CN102471770B

CN102471770B - 抗原肽及其用途

Info

Publication number: CN102471770B
Application number: CN2011800028622A
Authority: CN
Inventors: 莲见贤一郎; 藏屋干夫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2011-05-23
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-05-23
Also published as: DE11786796T8; US8784830B2; JP2017520556A; MY167069A; US20200009239A1; US11020468B2; WO2011149099A1; US20120301495A1; EP2430157A1; JP5243624B2; EP2430157B1; EP3157554A4; US10426825B2; JP2012528566A; US20150023997A1; CN106687131A; CN102471770A; US20180133299A1; DE11786796T1; EP2430157A4

Abstract

为了提供对抗痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)感染的有效疫苗，本发明提供一种肽，所述肽是由特异性氨基酸序列组成的肽或者是由通过缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸衍生自所述特异性氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症。

Description

抗原肽及其用途

技术领域

根据35U.S.C.§119(e)，本PCT国际申请要求2010年5月27日提交的美国临时申请Ser.No.61/396,574的权益，其全部内容以参考的形式并入本文。

背景领域

本发明涉及对抗痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的抗原肽和所述抗原肽的用途。

背景技术

痤疮是一种炎性疾病，其主要在青春期以及也在成年期常见于人体从颈部至面部的部分。由于炎症所出现的位置，痤疮的出现对人的心理有极大的影响。

到目前为止，已经开发了多种用于痤疮的治疗剂。特别的，已经进行了很多直接作用于作为痤疮病原体的痤疮丙酸杆菌之药物的开发

2004年，确定了痤疮丙酸杆菌的完整基因组序列。其阐明了痤疮丙酸杆菌的很多基因编码毒力因子(见非专利文献1)。基于该信息，在开发疫苗过程中，已经对痤疮丙酸杆菌唾液酸酶进行了研究(见非专利文献2)。在非专利文献2中，在小鼠耳廓皮肤中重现了炎症。

引文列表

[非专利文献1]

Bruggemann H.等，“The Complete Genome Sequence ofPropionibacterium Acnes，a Commensal of Human Skin”，Science，2004，305，671-673。

[非专利文献2]

Nakatsuji T.等，“Vaccination Targeting a Surface Sialidase of P. acnes：Implication for New Treatment of Acne Vulgaris”，PLoS ONE，2008，3，2，1-9。

发明内容

技术问题

目前已开发的大多数药物作用于作为痤疮原因的痤疮丙酸杆菌细菌细胞本身并发挥抗炎作用。因此，在发生痤疮丙酸杆菌再次感染的情况下，炎症再次发生。此外，即便使用此类药物暂时有效，所述药物的使用也诱导耐药细菌的出现。这使得治疗更加困难。

鉴于上述问题作出了本发明。本发明的目的是提供实现连续治疗痤疮的化合物。

问题的解决方案

可预期作为对痤疮的连续治疗是免疫治疗，即疫苗。一旦建立了有效的抗痤疮免疫(特定痤疮丙酸杆菌的识别和免疫记忆)，至少在相同痤疮丙酸杆菌菌株再次感染时，痤疮丙酸杆菌立即被清除。因此，预期免疫治疗将发挥连续抗炎作用。

作为勤奋研究的结果，本发明的发明人发现，与在小鼠耳廓皮肤中注射相比，在小鼠腹中线皮肤中注射痤疮丙酸杆菌可以更有效地诱导感染。通过使用这种炎症诱导，发明人发现，一种由基于常规技术无法获得的氨基酸序列组成的肽可非常有效地抑制痤疮丙酸杆菌所诱导的炎症，完成了本发明。

为了解决上述问题，本发明的肽是选自下列的肽：(a)由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽；和(b)由通过缺失、替换、插入或添加一个或数个氨基酸衍生自SEQ NO.1所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症。

使用本发明的肽使得能够抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症(痤疮和丘疹(pimple))。

为了解决上述问题，本发明的肽可以是选自下列的肽：(c)由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽；和(d)由通过缺失、替换、插入或添加一个或数个氨基酸衍生自SEQ NO.3所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症。

本发明的肽组合物可以是包括下列的肽组合物：(e)上述(a)或(b)中描述的肽，或者通过接头连接多个上文(a)或(b)中所述肽而获得的多价抗原肽形式的肽；和(f)上文(c)或(d)中所述的肽，或者通过接头连接多个上文(c)或(d)中所述肽而获得的多价抗原肽形式的肽。

本发明的疫苗是对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其包含上述肽或上述肽组合物。

本发明的多核苷酸是编码上述肽的多核苷酸。

本发明的表达载体是有效连接上述多核苷酸的表达载体。本发明表达载体的使用使得能够提供可抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症的肽。

本发明的抗体是特异性识别上述肽的抗体。

用于测定对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗有效性的本发明方法包括下述步骤：检测从活体中收集的样品中是否存在编码上述肽的多核苷酸。使用本发明的方法使得能够在向活体施用所述疫苗前容易地确定对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗在活体中是否有效。

用于治疗或预防痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的本发明方法包括向个体施用上述疫苗的步骤，所述疫苗含有治疗有效量的所述肽。

用于治疗或预防痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的本发明方法包括向个体施用上述疫苗的步骤，所述疫苗含有治疗有效量的所述多核苷酸。

发明的优势作用

本发明的肽具有非常高的抗原性。因此，使用本发明的肽可提供对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗。

附图简述

图1

图1显示了测量通过将痤疮丙酸杆菌注射进个体部分所引起的炎症面积的结果。

图2

图2显示了通过注射痤疮丙酸杆菌所引起的炎症面积与注射后所经过时间之间的相关性。

图3

图3图示了检查肽的抗炎作用的步骤。

图4

图4显示了检查肽的抗炎作用的结果。

图5

图5显示了检查肽的抗炎作用的另一结果。

图6

图6对比了分离自患者的菌株的16S rDNA碱基序列与标准菌株的16S rDNA碱基序列。

图7

图7显示了检查肽针对注射分离自患者的痤疮丙酸杆菌的抗炎作用的结果。

图8

图8显示了用本发明的疫苗接种的痤疮患者的随访照片。

图9

图9显示了用本发明的疫苗接种的另一痤疮患者的随访照片。

图10

图10显示了用本发明的疫苗接种的又一痤疮患者的随访照片。

图11

图11显示用本发明的疫苗接种的再一痤疮患者的随访照片。

具体实施方式

[肽和多核苷酸]

