ES2400280T3

ES2400280T3 - Antígenos de estreptococos

Info

Publication number: ES2400280T3
Application number: ES08155317T
Authority: ES
Inventors: Bernard R. Brodeur; Nathalie Charland; Josée Hamel; Denis Martin; Isabelle Pineau; Clément Rioux
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2013-04-08
Anticipated expiration: 2019-12-20
Also published as: NO330800B1; CY1114722T1; EP2261358B1; IL194230A; AR029322A1; PT1141306E; CN1654657A; DK1950302T3; JP2002533123A; CN101134775A; KR20010104693A; IL194230A0; ZA200105114B; EP1141306B1; TR200102497T2; ES2480417T3; JP4761623B2; OA11736A; PL205041B1; HUP0104774A2

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene: a) al menos un 95 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia elegida de las: SEC ID Nº: 4,58, 60, 61, 63, 73 a 75 o 79;o b) más de un 99 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia elegida de las: SEC ID Nº: 14,67 o 68; y c) en el que el polinucleótido no codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº 5 del documento WO00/17370, SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 o SEC ID Nº 194 del documento WO 00/06737; y d) en el que el polipéptido produce una respuesta inmunológica antiestreptocócica cuando se administra a unindividuo.

Description

Antígenos de estreptococos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a antígenos, más particularmente a antígenos de proteínas del patógenoStreptococcus pneumoniae que son útiles como componentes de vacunas para terapia y / o profilaxis.

Antecedentes de la invención

S. pneumoniae es un agente importante de enfermedad en el ser humano,, especialmente entre niños, ancianos y personas inmunocomprometidas. Es una bacteria aislada frecuentemente entre pacientes con enfermedades invasivas tales como bacteriaemia/septicemia, neumonía, meningitis con alta morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Incluso con la terapia apropiada de antibióticos, las infecciones neumocócicas pueden dar como resultado muchas muertes. Aunque la llegada de fármacos antimicrobianos ha reducido la mortalidad global por la enfermedad por neumococos, la presencia de organismos neumocócicos resistentes se ha convertido en un gran problema en todo el mundo hoy en día. Las vacunas eficaces contra neumococos podrían tener un impacto fundamental en lamorbilidad y la mortalidad asociadas con enfermedad por S. pneumoniae. Tales vacunas deberían ser potencialmente útiles para evitar la otitis media en bebés y niños pequeños.

Los esfuerzos para desarrollar una vacuna neumocócica se han concentrado en general en la generación derespuestas inmunológicas al polisacárido capsular neumocócico. Se han identificado más de 80 serotipos capsulares neumocócicos en base a las diferencias antigénicas. La vacuna neumocócica comercialmente disponibleactualmente, que comprende 23 polisacáridos capsulares que con mayor frecuencia provocan enfermedad, tiene inconvenientes significativos relacionados principalmente con la escasa inmunogenicidad de algunos polisacáridos capsulares, la diversidad de los serotipos y las diferencias en la distribución de los serotipos con el tiempo, áreas geográficas y grupos de edad. En particular, la falta de vacunas existentes y vacunas conjugadas capsulares actualmente en desarrollo para proteger a los niños pequeños contra todos los serotipos estimula la evaluación deotros componentes de S. pneumoniae. Aunque la inmunogenicidad de los polisacáridos capsulares se puedemejorar, la especificidad del serotipo representará una limitación principal de las vacunas basadas en polisacáridos. El uso de un antígeno de proteínas neumocócicas inmunogénicas antigénicamente conservado, bien por sí solo o en combinación con componentes adicionales, ofrece la posibilidad de una vacuna neumocócica basada en proteína.

La Publicación PCT número WO98/18930 publicada el 7 de mayo de 1998 titulada "Streptococcus Pneumoniae antigens and vaccines" describe ciertos polipéptidos reivindicados como antigénicos. Sin embargo, no se reseñaninguna actividad biológica de estos polipéptidos.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad no satisfecha de antígenos de Streptococcus que se pueden usar comocomponentes de vacuna para la profilaxis y / o la terapia de infección por Streptococcus.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene:

a) una identidad de al menos un 95% con un segundo polipéptido que tiene una secuencia elegida entre lasSECID Nº: 4, 58, 60, 61, 63, 73 a 75 o 79; o

b) una identidad superior al 99 % con un segundo polipéptido que tiene la secuencia elegida entre las SEC ID Nº 14, 67 o 68; y

c) en el que el polinucleótido no codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº 5 del documento WO 00/17370, la SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 o la SEC ID Nº 194 del documento 00/06737; y

d) en el que el polipéptido produce una respuesta inmunitaria antiestreptocócica cuando se administra a unindividuo.

En otros aspectos se proporcionan vectores que comprenden polinucleótidos de la invención unidos de manera operable a una región de control de la expresión, así como células huésped transfectadas con dichos vectores y procedimientos de producción de polipéptidos que comprenden el cultivo de dichas células huésped en las condiciones adecuadas para la expresión.

En otro aspecto, se proporcionan polipéptidos novedosos codificados por polinucleótidos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es la secuencia de ADN del gen BVH-3; SEC ID Nº 1.

La figura 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-3; SEC ID Nº 2.

La figura 3 es la secuencia de ADN del gen de BVH-11; SEC ID Nº 3.

La figura 4 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11; SEC ID Nº 4.

La figura 5 es la secuencia de ADN del gen BVH-28; SEC ID Nº 5.

La figura 6 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-28; SEC ID Nº 6.

La figura 7 es la secuencia de ADN del gen BVH-3A que corresponde al extremo 5’ terminal de BVH-3; SEC ID Nº 7.

La figura 8 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-3A; SEC ID Nº 8.

La figura 9 es la secuencia de ADN del gen BVH-3B que corresponde al extremo 3’ terminal de BVH-3; SEC ID Nº 9.

La figura 10 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-3B; SEC ID Nº 10.

La figura 11 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los marcos de lectura abiertosde BVH-3 de las cepas de S. pneumoniae WU2, RX1, JNR.7/87, SP64, P4241 y A66 usando el programa software de análisis de secuencias de Clustal W from MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación, existe una línea de consenso donde los caracteres * e indican restos idénticos y similares de aminoácidos, respectivamente.

La figura 12 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los marcos de lectura abiertos de BVH-11 de las cepas de S. pneumoniae WU2, Rx1, JNR.7/87, SP64, P4241, A66 y SP63 usando el programasoftware de análisis de secuencias de Clustal W de MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación, existe una línea de consenso donde * y los caracteres indican restos idénticos y similares de aminoácidos, respectivamente.

La figura 13 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de las proteínas BVH-11 de diversas cepas de S. pneumoniae. Los grados de identidad (I) y similitud (S) se determinaron usando el programa Clustal W del software de análisis de secuencia de MacVector (versión 6.5).

La figura 14 es una secuencia de ADN que contiene el gen completo de BVH-3 (marco de lectura abierto "ORF" enlos nucleótidos 1777 a 4896); SEC ID Nº 11.

La figura 15 es una secuencia de ADN que contiene el gen completo de BVH-11 (ORF en los nucleótidos 45 a 2567);

SEC ID Nº 12.

La figura 16 es una secuencia de ADN que contiene el gen completo de BVH-11-2 (ORF en los nucleótidos 114 a 2630); SEC ID Nº 13. La figura 17 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11-2; SEC ID Nº14. La figura 18 es la secuencia de ADN de SP63 BVH-3 gene; SEC ID Nº15. La figura 19 es la secuencia de aminoácidos de la proteína SP63 BVH-3; SEC ID Nº 16. La figura 20 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-3M; SEC ID Nº 55. La figura 21 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-3AD; SEC ID Nº 56. La figura 22 es la secuencia de aminoácidos de la proteína L-BVH-3-AD; SEC ID Nº 57. La figura 23 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW12; SEC ID Nº 58. La figura 24 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-3C; SEC ID Nº 59. La figura 25 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11M; SEC ID Nº 60. La figura 26 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11A; SEC ID Nº 61. La figura 27 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11B (también llamada New13); SEC ID Nº 62. La figura 28 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11C; SEC ID Nº 63. La figura 29 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW1; SEC ID Nº 64. La figura 30 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW2; SEC ID Nº 65. La figura 31 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW3; SEC ID Nº 66. La figura 32 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW4; SEC ID Nº 67. La figura 33 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW5; SEC ID Nº 68. La figura 34 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW6; SEC ID Nº 69. La figura 35 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW7; SEC ID Nº 70. La figura 36 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW8; SEC ID Nº 71. La figura 37 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW9; SEC ID Nº 72. La figura 38 es la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-11-2M; SEC ID Nº 73. La figura 39 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW10; SEC ID Nº 74.

La figura 40 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW11; SEC ID Nº 75. La figura 41 es la secuencia de ADN de NEW12 gene; SEC ID Nº 76. La figura 42 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW14; SEC ID Nº 77. La figura 43 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW15; SEC ID Nº 78. La figura 44 es la secuencia de aminoácidos de la proteína NEW16; SEC ID Nº 79. La figura 45 es la secuencia de ADN del gen GBS BVH-71; SEC ID Nº 80. La figura 46 es la secuencia de aminoácidos de la proteína GBS BVH-71; SEC ID Nº 81. La figura 47 es la secuencia de ADN del gen GAS BVH-71; SEC ID Nº 82. La figura 48 es la secuencia de aminoácidos de la proteína GAS BVH-71; SEC ID Nº 83. Descripción detallada de la invención

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia escogida de lasSEC IDNº: 4, 58, 60, 61, 63, 73 a 75 o 79.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 4 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene una identidad de más del 99% on un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 14 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 58 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 60 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene una identidad de más del 99% on un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 67 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene una identidad de más del 99% on un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 68 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptidoque tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 74 o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos escogida de las SEC ID Nº 4, 58, 60, 61, 63, 73 a 75, 79, o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos escogida de las SEC ID Nº 14, 67, 68, o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos escogida de las SEC ID Nº 4, 14, 60, 73, o fragmentos, análogos o derivados del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos escogida de las SEC ID Nº 4, 14, 58, 60 a 63, 67, 68, 73 a 75, 77, 79.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 4, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 14, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 58, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 67, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº 68, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipétidos quiméricos que comprenden uno

: o más polipéptidos o sus fragmentos, análogos o derivados como se ha descrito en la presente solicitud. En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden uno

: o más polipéptidos o sus fragmentos, análogos o derivados como se ha definido en las figuras de la presente

solicitud. En una realización adicional, la presente solicitud también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos elegidos de las SEQ ID Nº 4, 14, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79 o fragmentos, análogos o derivados de los mismos: con la condición de que los polipéptidos o fragmentos, análogos o derivados de los mismos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá dos o más polipéptidos escogidos de las SEC ID Nº 58, 60, 62, 67, 68,69, 72, 74, 77 o fragmentos, análogos o derivados de los mismos: con la condición de que lospolipéptidos o fragmentos, análogos o derivados de los mismos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá dos o más polipéptidos escogidos de las SEC ID Nº 58, 60, 62, 67, 68, 72, 74, 77 o fragmentos, análogos o derivados de los mismos: con la condición de que los polipéptidos o fragmentos, análogos o derivados de los mismos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá dos o más polipéptidos escogidos de las SEC ID Nº 62, 67, 68, 74, 77 o fragmentos, análogos o derivados de los mismos; con la condición de que los polipéptidos ofragmentos, análogos o derivados de los mismos estén unidos para formar un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá entre 2 y 5 polipéptidos. En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá entre 2 y 4 polipéptidos. En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá entre 2 y 3 polipéptidos. En una realización adicional, el polipéptido quimérico comprenderá 2 polipéptidos. En una realización adicional, se proporciona un polipéptido quimérico de fórmula (I)

A-(B)m-(C)n-D (I) en la que; m es 0 o 1, n es 0 o1, A se elige entre las SEC ID Nº 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; B se elige entre las SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; C se elige entre .SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; y D se elige entre SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; en la que el polipéptido provoca una respuesta

inmunitaria antiestretocócicas cuando se administra a un individuo. En una realización adicional, A es SEC ID Nº: 58 o sus fragmentos, análogos o derivados En una realización adicional, A es SEC ID Nº 62 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, A es SEC ID Nº 68 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, A es SEC ID Nº 74 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, A es SEC ID Nº 77 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, B es SEC ID Nº 58 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, B es SEC ID Nº 67 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, B es SEC ID Nº 68 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, B es SEC ID Nº 74 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, B es SEC ID Nº 77 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, C es SEC ID Nº 58 o sus fragmentos, análogos y derivados. En una realización adicional, C es SEC ID Nº 62 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, C es SEC ID Nº 67 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, C es SEC ID Nº 68 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, C es SEC ID Nº 74 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, C es SEC ID Nº 77 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, D es SEC ID Nº 58 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, D es SEC ID Nº 62 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, D es SEC ID Nº 67 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, D es SEC ID Nº 68 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, D es SEC ID Nº 74 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, D es SEC ID Nº 77 o sus fragmentos, análogos y derivados.

