DE69934299T2

DE69934299T2 - Gruppe b-streptococcus antigene

Info

Publication number: DE69934299T2
Application number: DE69934299T
Authority: DE
Inventors: R. Bernard Sillery BRODEUR; Clement Ville de Cap Rouge RIOUX; Martine Beauport BOYER; Isabelle St-Nicolas CHARLEBOIS; Josee Sillery HAMEL; Denis St-Augustin-de-Desmaures MARTIN
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2019-02-18
Also published as: OA11686A; IL190018A; CA2321106A1; HU228497B1; EP2280072B1; CN1944652A; CA2321106C; EP1757697A3; KR100771148B1; AP2000001886A0; WO1999042588A2; CZ301056B6; US20110182923A1; EP1054971A2; US20030228323A1; US7914794B2; DE69934299D1; AU2505999A; IL137921A; EP2280072A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antigene, genauer gesagt Protein-Antigene von Gruppe B-Streptococcus (GBS) bakteriellem Pathogen, die als Vakzin-Komponenten für die Therapie und/oder Prophylaxe nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Streptococcen sind grampositive Bakterien, die durch die gruppenspezifische Kohlenhydratantigene A bis O, die auf ihrer Zelloberfläche angetroffen werden, differenziert werden. Die Streptococcus-Gruppen werden weiter durch typspezifische Kapsel-Polysaccharid-Antigene unterschieden. Etliche Serotypen wurden für Gruppe B-Streptococcus (GBS) identifiziert: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII und VIII. GBS enthält auch antigene Proteine, die als "C-Proteine" (alpha, beta, gamma und delta) bekannt sind, von denen einige kloniert wurden.
Obwohl GBS ein üblicher Bestandteil der normalen menschlichen Vaginal- und Kolonflora ist, ist seit langem bekannt, dass dieses Pathogen eine Hauptursache für die neonatale Sepsis und Meningitis, late-onset-Meningitis bei Kleinkindern, Postpartum-Endometritis wie auch Mastitis in Milchkuhherden ist. Schwangere Mütter, die GBS ausgesetzt werden, haben ein Risiko einer Postpartum-Infektion und können die Infektion auf ihr Baby übertragen, wenn das Kind durch den Geburtskanal kommt. Obwohl der Organismus gegenüber Antibiotika empfindlich ist, führt die hohe Angriffsrate und der schnelle Ausbruch der Sepsis bei Neugeborenen und die Meningitis bei Kleinkindern zu einer hohen Morbidität und Mortalität.
Um ein Vakzin zu finden, das Individuen vor GBS-Infektionen schützen kann, haben sich die Forschungen auf die typspezifischen Antigene gerichtet. Unglücklicherweise haben sich die Polysaccharide als schlecht immunogen bei Menschen erwiesen und sind auf den bestimmten Serotyp beschränkt, von dem das Polysaccharid abstammt. Weiterhin rufen Polysaccharide eine T-Zell-unabhängige Reaktion hervor, d.h. keine IgG-Produktion. Dementsprechend sind kapsuläre Polysaccharidantigene als Vakzin-Komponente für einen Schutz gegen eine GBS-Infektion ungeeignet.
Andere haben ihre Aufmerksamkeit auf das C-Protein beta-Antigen gerichtet, das immunogene Eigenschaften in Mäusen und Kaninchenmodellen demonstrierte. Es erwies sich, dass dieses Protein als menschliches Vakzin ungeeignet ist, da es die unerwünschte Eigenschaft einer Interaktion in hoch affiner und nicht-immunogener Weise mit der Fc-Region von menschlichem IgA aufweist. Das C-Protein alpha-Antigen ist bei Typ III-Serotypen von GBS selten, wobei es sich um den Serotyp handelt, der für die meisten GBS-vermittelten Zustände verantwortlich ist und ist daher von geringer Verwendung als Vakzin-Komponente.
Daher bleibt ein noch nicht erfüllter Bedarf an GBS-Antigenen, die als Vakzin-Komponenten für die Prophylaxe und/oder Therapie einer GBS-Infektion verwendet werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit, das ein Polypeptid codiert mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid, umfassend eine Sequenz, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 44 oder Fragmenten davon.
