(pH 8.0)。4℃搅拌2h，12000rpm，离心15min，共离心2次，收集上清待用。用6M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(pH 8.0)充分平衡Ni柱，先用含10mmol咪唑的6M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(pH 8.0)洗脱杂蛋白，再用含250mmol咪唑的6M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(pH 8.0)洗脱目的蛋白。收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris(pH 8.0)复性，终浓度1mg/ml。最后透析入0.01M Tris(pH 9.5)中，PEG8000浓缩后，用Bradford法测定蛋白浓度(图4)。

4、动物免疫

4.1 昆明小鼠分组与免疫方案

分组：将18只雄性昆明小鼠分成3组，分别为生理盐水对照组，rhB7-H1IgV+生理盐水组和rhB7-H1IgV+Freund佐剂组。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中抗B7-H1抗体效价及其与肿瘤细胞的结合和杀伤作用。免疫方案：背部皮下多点注射；rhB7-H1IgV：40μg/只；生理盐水或Freund(第1次使用完全佐剂，第2和3次使用不完全佐剂)佐剂溶液总体积为200μL/只，分别隔周注射；第4次，使用rhB7-H1IgV：40μg/只，生理盐水200μL/只，腹腔注射。

4.2 抗血清活性鉴定

4.2.1 ELISA法测定血清抗B7-H1抗体效价

在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗B7-H1抗体效价。每个样品均设6个孔(图5)。ELISA实验方法如下：

所需溶液的配制：a.包被缓冲液：碳酸盐缓冲液取Na₂CO₃：0.32g(终浓度0.015mol/L)，NaHCO₃：0.59g(终浓度0.035mol/L)，纯水定容至200mL(pH 9.6)，有效期：两周。b.洗涤液：含0.5％ Tween-20的PBS(pH7.4)。c.封闭液：含1％ BSA的洗涤液。d.稀释液：含0.5％ BSA的洗涤液。e.底物缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O：1.84g，柠檬酸：0.51g纯水定容至100mL(pH5.0)。f.底物显色液：OPD：8mg，3％ H₂O₂：30μL。h.终止液：H₂SO₄：1mol/L。

操作方法：

1)包被：取96孔ELISA板，将B7-H1/F_c蛋白溶解于包被缓冲液中(0.5μg/ml)，按100μl/孔加入孔板中，4℃包被过夜；

2)倒掉包被液，加入封闭液，室温封闭2h；

3)弃去封闭液，用洗涤液洗6次，每次2min；

4)分别加入倍比稀释的小鼠抗人B7-H1单抗(500μg/ml)和抗血清，100μl/孔，室温孵育1h；

5)弃去单抗和抗血清，用洗涤液洗6次，每次3min；

6)加入HRP抗小鼠的二抗，100μl/孔，室温孵育1h；

7)弃去二抗，用洗涤液洗6次，每次3min；

8)加入底物显色液，100μl/孔，室温，显色10～20min；

9)加入终止液，50μl/孔，终止反应；

10)酶标仪读数，测定每孔在490nm的吸广光值。

4.2.2 竞争ELISA法测定血清抗B7-H1抗体活性

参照上述的ELISA检测方法。取96孔板包被抗B7-H1单克隆抗体(R&D)4℃过夜，每孔加入封闭液封闭2h，用PBST洗6次，分别加入室温已反应2h的抗rhB7-H1IgV抗血清和B7-H1/Fc(R&D，含有人源性Fc段)混合溶液。其中每孔加入的抗血清含量分别为0、1、2、3、4、5μl，室温1h后洗板，加入辣根过氧化物酶标记的抗人Fc段二抗，室温1h后洗板，加入OPD显色，显示B7-H1/Fc与抗B7-H1单克隆抗体结合的情况，间接反映抗血清对其结合反应的竞争作用(图6)。

