KR20150093838A - 면역원성을 평가하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는, 하나 이상의 항원들에 대해 반응성인 숙주에서 약물 제제의 효력을 검출하고/하거나 항체를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 개시는, 약물 제품의 효력을 검출하고/하거나 하나 이상의 항원에 대해 반응성인 숙주에서 항체를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
항원(예를 들면, 백신)을 함유하는 약물 제품의 효력은 전형적으로 약물 제품 내의 면역원성 항원("온전한" 약물 제품)의 존재에 의존한다. 상기 약물 제품의 품질(예를 들면, 이것이 충분한 양 또는 충분한 품질의 항원을 함유하는지의 여부)은 확인하기 어려울 수 있다. 유사하게, 전형적으로 임상 시험을 수행하지 않고 보호 백신을 동정하는 것은 어렵다. 단순하고 정확한 시험관내 검정의 이용가능성은 상기 과제를 해결할 것이다.
미생물의 세포 표면 상의 세균 세포 표면 항원에 대한 항체의 검출을 제공하는 검정 시스템이 기술되었다. 예를 들면, WO 2011/014947(2011년 2월 10일 공개(2010년 7월 30일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 제13/388,042호에 상응함))은, 온전한 세포 상의 다양한 피. 진지발리스(P. gingivalis) 단백질의, 상응하는 재조합 단백질에 대해 생성된 마우스 모노클로날 항체에의 접근능을 측정하기 위한 유동 세포측정 표면 접근능 검정을 기술한다. 유사하게, WO 2011/075823 A1 (2011년 6월 30일 공개(2010년 12월 20일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 제13/515,093호에 상응함))은, 사람 정제된 모노클로날 항체(PspA에 대해), 정제된 래빗 항원-특이적 항체(PhtD 및 PcpA에 대해) 및 생존 세균을 사용한 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 항원 PspA, PhtD 및 PcpA(단독으로 또는 조합으로)를 동정하기 위한 유동 세포측정 표면 접근능 검정을 기술한다. 이들 검정 시스템을 사용하여, 정제된 재조합 단백질에 대해 동물에서 생성된 항체 또는 상기 단백질에 대해 특이적인 정제된 사람 모노클로날 항체가 생존 세균 표면 상의 천연 및 온전한 단백질에 결합할 수 있고 유동 세포측정기에 의해 검출될 수 있음을 보여주었다. 본 개시는, 항원 양 및/또는 약물 제품의 품질 및/또는 백신의 보호 잠재력이 확인될 수 있도록 경쟁 단계를 포함함으로써, 공지되어 있는 검정 시스템을 개선시키는 검정 시스템을 기술한다. 본 개시는, 또한, 사람에서 백신 면역원성 및/또는 효능을 측정하는 전형적인 검정 시스템에 대한 대용으로서의 SASSY의 놀라운 용도를 기술한다. 상기 검정 시스템의 다양한 실시형태는 본원에 기술되어 있다.
도 1. PcpA 차단 연구의 그래픽 결과. 항-PcpA 폴리클로날 혈청은, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 10μg/용량으로 래빗을 근육내 면역화시키고 인산염 처리된 AIOOH로 제형화된 온전한 PcpA로 2회 부스팅함으로써 생성되었고, 10% 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 혈청은, 온전하거나 AIOOH의 탈착 후 스트레스 받은 PcpA 단백질의 적정액(10μg/mL로부터 출발하여 1:2 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 2. 항- PcpA 모노클로날 항체와의 경쟁 SASSY의 그래픽 결과. 항-PcpA 모노클로날 항체(1-12, 1-29, 2B3, 6A4, 및 9G11)의 혼주를, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 각각 5μg/mL의 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 모노클로날 항체는 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 단백질의 적정액(10μg/mL(최종 농도)에서 출발하여 7:10 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 3. 항- PhtD 폴리클로날 혈청을 사용한 경쟁 SASSY의 그래픽 결과. 항-PhtD 폴리클로날 혈청은, 인산염 처리된 AIOOH와 함께 온전한 PhtD 제형으로 래빗을 근육내 면역화시킴으로써 생성되었고, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 5% 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 혈청은, 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 단백질의 적정액(10μg/mL(최종 농도)에서 출발하여 7:10 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 4. 항- PhtD 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 Sassy의 그래픽 결과. 항-PhtD 모노클로날 항체(3C, 4D5, 5B7, 6B7, 8G4 및 8H6)의 혼주를, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 각각 2.5㎍/mL의 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 모노클로날 항체는, 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 단백질의 적정액(10μg/mL 최종 농도에서 출발하여 7:10 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 5. 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 제형으로 면역화된 래빗 유래의 혈청 적정의 그래픽 결과. 항-PcpA 혈청은, 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 제형으로 래빗을 면역화시킴으로써(43 내지 47℃에서 1주 또는 6주) 생성되었다. 각각의 그룹으로부터 혼주된 혈청을, 본원에 기술되는 바와 같은 SASSY에서 1:2 희석 인자로 적정하였다.
도 6. 수동 보호에서 온전하거나 스트레스 받은 1가의 PcpA 제형으로 면역화된 래빗 유래의 희석된 항- PcpA 혈청이 주사된 마우스의 생존을 도시하는 막대 그래프. 2개의 연구에서, 1 또는 6주 동안 43 내지 47℃에서 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 단백질 제형으로 면역화된 래빗으로부터 수득된 항-PcpA 혈청은, 본원에 기술되는 바와 같은 수동 보호 모델의 CBA/n 마우스에서 시험하였다. 혈청은 하기에 나타내는 농도로 희석하였고(PBS는 대조군으로서 사용하였다) CBA/N 마우스를 수동으로 i.p. 면역화시키기 위해 사용하였고 50cfu의 A66.1Mn -는 수동 면역화 1시간 후에 i.v. 전달하였다. 상기 두 연구로부터 생존율을 조합하여 플롯팅하였다.
도 7. 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 제형으로 면역화된 래빗 유래의 혈청의 적정의 그래픽 결과. 항-PhtD 혈청은, 래빗을 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 제형으로 면역화시킴으로써(43 내지 47℃에서 1주 또는 6주) 생성되었다. 각각의 그룹으로부터 혼주된 혈청은 본원에 기재술되는 바와 같은 SASSY에서 1:2 희석 인자로 적정하였다.
도 8. 수동 보호에서 온전하거나 스트레스 받은 1가의 PhtD 제형으로 면역화된 래빗 유래의 희석된 항- PhtD 혈청이 주사된 마우스의 생존을 도시하는 막대 그래프. 2개의 연구에서, 1주 또는 6주 동안 43 내지 47℃에서 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 1가의 제형으로 면역화된 래빗으로부터 수득된 항-PhtD 혈청은, 본원에 기술되는 바와 같은 수동 보호 모델의 CBA/N 마우스에서 시험하였다. 혈청은, 하기 나타낸 농도로 희석하였고(PBS는 대조군으로서 사용하였다) CBA/N 마우스를 수동으로 i.p. 면역화시키기 위해 사용하였고 50cfu의 A66.1Mn -는 수동 면역화 1시간 후에 i.v. 전달하였다. 상기 두 연구로부터 생존율을 조합하여 플롯팅하였다.
도 9. SASSY와 수동 보호 동시 연구로부터의 대표적인 결과. SASSY와 수동 보호 동시 연구는 3개의 연구에서 수행하였다. 혼주된 항-PcpA 모노클로날 항체(1-12, 1-29, 2B3, 6A4, 및 9G11)는 1:2 희석 인자로 20㎍/mL 최종 농도에서 출발하여 적정하였다. 생존은 각각의 그룹에 대해 SASSY로부터의 MFI 신호를 따라 플롯팅하였다. 하나의 연구로부터 대표적인 결과를 나타낸다. 총 5개의 상이한 농도를 시험하였다.
도 10. SASSY와 수동 호보 검정 사이의 상호관계를 도시하는 플롯. 항체로 예비-항온처리된 A66.1의 4개의 독립적인 조제를 수행하였고, SASSY와 수동 보호 사이의 상호 관계는, 스피어맨 계수(Spearman Coefficient)를 사용하여 평가하였다. R2가 0.963인, 시험관내 및 생체내 검정 둘 다 사이에 매우 강한 상호관계가 존재하였다.
도 11. PcpA 제형의 생물학적 활성 및 안정성을 평가하기 위한 시험관내 경쟁 SASSY의 용도. 분해된 PcpA 단백질은, 경쟁 SASSY가 기능성 판독에 결부될 수 있는지를 결정하기 위해 경쟁 SASSY와 수동 보호 둘 다에서 시험하였다. 분해된 단백질은 우선 실온에서 모노클로날 항체와 함께 항온처리하였고 A66.1의 신선한 배양물을 각각의 샘플에 첨가하여 MFI를 검출함으로써 마우스에서의 생존율과 결합 둘 다를 모니터링하였다.
도 12. 레퍼토리 확대를 검출하기 위한 SASSY의 용도. SASSY가 레퍼토리 확대를 검출하기 위해 사용될 수 있는지를 결정하기 위해, 2개의 모노클로날 항체(4D5 및 8H6)를 단독으로 및 동시에 사용하여 MIF를 측정하였다. 2중 포인트(시리즈 1 및 2)를 설명하고 3개의 독립적인 연구를 대표한다.
도 13. 사람 대상체 유래의 혈청을 사용한 SASSY. SASSY 결과가 사람에서 생체내 면역화 연구와 상호관련되는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 임상 시험에 입회되고 기능성 PhtD-특이적 항체를 함유하는 것으로 공지되어 있는 사람 대상체 유래의 혈청을 SASSY에서 시험하였다. 대상체 #37의 대표적인 플롯은, Bld3이 후-백신 혈청을 나타내고 Bld1이 이전-백신 혈청을 나타냄을 보여준다.
도 14. 면역원성 PhtD 펩타이드의 동정. 대상체 #37 유래의 채혈 1(Bld1) 대 채혈 3(Bld3) 혈청은, 프로어레이(ProArray) 펩타이드 마이크로어레이 (ProImmune)을 사용하여 PhtD 및 PhtE 단백질에 걸쳐 15량체 중첩 펩타이드에 대한 결합에 관해 스크리닝하였다. 양성 신호는, 10K LU 이상을 갖는 것으로 고려되었고, 10K LU 초과의 쌍만을 나타낸다. 유의한 차이는 3배 이상의 증가(별표)를 갖는 것으로 고려되고, 이는, Bld3에서 잠재적으로 새로운 항체 에피토프 인식을 나타낸다.
[발명의 내용]
본 개시의 요약
약물 제품을 특성확인하기 위한 방법이 본원에 개시되어 있고, 상기 방법은, 하나 이상의 세포 표면 항원들을 포함하는 약물 제품을, 상기 항원들 중 하나 이상에 대해 반응성인 항체들을 포함하는 항체 조성물과 접촉시켜 시험 조성물을 제조하고, 상기 시험 조성물을, 상기 세포 표면 항원들 중 하나 이상을 발현하는 시험 세포(예를 들면, 미생물)와 접촉시키고, 상기 시험 세포에 대한 항체들의 결합을 검출함을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 약물 제품들을 별도로 검정함으로써 수득된 결과들을 서로 비교하고/하거나 대조군 약물 제품과 비교하여 임의의 상기 약물 제품들이 대상체(예를 들면, 사람)에게 투여하기에 적합한지를 결정할 수 있다. 본 개시는, 또한, 사람에서 백신 면역원성 및/또는 효능을 측정하는 전형적인 검정 시스템에 대한 대용으로서 SASSY의 놀라운 용도를 기술한다.