本发明提供能够诱导对抗痤疮丙酸杆菌感染之免疫应答的抗原肽。

一方面，本发明可为下述肽(a)至(d)之一：

(a)由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽；

(b)由通过缺失、替换、插入或添加一个或数个氨基酸衍生自SEQNO.1所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答产生抑制痤疮丙酸杆菌增加的抗体；

(c)由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽；

(d)由通过缺失、替换、插入或添加一个或数个氨基酸衍生自SEQNO.3所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答产生抑制痤疮丙酸杆菌增加的抗体；

本文中，“数个氨基酸”可以是例如两个或三个氨基酸，并且更优选地为两个氨基酸。

在氨基酸被替换的情况下，优选的替换是一个氨基酸替换与该氨基酸具有相同特性的另一个氨基酸，例如，一个氨基酸被与该氨基酸具有相同侧链官能团的另一个氨基酸所替换(例如，Lys替换Arg和Glu替换Asp)；以及一个疏水氨基酸被另一个疏水氨基酸所替换(例如，Ile替换Val)。

在本说明书中，术语“肽”以可以与“多肽”或“蛋白质”互换的方式使用。

由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽对应于痤疮丙酸杆菌膜蛋白中第90个氨基酸残基至第103个氨基酸残基的氨基酸残基，所述膜蛋白由在Genbank/EMBL/DDBJ中以登记号AAT84059注册的氨基酸序列组成。由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽对应于痤疮丙酸杆菌膜蛋白中第260个氨基酸残基至第272个氨基酸残基的氨基酸残基，所述膜蛋白由在Genbank/EMBL/DDBJ中以登记号YP_056445注册的的氨基酸序列组成。由以上述登记号注册的氨基酸序列组成的蛋白质是下述蛋白质，即按照非专利文献1中描述的基因组分析结果所推定的表达的蛋白质。一般来说，在抗体的生产中，对作为抗原来说优良的氨基酸序列为亲水氨基酸序列和具有丰富电荷的氨基酸序列，以及预计具有转角结构(turnstructure)的氨基酸序列。所述电荷可为正电荷或负电荷，且包括至少5个带电荷的氨基酸是最为理想的。此外，所选的氨基酸的长度优选对应10至15个残基。SEQ NO.1或3所示的氨基酸序列是基于上述想法而选择的。

这些肽诱导对外来物痤疮丙酸杆菌的免疫。据推测，在免疫诱导时，作为诱导Th2主导免疫的结果而诱导了特异性抗体的产生。

生产本发明的多肽的方法可为化学合成或可采用表达载体。在化学合成的情况下，可通过合成肽的公知方法来产生本发明的肽。合成肽的方法的例子有化学合成法，例如液相肽合成法和固相肽合成法。然而，所述方法并不限于这些。在采用表达载体的情况下，可从已经引入了表达载体的转化体中产生肽，或可使用体外翻译系统来产生。例如，将编码所述肽的多核苷酸(例如，包含SEQ NO.2或4中所示碱基序列的多核苷酸)插入表达载体，并将所述表达载体引入宿主细胞，以使宿主细胞中可产生目标肽。本文中使用的术语“转化体”不仅表示细胞、组织和器官，而且表示活的有机体本身。制备转化体的方法可为本领域中公知的方法，例如通过将重组载体引入宿主的转化。要转化的活的有机体的例子包括但不限于微生物、植物和动物。可通过本领域中公知的方法来确定基因是否已被引入宿主细胞，所述方法例如PCR、Southern杂交、Northern杂交等。

在通过制备转化体来产生本发明肽的情况下，优选所述肽在宿主细胞中稳定表达。然而，所述肽可在宿主细胞中瞬时表达。可通过公众已知的方法来纯化如此产生的肽。纯化所述肽的方法的例子包括但不限于凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法。

另一方面，本发明的肽可以是多价抗原肽的形式(其也可称为MAP：多抗原肽(Multiple Antigen Peptide))，其通过如下方式获得：通过接头(linker)连接多个下述肽(a)或(b)或者连接多个下述肽(c)或(d)。

(a)由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽；

(c)由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽；

MAP是能够显示较高抗原性的肽，其为通过以下方式获得的多价肽，所述方式即将接头添加至特异性肽的C末端和通过所述接头将所述特异性肽与基于Lys构建的MAP结构(基质)相连接。可通过常规且公知的方法合成MAP。包含于一个MAP分子中的特异性肽的数目没有特别的限制，但优选为5个或更多。包含于一个MAP分子中的特异性肽的数目的上限没有限制，因为就抗原性而言，该数目优选较大。鉴于现有的合成技术的限制，MAP可合成为具有15个分子或更少的特异性肽数目。

一般来说，使用Cys残基作为构成添加至特异性肽的接头的氨基酸。然而，在本发明的MAP形式的肽中使用在特异性肽和Cys残基之间包含Gly残基的接头。具体来说，-GlyCys或-GlyGlyCys作为接头添加至所述特异性肽的C末端。例如，-GlyCys被添加至由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽的C末端，而-GlyGlyCys被添加至由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽的C末端。因为Gly残基被添加于Cys残基和所述特异性肽的C末端之间，所以该Cys残基被赋予了旋转的灵活性，以使当其结合至MAP结构时，所述特异性肽不受到空间位阻，以及所述接头处的Cys残基可形成角度，所述角度使得该Cys残基能够接近MAP的反应基团。MAP形式本发明肽的接头并不限于此，并且可以是由Cys残基构成的一般性接头。