4.2.3 免疫细胞化学技术鉴定抗血清中多克隆抗体与肿瘤细胞表面B7-H1蛋白的结合特性

人HT-29细胞(人结肠腺癌细胞)爬片贴壁后，加入终浓度为20ng/mL的IFN-γ，刺激2天后HT-29细胞表达B7-H1分子。按SP试剂盒所示步骤并加以改进进行免疫细胞化学染色：PBS振洗3次，每次5min；滴加10％非免疫动物血清，室温下孵育5min，吸掉；分别滴加小鼠抗B7-H1单克隆抗体和已获得的小鼠抗rhB7-H1IgV血清，4℃冰箱放置过夜；37℃孵育60min；0.01M PBS振洗3次，每次5min；滴加生物素标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育10min；PBS振洗3次，每次5min；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液，37℃孵育10min；PBS振洗3次，每次5min；DAB-H₂O₂显色5min，苏木精衬染，脱水透明，中性树胶封固(图7)。

4.2.4 流式细胞术鉴定抗血清中多克隆抗体与肿瘤细胞表面B7-H1蛋白的结合活性及其阻断实验

人HT-29细胞贴壁后，加入终浓度为20ng/mL的IFN-γ，刺激2天后HT-29细胞高表达B7-H1分子。用已获得的小鼠抗血清中的多克隆抗体与表达B7-H1蛋白的HT-29细胞作用，观察抗血清中多克隆抗体与细胞的结合情况，同时，以抗B7-H1单抗作为阳性对照按照同样方法进行实验。并且，以未经刺激的HT-29/B7-H1-(不表达B7-H1的HT-29细胞)细胞作为阴性对照与抗血清相互作用，通过流式细胞术检测抗血清中多克隆抗体与肿瘤细胞的结合活性。小鼠SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)低表达B7-H1蛋白，按照类似方法，阴性对照取腹腔仅注射生理盐水组小鼠血清，观察小鼠抗人rhB7-H1IgV多克隆抗体与小鼠肿瘤细胞表面B7-H1的结合情况。阻断实验：方法同上，单克隆抗体和抗血清先与不同浓度的B7-H1/Fc共同孵育30min后再加入细胞悬液与之结合(图8、9)。

4.2.5 抗血清依赖补体对人和小鼠肿瘤细胞的细胞毒作用的测定及其阻断实验

调整HT-29/B7-H1+和SP2/0细胞的浓度为1×10⁶个/孔，加入1∶10倍稀释的豚鼠血清。按照1∶1×10³，1∶4×10³，1∶16×10³，1∶64×10³，1∶256×10³分别稀释抗血清、单抗(单抗浓度为500μg/mL)和正常小鼠血清(阴性对照)，加入到上述含有肿瘤细胞的96孔板中。轻轻震荡混匀，设正常血清组为阴性对照组，每组均设6个复孔。37℃，5％ CO₂孵箱培养1.5h，1000rpm，4℃，离心5min，每孔加入1％FCS-1640：200μL和MTT：20μL，继续培养4h，1000rpm，4℃，离心5min，小心吸弃上清，每孔中加150μL DMSO振荡直至沉淀全部溶解，用酶标仪测定A570nm吸光度。阻断实验：方法同上，单克隆抗体和抗血清先与不同浓度的B7-H1/Fc共同孵育30min后再加入细胞悬液与之结合(图10-13)。

5、抑瘤实验

5.1 分组并免疫小鼠

BALB/c小鼠，雄性，共18只，体重：21～25g，随机分3组，每6只一组。A组：按照4.1中有关“rhB7-H1IgV+生理盐水组”所述的常规免疫方法用生理盐水溶解制备的rhB7-H1IgV蛋白进行免疫，常规免疫完毕后隔周持续进行腹腔免疫；B组：按照4.1中有关“rhB7-H1IgV+生理盐水组”所述的常规免疫方法用生理盐水溶解制备的rhB7-H1IgV蛋白进行免疫；C组：对照组，仅用生理盐水按照常规免疫方法进行免疫。