도 2. 항- PcpA 모노클로날 항체와의 경쟁 SASSY의 그래픽 결과. 항-PcpA 모노클로날 항체(1-12, 1-29, 2B3, 6A4, 및 9G11)의 혼주를, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 각각 5μg/mL의 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 모노클로날 항체는 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 단백질의 적정액(10μg/mL(최종 농도)에서 출발하여 7:10 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 3. 항- PhtD 폴리클로날 혈청을 사용한 경쟁 SASSY의 그래픽 결과. 항-PhtD 폴리클로날 혈청은, 인산염 처리된 AIOOH와 함께 온전한 PhtD 제형으로 래빗을 근육내 면역화시킴으로써 생성되었고, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 5% 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 혈청은, 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 단백질의 적정액(10μg/mL(최종 농도)에서 출발하여 7:10 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 4. 항- PhtD 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 Sassy의 그래픽 결과. 항-PhtD 모노클로날 항체(3C, 4D5, 5B7, 6B7, 8G4 및 8H6)의 혼주를, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 각각 2.5㎍/mL의 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다. 희석된 모노클로날 항체는, 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 단백질의 적정액(10μg/mL 최종 농도에서 출발하여 7:10 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
도 5. 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 제형으로 면역화된 래빗 유래의 혈청 적정의 그래픽 결과. 항-PcpA 혈청은, 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 제형으로 래빗을 면역화시킴으로써(43 내지 47℃에서 1주 또는 6주) 생성되었다. 각각의 그룹으로부터 혼주된 혈청을, 본원에 기술되는 바와 같은 SASSY에서 1:2 희석 인자로 적정하였다.
도 6. 수동 보호에서 온전하거나 스트레스 받은 1가의 PcpA 제형으로 면역화된 래빗 유래의 희석된 항- PcpA 혈청이 주사된 마우스의 생존을 도시하는 막대 그래프. 2개의 연구에서, 1 또는 6주 동안 43 내지 47℃에서 온전하거나 스트레스 받은 PcpA 단백질 제형으로 면역화된 래빗으로부터 수득된 항-PcpA 혈청은, 본원에 기술되는 바와 같은 수동 보호 모델의 CBA/n 마우스에서 시험하였다. 혈청은 하기에 나타내는 농도로 희석하였고(PBS는 대조군으로서 사용하였다) CBA/N 마우스를 수동으로 i.p. 면역화시키기 위해 사용하였고 50cfu의 A66.1Mn -는 수동 면역화 1시간 후에 i.v. 전달하였다. 상기 두 연구로부터 생존율을 조합하여 플롯팅하였다.
도 7. 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 제형으로 면역화된 래빗 유래의 혈청의 적정의 그래픽 결과. 항-PhtD 혈청은, 래빗을 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 제형으로 면역화시킴으로써(43 내지 47℃에서 1주 또는 6주) 생성되었다. 각각의 그룹으로부터 혼주된 혈청은 본원에 기재술되는 바와 같은 SASSY에서 1:2 희석 인자로 적정하였다.
도 8. 수동 보호에서 온전하거나 스트레스 받은 1가의 PhtD 제형으로 면역화된 래빗 유래의 희석된 항- PhtD 혈청이 주사된 마우스의 생존을 도시하는 막대 그래프. 2개의 연구에서, 1주 또는 6주 동안 43 내지 47℃에서 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 1가의 제형으로 면역화된 래빗으로부터 수득된 항-PhtD 혈청은, 본원에 기술되는 바와 같은 수동 보호 모델의 CBA/N 마우스에서 시험하였다. 혈청은, 하기 나타낸 농도로 희석하였고(PBS는 대조군으로서 사용하였다) CBA/N 마우스를 수동으로 i.p. 면역화시키기 위해 사용하였고 50cfu의 A66.1Mn -는 수동 면역화 1시간 후에 i.v. 전달하였다. 상기 두 연구로부터 생존율을 조합하여 플롯팅하였다.
도 9. SASSY와 수동 보호 동시 연구로부터의 대표적인 결과. SASSY와 수동 보호 동시 연구는 3개의 연구에서 수행하였다. 혼주된 항-PcpA 모노클로날 항체(1-12, 1-29, 2B3, 6A4, 및 9G11)는 1:2 희석 인자로 20㎍/mL 최종 농도에서 출발하여 적정하였다. 생존은 각각의 그룹에 대해 SASSY로부터의 MFI 신호를 따라 플롯팅하였다. 하나의 연구로부터 대표적인 결과를 나타낸다. 총 5개의 상이한 농도를 시험하였다.
도 10. SASSY와 수동 호보 검정 사이의 상호관계를 도시하는 플롯. 항체로 예비-항온처리된 A66.1의 4개의 독립적인 조제를 수행하였고, SASSY와 수동 보호 사이의 상호 관계는, 스피어맨 계수(Spearman Coefficient)를 사용하여 평가하였다. R2가 0.963인, 시험관내 및 생체내 검정 둘 다 사이에 매우 강한 상호관계가 존재하였다.
도 11. PcpA 제형의 생물학적 활성 및 안정성을 평가하기 위한 시험관내 경쟁 SASSY의 용도. 분해된 PcpA 단백질은, 경쟁 SASSY가 기능성 판독에 결부될 수 있는지를 결정하기 위해 경쟁 SASSY와 수동 보호 둘 다에서 시험하였다. 분해된 단백질은 우선 실온에서 모노클로날 항체와 함께 항온처리하였고 A66.1의 신선한 배양물을 각각의 샘플에 첨가하여 MFI를 검출함으로써 마우스에서의 생존율과 결합 둘 다를 모니터링하였다.
도 12. 레퍼토리 확대를 검출하기 위한 SASSY의 용도. SASSY가 레퍼토리 확대를 검출하기 위해 사용될 수 있는지를 결정하기 위해, 2개의 모노클로날 항체(4D5 및 8H6)를 단독으로 및 동시에 사용하여 MIF를 측정하였다. 2중 포인트(시리즈 1 및 2)를 설명하고 3개의 독립적인 연구를 대표한다.
도 13. 사람 대상체 유래의 혈청을 사용한 SASSY. SASSY 결과가 사람에서 생체내 면역화 연구와 상호관련되는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 임상 시험에 입회되고 기능성 PhtD-특이적 항체를 함유하는 것으로 공지되어 있는 사람 대상체 유래의 혈청을 SASSY에서 시험하였다. 대상체 #37의 대표적인 플롯은, Bld3이 후-백신 혈청을 나타내고 Bld1이 이전-백신 혈청을 나타냄을 보여준다.
도 14. 면역원성 PhtD 펩타이드의 동정. 대상체 #37 유래의 채혈 1(Bld1) 대 채혈 3(Bld3) 혈청은, 프로어레이(ProArray) 펩타이드 마이크로어레이 (ProImmune)을 사용하여 PhtD 및 PhtE 단백질에 걸쳐 15량체 중첩 펩타이드에 대한 결합에 관해 스크리닝하였다. 양성 신호는, 10K LU 이상을 갖는 것으로 고려되었고, 10K LU 초과의 쌍만을 나타낸다. 유의한 차이는 3배 이상의 증가(별표)를 갖는 것으로 고려되고, 이는, Bld3에서 잠재적으로 새로운 항체 에피토프 인식을 나타낸다.
[발명의 내용]
본 개시의 요약
약물 제품을 특성확인하기 위한 방법이 본원에 개시되어 있고, 상기 방법은, 하나 이상의 세포 표면 항원들을 포함하는 약물 제품을, 상기 항원들 중 하나 이상에 대해 반응성인 항체들을 포함하는 항체 조성물과 접촉시켜 시험 조성물을 제조하고, 상기 시험 조성물을, 상기 세포 표면 항원들 중 하나 이상을 발현하는 시험 세포(예를 들면, 미생물)와 접촉시키고, 상기 시험 세포에 대한 항체들의 결합을 검출함을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 약물 제품들을 별도로 검정함으로써 수득된 결과들을 서로 비교하고/하거나 대조군 약물 제품과 비교하여 임의의 상기 약물 제품들이 대상체(예를 들면, 사람)에게 투여하기에 적합한지를 결정할 수 있다. 본 개시는, 또한, 사람에서 백신 면역원성 및/또는 효능을 측정하는 전형적인 검정 시스템에 대한 대용으로서 SASSY의 놀라운 용도를 기술한다.
항원들(예를 들면, 백신)을 함유하는 약물 제품의 효력은 전형적으로 약물 제품 내의 면역원성 항원들("온전한" 약물 제품)의 존재에 의존한다. 따라서, 약물 제품의 효력이 영향을 받을 수 있기 때문에 숙주에게 투여하기 전에 약물 제품에 존재하는 항원들의 품질을 이해하는 것이 중요하다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 과제는, 하나 이상의 세포 표면 항원들을 포함하는 약물 제품(예를 들면, 시험 약물 제품)을 상기 항원들 중 하나 이상에 대해 반응성인 항체들을 포함하는 조성물(예를 들면, 항체 조성물)과 접촉시켜 시험 조성물(예를 들면, 비결합 항체를 잠재적으로 함유함)을 생성시키는 단계, 상기 시험 조성물을 상기 세포 표면 항원들 중 하나 이상을 발현하는 시험 세포(예를 들면, 미생물, 종양 세포, 바이러스를 포함하여 이로써 하나 이상의 바이러스 항원들을 발현하는 세포 또는 하나 이상의 항원들을 발현하도록 조작된 재조합 세포)와 접촉시키는 단계; 및 상기 시험 세포에 결합된 약물 제품에서(예를 들면, 시험 조성물에서) 항원에 대해 임의의 비결합 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 시험관내 검정에 의해 해결된다. 일부 실시형태에서, 상기 검정은, 항원들을 포함하는 약물 제품을, "온전한" 형태로 존재하는 약물 제품 중의 모든 또는 실질적으로 모든 항원들에 결합하기에 충분한 양의 항체를 포함하는 항체 조성물과 접촉시키는 "예비-항온처리" 단계를 포함함으로써 수행할 수 있다. "온전한" 형태로의 약물 제품은 전형적으로 유효량의 약물(예를 들면, 적합한 양 및 형태의 항원)을 함유하여 상기 약물 제품이 투여되는 숙주에서 치료학적(또는 예방학적) 반응을 생성시킨다. 대조적으로, 분해된(또는 실시예에서와 같이 "스트레스 받은") 약물 제품은, 유효량 미만의 약물(예를 들면, 적합한 정도 미만의 양 및 형태의 항원)을 함유하여 상기 약물 제품이 투여된 숙주에서 치료학적 (또는 예방학적) 반응을 생성시킨다. 예를 들면, 온전한 백신은 전형적으로 보호 면역 반응을 생성시키고, 한편, 분해된 백신은 상기 반응을 생성시키지 못한다. 온전한 약물 제품(예를 들면, 백신)과의 항온처리 후, (예를 들면, 상기 항체 조성물 중에 모든 또는 실질적으로 모든 항체는 약물 제품 중의 항원에 결합되어 있으므로) 시험 세포의 세포 표면 항원에 결합하기 위해 상기 시험 조성물 중에서 이용가능한 항체(예를 들면, 비결합 항체)는 거의 없거나 전혀 없다. 대조적으로, 상기 약물 제품(예를 들면, 백신)이 분해되는 경우, 항체 조성물 중의 모든 또는 실질적으로 모든 항체는 예비 항온처리 후 약물 제폼에서 항원에 결합되어 있지 않고(예를 들면, 약물 제품 중의 항원의 일부 또는 전부가 분해되므로) 상기 시험 세포에 결합하기 위해 이용가능할 것이다. 상기 시험 세포에 대한 항체들의 결합은, 유동 세포측정기(예를 들면, 여기서, 시험 세포는 용액 중에 존재함)와 같은 임의의 적합한 기술에 의해 또는 시험 세포가 고형 표면에 부착된 다른 방법에 의해 측정할 수 있다. 시험 세포는 고형 지지체(예를 들면, 비드)에 부착되고 유동 세포측정기를 사용하여 분석될 수 있음에 주의한다. 상기 적용에서, 상기 약물 제품/항체 복합체를 세척 제거하여 검출된 항체만이 상기 미생물에 결합하도록 한다. 상기 검정은, 일반적으로 본원에서 이것이 경쟁(예를 들면, 약물 제품의 항체 조성물과의 예비 항온처리) 단계를 포함하기 때문에 "경쟁 SASSY" 시스템으로서 언급된다. 전형적인 SASSY 시스템은, 예를 들면, 미국 공개 번호 US 제2012-0156211 A1호(미국 일련 번호 제13/388,042호) 및 미국 일련 번호 제13/515,093호(WO 2011/075823 A1)(이 둘 다는 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다)에 기술된 바와 같은 이러한 경쟁 단계를 포함하지 않는다.