En una realización adicional, m es 0.

En una realización adicional, n es 0.

En una realización adicional, m y n son 0.

De acuerdo con la presente invención, todos los nucleótidos que codifican polipéptidos y polipéptidos quiméricos están dentro del alcance de la presente invención.

En una realización adicional, los polipéptidos o los polipéptidos quiméricos de acuerdo con la presente invención son antigénicos.

En una realización adicional, los polipéptidos o los polipéptidos quiméricos de acuerdo con la presente invención pueden producir una respuesta inmunológica en un individuo.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos que son capaces de producir anticuerpos que tienen especificidad de unión a los polipéptidos o a los polipéptidos quiméricos de la presente invención como se ha definido anteriormente.

Un anticuerpo que "tiene especificidad de unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado pero que sustancialmente no reconocen y se unen a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que incluye de manera natural el péptido seleccionado. La unión específica se puede medir usando unensayo ELISA en el que el polipéptido seleccionado se usa como un antígeno.

Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entienden los expertos en la técnica a la que la invención pertenece. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En el caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, tendrán prioridad. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no sepretende que sean limitantes.

Como se usa en el presente documento, "fragmentos", "derivados" o "análogos" de los polipéptidos de la invención incluyen los polipéptidos en los que uno o más de los restos aminoácidos están sustituidos con un resto aminoácido conservado o no conservado (preferentemente conservado) y que puede ser de origen natural o no natural. En una realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán una identidad de aproximadamente el70 % con las secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos. Es decir, el 70 % de los restos son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 75 % de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 80 % de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 85 % de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 90 % dehomología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 95 % de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 99 % de homología. En una realización adicional, los derivados yanálogos de los polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o supresiones de restos aminoácidos, y más preferentemente menos de 10. Las sustituciones preferidas son las conocidas en la técnica como conservadas, es decir los restos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales.

De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos de la invención incluyen tanto polipéptidos como polipéptidosquiméricos.

También están incluidos los polipéptidos que tienen condensados a ellos otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas de los polipéptidos es decir, polietilenglicol (PEG) para incrementar lasemivida; secuencias de aminoácidos líder o secretoras para la facilidad de la purificación; secuencias prepro-y pro-;y (poli)sacáridos.

Además, en las situaciones en las que se encuentra que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede ser deseable variar uno o más aminoácidos más particulares para imitar de manera más eficaz los diferentes epítopos de las diferentes cepas de estreptococos.

Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden modificar mediante acilación -NH2 terminal (por ejemplo, mediante acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, carboxiamidación terminal, por ejemplo, con amoníaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, aumento de la hidrofobicidad para ligar o unir a un soporte o a otra molécula.

También se contemplan hetero y homomultímeros de polipeptídicos de los fragmentos, análogos y derivados de los polipéptidos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han reticulado con reticuladores tales como avidina/biotina, gluteraldehído o dimetil-superimidato. Tales formas poliméricas también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir deARNm multicistrónicos generados mediante tecnología de ADN recombinante.

Preferentemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una región antigénica es decir, al menos un epítopo.

Con el fin de lograr la formación de polímeros antigénicas (es decir, multímeros sintéticos), se pueden utilizar polipéptidos que tengan grupos bishaloacetilo, nitroarilhauros, o similares, en los que los reactivos son específicos de los grupos tio. Por lo tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los diferentes péptidos puede ser un único enlace o puede estar compuesto por un grupo de enlace de al menos dos, normalmente al menos cuatro, y no más de 16, pero usualmente no más de aproximadamente 14 átomos de carbono.

En una realización particular, los fragmentos, análogos y derivados de, polipéptidos de la invención no contienen un resto de partida metionina (Met). Preferentemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora(secuencia señal). La parte de señal de un polipéptido de la invención se puede determinar de acuerdo con las técnicas biológicas moleculares establecidas. En general, el polipéptido de interés se puede aislar a partir de uncultivo de estreptococos y posteriormente secuenciarse para determinar el resto inicial de la proteína madura y, por lo tanto, la secuencia del polipéptido maduro.

De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan composiciones de vacunas que comprenden uno o más polipéptidos de estreptococos de la invención en mezcla con un vehículo, diluyente o adyuv ºante farmacéuticamente aceptable.Adyuvantes adecuados incluyen aceites es decir, adyuvante completo o incompleto de Freund; sales es decir, AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, sílice, caolín, polinucleótidos de carbono es decir, poli IC y poli AU. Los adyuvantes preferidos incluyen QuilA y Alhydrogel. Las vacunas de la invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral. Los vehículos farmacéuticamente aceptables también incluyen el toxoide del tétanos.

Las composiciones de las vacunas de la invención se usan para el tratamiento o profilaxis de la infección porestreptococos y / o enfermedades y síntomas mediados por la infección por estreptococos como se describe en P.R. Murray (Ed, en jefe), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. sexta edición, 1995, 1482 p que se incorporan en el presente documento por referencia. Enuna realización, las composiciones de las vacunas de la presente invención se usan para el tratamiento o profilaxisde meningitis, otitis media, bacteriemia o neumonía. En una realización, las composiciones de las vacunas de lainvención se usan para el tratamiento o profilaxis de la infección por estreptococos y / o enfermedades y síntomasmediadas por la infección por estreptococos, en particular S. pneumoniae, grupo A de streptococcus (pyogenes), grupo B de streptococcus (GBS o agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia así como Staphylococcus aureus. En una realización adicional, la infección por estreptococos es S.pneumoniae.

En una realización particular, las vacunas se administran a los individuos en riesgo de infección por estreptococos, tales como bebés, ancianos e individuos inmunocomprometidos.

Como se usa en la presente solicitud, el término " individuos" incluye mamíferos. En una realización adicional, el mamífero es un ser humano.

Las composiciones de las vacunas están preferentemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente0,001 a 100 μg/kg (antígeno/peso corporal) y, más preferentemente, de 0,01 a 10 μg/kg y, lo más preferentemente,de 0,1 a 1 μg/kg 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas de intervalos entre inmunizaciones.

De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por lasecuencia de aminoácidos elegida entre las SEC ID Nº: 4, 14, 58, 60, 61, 63, 73 a 75, 77, 79 o fragmentos, análogos

o derivados de los mismos.

En una realización, los polinucleótidos son los ilustrados en las SEC ID Nº: 12, 13, 76, que pueden incluir los marcos de lectura abiertos (ORF), que codifican los polipéptidos de la invención. Se apreciará que las secuencias de polinucleótidos ilustradas en las figuras se pueden alterar con codones degenerados que incluso codifican lospolipéptidos de la invención. De acuerdo con lo anterior, la presente invención además proporciona polinucleótidos que hibridan con las secuencias de polinucleótidos descritas anteriormente en el presente documento (o sus secuencias complementarias) que tienen una identidad del 50 % entre las secuencias. En una realización, al menos un 70 % de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 75 % de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 80 % de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 85 % de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 90 % de identidad entre secuencias. En una realización adicional, los polinucleótidos se pueden hibridar en condiciones rigurosas es decir, teniendo al menos 95% de identidad. En una realización adicional, más de 97 % de identidad.

En una realización adicional, los polinucleótidos son los ilustrados en las SEC ID Nº: 3, 12, 13, 76, que codifican los polipéptidos de la invención.

En una realización adicional, los polinucleótidos son los ilustrados en la SEC ID Nº: 3, que codifican los polipéptidos de la invención.

En una realización adicional, los polinucleótidos son los ilustrados en la SEC ID Nº: 12, que codifican los polipéptidos de la invención.

En una realización adicional, los polinucleótidos son los ilustrados en la SEC ID Nº: 13, que codifican los polipéptidos de la invención.

En una realización adicional, los polinucleótidos son los ilustrados en la SEC ID Nº: 76, que codifican los polipéptidos de la invención.

Como fácilmente apreciarán los expertos en la técnica, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.

La presente invención también incluyen polinucleótidos complementarios a los polinucleótido descritos en la presente solicitud.

En un aspecto adicional, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención, o sus fragmentos,análogos o derivados, se pueden usar en un procedimiento de inmunización de ADN. Esto es, se pueden incorporar en un vector que se puede replicar y expresar tras la inyección produciendo por lo tanto el polipéptido antigénico in vivo. POr ejemplo, los polinucleótidos se pueden incorporar en un vector plásmido bajo el control del promotor deCMV que es funcional en células eucarióticas.

Preferentemente, el vector se inyecta por vía intramuscular.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes mediante la expresión de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y recuperando el producto de polipéptido expresado. Como alternativa, los polipéptidos se pueden producirde acuerdo con las técnicas químicas sintéticas establecidas es decir, síntesis en fase en solución o en fase sólida deoligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido completo (ligamiento en bloque).

Los procedimientos generales para la obtención y evaluación de polinucleótidos y polipéptidos se describen en las siguientes referencias: Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. et al., John Wiley y Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 páginas; Protein Purification, Principles y Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3ª Edición, 1993, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan J.E. y col., John Wiley & Sons Inc., New York que se incorporan en el presente documento por referencia.

Para la producción recombinante, las células huésped se transfectan con vectores que codifican el polipéptido, ydespués se cultivan en un medio nutriente modificado según sea adecuado para activar promotores, selección detransformantes o amplificación de los genes. Los vectores adecuados son aquellos que son viables y se pueden replicar en el huésped elegido e incluyen secuencias cromosómicas, no cromosómicas de ADN sintético por ejemplo, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones deplásmidos y ADN de fago. La secuencia de polipéptidos se puede incorporar en el vector en el sitio apropiado usando enzimas de restricción tal como la que está unida de manera operativa a una región de control de expresión que comprende un promotor, sitio de unión a ribosomas (región de consenso o secuencia Shine-Dalgarno), yopcionalmente un operador (elemento de control). Se pueden seleccionar components individuales de la region de control de expresión que son apropiados para un huésped y vector dado de acuerdo con los principios de biología molecular establecidos (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley y Sons, Inc. New York incorporadas en el presente documento por referencia). Los promotores adecuados incluyen pero no se limitan a LTR

o promotor de SV40, E.coli lac, promotores tac o trp y el promotor PL del fago lambda. Los vectores preferentemente incorporarán preferentemente incorporan un origin de replicación así como marcadores de selección es decir, gen de ersistencia a amplicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y eukaryotic vectors pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG ypSVL. Las células huésped pueden ser bacterianas es decir, E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; hongos es decir, Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; levaduras es decir, Saccharomyces o eucarióticas es decir, CHO, COS.

Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se recogen típicamente mediante centrifugación después serompen mediante medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se secreta en el medio) y el extracto bruto resultante retenido para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido a partir del medio de cultivo o lisado se puede lograr mediante las técnicas establecidas dependiendo de las propiedades del polipéptido es decir, usando sulfato de amonio o etanol, precipitación, extracción por ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxiapatita ycromatografía de lectina. La purificación final se puede lograr usando HPLC.

El polipéptido se puede expresar con o sin una secuencia líder o de secreción. En el caso anterior, la líder se puederetirar usando un procedimiento posterior a la traducción (véanse los documentos US 4.431.739; US 4.425.437; y US

4.338.397 incorporados en el presente documento por referencia) o retirarse químicamente posteriormente a lapurificación del polipéptido expresado.

De acuerdo con un aspecto adicional, los polipéptidos de estreptococos de la invención se pueden usar en un ensayode diagnóstico para la infección por estreptococos, en particular infección por S. pneumoniae. Son posibles varios procedimientos de diagnóstico, por ejemplo detección de organismos de estreptococos en una muestra biológica, se puede seguir el siguiente procedimiento:

a) obtener una muestra biológica de un paciente;

b) incubar un anticuerpo o su fragmento reactivo con un polipéptido de estreptococos de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c) detectar el anticuerpo unido de manera específica en la mezcla que indica la presencia de estreptococos.

Como alternativa, se puede realizar un procedimiento para la detección de un anticuerpo específico para un antígeno de estreptococos en una muestra biológica que contiene o es sospechosa de contener dicho anticuerpo se puede realizar del siguiente modo:

a) obtener una muestra biológica de un paciente;

b) incubar uno o más polipéptidos de estreptococos de la invención o sus fragmentos con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c) detectar el antígeno unido de manera específica o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo específico de.

Los expertos en la técnica reconocerán que este ensayo diagnóstico puede tener varias formas, incluyendo un ensayo inmunológico tal como ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioimmunoensayo o unensayo de aglutinación de látex, esencialmente para determinar si los anticuerpos específicos para la proteína están presentes en un organismo.

Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de la invención también se pueden usar para diseñar sondas de ADN para uso en la detección de la presencia de estreptococos en una muestra biológica sospechosa de contener tal bacteria. El procedimiento de detección de la presente invención comprende:

a) obtener una muestra biológica de un paciente;

b) incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o sus fragmentos con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c) detectar la sonda de ADN unida específicamente en la mezcla que indica la presencia de bacterias de estreptococos.

Las sondas de ADN de la presente invención también se pueden usar para detectar estreptococos circulantes esdecir, ácidos nucleicos de S. pneumoniae en una muestra, por ejemplo usando una reacción en cadena de la polimerasa, como un procedimiento para la diagnosis de de infecciones por estreptococos. La sonda se puede sintetizar usando técnicas convencionales y se puede inmovilizar sobre una fase sólida, o se puede marcar con una etiqueta detectable. Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un ligómero que tiene una secuencia complementaria a al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de streptococcuspneumoniae de la invención.

Otro procedimiento de diagnóstico para la detección de estreptococos en un paciente comprende:

a) marcar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención o su fragmento con una etiqueta detectable;

b) administrar el anticuerpo marcado o fragmento marcado al paciente; y

c) detectar el anticuerpo marcado unido de manera específica o fragmento marcado en el paciente que indica lapresencia de estreptococos.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de los polipéptidos de estreptococos de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico y en el tratamiento de la infección por estreptococos. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar usando procedimientos de selección apropiados,por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger de manera pasiva contra infección por estreptococos en un modelo de ensayo. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón descrito en los ejemplos en el presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de unión aantígeno y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen de mamíferos y más específicamente de murino, rata o humano. Puede ser unanticuerpo de origen natural o su fragmento, o si se desea, un anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo. Eltérmino anticuerpo recombinante fragmento de anticuerpo significa anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produjo usando las técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales,

o preferentemente monoclonales. Puede ser específico para numerosos epítopos asociados a los polipéptidos destreptococcus pneumoniae pero preferentemente específicos para uno.

Sin limitar su alcance, la presente invención también se refiere a nuevos antígenos designados BVH-3, BVH-11, BVH-11-2, BVH-28 y BVH-71. La presente invención también se refiere a polipéptidos truncados que comprenden fragmentos de los nuevos antígenos designados BVH-3, BVH-11, BVH-11-2, BVH-28 y BVH-71. La presenteinvención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden los antígenos designados BVH-3, BVH-11, BVH-11-2, BVH-28 y BVH-71. Lo siguiente es una tabla de referencia que resume la relación entre los antígenos de la presente invención.

Familia: SEC ID Nº de nucleótidos SEC ID Nº de polipéptidos

BVH-3

BVH-3: 1, 11 2

BVH-3A: 7 8

BVH-3B: 9 10

BVH-3 SP63: 15 16

BVH-3M: 55

BVH-3AD (: 56

L-BVH-3AD: 57

New12: 76 58

BVH-3C: 59

New1: 64

New2: 65

New3: 66

New15: 78

BVH-11

BVH-11 -1: 3, 12 4

BVH-11-2: 13 14

BVH-11M: 60

BVH-11A: 61

BVH-11B también conocido como NEW13: 62

BVH-11C: 63

New4: 67

New5: 68

New6: 69

New7: 70

New8: 71

New9: 72

BVH-11-2M: 73

New10: 74

New11: 75

New12: 76 58

New14: 77

New16: 79

BVH-28

BVH-28: 5 6

BVH-71

GBS: 80 81

GAS: 82 83

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la clonación de los genes de S. pneumoniae.

La region codificante del gen de S. pnemoniae BVH-3 (SEC ID Nº 1) y la región codificante del gen de S. pneumoniaeBVH-28 (SEC ID Nº 5) se amplificaron mediante la PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR Sistema 2400 Perkin Elmer, San José, CA) del ADN genómico del serogrupo 6 de la cepa SP64 de S. pneumoniae usando los oligos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción BgIII (AGATCT) y XbaI (TCTAGA). Los productos de PCR se purificaron a partir de gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), digerido por BglII-XbaI (Pharmacia Canadá Inc, Baie d’Urfé, Canadá), se extrajo con fenol: cloroformo y se precipitó con etanol. El vector Superlinker pSL301 (Invitrogen, San Diego, CA) se digirió con BglII y XbaI y se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN genómicos de BglII-XbaI se ligaron al vector Bg1II-XbaI pSL301. Los productos ligados setransformaron en la cepa DH5a de E. coli [f80 lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D.DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 -135). Los plásmidos pSL301 recombinantes (rpSL301) que contienen

o bien el gen BVH-3 o BVH-28 se purificaron usando el kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y la inserciones de ADN se confirmaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). rpSL301 recombinante (rpSL301) se digirió con las enzimas de erstricción BglII (AGATCT) y XhoI (CTCGAG). Los fragmentos de ADN BglII-XhoI se purificaron usando el kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). El vector de expresión pET-32c (+) (Novagen, Madison, WI) que contiene la secuencia thioredoxin-His·Tag se digirió con BamHI (GGATCC) y XhoI y se extrajo en gel usando el kit de extracción en gel QIAquick deQIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN de BglIIXhoI se ligaron al vector BamHI-XhoI pET-32c(+) para crear la secuencia de codificación para la proteína de fusión tioredoxina-His·Tag-BVH-3 o tioredoxina-His·Tag-BVH

28. Los productos ligados se transformaron en la cepa DH5a de E. coli [f80 lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 -135). Los plásmidos pET-32c(+) recombinantes se purificaron usando un kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y las secuencias de nucleótidos en los sitios de thioredoxin-His·Tag y la inserción de ADN se verificaron mediante la secuenciación de ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminador Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la clonación de los genes de proteína de S. pneumoniae en el plásmido pCMV-GH de CMV.

La región codificante de una proteína de S. pneumoniae se insertó en fase cadena debajo de un gen de la hormona de crecimiento (hGH) que estaba bajo el control de transcripción del promotor de citomegalavirus (CMV) en el vector de plásmido pCMV-GH (Tang et al., Nature, 1992, 356 :152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en células de E. coli pero activo tras la administración del plásmido en células eucarióticas. El vector también incorporaba el gen de resistencia a ampicilina.

La región codificante del gen BVH-3 (SEC ID Nº 1) y gen BVH-28 (SEC ID Nº 5) se obtuvieron de rpSL301 (véase el ejemplo 1) usando las enzimas de restricción BglII (AGATCT) y XbaI (TCTAGA). Los productos digeridos sepurificaron en gel de agarosa usando el kit de extracción en gel de agarosa QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Elvector pCMV-GH (Laboratory del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas) que contiene la hormona de crecimiento humana para crear las proteínas de fusión se digirió con BglII y XbaI y se purificó en gel de azarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN de BglII-XbaI DNA se ligaron al vector BglII-XbaI pCMV-GH para crear la proteína de fusiónhGH-BVH-3 o hGH-BVH-28 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron la cepa de

E. coli DH5a[f80 lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169] (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 -135). Los plásmidos pCMV recombinantes se purificaron usando un kit de QIAgen (QIAgen, Chatsworth, CA).

La región codificante del gen BVH-11 (SEC ID Nº 3) se amplificó mediante la PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmpPCR sistema 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir del ADN genómico del serogrupo 6 de la cepa SP64 de S. pneumoniae usando los oligos que contenías extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción BglII (AGATCT) y HindIII (AAGCTT). El producto de la PCR se purificó en gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), digerido con las enzimas de restricción (Pharmacia Canadá Inc, Baie d’Urfe, Canadá), se extrajo con fenol : cloroformo y se precipitó con etanol. El vector pCMV-GH (Laboratorios del Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas) se digirió con BglII y HindIII y se purificó en gel de azarosa usando el kit de extracción QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Elfragmento de ADN BglII-HindIII se ligó la vector BglII-HindIII pCMVGH para crear la proteína de fusión hGH-BVH-11 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli DH5a[f80 lacZ

DM15 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D (lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg,MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 -135). El plásmido de pCMV recombinante se purificó usando un kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos de la inserción de ADN se verificó mediante secuenciación de ADN.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra el uso de ADN para inducir una respuesta inmunológica a los antígenos de S. pneumoniae.

Un grupo de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) se inmunizaron mediante inyección intramuscular de 50 μl tres veces a intervalos de dos o tres semanas con 100 μg de pCMV-GHrecombinante que codifica el gen BVH-3, BVH-11 o el gen BVH-28 en presencia de 50 μg del factor estimulante de la colonia de granulocitos -macrófagos (GM-CSF)-que expresa el plásmido pCMV-GH-GM-CSF (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas). Como control, se inyectó a un grupo de ratones 100 μg de pCMV-GH en presencia de 50 μg de pCMV-GH-GM-CSF. Se recogieron muestras de sangre del orbital antes de cada inmunización y siete días después de la tercera inyección y se determinaron las respuestas de anticuerpo en suero mediante ELISA usando la proteína de fusión tioredoxin-His·Tag-S. pneumoniae como antígeno de recubrimiento. La inmunización de ADN con plásmido recombinante pCMV-GH que codifica la proteína de S. pneumoniae BVH-3, BVH-11 o BVH-28 indujo un anticuerpo reactivo contra la proteína recombinante respectiva. Los títulos de anticuerpos recíprocos, definidos como la mayor dilución en suero a la que los valores deabsorbancia eran 0,1 por encima de los valores de fondo, eran superiores a 4x103.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la producción y purificación de las proteínas recombinantes de S. pneumoniae.