另一方面，本发明的肽以包含下述肽(e)或(f)的肽组合物的形式提供。

(e)肽(a)或(b)，或者通过接头连接多个肽(a)或(b)而获得的多价抗原肽形式的肽；和

(f)肽(c)或(d)，或者通过接头连接多个肽(c)或(d)而获得的多价抗原肽形式的肽。

本文中使用的“组合物”表示含有多个组分的物质。

混合各个组分的比例没有特别的限制，可以为例如1∶1(重量比)。此外，为了确保更高的免疫原性，所述肽组合物优选包含：通过接头连接多个由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽而获得的多价抗原肽形式的肽；和通过接头连接多个由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽而获得的多价抗原肽形式的肽。

此外，本发明提供编码肽(a)～(d)的多核苷酸。本发明的所述多核苷酸的例子包括但不限于由SEQ NO.2或4所示的碱基序列组成的多核苷酸。本文中使用的术语“碱基序列”可与“核酸序列”或“核苷酸序列”互换，并且表示为脱氧核糖核苷酸的序列(缩写为A、G、C和T)。SEQ NO.2所示碱基序列编码由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽，以及SEQ NO.4所示碱基序列编码由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽。

本发明的多核苷酸可为DNA或RNA的形式。根据本发明的肽的氨基酸序列信息和编码所述肽的碱基序列信息，本领域中的技术人员可容易地产生本发明的多核苷酸。具体来说，本发明的多核苷酸可通过一般的DNA合成、PCR等来产生。

此外，本发明提供含有编码所述肽的所述多核苷酸的载体。当所述载体被用于所述肽的产生时，优选所述载体为可操作地连接所述多核苷酸的表达载体。本文中使用的措辞“可操作地连接至”表示用于编码目标肽的多核苷酸处于控制区的控制之下，所述控制区例如启动子并且能够在宿主细胞中表达所述肽。使表达载体的编码目标肽的多核苷酸“可操作地连接”至表达载体以构建所需载体的方法是本领域中公知的。此外，将表达载体引入宿主细胞的技术也是本领域中公知的。因此，本领域中的技术人员可容易地在宿主细胞中产生所需的肽。

使用本发明的肽和本发明的多核苷酸使得能够诱导对痤疮丙酸杆菌的免疫。即，本发明的肽和本发明的多肽可用作对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗。因此，使用本发明的肽和本发明的多核苷酸使得能够抑制因痤疮丙酸杆菌感染而引起的皮内炎症(例如痤疮和丘疹)。

[疫苗]

本发明的疫苗是对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其含有前述的肽、前述的肽组合物或前述的多核苷酸作为有效组分。本文中使用的术语“疫苗”表示用于免疫治疗(疫苗治疗)的疫苗，并且其诱导特异性针对本发明肽的免疫应答。

本发明疫苗可以以疫苗组合物的形式或以疫苗试剂盒的形式提供。本文中，“含有有效组分的疫苗组合物”和“含有有效组分的疫苗试剂盒”一般是指“含有有效组分的疫苗”。“试剂盒”表示这样的形式，其中单个组分包含于不同的物质中，以使至少一个组分包含于一种物质，并且其余组分包含于其他物质中。所述疫苗组分和所述疫苗试剂盒将在下文中详述。

一般来说，术语“组合物”表示“其中两个或更多个组分均匀存在的作为一个整体的物质，以至于所述组分被认为是一种物质”。例如，组合物可为含有材料A为主要组分的单一物质，或含有材料A和B为主要组分的单一物质。即，施用本发明的疫苗可为例如单次施用由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽或由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽，或者可施用这两种肽的混合物。在施用所述两种肽的混合物的情况下，即便痤疮丙酸杆菌抗原蛋白的氨基酸序列(所述抗原蛋白对应于两种肽的一种)被突变，所述这种肽的抗炎作用丢失，所述另一种肽也可发挥抗炎作用。除了所述材料A和B之外，这样的组合物可含有其他组分(例如，药学上可接受的支持物(support))。本发明的疫苗组合物含有后面提及的有效组分材料A或B，其可单独使用或者与其他材料或其他组合物联合使用。在后一种情况中，与本发明的疫苗组合物联合使用的材料或组合物可包含或不包含于本发明的疫苗组合物中。当该材料或组合物未包含于本发明的疫苗组合物中时，所述材料或组合物与本发明的疫苗组合物的联合不能被认为是一种组合物，而是可被涵盖于所述“试剂盒”中，并可作为试剂盒而提供。本领域中的技术人员可容易地理解这一点。

在一个方面，本发明提供疫苗组合物。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物含有本发明的肽。在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物含有本发明的多核苷酸。在本实施方案中，本发明的多核苷酸优选为能够表达本发明多核苷酸所编码的肽的形式，更优选以有效连接本发明多核苷酸的表达载体的形式提供。如上文所述，在制备对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗中，使用本发明的肽或本发明的多核苷酸作为有效的疫苗组分。

本发明的疫苗可用作对抗痤疮丙酸杆菌预防性疫苗或治疗性疫苗。本文中使用的术语“预防性疫苗”表示施用给未治疗个体的疫苗，以预防所述个体感染疾病。本文中使用的术语“治疗性疫苗”表示施用给已经感染疾病之个体的疫苗，以改善所述感染或使所述感染尽可能地小或消除该疾病的免疫病理作用。

本领域中的技术人员公知如何制备含有有效组分的疫苗。本发明的疫苗的代表性的例子是制备成注射剂，所述注射剂为溶液剂或混悬剂。或者，本发明的疫苗可制备成适宜的固体形式，其在注射之前溶解或混悬于溶液中。所述制剂可以是乳化的或可以是核糖体中乳化的蛋白质(a proteinemulsified in a ribosome)。

本发明的疫苗组合物的有效组分可与稀释剂混合，所述稀释剂是药学上可接受的并且是与所述有效组分相容的。所述稀释剂的优选实例包括水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其混合物。此外，如果需要，本发明的疫苗组合物可含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂和pH缓冲剂。

本发明的疫苗组合物可经多种途径(例如，鼻腔、黏膜、口腔、阴道内、尿道和眼内)通过注射(包括皮内注射、皮下注射和肌内注射)施用，或可使用贴片(透皮施用)、栓剂等非口服施用。