예를 들면, 경쟁 SASSY는 다음과 같이(예를 들면, 시험 세포가 미생물인 경우) 수행할 수 있다. 적절한 양의 약물 제품은, 적절한 용적(예를 들면, 250μL) 중의 적절한 양의 항체(예를 들면, PBS 중에서 목적하는 농도로 희석된 혈청 또는 모노클로날 항체)를 포함하는 조성물과 함께 항온처리할 수 있다(예를 들면, 예비 항온처리 단계). 이어서, 적절한 양의 시험 미생물(예를 들면, 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae))을 약물 제품/항체 혼합물에 첨가할 수 있다. 이어서, 적절한 조건(예를 들면, 37℃, 5% CO2) 하에서 적당한 시간(예를 들면, 약 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60분 중 어느 하나) 동안 항온처리를 수행할 수 있고, 이어서, 임의로 적절한 세척 단계(예를 들면, PBS 중에서 2회 세척)를 수행할 수 있다. 이어서, 2차 염색제(예를 들면, PBS 중의 1:100 희석으로 검정에 사용된 혈청 종에 대한 Alexa-488 접합된 항체(예를 들면, 염소 항-래빗 IgG 또는 염소-항-마우스-IgG))를 첨가함에 이어서 적절한 조건(예를 들면, 30분 동안 실온) 하에서 항온처리할 수 있다. 이어서, 다른 세척 단계를 수행하여 비결합 항체(예를 들면, PBS로 2회 세척), 및 적절한 조성물(예를 들면, 0.5ml, 1% 파라포름알데하이드) 중에 현탁된 미생물을 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 미생물에 대한 항체의 결합은, 예를 들면, 유동 세포측정기(예를 들면, 평균 형광 강도(MFI)를 결정하기 위해)를 사용하여 결정할 수 있다. 실시예는, 대표적인 대조군 약물 제품(예를 들면, 공지의 "온전한" (예를 들면, 적절히 보관된) PcpA 또는 PhtD 단백질) 및 대표적인 시험 약물 제품(예를 들면, 공지의 "스트레스 받은" (예를 들면, 가열된) PcpA 또는 PhtD 단백질)을 사용한 경쟁 SASSY를 기술하고, 상기 약물 제품은 각각 대조군 및 시험 약물 샘플에 대한 대용물로서 비교되었다. 또한, 당업자에게 자명한 바와 같은 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 상기 미생물은 고형 지지체(예를 들면, 비드, 슬라이드 또는 플레이트)에 부착될 수 있다. 미생물을 상기 고형 지지체에 부착시키기 위한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 상기 부착된 미생물(예를 들면, 여기에 부착된 항체)을 검출하기 위한 방법도 당업계에 널리 공지되어 있다.
상기 SASSY 시스템(예를 들면, 경쟁 SASSY)은, 또한, 생체내 수동 보호 검정을 위해 적합한 대용인 것으로 결정되었다. 전형적인 생체내 수동 면역화 시스템은, 공급원 동물(예를 들면, 래빗)의 수동 면역화 및 시험 동물(예를 들면, 마우스(예를 들면, CBA/CaHN-Btkxid/J(CBA/N)으로 약칭)에게 상기 공급원 동물에서 생성된 항혈청의 투여를 포함한다. 항혈청은, 예를 들면, PBS(예를 들면, 200㎕) 중에 희석된 래빗 항-혈청일 수 있고, 임의의 적합한 경로(예를 들면, 전형적으로 복강내(i.p.))를 통해 시험 동물에게 투여될 수 있다. 적당량의 시간 후(예를 들면, 항혈청 투여 1시간 후), 상기 마우스는 전형적으로 적합한 경로(꼬리 정맥내, 예를 들면, 200㎕로 정맥내(i.v.))에 의해 정상적으로(예를 들면, 백신접종되지 않은 상태로) 항체가 반응성일 수 있는 미생물의 치사 용량(예를 들면, PcpA 또는 PhtD 단백질에 의해 면역화된 래빗 유래의 항체의 수동 투여 후 50cfu/마우스로 망간 고갈된 THY/MOPS(A66.1Nn -)에서 성장된 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 균주 A66.1)를 챌린지하였다. 상기 실시예는, 시험관내 SASSY가 전형적인 생체내 수동 면역화 모델을 위해 적합한 대용임을 입증한다. 상기 연구에서, 래빗은 "온전한" 항원(예를 들면, 적절히 보관된 PcpA 또는 PhtD 단백질) 또는 "스트레스 받은" 항원(예를 들면, 열-처리된(1주 동안 45℃))으로 면역화시켰다. 면역화된 래빗으로부터 수득한 항혈청(예를 들면, 잠재적으로 항-PcpA 또는 PhtD 항체를 함유함)은 적당량의 챌린지 미생물(예를 들면, l x lO8 cfu의 A66.lMn -)으로 예비-항온처리하였다. 이어서, 상기 "온전한" 또는 "스트레스 받은" 항혈청은: 1) 전형적인 수동 면역화 검정에서 프로세싱하거나; 2) 경쟁 SASSY 시스템을 사용하여(예를 들면, 상기된 바와 같이) 프로세싱하였다. 실시예에 기술된 바와 같이, 전형적인 수동 면역화 프로토콜 및 SASSY 시스템의 결과들은 비슷하다. 따라서, 이어서, 상기 SASSY 시스템은 시험 동물(예를 들면, 마우스)에게 시험 항혈청(예를 들면, 래빗 항혈청)을 투여하는 단계(예를 들면, 전형적인 생체내 수동 면역화 시스템)을 대체할 수 있고; 사용자는, SASSY 시스템을 사용한 시험관내 면역화된 동물 혈청(예를 들면, 래빗 혈청)으로부터 직접 백신 효능의 지표를 수득할 수 있다. 따라서, 이어서, 다른 실시형태에서, 보호 백신을 동정하는 과제는, 항원을 포함하는 조성물을 동물(예를 들면, 래빗 또는 사람)에게 투여하는 단계, 동물 유래의 항원에 대한 항체를 (예를 들면, 항혈청으로서) 수득하는 단계, 하나 이상의 세포 표면 항원들을 발현하는 시험 세포(예를 들면, 미생물)와 항체를 접촉시키는 단계, 및 상기 미생물에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, SASSY 시스템에 의해 해결된다. 전형적으로, 상기 최종 단계는, 상기 항원을 발현하는 유기체에 의한 감염에 대한 보호가 제공될 수 있도록 동물에서 충분한 양 및/또는 유형의 항체를 유도하는지를 결정하기 위한 다양한 시험 조성물(예를 들면, 백신)의 비교를 포함할 수 있다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 검정 시스템은, 마우스가 다른 동물(예를 들면, 래빗)에 의해 생성된 항체를 사용한 전처리 또는 전처리의 존재 또는 부재 하에 미생물로 챌린지된 생체내 마우스 모델에 대해 비슷한 결과를 제공한다. 본원에 기술된 상기 경쟁 SASSY 시스템은 연구자에게 생체내 수동 보호 검정에 대한 대안을 제공한다.
본원에 기술된 SASSY 시스템은, 연구자에게 잠재적 백신이 사람에서 보호성일 것인지를 신속히 확인할 수 있는 실제 임상 시험에 대한 대안을 제공한다. 상기 전형적인 SASSY 시스템(예를 들면, 경쟁 단계를 포함하지 않음)은, 예를 들면, 모노클로날 항체와 함께 사용되었지만, 백신 접종된 사람으로부터 단리된 혈청과 함께 사용될 수 있음을 발견한 것은 놀라운 것이었다. 상기 실시예에 기술된 바와 같이, 임상 시험에 입회한 사람 유래이고 표준 검정에 의해 기능성 백신-특이적 항체(예를 들면, PhtD 항원 함유)를 함유하는 것으로 공지되어 있는 혈청은 SASSY 시스템을 사용하여 시험하였다. 후-백신 혈청은, 혈청 샘플 쌍이 시험되는 경우 전-백신 혈청보다 더 높은 MFI로 포화되었다. 따라서, SASSY는, 사람에서 백신 효능을 측정하기 위해 사용되어 왔던 전형적인 검정 시스템을 대체할 수 있다. 이것은 모노클로날 항체 제제의 성질이 매우 상이하고 백신 접종된 사람의 혈청에 전형적으로 존재하는 특정 항원(예를 들면, PhtD)에 대한 항체의 양이 매우 적다는 것을 고려하면 놀라운 것이다. 사람 혈청을 사용한 이들 놀라운 결과를 고려하면, 당업자는 SASSY가 또한 사람 이외의 유기체(예를 들면, 다른 포유동물)에서의 면역 반응을 검출하는데 유용할 거심을 이해해야만 한다.
약물 제품은, 예를 들면, 면역학적 조성물을 포함할 수 있다. 면역학적 조성물은, 숙주(예를 들면, 사람)에게 투여시 상기 조성물 내에 함유된 하나 이상의 항원 및/또는 면역원에 대해 지시된 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 조성물이다. 상기 면역학적 조성물에 함유된 항원들의 유형은 다양할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 항원은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 또는 소분자일 수 있다. 면역학적 조성물은 또한 하나 이상의 항원보강제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 상기 면역 반응은 (예를 들면, B 세포의 자극을 통한) 항체의 생성 및/또는 T 세포-기반 반응(예를 들면, 세포용해 반응)을 포함할 수 있다. 전형적으로 본원에 기술된 SASSY 시스템은, 숙주에게 투여시 항체의 생성(예를 들면, 항체-기반 면역 반응)을 유도하는 약물 제품과 필연적으로 관련되는 것은 아니다. 상기 면역 반응은 보호성이거나 중화성일 수 있거나 아닐 수 있다. 보호성 또는 중화성 면역 반응은 성장을 억제하고/하거나 숙주 유래의 항원을 제거함으로써 항원을 함유하거나 발현하는 세포(예를 들면, 이로부터 항원이 유도됨)에 유해할 수 있는 반응이고, 따라서, (예를 들면, 감염 및/또는 종양 성장을 감소시키거나 예방함으로써) 숙주에게 이득이 된다. 본원에 사용된 바와 같이, 보호성 또는 중화성 항체는 전형적으로 이의 항원에 반응성이다. 숙주에게 투여시 보호성 또는 중화성 면역 반응을 초래하는 면역학적 조성물은 백신인 것으로 고려될 수 있다.