Los plásmidos Pet recombinantes que contienen el gen BVH-3, BVH-11 o BVH-28 que corresponde a la SEC ID Nº 1,SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº: 5 respectivamente se transformaron mediante electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) en la cepa de E. coli AD494 (DE3) (Dara-leu7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR DmalF3 F’[lac+(lacIq) pro] trxB::Kan) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli, el promotor de T7 que controla la expresión de la proteína de fusión se reconoce específicamente por la ARN polimerasa de T7 (presente en el profago 1DE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que se puede inducir por isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG).El AD494(DE3)/rpET transformante se desarrolló a 37°C con agitación a 250 rpm en caldoLB (peptona 10g/l, extracto de levadura 5g/l, NaCl 10g/l) que contiene 100 μg de ampicilina (Sigma-Aldrich Canadá Ltd., Oakville, Canadá) por ml hasta que A600 alcanzó un valor de 0,6. Con el fin de inducer la producción de laproteína de fusión tioredoxin-His·Tag-BVH-3, tioredoxin-His·Tag-BVH-11 o tioredoxin-His·Tag-BVH-28, las células se incubaron durante 2 horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células inducidas de 100 ml de cultivo se sedimentaron mediante centrifugación y se congelaron a -70°C.

La purificación de las proteínas de fusión de la fracción citoplásmica de AD494(DE3)/rpET Inducida por IPTG se realizó mediante cromatografía social basándose en las propiedades de la secuencia His·Tag (6 restos de histidina consecutivos) para unirse a cationes divalentes (Ni2+) inmovilizados sobre la resina de quelación de metales His-Bind. En resumen, las células sedimentadas obtenidas a partir de un cultivo de 100 ml inducido con IPTG se volvieron a suspender en solución tamponada con fosfato (PBS):500 mM NaCl pH 7,1, se sonicaron y se centrifugaron a 20.000 X g durante 20 min para eliminar los desechos. Se filtró el sobrenadante (membrana de tamaño de poro 0,22 μm) yse depositó en 1 ml de columna quelante empaquetada previamente lista para uso HiTrap® (Pharmacia Biotech, Baie d’Urfé, Canadá). La proteína de fusion tioredoxin-His·Tag-S. pneumoniae se eluyó con 1 M imidazol-500mM NaCl-PBS pH 7,1. la eliminación de la sal e imidazol de la muestra se realizó mediante diálisis contra PBS a 4°C. Las cantidades de la proteína de fusión obtenidas de la fracción soluble de E. coli se estimó mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la protección de ratones contra la infección neumocócica fatal mediante inmunización.

Grupos de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles River) se inmunizaro por vía subcutánea tres veecs a intervalos deters semanas con o 25 μg de proteína de fusión thioredoxin-His·Tag-BVH-3 purificada por afinidad en presencia de15 μg de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como controll, con adyuvante QuilA soloen PBS. Se recogieron muestras de sangre del seno orbital el día 1, 22 y 43 antes de cada inmunización y siete días(día 50) después de la tercera inyección. Una semana después los ratones se expusieron con aproximadamente 106 UFC del tipo 3 la cepa de S. pneumoniae WU2. Muestras del inóculo de de exposición de S. pneumoniae se sembraron sobre placas de agar de chocolate para determinar la UFC y para verificar la dosis de exposición. Se registraron als muertes durante un período de 14 días y el día 14 después de la exposición, los ratones supervivientes se sacrificaron y se ensayaron las muestras de sangre para determinar la presencia de organismos de

S. pneumoniae. Los datos de supervivencia se muestran en la tabla 1.

Se analizaron sueros antes de la exposición para determinar la presencia de anticuerpos reactivos con S. pneumoniae mediante inmunoensayos convencionales. Los análisis ELISA y de inmunotransferencia indicaron que la inmunización con la proteína recombinante de S. pneumoniae en E. coli indujo anticuerpos reactivos con tanto la proteína recombinante como nativa neumocócica.

Tabla 1. Protección mediada por la proteína BVH-3 recombinante 5

60 (Cont.)

BVH-3: 8 : 0 > 14

ninguno: 0 : 8 1

Todos los ratones inmunizados con la proteína recombinante BVH-3 sobrevivieron a la infección mientras que ninguno de los ratones control a los que se les proporcionó adyuvante sobrevivió. Existe una diferencia significativa en la supervivencia entre los dos grupos de ratones (P< 0,0001, ensayo de intervalo log para un análisis no paramétrico de curvas de supervivencia; P = 0,0002, prueba exacto de Fisher’). Todos los hemocultivos de los ratones supervivientes fueron negativos el día 14 después de la exposición.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe la clonación de los genes BVH-3 y BVH-11 de una diversidad de cepas de S. pneumoniae y la conservación molecular de estos genes.

El análisis molecular de ADN cromosómico de diversos aislamientos de S. pneumoniae con sondas de ADN que se expanden sobre diferentes regiones de BVH-3 o BVH-11 revelaron la presencia de una copia del gen de BVH-3 dos copias del gen de BVH-11 . Las dos copias del gen BVH-11 no eran idénticas y los genes se designaron de maneraarbitraria BVH-11 (SEC ID Nº12; ORF en los nucleótidos 45 a 2567) y BVH-11-2 (SEC ID Nº13; ORF en los nucleótidos 114 a 2630).

Los primeros aminoácidos de las regiones que codifican BVH-3 y BVH-11 tienen las características de las secuencias guía también conocidas como secuencias señal. El sitio de escisión de la peptidasa de señal deconsenso L-X-X-C se los sitios de modificación/ procesamiento estaba presente en las secuencias. Las proteínas maduras BVH-3, BVH-11 y BVH-11-2 de S. pneumoniae SP64 tienen 1019, 821 y 819 aminoácidos, respectivamente. Las regiones de los genes de S. pneumoniae que codifican BVH-3 maduro, llamado BVH-3M, (nucleótidos 1837 4896; SEC ID Nº 11), BVH-11M (nucleótidos 102 -2567; SEC ID Nº 12) y BVH-11-2M (nucleótidos 171 -2630; SEC ID Nº 13), se amplificaron mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR sistema 2400 Perkin Elmer, San José, CA) a partir del ADN genómico de 6 ó 7 cepas de S. pneumoniae. Los aislamientos clínicos del serogrupo 6 de

S. pneumoniae SP64 y serogrupo 9 SP63 se proporcionaron por los laboratorios de la salud pública de3 Québec,Sainte-Anne-de-Bellevue; serotipo 4 cepa JNR.7/87 fue proporcionada por Andrew Camilli, Tufts Universidad de la Escuela de Medicina, Boston; cepa Rx1, un derivado no encapsulado de la cepa D39 de tipo 2 y las cepas de tipo 3A66 y WU2 se proporcionaron por David E. Briles de la Universidad de Alabama, Birmingham y el aislamiento clínicode P4241 3 se proporcionó por el centro de investigación de infecciones del centro hospitalario de la universidad deLaval, Sainte-Foy. Los conjuntos de cebadores de OCRR479-OCRR480; HAMJ160-OCRR488 y HAMJ160-HAMJ186, que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción se usaron para la amplificación del gen BVH-3, BVH-11 y BVH-11-2, respectivamente, con la excepción del gen BVH-11 de la cepaSP64 que se amplificó usando el conjunto de cebadores constituidos por HAMJ487 y OCRR488. Las secuencias de cebadores se enumeran a continuación (Tabla 2). Los productos de la PCR se pueden purificar en gel de azarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA) y se digiriern mdiante BglII-XbaI o BglII-HindIII (Pharmacia Canadá Inc, Baie d’Urfé, Canadá). Las diegstiones se limpiaron usando un kit de purificación de PCR QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de la PCR se ligaron al vector de pSL301 BglII-XbaI o BglII-HindIII. Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli strain DH5α・[Φ80 lacZ ∆M15 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1λ-gyrA96 relA1 ∆(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo conel procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109 -135). Los plásmidos recombinantes pSL301 (rpSL301) que contiene BVH-3, BVH-11 o BVH11-2 se purificaron usando un kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenciaron las inserciones de ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). Las figuras 11 y 12 muestran las secuencias de consenso establecidas a partir de las secuencias de aminoácidos deducidas BVH-3, y BVH-11, respectivamente. La comparación de las secuencias de proteínas de BVH3 reveló un 99 a 100% de identidad de secuencias con la excepción que BVH-3 del serogrupo 9 de la cepa SP63 (SEC ID Nº 15 y SEC ID Nº 16) carecía de un tramo de 177 aminoácidos correspondiente a los residuos 244 a 420 sobre la secuencia de proteínas de BVH-3’ de S. pneumoniae SP64. El análisis de las secuencias de las cepas adicionales del serogrupo 9 reveló que la molécula BVH-3 tiene la misma supresión en 3 de 4 cepas sugiriendo deesta manera que las 3 cepas son miembros de un clon del serogrupo 9 de S. pneumoniae.

La comparación de 13 secuencias de nucleótidos de BVH-11 obtenidas de 7 cepas de S. pneumoniae, reveló que las secuencias de nucleótidos son muy similares. El análisis por ordenador (MacVector, Clustal W 1.4) que

alineación múltiple de las secuencias de proteínas de BVH-11 previstas reveló que estas secuencias eran 75

%
usa idénticas y 82 % homólogas en una longitud de 834 aminoácidos. La alineación de emparejamiento reveló un 80 a100% de identidad (La figura 13). Las secuencias mostraron gran similitud en la organización global. La variabilidad en la secuencia principal de de estas proteínas casi está restringida a los últimos 125 aminoácidos en la parte Cterminal de las proteínas. Esta región constituye un dominio. El examen estrecho de este dominio reveló dos grupos de secuencias. Las primeras 9 secuencias de la figura 13 pertenecen a un grupo mientras las últimas 4 secuenciaspertenecen a otro grupo . Un 39% de valor de identidad se obtiene cuando se comparan las secuencias de dominio de las 13 proteínas (MacVector, Clustal W 1.4). El valor de identidad aumentó a más de 92% cuando se comparanlas secuencias que pertenecen al mismo grupo.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la homología de porciones de los genes de BVH-3 y BVH-11.

El análisis molecular con sondas de ADN derivadas de los genes BVH-3 y BVH-11 indicó que BVH-3 y BVH-11estaban relacionados. En estudios de hibridación de transferencia de puntos, la sonda de ADN que consistía o bien,de BVH-3 o BVH-11, la secuencia de genes BVH-3 y BVH-11 se hibridaba a tanto los genes BVH-3 como BVH-11 indicando que los genes BVH-3 y BVH-11 compartían secuencias homólogas. La comparación de secuencias reveló que los ORF y las proteínas eran 43 y 33% idénticas, respectivamente. El examen más estrecho reveló que la región correspondiente a los aminoácidos 1 a 225 en BVH-3 y 1 a 228 en BVH-11 eran 73 y 75% idénticas y el nivel de proteína, respectivamente. Por el contrario, las regiones 3’ correspondientes a los aminoácidos 226 a 1039 de BVH-3y aminoácidos 229 -840 de BVH-11 eran solamente 34 y 22% idénticas a nivel de ADN y de proteína, respectivamente. De este modo los extremos 5’ de los genes BVH-3 y BVH-11 parecen contener secuencias altamente conservadas mientras que las partes restantes de los genes son altamente divergentes. Estos resultados sugieren que BVH-3 y BVH-11 pudieran compartir funciones similares mediadas por las secuencias presentes en laregión conservada mientras que las funciones específicas de BVH-3-y BVH-11-podrían estar mediadas por las secuencias en la región divergente.