本发明的疫苗组合物可口服施用。在口服施用的情况下，本发明的所述疫苗组合物与稀释剂联合使用，所述稀释剂例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖酸钠(sodium saccharate)、纤维素和碳酸镁。当口服施用时，本发明的疫苗组合物可以是溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末药物的形式。在以冻干的形式提供本发明疫苗组合物的情况下，在施用之前，所述冻干物质可重构为混悬剂。所述重构优选在缓冲溶液中进行。

本发明的疫苗组合物可含有用于增强所述疫苗有效性的佐剂。有效佐剂的例子包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、硅石、高岭土、炭、油包水型乳剂、水包油型乳剂、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂肪X、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、多聚核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、sponin、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物和其他合成的佐剂。这些佐剂可购自多个供应商。这些佐剂的代表性实例包括水包油型佐剂、氢氧化铝佐剂和与这些佐剂混合的佐剂。允许应用于人的佐剂为氢氧化铝。

另一方面，本发明提供疫苗试剂盒。本发明的疫苗试剂盒对应于前述的疫苗组合物，可含有本发明的肽或本发明的多核苷酸作为有效疫苗组分，并且还可含有前述的疫苗组合物的组分。

在一个实施方案中，本发明的疫苗试剂盒含有本发明的肽。在另一个实施方案中，本发明的疫苗试剂盒含有本发明的多核苷酸。在本实施方案中，本发明的多核苷酸优选为能够表达本发明多核苷酸所编码的肽的形式，并且更优选以有效连接了本发明多核苷酸的表达载体的形式提供。

本文中使用的术语“试剂盒”表示包含其中含有特定物质之容器(例如，瓶、板、管和皿)的套件(package)。所述试剂盒优选具有使用各个物质的说明。本发明的说明书中试剂盒方面所使用的术语“包含/包括”表示材料包含在构成所述试剂盒的各个容器的任一中。此外，本发明的试剂盒可为其中包含多个不同组合物的套件。组合物的形式可以如上所述，如果组合物是溶液的形式，则组合物可以包含在容器中。本发明的试剂盒可以设计成使得材料A和B混合并包含于单个容器中或包含于各自的容器中。所述“说明”可书写在纸或其他类型的媒介上，或可打印出来。或者，所述“说明”可为磁带或电子媒介的形式，例如计算机可读的磁盘或磁带和CD-ROM。此外，本发明的试剂盒可包括含有稀释剂、溶剂、清洁液或其他试剂的容器。此外，本发明的试剂盒可事先包括必要的用于预防/治疗痤疮丙酸杆菌感染所引起的痤疮的设备。

按上文使用本发明的疫苗使得能够有效地预防/治疗痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症(痤疮)。

也就是说，治疗或预防痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症的方法也涵盖于本发明中，所述方法包括向个体施用疫苗的步骤，所述疫苗含有治疗有效量的本发明的肽或治疗有效量的本发明的多核苷酸。

本文中使用的术语“治疗有效量”表示使所述肽或所述多核苷酸能够发挥所需治疗作用或预防作用的肽或多核苷酸的量。所述治疗有效量可根据施用所述疫苗个体的年龄、体重和其他健康状况，要治疗的炎症的状况和施用方法而不同。在皮下施用的情况下，一个例子可为以这样的方式施用疫苗，即在一次施用中供给5-10μg肽/kg体重或10-50μg多核苷酸酶/kg体重。为了诱导足以用于抗炎的免疫应答，可给个体施用两次或更多次所述疫苗。在该情况下，以预定间隔进行施用。

另一个例子如下：在含有MAP混合物的疫苗的情况下，可通过下述方式的皮下注射进行施用，所述方式即以生理盐水溶液的形式施用100-500μg每种肽/一次注射，以3～5天的间隔施用大约5次，，所述MAP混合物为基于由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成之肽的MAP和基于由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成之肽的MAP的混合物(重量比为1∶1)。

在通过贴片施用的情况下，一个剂量可能是小的，可降低剂量数，并且个体可自己使用贴片进行治疗。

本文中使用的术语“个体”表示人或非人动物(例如，大鼠、小鼠、兔、猪、牛和猴)个体。

[抗体]

本发明提供特异性识别任何本发明肽的抗体。也就是说，本发明的抗体可特异性结合任何所述肽。在一个实施方案中，本发明的抗体优选为与下述肽结合的抗体：(1)由SEQ NO.1或3所示的氨基酸序列组成的肽，或(2)通过MAP方法，从由SEQ NO.1或3所示氨基酸序列组成的肽合成的多价抗原肽。

本文中使用的术语“抗体”表示免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，及其Fab片段、F(ab’)₂片段和Fc片段)。抗体的例子包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体和抗独特型抗体。

本发明的抗体可通过本发明所涉及的领域中公知的方法来产生。例如，可通过向哺乳动物活体施用本发明的肽并且引起免疫应答，以使所述活体中产生抗体，从而获得所述抗体。在该情况下获得的抗体通常是多克隆抗体。使用本发明的肽，可通过常规且公知的杂交瘤技术等来产生单克隆抗体。或者，可通过应用重组DNA技术或化学合成来产生所述单克隆抗体。

使用本发明的抗体使得能够容易地纯化本发明的肽。例如，通过对本发明的肽进行亲和纯化，使得能够高效地收集所述肽，所述肽是使用本发明的载体或本发明的转化体在细胞中表达的。

本发明的抗体可以是任何抗体，只要所述抗体特异性地结合本发明的肽，本发明的抗体不应在以下方面受到限制，即本说明书中具体描述的个别免疫球蛋白种类(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、用于制备嵌合抗体的方法、用于制备肽抗原的方法等。因此，应当注意的是，通过不同于上述方法而获得的抗体也涵盖于本发明中。

[测定疫苗有效性的方法]

用于测定对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗之有效性的本发明方法仅需要包括检测步骤，所述步骤检测编码上述肽的多核苷酸是否存在于收集自活体的样品中，并且所述方法在所使用的其他特异性步骤和仪器和设备方面没有特别限制。

在所述检测步骤检测到编码所述肽的核苷酸的情况下，可确定向测试对象施用本发明的疫苗高度非常有可能导致对痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的有效抑制。具体地说，当检出编码上述蛋白的多核苷酸时，则确定本发明的疫苗很可能有效对抗痤疮丙酸杆菌。