상기 용어 "항체" 또는 "항체들"은, 비정제되거나 부분적으로 정제된 형태(예를 들면, 하이브리도마 상청액, 복수액, 폴리클로날 항혈청, 혈청) 및/또는 정제된 형태로의 전체 또는 단편화된 항체를 나타낼 수 있고/있거나 항체들의 유도체를 나타낼 수 있다. 정제된 항체는, (예를 들면, 하이브리도마 상청액 또는 복수액 제제의 일부로서) 처음에 발견된 단백질의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 항체들은, 예를 들면, 뮤린을 포함하는 임의의 적합한 기원 또는 형태(예를 들면, 뮤린 하이브리도마 세포에 의해 제조됨)일 수 있거나 사람화된 항체, 키메라 항체 및 사람 항체 등으로서 발현된 것일 수 있다. 예를 들면, 항체는, 예를 들면, 사람(예를 들면, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1 및 IgA2), IgD, 및 IgE), 개(예를 들면, IgGA, IgGB, IgGC, IgGD), 닭(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY), 염소(예를 들면, IgG), 마우스(예를 들면, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), 돼지(예를 들면, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM), 래트(예를 들면, IgG, IgD, IgE, IgG, IgM)를 포함하는 임의의 적합한 유형의 항체이고/이거나 이의 단편 및/또는 유도체(예를 들면, 키메라 항체로서)일 수 있다. 적합한 유도체는, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fab' 단일쇄 항체, Fv, 단일 도메인 항체, 단일-특이적 항체, 이-특이적 항체, 삼-특이적 항체, 다가의 항체, 키메라 항체, 개-사람 키메라 항체, 개-마우스 키메라 항체, 개 Fc를 포함하는 항체, 사람화된 항체, 사람 항체, 개화된(caninized), CDR-이식된 항체, 상어 항체, 나노바디 (예를 들면, 단일 단량체성 가변 도메인으로 이루어진 항체), 카멜리드 항체(예를 들면, 카멜리대(Camelidae) 패밀리 구성원의 항체), 마이크로바디, 인트라바디(intrabody)(예를 들면, 세포내 항체), 또는 모사체를 포함할 수 있다. 모사체는, 또한, 예를 들면, CHV형 바이러스, 또는 예를 들면, 어피바디(affibody)(Nygren, et al, FEBS J. 275(11):2668-76, 2008), 어필린(Ebersbach, et al, J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85, 2007), 어피틴(Krehenbrink et al, J. Mol. Biol. 383(5): 1058-68, 2008), 안티칼린(Skerra, A., FEBS J. 275(11):2677-83, 2008), 아비머(Silverman et al, Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-61, 2005), DARPin(Stumpp et al, Drug Discov. Today 13(15-16):695-701, 2008), 피노머(Grabulovski et al, J. Biol. Chem. 282(5):3196-3204, 2007), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide) (Nixon et al, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 9(2):261-8, 2006), 및/또는 모노바디(Koide et al, Methods Mol. Biol. 352:95-109, 2007)와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 유기 화합물을 포함할 수 있다. 당업자들 중 하나에 의해 이해되는 다른 항체가 또한 적합할 수 있다.
다양한 유형의 항체를 (예를 들면, 항체 조성물로서) 제조하고 사용하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고 본 발명을 수행하는데 적합할 것이다(예를 들면, 문헌[Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998; Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975; Jones et al, Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596, 1992; Verhoeyen et al , Science, 239: 1534-1536, 1988; Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581, 1991; Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991; Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826, 1996; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995; 및 미국 특허 제4,816,567호, 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 및 제5,661,016호]를 참조한다). 혈청은, 예를 들면, 표준 기술을 사용하여 약물 제품이 투여된 숙주로부터 단리될 수 있다. 전형적으로, 혈청은 약물 제품을 투여한지 적어도 약 7일, 14일 또는 21일 후에 숙주로부터 단리된다. 혈청은, 또한, 선택된 본원에 기술된 검정에서 사용하기 위해 다양한 시점 및 적절한 시점에서 단리될 수 있다. 소정 적용에서, 상기 항체는 하이브리도마 상청액 또는 복수액 내에 함유되어 표준 기술을 사용한 상기 또는 하기 농축으로 직접 사용될 수 있다. 다른 적용에서, 상기 항체는, 예를 들면, 염 분획화 및 이온 교환 크로마토그래피, 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 공유결합적으로 커플링된 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 및/또는 단백질 L 리간드를 사용한 친화성 크로마토그래피 또는 이들 기술의 조합을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 상기 항체는, 동결된 제제(예를 들면, -20℃ 또는 -70℃)로서 동결건조된 형태를 포함하는 임의의 적합한 포맷으로 또는 정상 냉장 조건(예를 들면, 4℃) 하에서 보관될 수 있다. 액체 형태로 보관되는 경우, Tris-완충 염수(TBS) 또는 인산 완충 염수(PBS)와 같은 적합한 완충액이 사용될 수 있다. 항체 조성물 중에 항체의 양은 다양할 수 있고, 사용되는 특정 SASSY 시스템에 따라 사용자에 의해 선택될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 상기 약물 제품은, 약물 제품 내에 존재하는 모든(또는 대부분의) 항원에 결합하도록 충분한 양(예를 들면, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10μg/ml 중 어느 하나)의 항체를 포함하는 항체 조성물과 함께 예비 항온처리한다. 이것은 필연적으로 약물 제품의 유형(예를 들면, 약물 제품 내에 함유된 항원의 성질 및/또는 양)에 따라 다양하다.
소정 실시형태에서, 항체의 검출은, 상기 항원-항체 복합체를 제2 항체가 복합체 내의 면역글로불린과 결합하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 면역글로불린과 면역학적으로 반응성인 "제2" 항체(예를 들면, 항-면역글로불린 항체)와 항원-항체 복합체를 접촉시키고, 이어서, 결합된 제2 항체를 검출함으로써 성취될 수 있다. 제2 항체는 검출가능한 표지, 마커 또는 리포터 분자로 표지시키는 것이 바람직하다. 적합한 표지, 마커 및/또는 리포터 분자는, 예를 들면, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 유로퓸 및 텍사스 레드와 같은 형광색소; 디아미노벤지딘, 방사성 동위원소와 같은 발색 염료; 착색성, 자기성 또는 상자기성인 라텍스 비드와 같은 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자 물질; 비오틴 및 디곡시제닌과 같은 결합제; 및 예를 들면, FACS, ELISA, 웨스턴 블롯, TRFIA, 면역조직화학, 에반에센스(evanescence), 루미넥스 비드 어레이(Luminex bead array), 딥스틱(dipstick), 또는 다른 측류(lateral flow) 검정 포맷에서 가시적으로 관찰되거나, 전기적으로 검출되거나 달리 기록되는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성제를 포함할 수 있다. 상기 방법에 사용하기 위해 적합한 항체-결합 분자는, 면역글로불린-결합 항체, 예를 들면, 항-사람 항체(예를 들면, Ig 이소형 또는 (예를 들면, IgG의) 서브클래스에 특이적이거나 스태필로코커스 단백질 A 또는 G에 대해 특이적인 항-사람 항체)를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 항체를 검출하기 위한 다른 시약도 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 시험 세포에 대한 항체들의 검출은, 평균 형광성(예를 들면, 평균 형광성 지표)("MFI")의 측정을 요구하는 검출 시스템을 사용하여 성취된다. 유동 세포측정은 하나의 상기 검출 시스템이다. 상기 MFI는, 시험 세포 표면 상의 항체 양의 지표로서 작용한다(예를 들면, MFI가 높을수록 검출된 항체의 양이 더 큼을 나타낸다). 일부 실시형태에서, 보호성 백신은 MFI를 측정함으로써 동정될 수 있다(예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이, 111 이상의 MFI는, 백신이 보호성일 수 있음을 나타낼 수 있다). 상기 관련 MFI는 특정 약물 제품에 의존한다. 경쟁 SASSY에 의해 검정된 2개의 약물 제품은 상이한 MFI를 나타낼 수 있고, 여기서, 상기 항원 함량은 2개의 약물 제품 사이에 상이하다. 예를 들면, 제1 약물 제품(예를 들면, 온전한 약물 제품)이 100의 경쟁 SASSY MFI를 나타내고 제2 약물 제품이 200의 경쟁 SASSY MFI를 나타내는 경우, 제2 약물 제품이 제1 약물 제품에 비해 온전하지 않은(또는 덜 온전한) 것으로 결론내릴 수 있다. 제2 약물 제품이 제1 약물 제품과 유사한 (예를 들면, ±10%) 경쟁 SASSY MFI를 나타내는 경우, 제1 및 제2 약물 제품 둘 다가 (예를 들면, 적어도 서로에 대해) 온전한 것으로 결론내릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 제품 사이의 MFI의 차이는 특정 적용 및/또는 약물 제품에 따라 적어도 일반적으로 유의한(예를 들면, 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 그 이상 중 어느 하나의 차이) 것으로 고려될 수 있다. 제1 및 제2 약물 제품은, 일부 실시형태에서, 상이한 로트의 동일한 백신을 나타낼 수 있다. 이와 같이, 경쟁 SASSY는, 로트-대-로트 안정성을 확인하기 위해 사용될 수 있는 효력 검정을 제공할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 다른 검출 시스템은, 또한, MFI의 측정에 의존할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 다른 MFI 수준은 또한 특정 방법에 관련되고/되거나 적용될 수 있다.