Ejemplo 8

Este ejemplo la clonación de los genes truncados de BVH-3, BVH-11 y BVH-11-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la expresión de las moléculas truncaads de BVH-3 y BVH-11.

Se amplificaron los fragmentos génicos mediante la PCR usando pares de oligonucleótidos modificados poringeniaría genética para amplificar los fragmentos que se extienden sobre el gen BVH-3 (SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 11), BVH-11 (SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 12) o BVH-11-2 (SEC ID Nº 13) de la cepa SP64 de S. pneumoniae. Cada uno de los cebadores tenía un sitio de endonucleasa de restricción en el extremo 5’, permitiendo por lo tanto la clonación direccional en fase del producto amplificado en el vector del plásmido digerido (Tablas 2 y 3). Los productos amplificados por PCR se digirieron con endonucleasas de restricción y se ligaron a o bien el plásmidolinealizado pSL301 (véase el ejemplo 1), pCMV-GH (véase el ejemplo 2) o pET (Novagen, Madison, WI) vector deexpresión digerido de la misma manera con enzimas que producen extremos cohesivos compatibles. Los plásmidos pSL301 recombinante y pCMV-GH recombinante se digirieron con enzimas de restricción para la clonación en fase en el vector de expresión de pET. Primero los clones se estabilizaron en E. coli DH5α ・antes de la introducción en E. coli BL21(λDE3) o AD494 (λDE3) para la expresión de las moléculas de BVH-3 o BVH-11. Cada una de las construcciones de plásmidos resultantes se confirmó mediante análisis de secuencias de nucleótidos. Las proteínas recombinantes se expresaron como fusions N-terminal con la tioredoxin y His-tag o como fusiones C-terminal con una His-tag. Las proteínas recombinantes expresados se purificaron a partir de las fracciones sobrenadantes obtenidas a partir de centrifugación de cultivos de E. coli inducidos por IPTG –usando una resina de quelación demetal His-Bind (QIAgen, Chatsworth, CA). Los productos génicos generados se enumeran en la tabla 3. Los productos génicos correspondientes a la región N-terminal que incluye la secuencia señal se denominan proteínas lapidadas o lipoproteínas (L-proteínas). Losd productos génicos correspondientes a la región N-terminal que carece de la secuencia señal se identifican como proteína sin secuencia señal (w/o ss).

Tabla 2. Lista de cebadores de oligonucleótidos de PCR (Cont.) (Cont.)

Cebador: SEC ID Secuencia 5’ -3’ Posición de los nucleótidos Sitios de restricción

OCRR 479: 17 cagtagatctgtgcctatgcactaaac SEC ID 1 :6178 BgIII

OCRR 480: 18 gatctctagactactgctattccttacgctatg SEC ID 11 : 49094887 XbaI

OCRR 497: 19 atcactcgagcattacctggataatcctgt SEC ID 1: 15251506 XhoI

OCRR 498: 20 ctgctaagcttatgaaagatttagat SEC ID 1 : 15341548 HindIII

OCRR 499: 21 gatactcgagctgctattccttac SEC ID 11: 49064893 XhoI

HAMJ 172: 22 gaatctcgagttaagctgctgctaattc SEC ID 1 : 675 -661 XhoI

HAMJ 247: 23 gacgctcgagcgctatgaaatcagataaattc SEC ID 1 : 3117 -3096 XhoI

HAMJ 248: 24 gacgctcgagggcattacctggataatcctgttcatg SEC ID 1 : 1527 -1501 XhoI

HAMJ 249: 25 cagtagatctcttcatcatttattgaaaagagg SEC ID 11 : 1749 -1771 BgIII

HAMJ 278: 26 ttatttcttccatatggacttgacagaagagcaaattaag SEC ID 1: 1414 -1437 NdeI

HAMJ 279: 27 cgccaagcttcgctatgaaatcagataaattc SEC ID 1 : 3117 -3096 HindIII

HAMJ 280: 28 cgccaagcttttccacaatataagtcgattgatt SEC ID 1 : 2400 -2377 HindIII

HAMJ 281: 29 ttatttcttccatatggaagtacctatcttggaaaaagaa SEC ID 1 : 2398 -2421 Ndel

HAMJ 300: 30 ttatttcttccatatggtgcctatgcactaaaccagc SEC ID 1 :6282 NdeI

HAMJ 313: 31 ataagaatgcggccgcttccacaatataagtcgattgatt SEC ID 1 : 2400 -2377 NotI

OCRR 487: 32 cagtagatctgtgcttatgaactaggtttgc SEC ID 3 :58 -79 BglII

OCRR 488: 33 gatcaagcttgctgctacctttacttactctc SEC ID 12 : 2577 2556 HindIII

HAMJ 171: 34 ctgagatatccgttatcgttcaaacc SEC ID 3 : 1060 -1075 EcoRV

HAMJ 251: 35 ctgcaagcttttaaaggggaataatacg SEC ID 3 : 1059 -1045 HindIII

HAMJ 264: 36 cagtagatctgcagaagccttcctatctg SEC ID 3 : 682700 BglII

HAMJ 282: 37 tcgccaagcttcgttatcgttcaaaccattggg SEC ID 3: 1060 -1081 HindIII

HAMJ 283: 38 ataagaatgcggccgccttacttactctcctttaataaagccaatagtt SEC ID 3 : 2520 -2492 NdeI

HAMJ 284: 39 catgccatggacattgatagtctcttgaaacagc SEC ID 3 : 856880 NcoI

HAMJ 285: 40 cgccaagcttcttactctcctttaataaagccaatag SEC ID 3 : 2520 -2494 HindIII

HAMJ 286: 41 cgacaagcttaacatggtcgctagcgttacc SEC ID 3: 2139-2119 HindIII

HAMJ 287: 42 cataccatgggcctttatgaggcacctaag SEC ID 3 : 2014 -2034 NcoI

HAMJ 288: 43 cgacaagcttaagtaaatcttcagcctctctcag SEC ID 3: 2376 -2353 HindIII

HAMJ 289: 44 gataccatggctagcgaccatgttcaaagaa SEC ID 3: 2125 -2146 NcoI

HAMJ 290: 45 cgccaagcttatcatccactaacttgactttatcac SEC ID 3: 1533 -1508 HindIII

HAMJ 291: 46 cataccatggatattcttgccttcttagctccg SEC ID 3: 1531 -1554 NcoI

HAMJ 301: 47 catgccatggtgcttatgaactaggtttgc SEC ID 3 : 5979 NcoI

HAMJ 302: 48 cgccaagctttagcgttaccaaaaccattatc SEC ID 3 : 2128 -2107 HindIII

HAMJ 160: 49 gtattagatctgttcctatgaacttggtcgtcacca SEC ID 13 : 172 196 BglII

HAMJ 186: 50 cgcctctagactactgtataggagccgg SEC ID 13: 2460 -2443 XbaI

HAMJ 292: 51 catgccatggaaaacatttcaagccttttacgtg SEC ID 11: 754 -778 NcoI

HAMJ 293: 52 cgacaagcttctgtataggagccggttgactttc SEC ID 11: 2457 -2434 HindIII

HAMJ 294: 53 catgccatggttcgtaaaaataaggcagaccaag SEC ID 11 : 2038 2062 Ncol

HAMJ 297: 54 catgccatggaagcctattggaatgggaag SEC ID 11 : 622 -642 NcoI

Tabla 3. Lista de los productos génicos de BVH-3 y BVH-11 generados a partir de S. pneumoniae SP64 (Cont.) (Cont.)

Conjuntos decebadores de PCR: Denominación de proteínas Identificación (aminoácidos codificados) SEC ID Nº Vector de clonación

OCRR479-OCRR480: BVH-3M BVH-3 w/o ss (211039) 55 pSL301

OCRR479-OCRR497: BVH-3AD BVH-3 N’ extremo w/o ss (21-509) 56 pSL301

HAMJ248-HAMJ249: L-BVH-3AD BVH-3 N’ extremo (1-509) 57 pET-21(+)

OCRR498-OCRR499: BVH-3B BVH-3 C’ extremo (512-1039) 10 pSL301

OCRR479-HAMJ172: BVH-3C BVH-3 N’ extremo w/o ss (21-225) 59 pET-32 c(+)

OCRR487-OCRR488: BVH-11M BVH-11 w/o ss (20-840) 60 pCMV-GH

HAMJ251-OCRR487: BVH-11A BVH-11 N’ extremo w/o ss(20-353) 61 pET-32 c (+)

HAMJ171-OCRR488: BVH-11B BVH-11 C’ extremo (354840) 62 pET-32 a(+)

HAMJ264-OCRR488: BVH-11C BVH-11 C’ extremo (228840) 63 pET-32a(+)

HAMJ278-HAMJ279: NEW1 BVH-3 C’ extremo (472-1039) 64 pET-21b(+)

HAMJ278-HAMJ280: NEW2 BVH-3 C’ extremo (472-800) 65 pET-21b(+)

HAMJ281-HAMJ279: NEW3 BVH-3 C’ extremo (800-1039) 66 pET-21b(+)

HAMJ284-HAMJ285: NEW4 BVH-11 C’ extremo (286840) 67 pET-21d(+)

HAMJ284-HAMJ286: NEW5 BVH-11 interno (286-713) 68 pET-21d(+)

HAMJ287-HAMJ288: NEW6 BVH-11 interno (672-792) 69 pET-21d(+)

HAMJ285-HAMJ289: NEW7 BVH-11 interno (709-840) 70 pET-21d(+)

HAMJ284-HAMJ290: NEW8 BVH-11 interno (286-511) 71 pET-21d(+)

HAMJ286-HAMJ291: NEW9 BVH-11 interno (511-713) 72 pET-21d(+)

HAMJ160-HAMJ186: BVH-11-2M BVH-11-2 w/o ss (20-838) 73 pSL301

HAMJ292-HAMJ293: NEW10 BVH-11-2 C’ extremo (271-838) 74 pET-21d(+)

HAMJ293-HAMJ294: NEW11 BVH-11-2 C’ extremo (699838) 75 pET-21d(+)

HAMJ282-HAMJ283: BVH-11B BVH-11 C’ extremo (354840) 62 pET-21b(+)

HAMJ286-HAMJ297: NEW14 BVH-11-2 interno (227-699) 77 pET-21d(+)

HAMJ300-HAMJ313: NEW15 BVH-3 N’ extremo w/o ss (21-800) 78 pET-21b(+)

HAMJ301-HAMJ302: NEW16 BVH-11 N’ extremo w/o ss (20-709) 79 pET-21d(+)

Ejemplo 9

Este ejemplo describe el aislamiento de anticuerpos monoclonales (Mabs) y el uso de los Mabs para caracterizar los 5 epítopos de proteínas de BVH-3, BVH-11 y BVH-11-2.