Gemäß anderen Aspekten werden Vektoren bereitgestellt, umfassend Polynukleotide der Erfindung, operabel an eine Expressionskontrollregion gebunden, wie auch Wirtszellen, die mit den Vektoren transfiziert sind und Verfahren zur Erzeugung von Polypeptiden, umfassend das Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen für eine Expression.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt werden neue Polypeptide bereitgestellt, die von den Polynukleotiden der Erfindung codiert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a (nur zur Referenz) ist die DNA-Sequenz von Klon 1 (SEQ ID NO: 1) mit den korrespondierenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen;
1b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2;
1c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3;
1d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4;
1e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 5;
1f ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6;
2a (nur zur Referenz) ist die DNA-Sequenz von Klon 2 (SEQ ID NO: 7) mit den korrespondierenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen;
2b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 8;
2c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 9;
2d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10;
2e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11;
2f ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 12;
3a (nur zur Referenz) ist die DNA-Sequenz von Klon 3 (SEQ ID NO: 13) mit den korrespondierenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen
3b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 14;
3c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 15;
3d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 16;
3e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 17;
3f ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 18;
3g ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 19;
3h ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 20;
3i ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 21;
4a (nur zur Referenz) ist die DNA-Sequenz von Klon 4 (SEQ ID NO: 22) mit den korrespondierenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen;
4b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 23;
4c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 24;
4d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 25;
4e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 26;
5a (nur zur Referenz) ist die DNA-Sequenz von Klon 5 (SEQ ID NO: 27) mit den korrespondierenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen;
5b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 28;
5c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 29;
5d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 30;
5e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 31;
6a (nur zur Referenz) ist die DNA-Sequenz von Klon 6 (SEQ ID NO: 32);
6b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 33;
6c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 34;
6d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 35;
6e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 36;
7a ist die DNA-Sequenz von Klon 7 (SEQ ID NO: 37); (erfinderisch)
7b ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 38;
7c ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 39; (erfinderisch)
7d ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 40;
7e ist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 41;
8 ist die DNA-Sequenz eines Teils von Klon 7, einschließlich einer Signalsequenz (SEQ ID NO: 42); (erfinderisch)
9 ist die DNA-Sequenz eines Teils von Klon 7 ohne Signalsequenz (SEQ ID NO: 43); (erfinderisch)
9a ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 44); (erfinderisch)
10 repräsentiert die Verteilung von anti-GBS ELISA-Titern in Seren von CD-1-Mäusen, die mit rekombinantem GBS-Protein immunisiert wurden, korrespondierend zu SEQ ID NO: 39 (erfinderisch).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue antigene Polypeptide von Gruppe B-Streptococcus (GBS), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 44.
Die Erfindung beinhaltet SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 44.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist SEQ ID NO: 39.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform ist SEQ ID NO: 44.
Wie hier verwendet, beinhalten "Fragmente" der Polypeptide der Erfindung diejenigen Polypeptide, worin ein oder mehr der Aminosäurereste durch einen konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise konserviert) ersetzt sind und die natürlich oder unnatürlich sein können.
Die Bezeichnung "Fragmente" der Polypeptide der vorliegenden Erfindung beinhalten auch Polypeptide, die durch Addition, Deletion, Substitution von Aminosäuren modifiziert wurden unter der Voraussetzung, dass sich die Polypeptide die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion erhalten.
Unter der Bezeichnung "konservierte Aminosäure" wird eine Substitution von ein oder mehr Aminosäuren anstelle einer anderen verstanden, worin die antigene Determinante (einschließlich ihrer Sekundärstruktur und hydropathischen Struktur) eines gegebenen Antigens vollständig oder teilweise trotz der Substitution konserviert ist.
Beispielsweise können ein oder mehr Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure einer ähnlichen Polarität ersetzt werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, was zu einer stillen Veränderung führt. Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse gewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Beispielsweise beinhalten die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren beinhalten Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren beinhalten Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren beinhalten Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Vorzugsweise werden die Derivate und Analoge der Polypeptide der Erfindung ungefähr 70% Identität zu denjenigen Sequenzen aufweisen, die in den Figuren illustriert sind oder Fragmenten davon. Das heißt, 70% der Reste sind dieselben. Noch bevorzugter werden die Polypeptide mehr als 95% Homologie aufweisen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Derivate und Analoge der Polypeptide der Erfindung weniger als ungefähr 20 Aminosäurerestsubstitutionen, Modifikationen oder Deletionen und noch bevorzugter weniger als 10 aufweisen. Bevorzugte Substitutionen sind die auf dem Gebiet als konserviert bekannten, d.h. die substituierten Reste teilen sich physikalische oder chemische Eigenschaften wie Hydrophobizität, Größe, Ladung oder funktionelle Gruppen.