상기 시험 세포는, 예를 들면, 목적하는 하나 이상의 항원을 발현하는 임의의 세포, 예를 들면, 미생물, 종양 세포, 바이러스를 포함하는(예를 들면, 이에 의해 하나 이상의 바이러스 항원을 발현하는) 세포 및/또는 바이러스-유사 입자 및/또는 목적하는 하나 이상의 항원을 발현하도록 조작된 재조합 세포일 수 있다. 상기 시험 세포는 용액 중에서 유리된 상태일 수 있다. 상기 시험 세포는, 또한, 포획 또는 검출 시약에 인접되고/되거나 비드(예를 들면, 자기 비드), 튜브, 미세플레이트 웰, 칩 및/또는 컬럼 물질과 같은 고형 지지체 상에 부착(예를 들면, 고정화)될 수 있다. 예시적 미생물로는, 예를 들면, 다음을 포함하는 임의의 하나 이상의 세균 종(spp)(예를 들면, 세균 표적 항원(들)), 예를 들면, 바실러스 종(Bacillus spp .)(예를 들면, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)), 보르데텔라 종(Bordetella spp .)(예를 들면, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)), 보렐리아 종(Borrelia spp .)(예를 들면, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 브루셀라 종(Brucella spp .)(예를 들면, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 캐니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis)), 캠필로박터 종(Campylobacter spp .)(예를 들면, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)), 클라미디아 종(Chlamydia spp .)(예를 들면, 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)), 클로스트리디움 종(Clostridium spp .)(예를 들면, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp .)(예를 들면, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diptheriae)), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp .)(예를 들면, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패쿰(enterococcus faecum)), 에스케리치아 종(Escherichia spp .)(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)), 프란시셀라 종(Francisella spp .)(예를 들면, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)), 해모필러스 종(Haemophilus spp .)(예를 들면, 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza)), 헬리코박터 종(Helicobacter spp.)(예를 들면, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 레지오넬라 종(Legionella spp .)(예를 들면, 레지오텔라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 종(Leptospira spp .)(예를 들면, 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)), 리스테리아 종(Listeria spp .)(예를 들면, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)), 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp .)(예를 들면, 마이코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 마이코플라스마 종(Mycoplasma spp .)(예를 들면, 마이코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae)), 나이세리아 종(Neisseria spp.)(예를 들면, 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)), 포르피로모나스 종(Porphyromonas spp .)(예를 들면, 피. 진지발리스(P. Gingavalis)), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp .)(예를 들면, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리케치아 종(Rickettsia spp.)(예를 들면, 리케치아 리케치(Rickettsia rickettsii)), 살모넬라 종(Salmonella spp .)(예를 들면, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피누리움(Salmonella typhinurium)), 쉬겔라 종(Shigella spp .)(예를 들면, 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei)), 스태필로코커스 종(Staphylococcus spp .)(예를 들면, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스태필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 응고효소(coagulase) 음성 스태필로코커스(예를 들면, 미국 특허 제7,473,762호)), 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp .)(예를 들면, 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 파이로게네스(Streptococcus pyrogenes), 트레포네마 종(Treponema spp .)(예를 들면, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)), 비브리오 종(Vibrio spp .)(예를 들면, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)), 및 예르시니아 종(Yersinia spp .)(예르시니아 페스티스(Yersinia pestis))가 포함된다. 추가의 미생물로는, 예를 들면, 다음을 포함하는 하나 이상의 기생충 유기체(종)(예를 들면, 기생충 표적 항원(들)), 예를 들면, 안사이클로스토마 종(Ancylostoma spp .)(예를 들면, 에이. 두오데날레(A. duodenale)), 아니사키스 종(Anisakis spp .), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 세스토다 종(Cestoda spp.), 시미시대 종(Cimicidae spp .), 클로노르키스 시넨시스(Clonorchis sinensis), 디크로코엘리움 덴드리티쿰(Dicrocoelium dendriticum), 디크로코엘리움 호스페스(Dicrocoelium hospes), 디필로보트리움 라툼(Diphyllobothrium latum), 드라쿤쿨루스 종(Dracunculus spp.), 에키노코커스 종(Echinococcus spp.)(예를 들면, 이. 그라눌로서스(E. granulosus), 이. 멀티로쿨라리스(E. multilocularis), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 엔테로비우스 베르미쿨라리스(Enterobius vermicularis), 파스시올라 종(Fasciola spp .)(예를 들면, 에프. 헤파티카(F. hepatica), 에프. 마그나(F. magna), 에프. 기간티카(F. gigantica), 에프, 야크소니(F. jacksoni)), 파스시올로프시스 부스키(Fasciolopsis buski), 기아르디아 종(Giardia spp .)(기아르디아 람블리아(Giardia lamblia)), 그나토스토마 종(Gnathostoma spp .), 하이메놀레피스 종(Hymenolepis spp .)(예를 들면, 에이취. 나나(H. nana), 에이취. 디미누타(H. diminuta), 레이슈마니아 종(Leishmania spp .), 로아 로아(Loa loa), 메토르키스 종(Metorchis spp .) (엠. 컨정투스(M. conjunctus), 엠. 알비두스(M. albidus)), 네카토르 아메리카누스(Necator americanus), 오에스트로이데아 종(Oestroidea spp.)(예를 들면, 보트플라이(botfly)), 온코세르시대 종(Onchocercidae spp .), 오피스토르키스 종(Opisthorchis spp .)(예를 들면, 오. 비베리니(O. viverrini), 오. 펠리네우스(O. felineus), 오. 구아이아쿠일렌시스(O. guayaquilensis), 및 오. 노베르카(O. noverca)), 플라스모디움 종(Plasmodium spp .)(예를 들면, 피. 팔시파룸(P. falciparum)), 프로토파스시올라 로부스타(Protofasciola robusta), 파라파스시올로프시스 파스시오모르패(Parafasciolopsis fasciomorphae), 파라고니무스 웨스테르마니(Paragonimus westermani), 쉬스토소마 종(Schistosoma spp .)(예를 들면, 에스. 만소니(S. mansoni), 에스. 자포니쿰(S. japonicum), 에스. 메콘기(S. mekongi), 에스. 해마토비움(S. haematobium)), 스피로메트라 에리나세이에우로파에이(Spirometra erinaceieuropaei), 스트론길로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis), 타에니아 종(Taenia spp .)(예를 들면, 티. 사기나타(T. saginata), 티. 솔리움(T. solium)), 톡소카라 종(Toxocara spp .)(예를 들면, 티. 카니스(T. canis), 티. 카티(T. cati)), 톡소플라스마 종(Toxoplasma spp.)(예를 들면, 티. 곤디(T. gondii)), 트리코빌하지아 레겐티(Trichobilharzia regenti), 트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 트리쿠리스 트리키우라(Trichuris trichiura), 트롬비쿨리대 종(Trombiculidae spp .), 트리파노소마 종(Trypanosoma spp .), 툰가 페네트란스(Tunga penetrans), 및/또는 우케레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti)가 포함될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 다른 유형의 시험 미생물도 적합할 수 있다.
상기 시험 세포는, 또한, 종양 세포이거나 이로부터 유도되거나 이와 관련된 것일 수 있다. 상기 세포가 유도될 수 있는 예시적인 종양 유형으로는, 예를 들면, 유방암, 결장암, 폐암, 위암, 육종, 혈액암(예를 들면, 백혈병), 자궁경부암, 난소암, 고환암, 뇌암, 신장암, 간암, 인후암, 피부암(예를 들면, 흑색종), 및 췌장암 등이 포함된다. 상기 종양 세포의 목적하는 항원은, 예를 들면, 암-고환(CT) 항원(즉, MAGE, NY-ESO-1); 멜라닌세포 분화 항원(즉, Melan A/MART-1, 티로시나제, gp1OO); 돌연변이 항원(즉, MUM-1, p53, CDK-4); 과발현된 '자가' 항원(즉, HER-2/neu, p53); 바이러스 항원(즉, HPV, EBV)(예를 들면, gp1OO(Cox et al., Science, 264:716-719 (1994)), MART-l/Melan A(Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352 (1994)), gp75(TRP-1)(Wang et al., J. Exp. Med., 186: 1131-1140 (1996)), 티로시나제(Wolfel et al., Eur. J. Immunol, 24:759-764 (1994)), NY-ESO-1(WO 98/14464; WO 99/18206), 흑색종 프로테오글리칸(Hellstrom et al., J. Immunol, 130: 1467-1472 (1983)), MAGE 패밀리 항원(즉, MAGE-1, 2,3,4,6, 및 12; Van der Bruggen et al., Science, 254: 1643-1647 (1991); 미국 특허 제6,235,525호), BAGE 패밀리 항원(Boel et al., Immunity, 2: 167-175 (1995)), GAGE 패밀리 항원(즉, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 182:689-698 (1995); 미국 특허 제6,013,765호), RAGE 패밀리 항원(즉, RAGE-1; Gaugler et at, Immunogenetics, 44:323-330 (1996); 미국 특허 제5,939,526호), N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V(Guilloux et at., J. Exp. Med., 183: 1173-1183 (1996)), p15 (Robbins et al., J. Immunol. 154:5944-5950 (1995)), β-카테닌(Robbins et al., J. Exp. Med, 183: 1185-1192 (1996)), MUM-1(Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980 (1995)), 사이클린 의존성 키나제-4(CDK4)(Wolfel et al., Science, 269: 1281-1284 (1995)), p21-ras(Fossum et at., Int. J. Cancer, 56:40-45 (1994)), BCR-abl(Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684 (1995)), p53(Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11993-11997 (1995)), p185 HER2/neu(erb-B1; Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117 (1995)), 상피 성장 인자 수용체(EGFR)(Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2 (1994)), 암배아성 항원(CEA)(Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990 (1995) 미국 특허 제5,756,103호; 제5,274,087호; 제5,571,710호; 제6,071,716호; 제5,698,530호; 제6,045,802호; EP 263933; EP 346710; 및 EP 784483); 암종-관련 돌연변이된 뮤신(즉, MUC-1 유전자 생성물; Jerome et al., J. Immunol, 151: 1654-1662 (1993)); EBV의 EBNA 유전자 생성물(즉, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Surveys, 13:53-80 (1992)); 사람 파필로마바이러스의 E7, E6 단백질(Ressing et al., J. Immunol, 154:5934-5943 (1995)); 전립선 특이적 항원(PSA; Xue et al., The Prostate, 30:73-78 (1997)); 전립선 특이적 막 항원(PSMA; Israeli, et al., Cancer Res., 54: 1807-1811 (1994)); 유전자형 에피토프 또는 항원, 예를 들면, 면역글로불린 유전자형 또는 T 세포 유전자형(Chen et al, J. Immunol, 153:4775-4787 (1994)); KSA(미국 특허 제5,348,887호), 키네신 2(Dietz, et al. Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7;275(3):731-8), HIP-55, TGFp-1 항-아폽토시스 인자(Toomey, et al. Br J Biomed Sci 2001;58(3): 177-83), 종양 단백질 D52(Bryne J. A., et al., Genomics, 35:523-532 (1996)), H1FT, NY-BR-1(WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87 및 NY-BR-96(Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY), 및/또는 췌장암 항원(예를 들면, 미국 특허 제7,473,531호의 서열번호 1 내지 288))일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이들 또는 다른 종양 항원을 발현하는 다른 시험 세포도 적합할 수 있다.
상기 시험 세포는, 또한, 바이러스 항원들을 포함할 수 있고/있거나 발현할 수 있다. 예시적인 바이러스로는, 예를 들면, 다음을 포함하는 하나 이상의 바이러스(예를 들면, 바이러스 표적 항원(들)), 예를 들면, dsDNA 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 엡슈타인-바르 바이러스, 헤르페스 심플렉스 1형, 헤르페스 심플렉스 2형, 사람 헤르페스 바이러스 심플렉스 8형, 사람 사이토메갈로바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 폭스바이러스); ssDNA 바이러스(예를 들면, 파르보바이러스, 파필로마바이러스(예를 들면, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, BPV1, BPV2, BPV3, BPV4, BPV5 및 BPV6(In Papillomavirus and Human Cancer, edited by H. Pfister(CRC Press, Inc. 1990); Lancaster et al., Cancer Metast. Rev. pp. 6653-6664 (1987); Pfister, et al. Adv. Cancer Res 48, 113-147 (1987)); dsRNA 바이러스(예를 들면, 레오바이러스); (+)ssRNA 바이러스(예를 들면, 피코나바이러스, 콕삭키 바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 토가바이러스, 루벨라 바이러스, 플라비바이러스, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스); (-)ssRNA 바이러스(예를 들면, 오르토믹소바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라브도바이러스, 파라믹소바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 융합세포 바이러스, 라브도바이러스, 광견병(rabies) 바이러스); ssRNA-RT 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 사람 면역결핍 바이러스(HIV)(예를 들면, 임의의 서브유형 A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J 및 K)); 및 dsDNA-RT 바이러스(예를 들면, 헤파드나바이러스, B형 간염)가 포함될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이들 또는 다른 바이러스 항원들을 발현하는 다른 시험 세포도 적합할 수 있다.