Ratones hembra BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea con productos de los genes BVH-3, BVH-11 o BVH-11-2 de S. pneumoniae cepa SP64 en presencia de 15 μg de adyuvante QuilA (Laboratorios Cedarlane Ltd, Hornby, Canadá). Un conjunto de ratones (experimento de fusión 1) se inmunizaron el día 1 y 14 con25 μg de proteína de fusión tioredoxina-His•Tag-BVH-3M purificada por afinidad. Se inmunizó un segundo grupo de 10 ratones (experimento de fusión 2) tres veces a intervalos de tres semanas con 25 μg de tioredoxina-His•Tag-BVH11M purificada por afinidad. Un tercer grupo de ratones (experimento de fusión 3) se inmunizó el día 1 y día 15 con25 μg de proteína de fusión tioredoxina-His•Tag-BVH-11-2M purificada por afinidad. Un cuarto grupo de ratones(experimento de fusión 4) se inmunizó el día 1 con 25 μg de proteína de fusión tioredoxina-His•BVH-11B purificada por afinidad y se volvieron a inmunizar mediante inyección intravenosa el día 16 y el día 37 con BVH-11B 15 recombinante en PBS. Tres a cuatro días antes de la fusión, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa con 25 μg del antígeno respectivo suspendido en PBS solo. Se produjeron hibridomas mediante la fusión de células de bazo con células de mieloma SP2/0 no secretoras como se ha descrito previamente por J. Hamel et al. [J. Med. Microbiol., 23, p 163 -170 (1987)]. Los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas se seleccionaron inicialmente mediante inmunoensayo ligado a enzimas de acuerdo con el procedimiento descrito por Hamel et al. (Supra) usando placas

20 revestidas con preparaciones de proteínas recombinantes purificadas o suspensiones de células de S. pneumoniae eliminadas por calor. Los hibridomas positivos seleccionados en la base de reactividad de ELISA con una diversidad de de antígenos se clonaron después mediante diluciones limitantes, se expandieron y se congelaron.

Se ensayaron los hibridomas mediante ELISA o inmunotransferencia tipo Western contra los productos génicos deBVH-3 y BVH-11 con el fin de caracterizar los epítopos reconocidos por los Mabs. BVH-3 y BVH-11 compartían

25 epítopos comunes con 6 Mabs (H3-1-F9, H3-1-D4, H3-1-H12, H11-1-E7, H11-1-H10 y H11-1.1-G11) que muestran reactividades con ambas proteínas (Tabla 4). Las moléculas de BVH-11 y BVH-11-2 de S. pneumoniae SP64 compartían epítopos comunes sobre BVH-3 con los Mabs (3A1, 13C11, 10H10, 1D8, 10G9, 10A2, 3E8, 10D7, 2H7 y 6H7) reactivos con tanto, las proteínas recombinantes BVH-11 como BVH-11-2, (Tabla 5) .

Tabla 4. Reactividad de Mabs BVH-3-inmunorreactivos con un panel de productos génicos BVH-3 y BVH-11 5

30 Tabla 5. Reactividad de Mabs inducidos contra la proteína BVH-11-2 de S. pneumoniae cepa SP64 con un panel de productos génicos de BVH-11

con las moléculas de BVH-3 y BVH-11 proteína de BVH-3C reconocida correspondiente a la región conservada, y los Mabs específicos de BVH-11 y BVH-11-2 eran reactivos con los epítopos localizados en las partes variables de estasmoléculas. BVH-3 y BVH-11, y BVH-11 y BVH-11-2 se pueden distinguir de su reactividad con Mabs.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la expresión simultánea de los productos génicos de BVH-3 y BVH-11 por S. pneumoniae.

Se usó una técnica de transferencia tipo Western para investigar si los genes de BVH-3 y BVH-11 se expresaron en

S. pneumoniae. S. pneumoniae cepa SP64 y SP63 se hicieron crecer durante toda una noche a 37°C en 5% de CO2 sobre placas de agar clorato, ls bacterias se suspendieron en PBS y se eliminaron por calor a 56°C durante 20 min. Para la preparación de antígenos, las suspensiones de S. pneumoniae se trataron con tampón de muestra que contenía SDS y 2-mercaptoetanol durante 5 min a 100°C. Se resolvieron antígenos de proteínas neumocócicas mediante electroforesis de SDS-PAGE de acuerdo con el procedimiento de Laemmli [Nature, 227, p. 680 -685 (1970)]. Después de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron de manera electroforética a partir del gel a papel de nitrocelulosa mediante el procedimiento de Towbin [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, p. 4350 -4354 (1979)] y se probó con antisuero de ratón o anticuerpos monoclonales. La detección de antígenos reactivos con los anticuerpos serealizó mediante inmunoensayo de enzimas usando inmunoglobulinas ani -ratón conjugadas y un sustrato de color. Cuando el antisuero inducido al BVH-3 recombinante se ensayó contra los antígenos S. pneumoniae SP64, sedetectaron dos bandas que tenían pesos moleculares aparentes de 127 kDa y 99 kDa. Las bandas que tenían losmismos pesos moleculares aparentes también se detectaron cuando los Mabs H3-1-F9, H3-1-D4, H3-1-H12, H11-1-E7, H11-1-H10 y H11-1.1-G11 se usaron de manera individual como sondas inmunológicas. Por el contrario los Mabs específicos para la molécula detectada de BVH-3 solamente la banda de 127 kDa y los Mabs específicos para BVH11 detectaron la banda de 99 kDa confirmando así solamente de esta manera la identidad de las bandas de 127 y 99 kDa como BVH-3 y BVH-11, respectivamente. Estos estudios proporcionaron la evidencia que las proteínas BVH-3 yBVH-11 están simultáneamente presentes en S. pneumoniae. Además los resultados son consistentes con las observaciones previas de los investigadores en que BVH-3 y BVH-11 poseen epítopos que son comunes para tanto las proteínas como los epítopos que son exclusivos a cualquier otra proteína.

En S. pneumoniae SP64, BVH-3, BVH-11 y BVH-11-2 maduras son proteínas de 1019, 821 y 819 aminoácidos con peso molecular de predicho de 112,5 kDa, 92,4 kDa, y 91,7 kDa, respectivamente. Aunque existe una discrepancia

entre el peso molecular predicho de la secuencia y el peso molecular calculado en SDS-PAGE, BVH-3 se puede distinguir entre BVH-11 mediante se peso molecular mayor. Además, las moléculas BVH-3 de S. pneumoniae cepaSP63 tienen un peso molecular aparente de 112 kDa en SDS-PAGE comparado con 127 kDa para BVH-3 de la cepaSP64. Estos datos son consistentes con la supresión de un tramo de 177 restos de aminoácidos en BVH-3 de S.pneumoniae cepa SP63.

Ejemplo 11

Este ejemplo describe la protección conferida en la infección experimental de ratones vacunados con productos génicos recombinantes de BVH-3 o BVH-11.

Grupos de 7 u 8 ratones hembra BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea tres veces a intervalos de tres semanas con o bien proteína de fusión thioredoxin-His•Tag-BVH-3M purificada por afinidad, proteína de fusión tioredoxina-His•Tag-BVH-11M purificada por afinidad o, como control, con adyuvante Qui1A solo en PBS. Doce a 14 días después de la tercera inmunización, los ratones se expusieron por vía intravenosa con la cepa WU2de S. pneumoniae o por vía intranasal con la cepa P4241. Las muestras del inóculo de desafío de S. pneumoniae se sembraron sobre placas de agar chocolate para determinar las UFC y para verificar la dosis de desafío. La dosis de desafío era aproximadamente 106 UFC. Se registraron las muertes durante un período de 14 días y el día 14 después de la exposición, los ratones supervivientes se sacrificaron y se ensayaron las mu7estars de sangre para determinar la p0resencia de organismos de S. pneumoniae. Los datos de supervivencia se muestran en las Tablas 6 y 7.

Tabla 6. Protección mediada por las proteínas de BVH-3M y BVH-11M recombinantes en infección experimental con

S. pneumoniae WU2 virulento

Experimento: Inmunógeno Vivos : Muertos a Mediana de días de supervivencia

1: 1 BVH-3M ninguno 8 : 0 0 : 8 > 14 1

2: 2 BVH-11M ninguno 8 : 0 0 : 8 > 14 1

a El número de ratones vivos : el número de ratones muertos del día 14 después de la exposición

Tabla 7. Protección mediada por las proteínas de BVH-3M y BVH-11M recombinantes en neumonía experimental con

S. pneumonie P4241 virulento

1: BVH-3M ninguno 6 : 1 1 : 7 > 14 4,5

2: BVH-3M BVH-11M ninguno 8 : 0 8 : 0 0 : 8 > 14 > 14 4

a El número de ratones vivos : el número de ratones muertos el día 14 después de la exposición

Todos los ratones inmunizados con proteína BVH-3M o BVH-11M recombinante sobrevivieron a la infección con WU2 mientras ninguno de los ratones de control a los que se les proporcionó adyuvante solo sobrevivieron. Todos los ratones excepto uno inmunizados con proteína BVH-3M o BVH-11M recombinante sobrevivieron a la infección conP4241 mientras solamente uno de los ratones de control a los que se proporcionó adyuvante solo sobrevivió. Todos los hemocultivos de los ratones que sobrevivieron eran negativos el día 14 después de la exposición. Estos resultados claramente indican que tanto BVH-3M como BVH-11M, inducen respuestas inmunológicas antineumocócicas protectoras en ratones. El hecho que estas proteínas están altamente conservadas entre aislamientos de S. pneumoniae enfatiza el potencial de BVH-3 y BVH-11 como candidatos de vacunas universales. De hecho, lasproteínas BVH-3 y BVH-11 del serogrupo 6 de S. pneumoniae cepa SP64 inducían protección contra infecciones neumocócicas con cepas de diferentes serotipos capsulares.

De manera ideal, una vacuna que podría proteger contra enfermedad neumocócica, podría proteger contra meningitis, otitis media, bacteriemia y neumonía. BVH-3 y BVH-11 eran protectoras contra modelos de infección sistémicos y de neumonía letal sugiriendo de esta manera que, en seres humanos, las vacunas basadas en proteína de BVH-3-y BVH11-podrían reducir la incidencia de un amplio espectro de enfermedades provocadas por virtualmente todos los S. pneumoniae independientemente del serotipo capsular.

Los datos de las tablas 6 y 7 demuestran claramente que BVH-3 y BVH-11 eran, ambas, moléculas que inducen protección de S. pneumoniae. Sin embargo, no se conocía, si la protección se puede mediar mediante secuencias específicas que no se compartían sobre las moléculas de BVH-3 y BVH-11. Grupos de ratones hembras BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea trs veces a intervalos de tres semanas con o bien proteína de

5 fusión tioredoxina-His•Tag-BVH-3AD, -BVH-3B -BVH-3C purificada por afinidad en presencia de15 μg de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá). Se inmunizaron ratones de control con adyuvante QuilA solo en PBS o proteína de fusión tioredoxina-His•Tag o tioredoxina-His•Tagf (His-Thio) purificada por afinidad en presencia de Qui1A.