Weiterhin kann es in denjenigen Situationen, in denen sich Aminosäureregionen als polymorph erweisen, wünschenswert sein, ein oder mehr bestimmte Aminosäuren zu variieren, um die unterschiedlichen Epitope der unterschiedlichen GBS-Stämme effektiver nachzuahmen.
Es sind auch Polypeptide beinhaltet, die andere Verbindungen fusioniert aufweisen, die die biologischen oder pharmakologischen Eigenschaften der Polypeptide ändern, d.h. Polyethylenglycol (PEG), um die Halblebenszeit zu erhöhen; Leader oder sekretorische Aminosäuresequenzen, um die Reinigung zu vereinfachen; präpro- und pro-Sequenzen und (Poly)saccharide.
Außerdem können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch eine terminale -NH₂-Acylierung (z.B. durch Acetylierung oder Thioglycolsäureamidierung, terminale Carboxyamidierung, z.B. mit Ammoniak oder Methylamin) für die Bereitstellung einer Stabilität, erhöhte Hydrophobizität für eine Bindung oder Bindung an einen Träger oder ein anderes Molekül modifiziert sein.
Ebenfalls werden Hetero- und Homopeptidmultimere der Polypeptidfragmente, Analoge und Derivate betrachtet. Diese polymeren Formen beinhalten beispielsweise ein oder mehr Polypeptide, die mit Vernetzungsmitteln wie z.B. Avidin/Biotin, Glutaraldehyd oder Dimethylsuperimidat vernetzt wurden. Solche polymeren Formen beinhalten auch Polypeptide, die zwei oder mehr Tandem oder invertierte benachbarte Sequenzen enthalten, erzeugt aus multicistronischen mRNAs, erzeugt durch rekombinante DNA- Technologie. Vorzugsweise wird ein Fragment, Analog oder Derivat des Polypeptids der Erfindung mindestens eine antigene Region, d.h. mindestens ein Epitop umfassen.
Um die Bildung antigener Polymere, (d.h. synthetischer Multimere) zu erreichen, können Polypeptide mit Bishalogenacetylgruppen, Nitroarylhalogeniden oder ähnlichem verwendet werden, wobei die Reagenzien für Thiogruppen spezifisch sind. Daher kann die Verbindung zwischen zwei Mercaptogruppen der unterschiedlichen Peptide eine einfache Bindung sein oder kann aus einer Bindungsgruppe von mindestens zwei, typischerweise mindestens vier und nicht mehr als 16, in der Regel jedoch nicht mehr als ungefähr 14 Kohlenstoffatomen bestehen.
In einer besonderen Ausführungsform enthalten die Polypeptidfragmente der Erfindung keinen Methionin-(Met)-Startrest. Vorzugsweise werden die Polypeptide nicht eine Leader- oder sekretorische Sequenz (Signalsequenz) inkorporieren. Der Signalanteil des Polypeptids der Erfindung kann gemäß etablierten molekularbiologischen Techniken bestimmt werden. Im Allgemeinen kann das Polypeptid von Interesse aus einer GBS-Kultur isoliert und darauffolgend sequenziert werden, um den Anfangs-Rest des reifen Proteins zu bestimmen und daher die Sequenz des reifen Polypeptids.
Gemäß einem anderen Aspekt werden Vakzin-Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend ein oder mehr GBS-Polypeptide der Erfindung, vermischt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans.
Geeignete Adjuvantien beinhalten Öle, d.h. Freunds komplettes oder inkomplettes Adjuvans; Salze, d.h. AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄)₂, Al(OH)₃, AlPO₄, Silika, Kaolin; Saponinderivate; Kohlenstoffpolynukleotide, d.h. Poly IC und Poly AU und auch Detoxizität des Choleratoxin (CTB) und E. coli hitzelabiles Toxin zur Induktion einer Mukosa-Immunität.
Bevorzugte Adjuvantien beinhalten QuilA^TM, Alhydrogel^TM und Ajuphos^TM. Die Vakzine der Erfindung können parenteral durch Injektion, schnelle Infusion, nasopharyngeale Absorption, Dermoabsorption oder bukal oder oral verabreicht werden.