시험 세포는, 예를 들면, 미생물, 종양 세포 및/또는 바이러스로부터 유도된 하나 이상의 항원들을 일시적으로 또는 안정하게 발현하도록 조작된 것일 수 있다. 상기 세포는 동물(예를 들면, 포유동물) 또는 비-포유동물일 수 있다. 상기 재조합 시험 세포를 제조하는데 사용하기 위해 적합한 예시적인 세포 유형으로는, 예를 들면, 293, BHK, CHO(예를 들면, CHO-T Ag; 미국 특허 제5,122,469호), CV-1, COS(예를 들면, CosV7), HBMF, HeLa, HuH7, 사람 각질세포, K562, MG63, P338D1, PC-12, Raw264.7, SK-N-MC, THP-1, U937, W12, 및 WI38 등이 포함될 수 있다. 재조합 세포를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 널리 이용가능하다. 예를 들면, 하나 이상의 항원을 암호화하는 핵산 분자는 세포를 형질감염시키거나 그렇지 않으면 세포에 전달하여 세포에서 항원을 발현시킬 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 SASSY 시스템과 함께 사용하기 위해, 항원은 전형적으로 세포 표면 상에 발현될 수 있다. 세포 표면 상에 항원(예를 들면, 상기된 것들 중 임의의 하나)을 재조합적으로 발현시키기 위한 방법은 당업자에게 광범위하게 이용가능하다(예를 들면, 미국 특허 제5,665,590호; 제6,686,168호; 및/또는 제7,125,973호에 기술된 바와 같음). 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 다른 적합한 재조합 시험 세포도 적합할 수 있다.
본원에 기술된 시약은 키트 포맷으로 제공될 수 있다. 키트는, 예를 들면, 본원에 기술된 검정을 수행하는데 필요한 구성성분들의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 대조군 조성물(예를 들면, 대조군 약물 제품 및/또는 대조군 항체 조성물), 시험 세포(예를 들면, 고형 지지체에 고정된 유리된 세포로서 및/또는 동결된 세포), 완충액, 표지화 시약(예를 들면, 염소 항-마우스 IgG 비오틴과 같은 표지된 항체, 스트렙트아비딘-HRP 접합체, 알로피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 퍼옥시다제, 및/또는 다른 검출가능한 표지), 지침서 및 임의의 다른 필요하거나 유용한 구성성분들을 포함할 수 있다. 상기 키트의 구성성분들은, 동결된, 동결건조된 형태, 또는 TBS 또는 PBS와 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는, 또한, 임의의 적합한 형태로 하나 이상의 시험 세포(예를 들면, 미생물)를 함유하는 고형 지지체를 포함할 수 있다. 상기 키트는, 또한, 예를 들면, 유동 세포측정 분석, ELISA, 면역블롯팅(예를 들면, 웨스턴 블롯), 동일반응계내 검출, 면역세포화학, 면역조직화학 및/또는 데이터의 가시화와 같은 검정을 수행하기 위한 다른 시약 및/또는 지침서를 포함할 수 있다. 키트는, 또한, 컨테이너(예를 들면, 튜브) 및/또는 상기 대조군 샘플을 함유하도록 미리 포맷팅된 슬라이드 및/또는 실험 샘플에 대한 추가의 공간(예를 들면, 튜브, 슬라이드 및/또는 슬라이드 상의 공간)과 함께 시약과 같은 구성성분들을 포함할 수 있다. 상기 키트는, 또한, 개체로부터 수득된 샘플을 취급하고/하거나 보관하기 위한 장치 및 개체로부터 샘플을 수득하기 위한 장치(즉, 바늘, 랜싯(lancet) 및 수집 튜브 또는 용기) 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 다른 실시형태들도 제공된다.
따라서, 상기 개시는, 특히, 하나 이상의 항원들을 포함하는 약물 제품을, 하나 이상의 항원들 중 하나 이상에 대해 반응성인 항체를 포함하는 항체 조성물과 접촉시켜 시험 조성물을 생성하고, 상기 시험 조성물을 항원들 중 하나 이상을 발현하는 시험 세포와 접촉시키고, 상기 시험 세포에 대한 항체들의 결합을 검출함을 포함하는 방법을 기술한다. 소정 실시형태에서, 상기 항원은 세포 표면 항원이고; 상기 시험 세포는, 미생물, 종양 세포, 바이러스 항원을 발현하는 세포, 또는 재조합 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 항체 조성물은, 혈청, 복수액, 세포 배양 상청액, 폴리클로날 항혈청, 모노클로날 항체 조성물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 혈청은, 약물 제품에 존재하는 항원으로 면역화된 동물로부터 유도되고; 상기 시험 세포는 용액 중에 존재하거나 고체 표면에 부착되어 있고; 시험 세포 상의 항체는 유동 세포측정에 의해 검출하고; 시험 세포상의 항체의 검출은, 약물 제품이 온전하지 않음을 나타내고/내거나; 미생물 상의 항체의 검출 부재는, 상기 약물 제품이 온전함을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 제1 및 제2 약물 제품을 사용하는 단계를 별도로 수행하고, 제1 및 제2 약물 제품을 각각 사용하여 수행된 방법에 대해 시험 세포 상에 검출된 항체의 양을 비교함을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 약물 제품은 대조군 약물 제품이다. 소정 실시형태에서, 제1 약물 제품과 비교하여 제2 약물 제품과의 항온처리 후 보다 많은 항체의 검출은, 제2 약물 제품이 제1 약물 제품에 비해 덜 온전하거나 온전하지 않음을 나타낸다(예를 들면, 여기서, 제1 및 제2 약물 제품은 상이한 로트의 동일한 약물 제품이다). 상기 방법은, 예를 들면, 약물 제품 효력 검정을 제공할 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 약물 제품은 면역학적 조성물 및/또는 백신일 수 있다. 또한, 대조군 반응을 수행하기 위해 요구되는 구성성분들 및 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다. 상기 개시는, 또한, 포유동물(예를 들면, 사람)에서 백신 면역원성 및/또는 효능을 측정하는 전형적인 검정 시스템에 대한 대용으로서 SASSY의 놀라운 용도를 기술한다. 예를 들면, 상기 개시는, 포유동물 혈청을, 포유동물에 이전에 백신 접종된 하나 이상의 세포 표면 항원을 발현하는 시험 세포와 접촉시키고, 여기에 존재하는 경우 상기 시험 세포에 대한 상기 혈청의 항체의 결합을 검출함을 포함하는, 포유동물에서 백신 효능을 측정하기 위한 방법을 기술한다. 일부 실시형태에서, 백신이 이전에 투여되지 않은 포유동물의 제1 혈청 샘플의 항체의 결합과 백신의 투여 후(예를 들면, 투여한지 7일 이상 후) 포유동물의 제2 혈청 샘플 유래의 항체의 결합과 비교하는 추가의 단계가 상기 방법에 포함된다.
특징이 선택적인 것으로 의도된 임의의 지표는, 선택적 특징과 관련하여 폐쇄되거나 배타적이거나 부정 어구를 포함하는 청구항에 대한 적당한 지지를 제공한다. 배타적인 어구는, 구체적으로 임의의 추가의 대상 항목을 포함하는 것으로부터 특정 인용된 특징을 배제한다. 예를 들면, A가 약물 X일 수 있다고 지적되는 경우, 상기 어구는 A가 단독의 X로 이루어지거나 A가 X 외에 어떠한 다른 약물을 포함하고 있지 않음을 명백히 특정하는 청구항에 대한 지지를 제공하는 것으로 의도된다. "부정" 어구는 청구항의 범위로부터 선택적 특징 자체를 명백히 배제한다. 예를 들면, 요소 A가 X를 포함할 수 있음이 지적되는 경우, 상기 어구는 A가 X를 포함하고 있지 않음을 명백히 명시하는 청구항에 대한 지지를 제공하는 것으로 의도된다. 배타적 또는 부정 용어의 비제한적인 예는 "단지", "유일하게", "로 이루어진", "필수적으로 이루어진", "단독의", "없이", "(예를 들면, 동일한 유형, 구조 및/또는 기능의 다른 항목)의 부재 하에", "배제하는", "포함하지 않는", "아닌", "할 수 없는" 또는 이의 임의의 조합 및/또는 변형 어구를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허 문헌은, 각각의 개별 공보 또는 특허 문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 인용되는 것으로 나타내어지는 바와 같이 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. GID 또는 수탁 번호에 의해 인용된 Genbank 기록, 특히, 임의의 폴리펩타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 주석이 본원에 인용에 의해 포함된다. 임의의 공보의 인용은 출원일 전에 개시를 위한 것이고, 본 발명이 이전 발명에 의해 상기 공보보다 선행하여 발명의 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되지 말아야 한다.
소정 실시형태는 하기의 실시예에서 추가로 기술한다. 이들 실시형태는 단지 예로서 제공되고 어떠한 방식으로든지 특허청구범위의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예
1
재료 및 방법
1, 4 또는 6주 동안 2 내지 8℃에서 보관되거나 43 내지 47℃에서 스트레스 받은 샘플의 단백질 함량 및 항원성은 HPLC, ELISA 및 바이아코어(Biacore)에 의해 시험하였다. 상기 HPLC 결과들은, 1가의 PcpA 단백질 함량이 0시에서와 비교하여 1주 동안 43 내지 47℃에서 보관 후 20%까지 감소하고 4주 보관 후에는 40%까지 감소하였음을 나타냈다. ELISA와 바이아코어 둘 다를 위해, 샘플의 수용시 2개의 시험을 수행하고 5개월 이후 초기 가속화된 분해 절차 후 2 내지 8℃에서 이들의 안정성을 모니터링하였다. 5개월 기간이내 수행된 2개의 시험은, 2 내지 8℃에서 보관된 단백질이 추가의 분해를 겪지 않음을 보여주었다. 보호성 모노클로날 항체 2B3을 사용한 ELISA는, 43 내지 47℃에서 보관 1주 후 항원성에 있어서 50% 감소 및 4 또는 6주 후 80 내지 85% 감소를 검출할 수 있었다. 대조적으로, 바이아코어(폴리클로날 혈청을 사용함)는, 1주 보관에서 항원성에 있어서 27% 감소 및 4 및 6주 보관에서 43 내지 47% 감소를 나타낸다. 이들 결과는, 모노클로날 항체가 폴리클로날 혈청보다 단백질 분해에 더 민감성임을 나타낸다. 모노클로날 항체를 사용하는 것은, 이것이 단백질의 한 영역에만 일어나는 분해에 민감할 수 있고 다른 가능한 분해 패턴을 검출할 수 없기 때문에 위험할 수 있지만, 보호를 부여하는 것으로 공지되어 있는 상기 에피토프가 여전히 온전한지를 나타내므로 상기 시약을 사용하는 것이 여전히 적절하다. 표 1은 이들 결과를 설명한다.
PhtD의 관점에서, 상기 HPLC 데이터는 단백질 함량에서 점진적인 감소(1주 및 4주에 각각 27 및 35% 감소)를 나타냈지만, 바이아코어 데이터는 항원성에 있어서 어떠한 유의한 감소도 보여주지 않았다. 한편, 비보호 모노클로날 항체 9E11을 사용한 ELISA 데이터는, 43 내지 47℃에서 1주 및 4주 보관에서 각각 항원성에 있어서 30% 및 60% 감소를 검출할 수 있었다. 표 2에 나타낸 결과들은, 폴리클로날 혈청이, 가속화된 분해에 의해 손상될 수 없는 단백질의 상이한 영역에 결합하는 항체로 인해 항원성의 상실을 차폐시킬 수 있음을 나타낸다.