Para determinar la capacidad protectora de un conjunto de proteínas truncadas, denominadas NEW4, NEW5, NEW6,

10 NEW7, NEW8, NEW9, NEW10, NEW11, NEW14 y BVH-11B, grupos de ratones hembra BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea dos veecs a intervalos de tres semanas con 25 μg de cualquier proteína de fusiónHis•Tag-purificada por afinidad en presencia de 15 μg adyuvante QuilA. Diez a 14 días después de la última inmunización, los ratones se expusieron con S. pneumoniae virulento. Los resultados de los investigadores indican que, BVH-3B, una molécula de BVH-3 truncada de los aminoácidos 512 -1039, inducían protección contra las cepas

15 WU2 y P4241 virulentas para los ratones. De manera similar, moléculas BVH-11B, NEW4 y NEW5, tres moléculas de BVH-11 truncadas que constan de los aminoácidos 354 -840, aminoácidos 286 -840 y aminoácidos 286 -713, respectivamente, inducían protección contra la exposición intravenosa experimental con WU2 y exposición intranasal con P4241. Además, la vacunación con NEW10 y NEW14, que constan de los aminoácidos 272 -838 y aminoácidos 227 -699 de la molécula de BVH-11-2 también dio como resultado protección contra la muerte con las cepas

20 neumocócicas. Estos resultados indican que la región que comprende 428 aminoácidos que se extiende desde los aminoácidos 286 -713 y aminoácidos 272 -699 sobre S. pneumoniae SP64 BVH-11 y BVH-11-2 secuencias de proteínas, respectivamente, contiene epítopos protectores. Esta región está altamente conservada con una identidad global del 91% y 94% de homología entre trece secuencias de proteína de BVH-11.

Tabla 8. Evaluación de la protección inducida por la vacunación de ratones con los productos génicos de BVH-3 y25 BVH-11

Exposición a WU2: Exposición con P4241

Experimento: Inmunógeno Vivos : Muertos a Mediana de días de supervivencia Vivos : Muertos Mediana de días de supervivencia

1 b: Ninguno 0 : 8 1, 5 1 : 7 4,5

NEW4: 8 : 0 > 14 8 : 0 > 14

NEW5: 8 : 0 > 14 8 : 0 > 14

NEW7: 0 : 8 2 0 : 8 5

BVH-11M: 8 : 0 > 14 8 : 0 >14

2 b: Ninguno 0 : 8 1 0 : 8 4

NEW5: 8 : 0 > 14 8 : 0 > 14

NEW8: 0 : 8 1,5 0 : 8 5,5

NEW9: 3 : 5 3,5 2 : 6 7

BVH-11M: 8 : 0 > 14 8 : 0 >14

3 b: Ninguno 0 : 8 1 0 : 8 4

NEW6: 0 : 8 1 4 : 4 10,5 c

NEW10: 8 : 0 > 14 8 : 0 > 14

NEW11: 0 : 8 1,5 1 : 7 6

BVH-11M: 8 : 0 > 14 8 : 0 >14

4 b: Ninguno BVH-11B NEW14 0 : 8 7 : 1 8 : 0 2 > 14 > 14 0 : 8 8 : 0 8 : 0 4 > 14 >14

5: His-tio BVH-3AD BVH-3B 0 : 8 1 : 7 5 : 3 2 2,5 > 14

6: His-tio 0 : 8 1

BVH-3C: 0 . 8 1

a El número de ratones vivos : el número de ratones muertos el día 14 después de la exposición. b La dosis de exposición WU2 era 105 UFC. c A los ratones que viven más de 14 días se les asignaron un tiempo de supervivencia de 14 días para la determinación de valores medios.

Ejemplo 12

Este ejemplo describió la clonación y expresión de un gen quimérico que codifica un polipéptido quimérico que corresponde con la región carboxi terminal de BVH-3 en fusión en el extremo C’ de la región carboxi terminal deBVH-11 y la protección aditiva observada después de la vacunación con un polipéptido quimérico.

Está claro a partir de los estudios descritos anteriormente que BVH-3 y BVH-11 son serológicamente moléculas distintas presentes de manera simultánea sobre S. pneumoniae. Los resultados de estudios inmunológicos de ratones indicant que ambas proteínas son buenos candidatos de vacunas. Estas proteínas tienen el potencial deproporcionar protección contra todos los neumococos, independientemente del serotipo. Incluso aunque las dos proteínas comparten epítopos y secuencias, tienen características diferentes y pueden tener diferentes funciones biológicas. De este modo, la inmunización contra las dos proteínas puede proporcionar un nivel de protección mayor que la impartida por cada uno de ellos individualmente. Para examinar esto, varias avenidas donde BVH-3 delongitud completa o truncada y BVH-11 se administran en combinación o conjuntamente se pueden explorar. En el presente documento los inventores describen la modificación por ingeniería genética de un gen de fusión BVH-3BVH-11 y proteína, denominado NEW12 (SEC ID Nº76 y SEC ID Nº58, respectivamente), y el uso potencial de la proteína NEW12 como una vacuna. Los fragmentos génicos de BVH-3 y BVH-11 que corresponden al extremo de los genes se amplificaron mediante la PCR usando pares de oligonucleótidos modificados por ingeniería genética para amplificar los fragmentos que se extienden sobre los nucleótidos 1414 a 3117 (SEC ID Nº 1) y los nucleótidos 1060 a 2520 (SEC ID Nº 3) de los genes de BVH-3 y BVH-11 de S. pneumoniae cepa SP64, respectivamente. Los cebadores usados, HAMJ278 y HAMJ279; HAMJ282 y HAMJ283 tenían un sitio de endonucleasa de restricción en el extremo 5’, permitiendo por lo tanto la clonación direccional en fase del producto amplificado en el vector de plásmidopET21b(+) digerido (Tabla 2). Los productos amplificados por la PCR se digirieron por endonucleasas de restricción yse ligaron al vector pET21b(+) de pla´smido linealizado digerido de manera similar. Las construcciones de plásmido resultantes se confirmaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos. El plásmido pET21b(+) recombinante que contiene el producto NdeI-HindIII BVH-3 PCR se linealizó mediante digestión con las enzimas de restricción HindIII y NotI para la clonación en fase del fragmento de ADN HindIII-NotI obtenido a partir del vector pET21(+) recombinante que contiene el fragmento génico de BVH-11. Se estabilizaron primero los clones en E. coli DH5α・anets de la introducción en E. coli BL21(λDE3) para la expresión de una molécula de proteína neumocócica quimérica. El polipéptido quimérico recombinante, denominado NEW 12, se expresó como fusión C-terminal con una His-tag. Laproteína recombinante expresada NEW 12 se purificó a partir de las fracciones sobrenadantes obtenidas a partir de la centrifugación se cultivos de E. coli inducidos por IPTG usando una resina de quelación de metales His-Bind(QIAgen, Chatsworth, CA).

De acuerdo con el mismo procedimiento descrito anteriormente, es posible construir otros polipéptidos quiméricos, como resultado de la expresión simultánea de New 1 y New 4, New 1 y New 5, New 1 y New 10, o New 1 y New 14. La construcción puede ser con New 1 cadena arriba o cadena abajo de New 4, New 5, New 10, BVH-11B o New 14. También es posible construir otros polipéptidos quiméricos como resultado de de una expresión simultánea de más de dos fragmentos de cualesquiera de los genes de BVH-3, BVH-11 o BVH-11-2.

Grupos de 8 ratones hembra BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía subcutánea dos veecs a intervalos detres semanas con 25 μg de proteína de fusión His•Tag-NEW1, BVH-11B o NEW12 purificada por afinidad enpresencia de 15 μg de adyuvante QuilA. Diez a 14 días después de la última inmunización, los ratones se expusieron con S. pneumoniae virulento. Como se ha demostrado anteriormente, las moléculas de NEW1 y BVH-11B que comprenden los aminoácidos 472 a 1039 de la proteína de BVH-3 y los aminoácidos 354 -840 de la proteína BVH11, respectivamente, corresponden a las partes de las proteínas capaces de inducir una respuesta inmunológicaprotectora. Para determinar si un polipéptido quimérico mejorarían de manera significativa la protección comparado con los observados para los homólogos individuales, la dosis de desafío se ajustó de una manera que la protección no se esperaba con las moléculas de NEW1 y BVH-11B. De manera interesante, la proteína quimérica NEW12, indujo protección contra las cepas WU2 y P4241 virulentas para los ratones. Siete de 8 ratones inmunizados conNEW12 estaban todavía vivos después de 10 de la exposición mientras 28 de 32 ratones inmunizados con NEW1,BVH-11B, BVH-3M o adyuvante solo murieron 5 días después de la exposición. De este modo, la vacunación de ratones con NEW12 proporcionó el mayor grado de protección contra la exposición con WU2. Estos resultados indican que la inmunización con un polipéptido quimérico y posiblemente una combinación de los productos génicosBVH-3 y BVH-11 pueden proporcionar protección adicional a la obtenida mediante la administración de antígenosBVH-3 o BVH-11 solos.

Tabla 9. Evaluación de la protección inducida mediante vacunación de ratones con la molécula de NEW12 quimérica .

Inmunógeno: Vivos : Muertos a Mediana de días de supervivencia Vivos : Muertos Mediana de días de supervivencia

Ninguno NEW1 BVH-11B NEW12 BVH-3M: 0 : 8 2 : 6 1 : 7 6 : 2 1 : 7 1 2 3,5 > 14 3 0 : 8 1 : 7 8 : 0 7 : 1 8 : 1 5 8 > 14 >14 > 14

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra la identificación de secuencias relacionadas con BVH-3 y BVH-11 en las especies de estreptococos diferentes de S. pneumoniae.

5 Se ha mostrado previamente que BVH-3, BVH-11 y BVH-11-2 son una familia de las proteínas relacionaads que comparten secuencias comunes. Las investigaciones de homología se realizaron con la secuencia de nucleótidos dela región conservada de estos genes y se comparan con las secuencias del GenBank y EMBL usando FASTA. La homología más significativa se observó con un gen de 2.469-kb que codifica una proteína calculada de 92-kDa (SEC ID Nº 81) de función desconocida en S. agalactiae también llamado grupo B de streptococcus o GBS. El gen se

10 denominó BVH-71. Una proteína que demuestra un 99,2% de identidad y 99.5% de similitud con la de GBS también se identificó en S. pyogenes también llamado grupo A de Streptococcus o GAS (SEC ID Nº 83). La región 5’ de las secuencias BVH-71 (SEC ID Nº 80 y SEC ID Nº 82), que se extienden sobre los nucleótidos 1 a 717, demostró un 58y 60% de identidad con las regiones conservadas de los genes de BVH-3 (nucleótidos 1 a 675) y BVH-11(nucleótidos 1 a 684) respectivamente. Los primeros 239 aminoácidos de las secuencias traducidas de los marcos de

15 lectura abiertos de GBS y GAS BVH-71 son un 51 y 54 % idénticos a 225 y 228 aminoácidos de BVH-3 y BVH-11, respectivamente. Además de las similitudes estructurales, las proteínas de estreptococos BVH-3, BVH-11 y BVH-71también comparten epítopos antigénicos. Se reveló una banda de 97-kDa en las transferencias de Western de GAS o GBS cuyas células, que usan Mab H11-1.1-G11 reactivos con las regiones conservadas de BVH-3 y BVH-11. De manera similar, las proteínas recombinantes de BVH-71 GAS y GBS se detectaron en análisis de

20 inmunotransferencia de tipo Western .