检测编码所述肽的所述多核苷酸的方法没有特别的限制。例如，所述方法可以是通过PCR扩增的检测或通过测定PCR产物的碱基序列的检测。通过测定PCR产物的碱基序列，有可能更精确地确定是否可发挥疫苗接种的作用。还可依据通过扩增是否产生PCR片段来确定是否发挥疫苗接种作用。例如，在通过使用特异性引物来扩增上述多核苷酸扩增产生预期长度片段的情况下(在PCR检测的结果为阳性的情况下)，受试对象非常有可能被带有上述多核苷酸的痤疮丙酸杆菌所感染，并且因此确定所述接种作用是高度预期的。另一方面，在未产生预期长度片段的情况下(在PCR检测的结果为阴性的情况下)，则确定所述接种预期作用不大。PCR扩增之前，可通过培养可包含痤疮丙酸杆菌的样品来培养痤疮丙酸杆菌，所述样品收集自受试对象。

可通过检测收集自活体之样品中痤疮丙酸杆菌的16S rDNA的部分序列是否存在来作为用于确定是否使用对抗痤疮丙酸杆菌的本发明疫苗的方法。对16S rDNA的部分序列是否存在的检测可以是下述检测：即通过PCR扩增的检测和通过确定PCR产物碱基序列的检测。该检测可表明受试对象的炎症源自痤疮丙酸杆菌。这可以是使用该疫苗的基础。

本发明中还涵盖非人哺乳动物的模型动物(例如下文中提到实施例中的小鼠)和制备所述模型动物的方法，以预先确定的或更高的细菌细胞浓度将痤疮丙酸杆菌皮内注射进所述模型动物的腹中线从而引起痤疮丙酸杆菌炎症。在所述模型动物中，使用相比于产生炎症的常规方法更高效的方式产生痤疮丙酸杆菌的炎症。迄今为止在开发抗痤疮药物中使用的检测系统是基于施加药物的假设。结果，在疫苗的开发中，迄今尚未构建能够体内测定疫苗之作用的有效检测系统。在对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗的开发中，优选地可使用用于确定疫苗有效性的方法、模型动物和用于制备模型动物的方法。

参照实施例，下文更详细地说明了本发明的实施方案。应当注意的是，本发明不限于如下的实施例，并可对其细节进行修改。本发明不限于上述对实施方案的描述，而本领域技术人员可在权利要求书的范围内对其进行改变。本发明的技术范围涵盖了基于对不同实施方案中所公开的技术手段进行合适组合的实施方案。说明书中引用的所有文献以参考的形式并入。

[实施例]

[实施例1：痤疮丙酸杆菌的培养]

痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(下文中缩写为“痤疮丙酸杆菌(P.acnes)”)的菌株(ATCC6919)购自RIKEN生物资源中心(RIKEN BioResource Center)(JCM目录No.6425)。根据来自所述中心的培养条件信息来培养所购买的痤疮丙酸杆菌菌株。具体地，在厌氧手套箱中，将痤疮丙酸杆菌的菌株悬于100ml的GAM培养基中(NipponSuisan Kaisha，Ltd制造)，并使用小瓶在37℃下厌氧培养3天。

[实施例2：痤疮丙酸杆菌在小鼠皮肤中引发皮内炎症]

将痤疮丙酸杆菌的活细菌细胞放入脱气的生理盐水中，同时保持厌氧条件，以用5×10⁷细胞/ml、1×10⁸细胞/ml或5×10⁸细胞/ml数目的痤疮丙酸杆菌活细菌细胞制备悬液。通过鼓氮气来保持厌氧条件。参照非专利文献：Ramstad S等，Photochem.Photobiol.Sci.，2006，5，66-72，基于以下假定来计算痤疮丙酸杆菌的活细菌细胞数：分光光度计在550nm处测量的0.98～1.02的OD测量值对应于5×10⁸细胞/ml。

将50μl所制备的痤疮丙酸杆菌悬液皮内注射进雄性Balb/c小鼠(9～10周龄)剃毛的腹中线、颈部、腰背部、尾根背部和耳廓。在预先确定的时间测量皮内注射所述悬液的各个部分中的炎症面积(长轴×短轴：mm²)。每组由5个个体组成。

结果，在注射了细菌细胞浓度为5×10⁸细胞/ml痤疮丙酸杆菌悬液的组中明显地证实了炎症。图1显示在注射后第5天观察到的各个部分中炎症面积的结果。如图1所示，在皮内注射所述悬液的各个部分中观察到了炎症，并且腹中线皮内部分的炎症面积最大。也就是说，当引起小鼠皮内炎症时，皮内注射进入腹中线是最有效的。在所观察的部分之中，耳廓处的炎症最轻微。图2显示将所述悬液皮内注射进腹中线之后，在各个时间点腹中线处炎症面积的结果。如图2所示，注射痤疮丙酸杆菌后5天时，腹中线处的炎症面积最大。

与之相反，在分别注射细菌细胞浓度为5×10⁷细胞/ml和1×10⁸细胞/ml的痤疮丙酸杆菌悬液的组中，在任何部分及在任何时间都不引起炎症。

[实施例3：肽的制备]

将由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽PepA的粉末或由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽PepD的粉末溶于生理盐水(OtsukaPharmaceutical Co.，Ltd.生产)中，以制备800μg/ml的肽溶液。

作为对比实施例，使用了PepB和PepC，所述PepB是对应于由在Genbank/EMBL/DDBJ中以登记号No.AAT81852注册的氨基酸序列所组成的痤疮丙酸杆菌膜蛋白中第10～26个氨基酸残基的肽，所述PepC是对应于由在Genbank/EMBL/DDBJ中以登记号No.YP 055518注册的氨基酸序列所组成的痤疮丙酸杆菌膜蛋白中第145～166个氨基酸残基的肽。表1显示各个肽的氨基酸序列。作为对比实施例使用的序列是可以在抗体生产中作为抗原有力候选的氨基酸序列，即富含亲水氨基酸和电荷的氨基酸序列，并且其选自具有转角结构的氨基酸序列。此外，按照上述非专利文献1中描述的基因组分析的结果，以上述登记号注册的氨基酸序列所组成的蛋白质被认为是表达的。