설명된 바와 같이, 이들 분석학적 결과들은, 경쟁 SASSY를 사용하여 수행된 효력 평가와 비교하였다.
실시예
2
시험관내
경쟁 SASSY
A. 온전하거나 스트레스 받은 제형을 시험하기 위해 항-
PcpA
폴리클로날
혈청 또는
모노클로날
항체들을 사용한 경쟁 SASSY
상기된 바와 같은 단백질 제형은, 2B3을 포함하는 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체와 함께 경쟁 SASSY에서 사용하였다. 도 1은 폴리클로날 혈청에 결합하는 것에 대해 A66.1 세균 균주와 경쟁하는 온전하거나 분해된 PcpA를 나타낸다. 예상되는 바와 같이, 온전한 PcpA 단백질은, 모든 항원성 PcpA 에피토프가 전-분해 단계에서 접근가능하거나 온전한지를 나타내는 1 또는 4 또는 6주에서 보관된 단백질과 비교하여 보다 낮은 양의 단백질과 함께 폴리클로날 혈청에 결합할 수 있었다. 한편, 단백질의 분해를 통해, 상기 에피토프는 상기 폴리클로날 혈청에 덜 효율적으로 결합하고, 그 결과로서 세균에 대해 보다 높은 결합이 검출된다. 온전한 단백질에 대한 이들의 상대적 효력을 측정하기 위해, 각각의 시험 샘플에 대한 곡선 아래 면적을 계산하였고 온전한 단백질에 대한 역 비(inverse ratio)는 표 3에 나타낸다. 1주 스트레스 받은 샘플의 효력은 온전한 단백질에 상대적으로 4 및 6주 동안 0.8 및 0.4 내지 0.5이다. 흥미롭게도, 이들 결과는 또한 폴리클로날 혈청을 사용한 바이아코어 데이터와 매우 유사하다.
또한, 분해된 PcpA 샘플은, 단백질 상의 상이한 영역에 결합하는 5개의 모노클로날 항체들의 혼주를 사용한 경쟁 SASSY에서 평가하였다. 이들 항체 중에서, 2B3은 또한 항원성 ELISA에서 사용하였고 2B3 및 1-12 둘 다는, 함께 조합되는 경우에 수동 보호 모델에서 보호성인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 43 내지 47℃에서 1주 동안 보관된 PcpA의 상대적 효력은 0.51이고, 4주 및 6주 동안 보관의 효력은 각각 0.25 및 0.21였다. (도 2 및 표 4). 이들 결과는, 폴리클로날 혈청과 함께 수득된 이전의 결과와는 상반되고, 동일한 모노클로날 항체 2B3을 사용한 항원성 데이터와 일치하고, 이는, 경쟁 SASSY가 안정성을 나타내고, 동일한 모노클로날 항체를 사용하여 수득된 항원성 결과를 반영함을 나타낸다. 추가로, 바이아코어 데이터와 ELISA 데이터 사이에 관찰된 차이는 기술보다는 차라리 사용된 시약으로 인한 것일 가능성이 높다.
B. 온전하거나 스트레스 받은 제형과 함께 항-
PhtD
모노클로날
항체 또는 폴리클로날 혈청과의 경쟁 SASSY
또한, 43 내지 47℃에서 보관된 PhtD 제형은, 단백질의 상이한 영역에 결합하는 PhtD 또는 모노클로날 항체에 특이적인 폴리클로날 혈청을 사용한 경쟁 SASSY에 의해 시험하였다. 시험된 이들 모노클로날 항체 중에서 4D5 및 8H6은, 조합하여 주사되는 경우에 WU2 균주에 대항하여 마우스를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 폴리클로날 혈청을 사용한 도 3에 설명된 바와 같은 결과는 2 내지 8℃에서 보관된 온전한 PhtD와 비교하여 1, 4 또는 6주 동안 보관된 샘플의 효력에 있어서 감소를 나타내지 않는다. 이들 결과는, 폴리클로날 혈청도 사용한 바이아코어 결과와 매우 유사하였다.
또한, 분해된 샘플의 효력은, 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 SASSY에서 측정되었다. 그 결과는, 분해된 PhtD 단백질의 상대적 효력이 보관 시점과 함께 점진적으로 감소함을 보여주었다. 그러나, 효력에 있어서 상기 감소는, PcpA에 대해서 만큼 유의하지 않았고 ELISA 데이터로 수득된 항원성 결과를 반영하지 않았다.
항-PhtD 모노클로날 항체(3C, 4D5, 5B7, 6B7, 8G4 및 8H6)의 혼주는, 본원에 기술된 바와 같은 경쟁 SASSY에서 각각 2.5㎍/mL의 최종 농도(희석제로서 PBS를 사용함)로 사용하였다(도 4, 표 6). 희석된 모노클로날 항체는, 온전하거나 스트레스 받은 PhtD 단백질의 적정액(10㎍/mL 최종 농도에서 출발하여 7:10의 희석 인자)과 함께 실온에서 1시간 이상 동안 예비 항온처리하였다.
실시예
3
SASSY와 수동 보호 사이의 상호관계
온전한 1가의
PcpA
제형 대 분해된 1가의
PcpA
제형으로 면역화된
래빗
유래의
폴리클로날
혈청을 사용한 SASSY와 수동 보호 사이의 상호관계
동물에서의 분해된 단백질의 실제 생물학적 효과에 대한 경쟁 SASSY 및 항원성 결과의 관계를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 래빗은 상기 기술된 바와 같이 온전하거나 분해된 단백질로 IM 면역화시켰고, 혈청은 2회 부스트 후 수집하여 IgG 측정, SASSY 및 수동 보호를 위해 사용하였다. 43 내지 47℃에서 6주 동안 처리된 PcpA 제형에서 어떠한 유의한 차이도 검출되지 않았지만, 1주 동안 PcpA 분해된 단백질로 면역화된 래빗은, 항-PcpA 항체 역가에서 2배 감소 및 수동 보호에서 4배 감소를 보여주었다. SASSY 검정이 이들 정성적 차이를 검출할 수 있는지를 입증하기 위해, 상기 동일한 혈청은 또한 SASSY 검정에서 A66.1에 대한 이들의 결합에 대해 시험하였다. 결과는, 또한, 온전한 PcpA 단백질로 생성된 면역 반응과 대조적으로 MFI에서 30% 감소를 나타냈고, 6주 스트레스 받은 샘플에서는 덜 주지할만한 감소가 측정되었다. 이들 결과들은, 수동 보호 연구에서 관찰된 것과 동일한 경향에 따르고, 이는 SASSY가, 세균에 결합된 항체의 양 및 생성된 반응의 폭(breadth)의 척도임을 시사한다. 한편, 단독의 IgG 역가 측정은, 이들 샘플 사이의 차이를 구분하는데 충분하지 않았다. 이들 결과는 표 7에 요약하고, 한편, SASSY 결과는 도 5에 나타내고 수동 보호 결과는 도 6에 나타낸다.
온전한 1가의
PhtD
제형과 분해된 1가의
PhtD
제형으로 면역화된
래빗
유래의
폴리클로날
혈청을 사용한 SASSY와 수동 보호 사이의 상호관계
또한, PcpA 분해된 샘플에 대해 수행된 동일한 분석을 PhtD 분해된 샘플에 대해 적용하였다. 흥미롭게도, 또한, PhtD 분해된 샘플로부터 동일한 결론이 나왔다. 효력의 보다 큰 감소가 1주 동안 43 내지 47℃에서의 보관과 관련되었고, 한편, 보다 긴 항온처리는 SASSY와 수동 보호에 의해 검출된 둘 다의 효력의 회복을 유도하였다. 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 1주 스트레스 받은 샘플은 MFI에서 25% 감소를 갖고 생체내에서 이들의 보호 능력을 상실한다. 흥미롭게도, 생성된 항체의 양의 정량화는, 동일한 경향을 따르지 않았고, 이는, 보호가, 생성된 항체의 양만이기 보다는 기능성 항체의 존재와 항체의 양에 의존함을 다시 확인시켜 준다. 흥미롭게도, 상기 SASSY 검정은, 생성된 결과에 설명된 바와 같이 이들 2개의 속성을 측정할 수 있다. 표 8은 SASSY, 수동 보호 및 IgG 역가의 결과를 요약한다.
수동 보호와 경쟁 SASSY 사이의 상호관계를 확립하기 위해, 본 발명자들은, 우선, 기능성 모노클로날 항체의 세균으로의 결합이 생체내 동물 모델에서 보호를 유도함을 먼저 확신하고 싶었다. 이어서, 이것은 생체내 시험을 PcpA 및 PhtD 둘 다의 효력을 평가하기 위해 모든 시험관내 검정의 실행을 가능하게 하는 유동 세포측정에 의한 항체 결합의 MFI 측정으로 대체할 수 있게 한다. PcpA에 특이적인 5개 모노클로날 항체들의 혼주가 경쟁 시험관내 검정에서 안정성을 나타내는 것으로 밝혀진 경우(1-12, 1-29, 2B3, 6A4, 및 9G11), 동일한 혼주는 SASSY에서 에스. 뉴모니애 A66.1 균주로의 이의 직접적인 결합 및 CBA/N 마우스의 IV 챌린지 후 보호하기 위한 이의 잠재력에 대해 평가하였다. 도 9에서 나타낸 바와 같은 결과들은, SASSY와 수동 보호 둘 다에서 관찰된 용량 반응을 나타냈다. 10㎍/mL의 농도에서의 모노클로날 항체의 혼주로 예비 항온처리된 A66.1 균주는, A66.1(MFI= 351)에의 결합의 관점에서 포화 상태이고, 마우스에 최적의 보호를 제공하고, 한편, 모노클로날 항체의 보다 낮은 농도(2.5μg/mL)는 A66.1(MFI=197)로의 준최적 결합을 제공하고 단지 60%의 생존율을 제공한다. 111 이하의 MFI는 더 이상 보호성이 아닌 것으로 결정되었다. 항체들로 예비 항온처리된 A66.1의 4개의 독립적인 조제를 수행하고 SASSY와 수동 보호 사이의 상호관계는, 스피어맨(Spearman) 계수를 사용하여 평가하였다. 도 10 및 표 9 둘 다는, R2= 0.963인 시험관내 및 생체내 검정 둘 다 사이에 매우 강한 상호관계를 나타낸다.