Vakzin-Zusammensetzungen der Erfindung werden für die Behandlung oder Prophylaxe von Streptococcus-Infektionen und/oder Erkrankungen und Symptomen, die durch Streptococcus-Infektionen vermittelt werden, verwendet, insbesondere von Gruppe A-Streptococcus (pyogenes), Gruppe B-Streptococcus (GBS oder agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia wie auch Staphylococcus aureus. Allgemeine Informationen über Streptococcus sind erhältlich aus Manual of Clinical Microbiology von P.R. Murray et al. (1995, 6. Ausgabe, ASM Press, Washington, D.C.). Insbesondere Gruppe B-Streptococcus, agalactiae. In einer besonderen Ausführungsform werden die Vakzine denjenigen Individuen verabreicht, die das Risiko einer GBS-Infektion tragen, wie z.B. Schwangeren und Kleinkindern im Hinblick auf Sepsis, Meningitis und eine Pneumonie wie auch immunkompromittierte Individuen, wie z.B. diejenigen mit einem Diabetes, einer Lebererkrankung oder Krebs. Die Vakzine können auch veterinärmedizinische Anwendungen haben, wie z.B. für die Behandlung von Mastitis bei Rindern, die durch die oben erwähnten Bakterien wie auch E. coli vermittelt wird.
Das Vakzin der vorliegenden Erfindung kann auch für die Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das für die Behandlung oder Prophylaxe von Streptococcus-Infektionen oder Erkrankungen und Symptomen, die durch eine Streptococcus-Infektion vermittelt werden, verwendet werden kann, insbesondere Gruppe A-Streptococcus (pyogenes), Gruppe B-Streptococcus (GBS oder agalactiae), dysgalactiae, uberis, Nocardia wie auch Staphylococcus aureus. Ganz besonders Gruppe B-Strptococcus, agalactiae.
Vakzin-Zusammensetzungen befinden sich vorzugsweise in einer Einheitsdosisform von ungefähr 0,001 bis 100 μg/kg (Antigen/Körpergewicht) und noch bevorzugter 0,01 bis 10 μg/kg und besonders bevorzugt 0,1 bis 1 μg/kg ein- bis dreimal mit einem Intervall von ungefähr 1 bis 12 Wochen-Intervallen zwischen den Immunisierungen und noch bevorzugter 1 bis 6. Gemäß einem anderen Aspekt werden Polynukleotide bereitgestellt, codierend Polypeptide von Gruppe B-Streptococcus (GBS), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 44 oder Fragmenten davon.
Bevorzugte Polynukleotide sind diejenigen, die in 7a (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) und 9 (SEQ ID NO: 43) illustriert werden, die zu den offenen Leserahmen korrespondieren, die die Polypeptide der Erfindung codieren.
Bevorzugte Polynukleotide sind diejenigen, die in den 7a (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) und 9 (SEQ ID NO: 43) illustriert sind und Fragmente davon.
Noch bevorzugtere Polynukleotide der Erfindung sind die in den 7 (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) und 9 (SEQ ID NO: 43) illustrierten.
Die besonders bevorzugten Polynukleotide der Erfindung sind die in den 8 (SEQ ID NO: 42) und 9 (SEQ ID NO: 43) illustrierten.
Es wird anerkannt werden, dass die in den Figuren illustrierten Polynukleotidsequenzen mit degenerierten Codons verändert werden können, die die Polypeptide der Erfindung immer noch codieren.
Aufgrund der Redundanz der Nukleotid codierenden Sequenzen können andere Polynukleotidsequenzen, die im wesentlichen dieselben Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese beinhalten Nukleotidsequenzen, die durch Substitution unterschiedlicher Codons verändert wurden, die denselben Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren, und so eine stille Veränderung erzeugen, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung weiterhin Polynukleotide bereit, die mit den Polynukleotidsequenzen wie oben beschrieben (oder den Komplementsequenzen davon) mit einer mindestens 70%igen Identität zwischen den Sequenzen hybridisieren. Noch bevorzugter sind Polynukleotide unter stringenten Bedingungen, d.h. mit mindestens 95% Identität und noch bevorzugter mehr als 97% Identität hybridisierbar.