5.2 接种肿瘤细胞

最后1次常规免疫完毕后14天，取对数生长期状态的SP2/0肿瘤细胞，按照1×10⁷/只接种至小鼠背部皮下。每周观察小鼠体内抗体滴度变化(图14)，待观察到形成肿瘤组织块后隔天检测肿瘤体积(图15、16)和小鼠体重。小鼠死亡时取出肿瘤组织称重(图17)，最后统计小鼠生存期(图18)。

6、本发明的效果：

经实验证实本发明的效果如下：

(1)设计并构建了rhB7-H1IgV融合蛋白疫苗。

(2)通过动物实验证实rhB7-H1IgV融合蛋白能够在小鼠体内诱导出高滴度中和抗体。

(3)该抗体(抗rhB7-H1IgV多克隆抗体)可以与人HT-29/B7-H1+肿瘤细胞和小鼠SP2/0肿瘤细胞相结合，且通过补体依赖途径杀伤以上两种肿瘤细胞。

(4)上述的抗rhB7-H1IgV多克隆抗体的结合和杀伤作用可以被B7-H1蛋白特异性阻断。

(5)初步证明了该蛋白作为肿瘤疫苗不仅可在一定程度上抑制小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长，并且还可延长荷瘤小鼠的生存期。

核苷酸和它对应的氨基酸序列

核苷酸和氨基酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>重组人His-TT-B7-H11gV肿瘤疫苗及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>393

<212>核苷酸和它对应的氨基酸序列

<213>人工序列

<220>

<223>misc_feature

<400>1

gga tcc cag tat atc aag gca aac agc aag ttc atc ggt att aca gaa gca gca gca gaa

Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Ala Ala Ala Glu

1               5                   10                  15                  20

ttc gac ctt tat gtg gta gag tat ggt agc aat atg aca att gaa tgc aaa ttc cca gta

Phe Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val

21              25                  30                  35                  40

gaa aaa caa tta gac ctg gct gca ctt att gtc tat tgg gaa atg gag gat aag aac att

Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

41              45                  50                  55                  60

att caa ttt gtg cat gga gag gaa gac ctg aag gtt cag cat agt agc tac cgt cag cgt

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg

61              65                  70                  75                  80

gcc cgt ctg ttg aag gac cag ctc tcc ctg gga aat gct gca ctt cag atc aca gat gtg

Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Set Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val

81              85                  90                  95                  100

aaa ttg cag gat gca ggg gtg tac cgc tgc atg atc agc tat ggt ggt gcc gac tac aag

Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys

101             105                 110                 115                 120

cgt att act gtg aaa gtc aat tga gtc gac 390

Arg Ile Thr Val Lys Val Asn

121                     127

Claims (2)

1.一种重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗，其特征在于，利用人工合成的方法获得TT_830-843-B7-H1IgV区基因片段，在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Sa1I酶切位点，将其插入pQE-30原核表达载体，转化大肠杆菌，在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到rhHis-TT-B7-H1IgV蛋白，在体外能够竞争性抑制B7-H1/Fc蛋白与抗B7-H1单抗的结合；

其TT_830-843-B7-H1IgV区的氨基酸序列为：

Gly Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr

Glu Ala Ala Ala Glu Phe Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp

Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser

Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu

Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala

Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys

Arg Ile Thr Val Lys Val Asn。

2.权利要求1所述的重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)rhHis-TT-B7-H1IgV基因的克隆及原核表达载体的构建将GeneBank中人B7-H1IgV基因序列上游引入BamHI酶切位点和破伤风类毒素表位，即TT_830-843表位；其氨基酸序列为Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser LysPhe Ile Gly Ile Thr Glu，以引发体内较强的细胞免疫反应，下游引入SalI酶切位点，并克隆入载体pGEX-4T-1中；