상호관계는 2개의 검정 사이에 성취되었기 때문에, 분해된 PcpA 단백질은 경쟁 SASSY가 또한 기능성 판독에 결부될 수 있는지를 결정하기 위해 경쟁 SASSY 및 수동 보호 둘 다에서 시험하였다. 상기 실험에서, 상기 기술된 바와 같은 분해된 단백질은 우선 본원에 기술된 바와 같이 실온에서 모노클로날 항체와 함께 항온처리하고 A66.1의 신선한 배양물을 각각의 샘플에 첨가하여 MFI를 검출함으로써 마우스에서의 생존율과 결합 둘 다를 모니터링하였다. 도 11에 나타낸 바와 같은 결과들은, 온전한 PcpA 단백질이 10, 4.9 및 2.4㎍/mL의 단백질로 첨가되는 경우에 MFI와 생존율 둘 다의 유의한 감소를 나타내고, 한편, 이것은 1주 분해된 PcpA에서는 10 및 4.9㎍/mL로 관찰되었고 6주 분해된 PcpA에서는 단지 10㎍/mL로 관찰되었다. 이들 결과는, 시험관내 경쟁 SASSY가 동물 모델을 사용해야만 하지 않고 PcpA 제형의 생물학적 활성 및 안정성을 평가하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
43 내지 47℃에서 1주 동안 보관된 AIOOH로 제형화된 1가의 PcpA는, 단백질 함량에서 약간의 감소를 입증하였지만, 보다 큰 영향은, 시험관내 또는 생체내 검정에 의해 평가된 바와 같은 이의 항원성 및 효력의 관점에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 1주 분해된 샘플로 면역화된 래빗에서 관찰된 IgG 역가의 감소는 유의한 것으로 고려될 수 없다(4배 이상의 차이는 생물학적으로 적절한 것으로 고려된다). 대조적으로, 수동 보호에서 시험된 바와 같은 혈청의 보호 능력은, 온전한 단백질과는 대조적으로 (4배 감소: 1/20 희석과 비교하여 1/80은 보호를 제공한다) 유의한 감소를 보여주었고, 이것은, 상기 단백질이 항체를 생성시킬 수 있다 하더라도, 단백질에서 입체배좌 변화 또는 단백질과 항원보강제 사이의 보다 밀접한 상호작용으로 인해 차폐될 수 있었음을 시사한다. 이것은, 기능성 항체의 감소된 양 및 궁극적으로 효력의 감소를 유도할 수 있다. 이들 결과들은, PcpA에 대해 생성된 체액성 면역 반응의 정성적 및 정량적 양상 둘 다가 효력의 척도로서 고려되어야 함을 나타낸다.
여기에서 수행된 연구에서, 경쟁 SASSY 및 항원성 ELISA 둘 다는 고온 보관에 적용되는 경우 약물 제품에서 보호 에피토프의 상실을 검출할 수 있었다. 흥미롭게도, 항원성 ELISA 및 시험관내 경쟁 SASSY가, 모노클로날 항체를 사용하여 43 내지 47℃에서 6주 보관 후 PcpA 항원성에서 유의한 감소를 나타냈지만, 수동 보호 결과들은 상기 분해된 샘플이 여전히 보호 면역 반응을 생성시킬 수 있음을 나타냈다. 이것은, 이들 단백질이 보호 에피토프를 포함할 것인 선형 펩타이드(SDS-PAGE에 의해 확인됨)로 완전히 분해된다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 이어서, 이들 에피토프들은 면역 인식 및 기능성 항체 반응의 생성을 위해 접근 가능해질 수 있다. 몇몇의 모델에서, 수동 보호와 함께 SASSY 또는 경쟁 SASSY 사이의 상호관계가 입증되었고, 이것은, 마우스에서의 보호가 초기 단계로서 세균에 결합하는 항체에 의해 매개됨을 나타낸다. 세균이 마우스에서 어떻게 제거되는 것인지는 공지되어 있지 않다. PhtD 스트레스 받은 물질의 관점에서, 면역화된 래빗 유래의 혈청을 사용한 항원성 ELISA 및 수동 보호 연구는, 온전한 단백질과 비교하여 43 내지 47℃에서 1주 동안 처리된 샘플과의 차이를 검출할 수 있었다. 추가로, 면역화된 래빗 유래의 동일한 혈청 샘플에 대해 수행된 직접적인 SASSY는 수동 보호와 동일한 경향을 보여주었고, 이것은, 2개의 검정이 일치함을 나타낸다. 경쟁 SASSY에서 사용된 모노클로날 항체의 동일한 혼주로 A66.1 또는 WU2의 예비-항온처리는 마우스에서 보호성이 아니었고, 따라서, SASSY와 수동 보호 사이의 상호관계가 입증되었다.
실시예
4
A. SASSY를 사용한 레퍼토리 확대의 검출
SASSY가 레퍼토리 확대를 검출하기 위해 사용될 수 있는지를 결정하기 위해, 2개의 모노클로날 항체는, MIF를 결정하기 위해 단독으로 및 동시에 사용하였다. 상기 결과들은 도 12에서 입증되었다. 본원에 나타낸 바와 같이, 항체 에피토프 레퍼토리 확대는, SASSY를 사용한 표면 결합(MFI 차이)에서의 증가로서 검출될 수 있다. 도 12는 이중 지점(시리즈 1 및 2)을 설명하고 3개의 독립적인 연구를 나타낸다.
B. 백신 접종된 사람의 혈청을 사용한 SASSY
실험은, 또한, SASSY 결과들이 사람에서 생체내 면역화 연구와 상호관련이 있는지를 결정하기 위해 수행하였다. 임상 시험에 입회하고 기능성 PhtD-특이적 항체를 함유하는 것으로 공지되어 있는 사람 유래의 혈청은 SASSY에서 시험하였다. 후-백신 혈청(Bld3)은, 3개의 혈청 샘플 쌍 중 3개(#37, #43 및 #61)가 시험된 경우에 전-백신 혈청(Bld1)보다 더 높은 MFI로 포화되었다. #37에 대한 대표적인 플롯은 도 13에 나타낸다. 약한 PhtD 항체 역가 증가를 갖는 대상체 유래의 음성 대조군 혈청 쌍이 MFI에서의 증가를 보여주지 않았음을 나타낸다.
C. 고유한
펩타이드
에피토프
또한, 동일한 임상적 시험에서 관찰된 면역 반응이 고유한 에피토프에 대해 반응성이었음이 결정되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 대상체 #37 유래의 채혈 1(B1d1) 대 채혈 3(Bld3) 혈청은 프로어레이(ProArray) 펩타이드 마이크로어레이(ProImmune)을 사용한 PhtD 및 PhtE 단백질에 걸친 15량체 중첩 펩타이드에 결합을 스크리닝하였다. 양성 신호는 10K LU 이상을 갖는 것으로 고려되었고, 10K LU 초과인 쌍만이 나타난다. 유의한 차이는 3배 이상의 증가(별표)를 갖는 것으로 고려되고, 이는, Bld3에서 잠재적으로 새로운 항체 에피토프 인식을 나타낸다. 본원에 나타낸 바와 같이, 새로운 에피토프는, PhtD-262(GVAVPHGNHYHFIPY(서열번호 1)), PhtD-290(FYNKAYDLLARIHQD(서열번호 2)), PhtD-348(SADNLYKPSTDTEET(서열번호 3)), PhtD-349(YKPSTDTEETEEEAE(서열번호 4)), PhtD-360(ETLTGLKSSLLLGTK(서열번호 5)), PhtE-404(YIPKSDLSASELAAA(서열번호 6)), 및 PhtE-440(AYIVRHGDHFHYIPK(서열번호 7))을 포함하였다. 또한, PhtE-404, 및 PhtE-440은 PhtD와 교차-반응성이었음이 관찰되었다.
본 발명은, 바람직한 실시형태의 관점에서 기술되었지만, 변화 및 변형은 당업자에게 자명한 것으로 이해된다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는, 청구된 바와 같은 본 발명의 범위 내인 모든 균등한 변화를 보호하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> SANOFI PASTEUR, LTD.
<120> METHODS FOR ASSESSING IMMUNOGENICITY
<130> PAT 7767W-90
<150> US 61/737,234
<151> 2012-12-14
<160> 7
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 1
Gly Val Ala Val Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 2
Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Ala Arg Ile His Gln Asp
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<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 3
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<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 4
Tyr Lys Pro Ser Thr Asp Thr Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Glu
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<211> 15
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 7
Ala Tyr Ile Val Arg His Gly Asp His Phe His Tyr Ile Pro Lys
1 5 10 15
Claims (25)
- a) 하나 이상의 항원들을 포함하는 약물 제품을 하나 이상의 항원들 중 하나 이상에 대해 반응성인 항체들을 포함하는 항체 조성물과 접촉시켜 시험 조성물을 생성시키는 단계;
b) 상기 시험 조성물을 상기 항원들 중 하나 이상을 발현하는 시험 세포와 접촉시키는 단계; 및
c) 상기 시험 세포로의 항체의 결합을 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 항원이 세포 표면 항원인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시험 세포가, 미생물, 종양 세포, 바이러스 항원을 발현하는 세포, 또는 재조합 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 조성물이, 혈청, 복수액(ascite), 세포 배양 상청액, 폴리클로날 항혈청, 모노클로날 항체 조성물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 용액 중에 존재하거나 고체 표면에 부착되어 있는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물에 대한 항체의 검출이 유동 세포측정에 의한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 세포에 대한 항체의 검출이, 상기 약물 제품이 온전하지 않음을 나타내는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 세포에 대한 항체의 검출의 부재가, 약물 제품이 온전함을 나타내는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 혈청이, 상기 약물 제품 중에 존재하는 항원으로 면역화된 포유동물로부터 유도되는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이, 항체와 반응성인 하나 이상의 입체배좌 에피토프를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 약물 제품과 함께 단계 (a) 내지 (c)를 수행하는 단계, 및 제1 및 제2 약물 제품에 대한 상기 시험 세포 상에서 검출된 항체의 양을 비교하는 단계를 별도로 추가로 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 약물 제품이 대조군 약물 제품인, 방법.
- 제11항에 있어서, 제1 약물 제품과 비교하여 제2 약물 제품으로의 항온처리 후 보다 많은 항체의 검출이, 제2 약물 제품이 제1 약물 제품에 비해 덜 온전하거나 온전하지 않음을 나타내는, 방법.
- 제11항 또는 제13항에 있어서, 상기 제1 및 제2 약물 제품이, 상이한 로트의 동일한 약물 제품인, 방법.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 제품 효력이 결정되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 약물 제품이 백신인, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 제품이 백신인, 방법.
- 대조군 반응을 수행하기 위해 요구되는 구성성분들 및 사용 지침서를 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
- 포유동물 혈청을, 포유동물이 이전에 백신 접종된 하나 이상의 세포 표면 항원을 발현하는 시험 세포와 접촉시키고; 여기에 존재하는 경우 상기 시험 세포에 대한 혈청의 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 백신 효능을 측정하기 위한 방법.
- 제19항에 있어서, 백신의 투여 후 포유동물의 제2 혈청 샘플 유래의 항체의 결합과, 백신이 이전에 투여되지 않은 포유동물의 제1 혈청 샘플의 항체의 결합을 비교함을 추가로 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 제2 혈청 샘플이, 백신을 투여한지 7일 이상 후에 포유동물로부터 수득되는, 방법.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인, 방법.
- 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 세포가, 미생물, 종양 세포, 바이러스 항원을 발현하는 세포, 또는 재조합 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- PhtD-262(GVAVPHGNHYHFIPY(서열번호 1)), PhtD-290 (FYNKAYDLLARIHQD(서열번호 2)), PhtD-348 (SADNLYKPSTDTEET(서열번호 3)), PhtD-349(YKPSTDTEETEEEAE(서열번호 4)), PhtD-360(ETLTGLKSSLLLGTK(서열번호 5)), PhtE-404(YIPKSDLSASELAAA(서열번호 6)), 및 PhtE-440(AYIVRHGDHFHYIPK(서열번호 7))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 펩타이드.
- 제24항의 펩타이드를 포함하는 조성물.
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