Unter der Fähigkeit zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist das Anhaften eines Nukleinsäuremoleküls an mindestens eine Region einer zweiten Nukleinsäuresequenz gemeint (egal ob cDNA, mRNA oder genomische DNA) oder an den komplementären Strang unter Standardbedingungen, z.B. hohe Temperatur und/oder niedriger Salzgehalt, die dazu neigen, eine Hybridisierung von nicht-komplementären Nukleotidsequenzen ungünstig zu beeinflussen scheinen. Ein geeignetes Protokoll wird in Maniatis T. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 beschrieben, was hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist.
In einem weiteren Aspekt können Polynukleotide, die Polypeptide der Erfindung codieren oder Fragmente davon in einem DNA-Immunisierungsverfahren verwendet werden. Das heißt, sie können in einen Vektor eingebaut werden, der bei Injektion replizierbar und exprimierbar ist und dadurch das antigene Polypeptid in vivo erzeugt. Beispielsweise können die Polynukleotide in einen Plasmidvektor unter der Kontrolle des CMV-Promotors, der in eukaryontischen Zellen funktionell ist, eingebaut werden. Vorzugsweise wird der Vektor intramuskulär injiziert.
Gemäß einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Erzeugung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Verfahren bereitgestellt, durch Expression eines Polynukleotids, das das Polypeptid codiert in einer Wirtszelle und Gewinnen des exprimierten Polypeptidprodukts. Alternativ können die Polypeptide gemäß etablierten chemischen Syntheseverfahren erzeugt werden, d.h. eine Lösungsphase- oder Festphasensynthese von Oligopeptiden, die ligiert werden, um das volle Polypeptid zu erzeugen (Blockligation).
Für eine rekombinante Produktion werden Wirtszellen mit Vektoren transfiziert, die das Polypeptid codieren und dann in einem Nährmedium kultiviert, das je nach Eignung, um Promotoren zu aktivieren, Transformanten zu selektieren oder die Gene zu amplifizieren, modifiziert wird. Geeignete Vektoren sind diejenigen, die in dem gewählten Wirt lebensfähig und replikationsfähig sind und beinhalten chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z.B. bakterielle Plasmide, Phagen-DNA, Baculovirus, Hefeplasmide, Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abstammen. Die Polypeptidsequenz kann in den Vektor an einer geeigneten Stelle unter Verwendung von Restriktionsenzymen eingebaut werden, so dass sie operabel an eine Expressionskontrollregion gebunden ist, umfassend einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle (Consensusregion oder Shine-Dalgarno-Sequenz) und optional einen Operator (Kontrollelement). Man kann individuelle Komponenten der Expressions-Kontrollregion, die für einen gegebenen Wirt und Vektor geeignet sind, gemäß etablierten molekularbiologischen Prinzipien wählen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, hier durch Referenz eingeschlossen). Geeignete Promotoren beinhalten den LTR- oder SV40-Promotor, E. coli lac-, tac- oder trp-Promotoren und den Phagen-λ-P_L-Promotor, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Die Vektoren werden vorzugsweise einen Replikationsursprung beinhalten wie auch Selektionsmarker, d.h. das Ampicillin-Resistenzgen. Geeignete bakterielle Vektoren beinhalten pET, pQE70, PQE60, pQE-9, pbs, pD10-Phagenscript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 und eukaryontische Vektoren pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL. Wirtszellen können bakteriell sein, z.B. E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; Pilze, d.h. Aspergillus niger, Aspergillus nidulains; Hefen, d.h. Saccharomyces oder eukaryontisch, d.h. CHO, COS.
Bei Expression des Polypeptids in die Kultur werden die Zellen typischerweise durch Zentrifugation geerntet, dann durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen (wenn das exprimierte Polypeptid nicht in die Medien sezerniert wird) und der resultierende Rohextrakt wird zurückgehalten, um das Polypeptid von Interesse zu isolieren. Die Reinigung des Polypeptids aus Kulturmedien oder Lysat kann durch etablierte Techniken erreicht werden, abhängig von den Eigenschaften des Polypeptids, d.h. unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder einer Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie. Die endgültige Reinigung kann unter Verwendung von HPLC erreicht werden.