将上述载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切；上述pGEX-4T-1获得的小片段与从pQE-30中获得的大片段相连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段；测序正确的质粒命名为pQE-30(+)-rhHis-TT-B7-H1IgV，工程菌命名为pQE-30(+)-rhHis-TT-B7-H1IgV/DH5α；

插入片段TT_830-843-B7-H1IgV区的基因序列为：

gga tcc cag tat atc aag gca aac agc aag ttc atc ggt att aca gaa gca gca gca gaa

ttc gac ctt tat gtg gta gag tat ggt agc aat atg aca att gaa tgc aaa ttc cca gta

gaa aaa caa tta gac ctg gct gca ctt att gtc tat tgg gaa atg gag gat aag aac att

att caa ttt gtg cat gga gag gaa gac ctg aag gtt cag cat agt agc tac cgt cag cgt

gcc cgt ctg ttg aag gac cag ctc tcc ctg gga aat gct gca ctt cag atc aca gat gtg

aaa ttg cag gat gca ggg gtg tac cgc tgc atg atc agc tat ggt ggt gcc gac tac aag

cgt att act gtg aaa gtc aat tga gtc gac；

(2)重组蛋白表达

挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液中，培养液含Amp100mg/L，37℃摇床培养过夜，次日以1：100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37℃摇床培养3h至对数生长中期，即OD₆₀₀为0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4h，离心收集菌体；

(3)表达产物的鉴定

SDS-PAGE电泳：取30μl裂菌上清，加入30μl的2×载样缓冲液，混匀；另取其他样品加入30μl水，混悬后再加入30μl的2×载样缓冲液混匀；沸水中煮5min，12000rpm离心5min，取10μl上清加样于18％分离胶6％浓缩胶，上样后电压为60V持续20min，样品进入分离胶后电压升至100V持续4-5h，用0.5％考马斯亮兰R-250振荡染色2-3h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存；

免疫印迹反应：SDS-PAGE结束后，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜靠近阳极一侧，置转移缓冲液中，缓冲液的配方为：25mmol/L Tris、192mmol/LGlycine、20％甲醇，100V恒压1h，将蛋白从凝胶电转移至硝酸纤维膜上，电转移结束后，取出硝酸纤维膜，用洗涤液室温洗3次，该洗涤液含0.02mol/L pH为7.4的TBS、0.4％的Tween20，浸入封闭液中，该封闭液含2％的BSA洗涤液，37℃，1h，封闭液中取出后用洗涤液室温洗3次，加小鼠抗人B7-H1mAb，37℃孵育1h，孵育后用洗涤液室温洗膜3次，加入羊抗小鼠IgG-AP二抗，37℃孵育1h，孵育后用洗涤液室温洗膜3次，再用Tris-HCl缓冲液洗3次，硝酸纤维膜浸入显色液中，室温避光显色5min，蒸馏水冲洗终止反应；

(4)融合蛋白的纯化和复性

取含pQE-30-TT-B7-H1IgV重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心10min，收菌，超声裂菌；4℃，12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀；将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，4℃下静置溶解；将溶解的沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析；在证实目的蛋白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀；按1g菌体加10mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌，12000rpm，离心15min，弃上清，1g沉淀加10ml的6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH8.0的0.01M Tris，4℃搅拌2h，12000rpm，离心15min，共离心2次，收集上清待用；

用6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH8.0的0.01MTris充分平衡Ni柱，先用含10mmol咪唑的6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH8.0的0.01MTris洗脱杂蛋白，再用含250mmol咪唑的6M尿素，0.1M NaH₂PO₄，pH8.0的0.01MTris洗脱目的蛋白；收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素、0.1M NaH₂PO₄、pH8.0的0.01MTris复性，终浓度1mg/ml；最后透析入pH9.5的0.01M Tris中，PEG8000浓缩后，用Bradford法测定蛋白浓度，即可得到重组人His-TT-B7-H1IgV肿瘤疫苗。

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