[表1]

实施例4：肽PepA对抗痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的抗炎作用

在实施例2中，将50μl痤疮丙酸杆菌(5×10⁸细胞/ml)皮内注射进腹中线后5天时，痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的面积最大。因此，在相同的条件下测定各个肽的抗炎作用，即通过将50μl痤疮丙酸杆菌(5×10⁸细胞/ml)皮内注射进腹中线，并在注射之后5天测量炎症面积(mm²)。

图3显示检测抗炎作用的方法。

图3是说明检测抗炎作用之方法的示意图。如图3所示，注射痤疮丙酸杆菌的活细菌细胞之前的第18天(图3中的第“0”天)、注射之前的第11天(图3中的第“7”天)和注射之前的第4天(图3中的第“14”天)将PepA(40μg/50μl/个体)皮内接种进雄性Balb/c小鼠的背部(第一次接种PepA时为7周龄)，即总共三次。随后，将痤疮丙酸杆菌皮内注射进小鼠的腹中线，并在注射5天之后测量炎症面积(图3中的第“23”天)。每组由10只小鼠组成。作为对比实施例，准备了一组施用无PepA之PBS的小鼠和施用PepB或PepC替代PepA的一组小鼠，并且将痤疮丙酸杆菌类似地接种进所述组。这些结果见图4。

图4是显示PepA抗炎作用之结果的图。如图4所示，与施用PBS的对照组相比，施用PepA的组表现出统计学上显著减少的炎症面积(P＝0.00865(P＜0.01))。也就是说，PepA统计学上显著地表现出对抗痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的抗炎作用。在施用PepB的组中，P＝1。在施用PepC的组中，P＝0.1655。这些数字不是统计学上显著的，因此认为PepB和PepC不表现出对抗痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的抗炎作用。

上述结果显示，包含肽PepA的组合物与对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗(即痤疮疫苗)一样有效。

[实施例5：肽PepA和PepD对抗痤疮丙酸杆菌所引起炎症的抗炎作用]

在与实施例4相同的条件下，使用炎症引发系统检验每个肽的抗炎作用，唯一不同的是注射痤疮丙酸杆菌之前要施用至小鼠的肽从PepA、PepB和PepC改变为PepA和PepD。结果见图5。

图5是显示PepA和PepD的抗炎作用结果的图。如图5所示，如实施例4的结果中一样的，与施用PBS的对照组相比，施用PepA的组表现出统计学上显著减少的炎症面积(P＝0.0012(P＜0.01))。此外，相比于施用PBS的对照组，施用PepD的组表现出统计学上显著减少的炎症面积(P＝0.00175(P＜0.01))。

上述结果显示，含有肽PepA或PepD的组合物作为对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗(即痤疮疫苗)是有效的。

[实施例6：痤疮患者所携带菌株的鉴定]

[16S rDNA的提取]

在37℃下，在GAM平板琼脂培养基上厌氧培养收集自痤疮患者患病部位的脓，并收集部分细菌细胞。将所收集的细菌细胞转移至GAM平板琼脂培养基，并厌氧培养以产生单菌落。收集来自单菌落的细菌细胞，并将其重悬于20mM NaOH水溶液中。在94℃下将所述悬液加热3分钟，裂解细菌细胞，并提取16S rDNA。使用所提取的16S rDNA，测定患者所感染的细菌细胞的16S rDNA碱基序列。分别针对收集自三个痤疮患者的三组细菌细胞的每一组测定碱基序列。

[16S rDNA的碱基序列的测定]

使用所提取的16S rDNA作为模板DNA。此外，使用引物9F(正向引物)：5’-GTTTGATCCTGGCTCA-3’(SEQ NO.5)和引物800R(反向引物)：5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’(SEQ NO.6)作为引物。在此进行的PCR由30个循环组成，每个循环由如下步骤组成：94℃30秒的步骤，55℃60秒的步骤和72℃60秒的步骤。用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(由Applied Biosystems制造)进行PCR。反应之后纯化PCR产物。接下来，使用纯化的PCR产物进行循环测序反应。将循环测序反应中获得的产物纯化，将其供应给ABI PRISM 310 Genetic Analyzer System(Applied Biosystems制造)，并使用分析软件BioEdit测定碱基序列。在循环测序反应中使用的引物为上述引物9F和引物536R：5’-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3’(SEQ NO.7)。所述循环测序反应是由25个循环组成的，每个循环由如下步骤组成：96℃10秒的步骤，50℃5秒的步骤和60℃4分钟的步骤。

[测定碱基序列的结果]

测定碱基序列的结果显示，在来自患者的(患者菌株1～3)所建立的三个分离的细菌菌株的每一个中，扩增部分的16S rDNA碱基序列(SEQNO.16)与痤疮丙酸杆菌ATCC6919菌株中所对应的碱基序列(SEQ NO.8)具有相同的序列。图6显示患者菌株1的结果。因此，来自所述患者的这三种分离的细菌菌株被鉴定为痤疮丙酸杆菌。

[实施例7：肽PepA对抗来自患者的痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的抗炎作用]

通过与实施例5中相同的方法检测PepA的抗炎作用，唯一的不同在于要注射进小鼠的细菌细胞是来自痤疮患者的痤疮丙酸杆菌。结果见图7。

图7是显示PepA免疫接种之后向小鼠腹中线皮内注射所述患者菌株1～3(P1-痤疮丙酸杆菌至P3-痤疮丙酸杆菌)之结果的图，并在注射之后第5天测量炎症面积。如图7所示，施用PepA的组与施用PBS以替代PepA的对照组相比，对于患者菌株1显示P＝0.0252(P＜0.05)，对于患者菌株2显示P＝0.0476(P＜0.05)，以及对于患者菌株3显示P＝0.0237(P＜0.05)。也就是说，对于注射每种患者菌株，施用PepA使得能够统计学上显著减少炎症面积。这提示PepA作为痤疮疫苗广泛地有效。