Estos resultados indican que las proteínas de BVH-71, BVH-3 y BVH-11 podrían compartir funciones similares. Los resultados de los investigadores también sugieren que las proteínas de BVH-71 se pueden usar como componentes de vacunas de proteínas de vacunas anti-GAS o anti-GBS.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BIOCHEM PHARMA INC. HAMEL, Josée BRODEUR, Bernard R. PINEAU, Isabelle

5 MARTIN, Denis RIOUX, Clément CHARLAND, Nathalie

<120> NUEVOS ANTÍGENOS DE ESTREPTOCOCOS

<130> 12806-11PCT 10 <150> US 60/113,800

<151> 1998-12-23

<160> 102

<170> FastSEQ for Windows Versión 3.0

<210> 1 15 <211> 3120

<212> ADN

<220>

<400> 1

<210> 2

<211> 1039

<212> PRT

<400> 2

<210> 3

<211> 2523

<212> ADN

<213> S. pneumoniae

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(2520)

<223> Región de codificación del gen BVH-11

<400> 3

<210> 4

<211> 840

<212> PRT

<400> 4

<210> 5

<211> 1581

<212> ADN

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1578)

<400> 5

<210> 6

<211> 526

<212> PRT

<400> 6

<210> 7

<211> 1455

<212> ADN

<213> S. pneumoniae

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1452)

<400> 7

<210> 8

<211> 484

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 8

<210> 9

<211> 1587

<212> ADN

<213> S pneumoniae

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1584)

<400> 9

<210> 10

<211> 528

<212> PRT

<213> S pneumoniae

<400> 10

<210> 11

<211> 5048

<212> ADN

<213> S. pneumoniae

<400> 11

<210> 12

<211> 2647

<212> ADN

<400> 12

<210> 13

<211> 2639

<212> ADN

<220>

<221> CDS

<222> (114)...(2627)

<400> 13

<210> 14

<211> 838

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 14

<210> 15

<211> 2528

<212> ADN

<213> S. pneumoniae

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(2520)

<400> 15

<210> 16

<211> 840

<212> PRT

<400> 16

<210> 17

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para

<400> 17

cagtagatct gtgcctatgc actaaac: 27

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 18

gatctctaga ctactgctat tccttacgct atg: 33

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 19

atcactcgag cattacctgg ataatcctgt: 30

<210> 20 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> ctgctaagct tatgaaagat ttagat 26: 20

<210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 21 gatactcgag ctgctattcc ttac 24

<210> 22 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 22 gaatctcgag ttaagctgct gctaattc 28

<210> 23 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 23 gacgctcgag cgctatgaaa tcagataaat tc 32

<210> 24 <211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 24

gacgctcgag ggcattacct ggataatcct gttcatg: 37

<210> 25

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 25

cagtagatct cttcatcatt tattgaaaag agg: 33

<210> 26

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 26

ttatttcttc catatggact tgacagaaga gcaaattaag: 40

<210> 27

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 27

cgccaagctt cgctatgaaa tcagataaat tc: 32

<210> 28

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 28

cgccaagctt ttccacaata taagtcgatt gatt: 34

<210> 29

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 29

ttatttcttc catatggaag tacctatctt gaga: 40

<210> 30

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 30

ttatttcttc catatggtgc ctatgcacta aaccagc: 37

<210> 31

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 31

ataagaatgc ggccgcttcc acaatataag tcgattgatt: 40

<210> 32

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 32

cagtagatct gtgcttatga actaggtttg c: 31

<210> 33

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 33

gatcaagctt gctgctacct ttacttactc tc: 32

<210> 34

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 34

ctgagatatc cgttatcgtt caaacc: 26

<210> 35

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 35

ctgcaagctt ttaaagggga ataatacg: 28

<210> 36

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 36

cagtagatct gcagaagcct tcctatctg: 29

<210> 37

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 37

tcgccaagct tcgttatcgt tcaaaccatt ggg: 33

<210> 38

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 38

ataagaatgc ggccgcctta ctctccttta ataaagccaa tagtt: 45

<210> 39

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 39

catgccatgg acattgatag tctcttgaaa cagc: 34

<210> 40

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 40

cgccaagctt cttactctcc tttaataaag ccaatag: 37

<210> 41

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 41

cgacaagctt aacatggtcg ctagcgttac c: 31

<210> 42

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 42

cataccatgg gcctttatga ggcacctaag: 30

<210> 43

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 43

cgacaagctt aagtaaatct tcagcctctc tcag: 34

<210> 44

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 44

gataccatgg ctagcgacca tgttcaaaga a: 31

<210> 45

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 45

cgccaagctt atcatccact aacttgactt tatcac: 36

<210> 46 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 46 cataccatgg atattcttgc cttcttagct ccg: 33

<210> 47 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 47 catgccatgg tgcttatgaa ctaggtttgc: 30

<210> 48 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 48 cgccaagctt tagcgttacc aaaaccatta tc: 32

<210> 49 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 49 gtattagatc tgttcctatg aacttggtcg tcacca: 36

<210> 50 <211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 50

cgcctctaga ctactgtata ggagccgg: 28

<210> 51

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 51

catgccatgg aaaacatttc aagcctttta cgtg: 34

<210> 52

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 52

cgacaagctt ctgtatagga gccggttgac tttc: 34

<210> 53

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 53

catgccatgg ttcgtaaaaa taaggcagac caag: 34

<210> 54

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico para PCR

<400> 54 catgccatgg aagcctattg gaatgggaag

<210> 55

<211> 1019

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 55

<210> 56

<211> 489

<212> PRT

<400> 56

<210> 57

<211> 509

<212> PRT

<400> 57

<210> 58

<211> 1057

<212> PRT

<400> 58

<210> 59

<211> 205

<212> PRT

<400> 59

<210> 60

<211>: 821 10 <212> PRT

<213>: S. pneumoniae

<400> 60

<210> 61

<211> 334

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 61

<210> 62

<211> 487

<212> PRT

<400> 62

<210> 63

<211> 613

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 63

<210> 64

<211> 568

<212> PRT

<400> 64

<210> 65

<211> 329

<212> PRT

<400> 65

<210> 66

<211> 240

<212> PRT

<400> 66

<210> 67

<211>: 555 10 <212> PRT

<213>: S. pneumoniae

<400> 67

<210> 68

<211> 428

<212> PRT

<400> 68

<210> 69

<211> 121

<212> PRT

<400> 69

<210>: 70 10 <211> 132

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 70

<210> 71

<211> 226

<212> PRT

<400> 71

<210> 72

<211> 203

<212> PRT

<400> 72

<210> 73

<211> 819

<212> PRT

<400> 73

<210> 74

<211> 568

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 74

<210> 75

<211> 140

<212> PRT

<400> 75

<210> 76

<211> 3171

<212> ADN

<400> 76

<210> 77

<211> 473

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 77

<210> 78

<211> 780

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 78

<210> 79

<211> 690

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 79

<210> 80

<211> 2469

<212> ADN

<400> 80

<210> 81

<211> 823

<212> PRT

<400> 81

<210> 82

<211> 2472

<212> ADN

<400> 82

<210> 83

<211> 824

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 83

<210> 84

<211> 1019

<212> PRT

<400> 84

<210> 85

<211> 1019

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 85

<210> 86

<211> 1019

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 86

<210> 87

<211> 1019

<212> PRT

<400> 87

<210> 88

<211> 1019

<212> PRT

<400> 88

<210> 89

<211> 1019

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 89

<210> 90

<211> 819

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 90

<210> 91

<211> 820

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 91

<210> 92

<211> 816

<212> PRT

<400> 92

<210> 93

<211> 816

<212> PRT

<400> 93

<210> 94

<211> 816

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 94

<210> 95

<211> 834

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 95

<210> 96

<211> 811

<212> PRT

<400> 96

<210> 97

<211> 811

<212> PRT

<400> 97

<210> 98

<211> 811

<212> PRT

<400> 98

<210> 99

<211> 811

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 99

<210> 100

<211> 805

<212> PRT

<213> S. pneumoniae

<400> 100

<210> 101

<211> 807

<212> PRT

<400> 101

<210> 102

<211> 821

<212> PRT

<400> 102

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene:

a) al menos un 95 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia elegida de las: SEC ID Nº: 4,58, 60, 61, 63, 73 a 75 o 79;o

b) más de un 99 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia elegida de las: SEC ID Nº: 14,67 o 68; y

c) en el que el polinucleótido no codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID Nº 5 del documento WO00/17370, SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 o SEC ID Nº 194 del documento WO 00/06737; y

d) en el que el polipéptido produce una respuesta inmunológica antiestreptocócica cuando se administra a unindividuo.
2.

Un polinucleótido aislado que es complementario al polinucleótido de la reivindicación 1.
3.

Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido está unido deforma operable a una región de control de expresión.
4.

Una célula huésped transfectada con el vector de la reivindicación 3.
5.

Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con lareivindicación 4 en condiciones adecuados para la expresión de dicho polipéptido.
6.

Un polipéptido aislado que tiene:

a) más de un 95 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de las: SEC ID Nº: 4, 58, 60, 61, 63, 73 a 75 o 79 o;

b) más de un 99 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia elegida de las: SEC ID Nº: 14,67 o 68; y

c) en el que el polipéptido no es la SEC ID Nº 5 del documento WO 00/17370, SEC ID Nº 4 del documento WO00/37105 o SEC ID Nº 194 del documento WO 00/06737; y d) en el que el polipéptido produce una respuesta inmunológica antiestreptocócica cuando se administra a un individuo.
7.

Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que tiene más de un 99 % de identidad con la secuencia de un segundo polipéptido elegida de las: SEC ID Nº 14, 4, 60 o 73.
8.

Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que tiene más de un 99 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 14.
9.

Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que tiene más de un 99 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 73.
10.

Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de entre las SEC ID Nº 14, 4, 58, 60 A 63, 67, 68, 73 A 75, 77, 79, y en el que el polipéptido produce una respuesta inmunitaria antiestreptocócica.
11.

Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la Met en N-terminal está delecionada.
12.

Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia secretora de aminoácidos está delecionada.
13.

Un polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que el polipéptidoaislado es un polipéptido recombinante.
14.

Un polipéptido quimérico que comprende dos o más polipéptidos elegidos de las SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79 o un polipéptido que tiene más de un 90 % de identidad del mismo, con la condición de que los polipéptidos estén unidos de modo que formen un polipéptido quimérico en el que el polipéptido produce una respuesta inmunológica antiestreptocócica cuando se administra a un individuo.
15.

Un polipéptido quimérico de fórmula (I):

A-(B)m-(C)n-D (I) en la que mes 0 o1, nes0 o1, A está seleccionado de las SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; B está seleccionado de las SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; C está seleccionado de las SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79; y

D se selecciona de las SEC ID Nº: 14, 4, 56 a 63, 67 a 75, 77, 79, en el que el polipéptido produce una respuesta inmunológica antiestreptocócica cuando se administra a un individuo.
16. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15 y a un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

5 17. Una composición de vacuna que comprende una cantidad profláctica o terapéutica del polipéptido aislado que tiene a) más de un 95 % de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las: SEC ID Nº 4, 58, 60, 61, 63, 73 a 75 o 79 o b)más más de un 99 % de identidad con un segundopolipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de las: SEC ID Nº 14, 67 o 68, en el que elpolipéptido no es la SEC ID Nº 5 del documento WI 00/17370, la SEC ID Nº 4 del documento WO 00/37105 o la SEC

10 ID Nº 194 del documento WO00/06737; y en el que el polipéptido produce una respuesta inmunitaria antiestreptocócica cuando se administra a un individuo, y un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por estreptococos en un animal susceptible a, o infectado con, una infección por estreptococos.

(SEC ID Nº1) FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4

FIGURA 5

FIGURA 6

FIGURA 7 FIGURA 8

FIGURA 9

FIGURA 10

FIGURA 11

FIGURA 12

FIGURA 14 FIGURA 15 FIGURA 16 FIGURA 17 FIGURA 18

FIGURA 19

FIGURA 20 FIGURA 21

FIGURA 22

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FIGURA 29

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FIGURA 32

FIGURA 33

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FIGURA 37

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FIGURA 39 FIGURA 40 FIGURA 41

FIGURA 42

FIGURA 43

FIGURA 44 FIGURA 45 FIGURA 46 FIGURA 47 FIGURA 48