Das Polypeptid kann mit oder ohne einen Leader oder eine Sekretionssequenz exprimiert werden. Im ersteren Fall kann der Leader unter Verwendung einer posttranslationalen Verarbeitung entfernt werden (siehe US 4,431,739 ; 4,425,437 und 4,338,397) oder kann chemisch folgend auf eine Reinigung des exprimierten Polypeptids entfernt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt können die GBS-Polypeptide der Erfindung in einem diagnostischen Test für eine Streptococcusinfektion, insbesondere eine GBS-Infektion verwendet werden. Etliche diagnostische Verfahren sind möglich, beispielsweise den Nachweis von Streptococcus-Organismen in einer biologischen Probe, wobei man dem folgenden Verfahren folgt:

a) Erhalt einer biologischen Probe von einem Patienten;
b) Inkubation eines Antikörpers oder Fragments davon, das mit einem GBS-Polypeptid der Erfindung reaktiv ist, mit der biologischen Probe zur Bildung einer Mischung und
c) Nachweis von spezifisch gebundenem Antikörper oder gebundenem Fragment in der Mischung, das die Gegenwart von Streptococcus anzeigt.

Alternativ kann ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers, der für ein Streptococcus-Antigen in einer biologischen Probe spezifisch ist, die den Antikörper enthält oder von der vermutet wird, dass sie ihn enthält, wie folgt durchgeführt werden:

a) Isolation der biologischen Probe von einem Patienten;
b) Inkubation von ein oder mehr GBS-Polypeptiden der Erfindung oder Fragmenten davon mit der biologischen Probe zur Bildung einer Mischung und
c) Nachweis von spezifisch gebundenem Antigen oder gebundenem Fragment in der Mischung, was die Gegenwart von einem Antikörper, der für Streptococcus spezifisch ist, anzeigt.

Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass dieser diagnostische Test etliche Formen annehmen kann, einschließlich einem immunologischen Test, wie z.B. einen enzymgebundenen Immunosorbentassay (ELISA), einem Radioimmunoassay oder einem Latex-Agglutinationsassay, im wesentlichen um zu bestimmen, ob die für das Protein spezifischen Antikörper in einem Organismus vorliegen.
Die DNA-Sequenzen, die die Polypeptide der Erfindung codieren, können auch verwendet werden, um DNA-Sonden zur Verwendung beim Nachweis der Gegenwart von Streptococcus in einer biologischen Probe zu entwerfen, von der vermutet wird, dass sie solche Bakterien enthält. Das Nachweisverfahren dieser Erfindung umfasst:

a) Isolation der biologischen Probe von einem Patienten;
b) Inkubation von ein oder mehr DNA-Sonden mit einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert oder Fragmenten davon mit der biologischen Probe zur Bildung einer Mischung und
c) Nachweis von spezifisch gebundener DNA-Sonde in der Mischung, was die Gegenwart von Streptococcus-Bakterien anzeigt.

Die DNA-Sonden dieser Erfindung können auch zum Nachweis von zirkulierendem Streptococcus verwendet werden, d.h. GBS-Nukleinsäuren in einer Probe, z.B. unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion als Diagnoseverfahren von Streptococcus-Infektionen. Die Sonde kann unter Verwendung konventioneller Techniken synthetisiert und auf einer Festphase immobilisiert werden oder kann mit einer nachweisbaren Markierung markiert werden. Eine bevorzugte DNA-Sonde für diese Anwendung ist ein Oligomer mit einer Sequenz, die zu mindestens ungefähr 6 benachbarten Nukleotiden der GBS-Polypeptide der Erfindung komplementär ist.
Ein anderes Diagnoseverfahren zum Nachweis von Streptococcus bei einem Patienten umfasst:

a) Markierung eines Antikörpers, der mit einem Polypeptid der Erfindung oder Fragment davon reaktiv ist mit einer nachweisbaren Markierung;
b) Verabreichung des markierten Antikörpers oder markierten Fragments an den Patienten und
c) Nachweis von spezifisch gebundenem markiertem Antikörper oder markiertem Fragment in dem Patienten, was die Gegenwart von Streptococcus anzeigt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der GBS-Polypeptide der Erfindung als Immunogene für die Erzeugung spezifischer Antikörper für die Diagnose und insbesondere die Behandlung einer Streptococcus-Infektion. Geeignete Antikörper können unter Verwendung geeigneter Screening-Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch Messung der Fähigkeit eines bestimmten Antikörpers, passiv gegen Streptococcus-Infektion in einem Testmodell zu schützen. Ein Beispiel eines Tiermodells ist das Maus-Modell, das hier in den Beispielen beschrieben wird. Der Antikörper kann ein ganzer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon sein und kann im allgemeinen zu jeder Immunglobulinklasse gehören. Der Antikörper oder das Fragment kann von tierischem Ursprung sein, insbesondere vom Säugerursprung und genauer gesagt von murinem, Ratten oder menschlichem Ursprung. Es kann sich um einen natürlichen Antikörper oder Fragment davon handeln oder falls gewünscht, einen rekombinanten Antikörper oder Antikörperfragment. Die Bezeichnung rekombinanter Antikörper oder Antikörperfragment bedeutet einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, die unter Verwendung molekular biologischer Techniken erzeugt wurden. Der Antikörper oder die Antikörperfragmente können polyklonal oder vorzugsweise monoklonal sein. Sie können für eine Anzahl von Epitopen spezifisch sein, die mit den GBS-Polypeptiden assoziiert sind, sind jedoch vorzugsweise für eines spezifisch.