[实施例8：在来自痤疮患者的痤疮丙酸杆菌中检查编码PepA或PepD的碱基序列]

为了使PepA或PepD有效地用作疫苗，期望目标痤疮丙酸杆菌菌株具有含PepA或PepD的蛋白质。因此，通过进行PCR和通过测定和查看PCR产物的碱基序列来检查目标痤疮丙酸杆菌菌株是否具有含PepA或PepD的蛋白质。

[通过PCR确认PepA]

在此使用的用于检测编码PepA之氨基酸序列的碱基序列的引物为引物L：5’-GATGAAAGCCATCCAGGAAA-3’(SEQ NO.9)和引物R：5’-GCACACGAAACAACGCTAGA-3’(SEQ NO.10)。在此进行的PCR是由35个循环组成的，每个循环是由如下步骤组成的：95℃15秒的步骤，60℃20秒的步骤和72℃30秒的步骤。使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems制造)进行PCR。

结果，通过扩增从所检测的患者来源痤疮丙酸杆菌中获得具有预期长度的PCR片段，并随后推断存在编码PepA之氨基酸序列的碱基序列。这提示，对应于PepA的蛋白具有与PepA相同的氨基酸序列。

此外，检查了收集自21名志愿者的样品，以确定其是否具有编码PepA之氨基酸序列的碱基序列，且21例中有19例阳性。本实施例中使用的术语“阳性”表明通过使用特异性引物的PCR扩增产生了具有预期长度的片段。本实施例中使用的术语“阴性”表明通过使用特异性引物的PCR扩增不能产生了具有预期长度的片段。

类似地，通过PCR考查从所述21位志愿者中收集的样品以确定其是否具有痤疮丙酸杆菌的16S rDNA。结果表明，在编码PepA氨基酸序列之碱基序列的检查中为阳性的19例在16S rDNA的检查中也为阳性，在编码PepA氨基酸序列之碱基序列的检查中为阴性的2例在16S rDNA的检查中也为阴性。在确认编码PepA氨基酸序列的碱基序列的PCR检测中2例结果为阴性并不表明这2位志愿者不携带编码PepA氨基酸序列的碱基序列，而是表明痤疮丙酸杆菌的细菌细胞数目少到不足以检出所述细菌细胞。根据上述结果，表明含有PepA氨基酸序列的蛋白质存在于确认了痤疮丙酸杆菌16S rDNA的19例中。

[表2]

此外，与上述类似的是，通过PCR检查了收集自另外11位志愿者的样品是否具有痤疮丙酸杆菌的16S rDNA。结果表明，所述样品的每一个都是阳性的。此外，检查了这11例是否具有编码PepA氨基酸序列的碱基序列，发现这11例均为阳性。表3显示了发现其为阳性的这11例的结果和所述19例的结果。

[表3]

[确认编码PepA和PepD的碱基序列]

对于收集自5位志愿者的每个样品和实施例1中描述的痤疮丙酸杆菌，通过PCR扩增编码PepA之氨基酸序列的DNA和编码PepD之氨基酸序列的DNA。在扩增编码PepA的DNA中，使用引物L(SEQ NO.9)和引物R(SEQ NO.10)作为引物。在扩增编码PepD的DNA中，使用引物omlL：5’-GGTGCTGTCGTCAATAACAACTTC-3’(SEQ NO.14)和引物omlR：5’-GGAGTGGCCAGAGACGATCT-3’(SEQ NO.15)作为引物。在此进行的PCR是由如下步骤组成的：(i)95℃5分钟的步骤，之后(ii)35个循环，每个循环由95℃15秒的步骤，53℃20秒的步骤和72℃30秒的步骤组成，并且随后(iii)72℃7分钟的步骤和25℃10分钟的步骤。表4显示PCR的结果。

如表4所示，在全部样品中，对于PepA，通过扩增产生预期大小的PCR产物。通过扩增产生预期大小PCR产物的情况被显示为“阳性”。对于PepD，通过扩增产生了预期大小PCR产物，患者菌株D的样品除外。

随后，测定PCR产物的碱基序列以确定推定的氨基酸序列。通过使用3130xl Genetic Analyzer、测序分析软件ver 5.3.1.和KB BaseCaller(均为Applied Biosystems制造)测定碱基序列。表4显示该结果。如表4所示，在全部样品中，PepA的序列是保守的。也就是说，这样获得的推定氨基酸序列与SEQ NO.1中显示的氨基酸序列相同。另一方面，在患者菌株C和E的样品中，PepD的序列是保守的。也就是说，这样获得的推定氨基酸序列与SEQ NO.3中显示的氨基酸序列相同。在患者菌株A和B的样品中，推定氨基酸序列具有一个氨基酸突变。具体来说，SEQ NO.3所示氨基酸序列的N末端第11位的氨基酸残基从Gln变为Lys。在来自Riken BioResource中心的菌株中也观察到该突变，所述菌株用于测定实施例中各个肽的抗炎作用。所述患者菌株A是来自实施例6中的痤疮患者的样品。

[表4]

然而，如实施例5和图5所示，单次施用PepD可产生对来自RIKENBioResource Center的菌株所引起之炎症的抗炎作用，所述菌株在PepD的氨基酸序列中含有突变。这表明，即便是对含有带一个氨基酸突变的PepD的菌株所引起的炎症，PepD也可有效地用作疫苗。

类似地，在表5中所示的收集自30位志愿者的样品中的痤疮丙酸杆菌中，通过PCR扩增编码PepA氨基酸序列的DNA和编码PepD氨基酸序列的DNA，并测定各自PCR产物的碱基序列，以确定各自的推定氨基酸序列。表5显示该结果。

[表5]

如表5所示，在此所检查的所有样品中，PepA的氨基酸序列完全保守。表4和5的结果显示，来自实际患者的痤疮丙酸杆菌的PepA序列非常保守。

另一方面，在所检查的30例中有20例，PepD的氨基酸序列完全保守(66.7％)。在所检查的30例中有6例，所述氨基酸序列部分突变(¹¹Gln→Lys)。这是与RIKEN BioResource中心的菌株相同的部分突变，而使用小鼠的测试发现施用疫苗对上述RIKEN BioResource中心的菌株有效。因此，鉴于疫苗作用的有效性，PepD序列被认为在30例中的26例(86.7％)中有效。也就是说，所述PepD序列非常保守。

鉴于上文，认为PepA和PepD具有在患者的细菌细胞中非常保守的序列，并因此作为针对患者的疫苗非常有效。

[实施例9：对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗用途]

[疫苗的制备]

按照上文的描述，实施例5中使用小鼠在痤疮炎症引发测试系统中发现两种单链肽(PepA和PepD)具有抗炎作用。为了使这些肽更有效地工作，通过MAP方法合成了PepA和PepD的MAP肽。如此获得的合成肽由7～13个与MAP结构连接的PepA或PepD单链肽分子组成。制备其中分别混合了PepA和PepD之MAP肽的MAP肽混合物溶液，将其用作疫苗。

按如下所述制备混合物溶液。起初，制备各个MAP肽，随后用蒸馏水透析，冷冻干燥以及制成粉末。随后，将各粉末溶于生理盐水中(OtsukaPharmaceutical Co.，Ltd.生产)，使得各种MAP肽的浓度为1mg/ml(所产生的每种溶液在下文中称为“PA-MAP”溶液)。对所述PA-MAP溶液进行内毒素检查和细胞毒性检查。内毒素的量符合NIH的允许量(5EU或更少/kg体重/1次注射)。此外，在所述细胞毒检查中，在37℃下，将10μl的受试肽溶液和90μl外周血单个核细胞(2×10⁶细胞/ml普通RPMI1640)共培养24小时。细胞存活率基本与对照的相等(±5％的差异或更少)，并且未发现毒性，在所述对照中培养向其中添加了生理盐水的外周血单个核细胞。

[例1]

以5天的间隔，5次将100μl所制备的PA-MAP溶液皮下接种进入痤疮患者的上臂。所述痤疮患者是携带实施例8中的患者菌株A的患者。图8显示观察的结果。

如图8所示，治疗之前(第一次施用)，因为痤疮细菌的皮下增殖，整个区域的皮肤凸出并隆起(图中箭头所指示)，并伴有炎症。第一次接种后1个月，尽管仍观察到凸出和隆起，其被分成两个区域，并且炎症改善并局部化。最后一次接种后3个月，炎症逐渐消失，痤疮转变为瘢痕，并且凸出和隆起变平。在治疗的过程中，观察到色素沉淀。未观察到接种所引起的恶性现象。

[例2]

从携带有实施例8中患者菌株C的痤疮患者中收集样品，并且通过用PCR扩增痤疮丙酸杆菌的16S rDNA来确认所述痤疮患者是否感染痤疮丙酸杆菌。结果表明该痤疮患者是痤疮丙酸杆菌阳性的。通过PCR，使用(i)引物L1，其由与引物9F相同的序列组成，和(ii)引物R2：5’-GCACGTAGTTAGCCGGTGCT-3’(SEQ NO.13)，进行痤疮丙酸杆菌16S rDNA的扩增，所述PCR由如下步骤组成：(i)95℃5分钟的步骤，以及随后(ii)35个循环，每个循环由如下步骤组成：95℃25秒的步骤，55℃20秒的步骤和72℃30秒的步骤，以及(iii)72℃7分钟的步骤。

以3天的间隔，5次将300μl所制备的PA-MAP溶液皮下接种进入痤疮患者的上臂。图9显示观察的结果。

如图9所示，治疗之前(第一次施用)，观察到的面颊上整个炎症区域在第一次接种后1个月和3个月有所改善。未观察到接种所引起的恶性现象。

[例3]

从携带实施例8中患者菌株D的痤疮患者中收集样品，并且通过用与例2中相同条件的PCR扩增痤疮丙酸杆菌的16S rDNA来确认所述痤疮患者是否感染痤疮丙酸杆菌。结果表明该痤疮患者是痤疮丙酸杆菌阳性的。

以3天的间隔，5次将300μl所制备的PA-MAP溶液皮下接种进入痤疮患者的上臂。图10显示观察的结果。

如图10所示，治疗之前(第一次施用)，观察到的鼻附近整个炎症区域在第一次接种后1个月和3个月有所改善。未观察到接种所引起的恶性现象。

[例4]

从携带实施例8中患者菌株E的痤疮患者中收集样品，并且通过用与例2中相同条件的PCR扩增痤疮丙酸杆菌的16S rDNA来确认所述痤疮患者是否感染痤疮丙酸杆菌。结果表明该痤疮患者是痤疮丙酸杆菌阳性的。

以5天的间隔，5次将300μl所制备的PA-MAP溶液皮下接种进入痤疮患者的上臂。图11显示观察的结果。

如图11所示，治疗之前(第一次施用)，观察到的面颊广泛区域上整个炎症区域在第一次接种后1个月和3个月有所改善。未观察到接种所引起的恶性现象。

上述结果表明，含有肽PepA和肽PepD的组合物作为对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗(即痤疮疫苗)是有效的。

工业实用性

本发明的使用实现了用于预防和治疗痤疮的免疫治疗。因此，本发明适用于医学领域、药物领域等，并且非常有用。

[序列表]

HK1005序列表

Claims

1.选自下列项的肽：

由SEQ NO.1所示氨基酸序列组成的肽。

2.选自下列项的肽：

由SEQ NO.3所示氨基酸序列组成的肽。

3.多价抗原肽形式的肽，其是通过接头连接多个权利要求1或2中所述的肽而获得的。

4.肽组合物，其包含：

权利要求1中所述的肽，或者通过接头连接多个权利要求1中所述的肽而获得的多价抗原肽形式的肽；和

权利要求2中所述的肽，或者通过接头连接多个权利要求2中所述的肽而获得的多价抗原肽形式的肽。

5.对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其包含权利要求1或2所述的肽。

6.编码权利要求1或2所述之多肽的多核苷酸。

7.有效连接权利要求6中所述多核苷酸的表达载体。

8.对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其包含权利要求6中所述的多核苷酸。

9.对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其包含权利要求3所述的肽。

10.对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其包含权利要求4所述的肽组合物。