Beispiel 1 Murines Modell einer lethalen Gruppe B-Streptococcus-(GBS)-Infektion
Das Mausmodell einer GBS-Infektion wird im Detail in Lancefield et al. (J Exp Med 142:165-179, 1975) beschrieben. Der GBS-Stamm 0388/90 (klinisches Isolat, erhalten 1990 aus einer Cephalorachidianflüssigkeit eines Patienten, der an Meningitis litt, Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Kanada) und NCS246 (National Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Kanada) wurden jeweils als Typ Ia/c und Typ II/R serotypisiert.
Um ihre virulenz zu erhöhen, wurden die GBS-Stämme 0388190 (Serotyp Ia/c) und NCS 246 (Serotyp II/R) seriell durch Mäuse, wie früher beschrieben, passagiert (Lancefield et al., J Exp Med 142:165-179, 1975). Kurz gefasst wurde der Anstieg der Virulenz unter Verwendung intraperitonealer Inokulationen serieller Verdünnungen einer Subkultur in Todd-Hewitt broth überwacht, erhalten von entweder dem Blut oder der Milz infizierter Mäuse. Nach der letzten Passage wurden die infizierten Blutproben verwendet, um die Todd-Hewitt broth zu inokulieren. Nach zweistündiger Inkubation bei 37°C mit 7% CO₂ wurde Glycerin in einer Endkonzentration von 10% (V/V) der Kultur zugefügt. Die Kultur wurde dann in Aliquots verteilt und bei –80°C zur Verwendung in GBS-Chellenge-Experimenten gelagert. Die Anzahl an KBE von GBS, die in diesen gefrorenen Proben vorlagen, wurde bestimmt. Die bakterielle Konzentration, die notwendig war, um 100 (LD100) der 18 Wochen alten Mäuse zu töten, wurde als 3,5 × 10⁵ bzw. 1,1 × 10⁵ für den GBS-Stamm C388/90 und NCS246 bestimmt, was einem signifikanten Anstieg der Virulenz für beide Stämme entsprach. Tatsächlich lag die LD100, die vor den Passagen für diese beiden Stämme aufgezeichnet wurde, bei mehr als 10⁹ KBE.
In einer Bakterienaussetzung wurde ein frisch aufgetautes Aliquot eines virulenten GBS-Stamms auf die ungefähre bakterielle Konzentration unter Verwendung von Todd-Hewitt broth eingestellt und 1 ml wurde intraperitoneal jeder weiblichen CD-1-Maus injiziert. Die für die passiven Schutzexperimente verwendeten Mäuse waren 6 bis 8 Wochen alt, während diejenigen, die für die aktiven Schutzexperimente verwendet wurden, waren zum Zeitpunkt der Aussetzung ungefähr 18 Wochen alt. Alle Inokula wurden durch Koloniezählungen verifiziert. Die Tiere wurden im Hinblick auf irgendwelche Infektionszeichen viermal täglich für die ersten 48 Stunden nach der Aussetzung und dann täglich für die nächsten 12 Tage beobachtet. Nach Ende dieser Zeitspanne wurden Blutproben von den Überlebenden erhalten und bei –20°C eingefroren. Die von jeder Maus, die die Aussetzung überlebte, erhaltene Milz wurde kultiviert, um verbleibendes GBS zu identifizieren.
Beispiel 2 Immunisierung und Schutz bei Mäusen mit Formaldehyd-getöteten ganzen GBS-Zellen
Formaldehyd-getötete GBS ganze Zellen wurden gemäß den in Lancefield et al. (J Exp Med 142:165-179, 1975) beschriebenen Verfahren hergestellt. Kurz gefasst wurde eine Übernachtkultur auf Schafblut-Agarplatten (Quelab Laboratories, Montreal, Kanada) eines GBS-Stamms zweimal in PBS-Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,2) gewaschen, auf ungefähr 3 × 10⁹ KBE/ml eingestellt und über Nacht in PBS inkubiert, enthaltend 0,3% (V/V) Formaldehyd. Die getötete GBS-Suspension wurde mit PBS gewaschen und bei –80°C eingefroren gehalten.
Weiblichen CD-1-Mäusen, die 6 bis 8 Wochen alt waren (Charles River, St-Constant, Québec, Kanada) wurde subkutan dreimal in einem zweiwöchigen Intervall 0,1 ml Formaldehyd getötete Zellen des GBS-Stamms C388/90 (^~6 × 10⁷ GBS) oder 0,1 ml PBS für die Kontrollgruppe injiziert. Am Tag vor der Immunisierung wurde Alhydrogel^TM (Superfos Biosector, Frederikssund, Dänemark) in einer Endkonzentration von 0,14 mg oder 0,21 mg Al diesen Präparationen zugefügt und über Nacht bei 4°C unter Bewegung inkubiert. Von jeder Maus wurden vor dem Beginn des Immunisierungsprotokolls und zwei Wochen nach der letzten Injektion Serumproben erhalten. Die Seren wurden bei –20°C eingefroren.
Acht Mäusen in jeder Kontrollgruppe wurde GBS injiziert und die mit Formaldehyd getöteten ganzen GBS-Zellen vom Stamm C388/90 (Ia/c) immunisierte Gruppe wurde mit 1,5 × 10⁴ KBE des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) eine Woche nach der dritten Injektion dem Antigen ausgesetzt. Alle mit den Formaldehyd-getöteten ganzen GBS-Zellen immunisierten Mäuse überlebten die homologe Aussetzung, während nur 4 von 8 Mäusen, denen PBS injiziert worden war, innerhalb von 5 Tagen nach der Antigenaussetzung die Infektion überlebten. Um die Mortalitätsrate in den Kontrollgruppen zu erhöhen, musste die bakterielle Suspension gemäß dem Alter der Mäuse zum Zeitpunkt der bakteriellen Aussetzung eingestellt werden. In darauffolgenden Antigen-Aussetzungsexperimenten wurde das bakterielle Inokulum bei Mäusen, die älter als 15 Wochen waren, auf Konzentrationen zwischen 3,0 × 10⁵ und 2,5 × 10⁶ KBE angehoben. Tabelle 1 Immunisierung von CD1-Mäusen mit Formaldehyd-getöteten ganzen GBS-Zellen und darauffolgende homologe Antigenaussetzung (Stamm C388/90 (Ia/c)] und heterologe Aussetzung (Stamm NCS246 (II/R)]

¹ es wurde Alhydrogel^TM mit einer Endkonzentration von 0,14 mg oder 0,21 mg Al verwendet,
² ungefähr 6 × 10⁷ KBE,
³ intraperitoneale Antigenaussetzung mit 1 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium, enthaltend GBS C388/90 (Ia/c) -Suspension, eingestellt auf 1,5 × 10⁴ KBE,
⁴ intraperitoneale Antigenaussetzung mit 1 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium, enthaltend GBS C388/90 (Ia/c) -Suspension, eingestellt auf 2,1 × 10⁶ KBE,
⁵ nicht durchgeführt,
⁶ intraperitoneale Antigenaussetzung mit 1 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium, enthaltend GBS NCS246 (II/R) -Suspension, eingestellt auf 1,2 × 10⁵ KBE.

In einem anderen Experiment wurde einer Gruppe von 12 Mäusen, die einer Kontrollgruppe entsprachen, PBS injiziert, während eine zweite Gruppe von 12 Mäusen mit Formaldehyd-getöteten ganzen Zelle des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) immunisiert wurde. Sechs Mäuse aus jeder dieser beiden Gruppen wurden mit 2,1 × 10⁶ KBE des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) (Tabelle I) Antigen ausgesetzt. Als erstes Antigen-Aussetzungsexperiment überlebten alle Mäuse, die mit dem GBS-Stamm C388/90 (Ia/c) immunisiert worden waren wie homologe Antigen-Aussetzung. Nur zwei der sechs Mäuse, denen PBS injiziert worden war, überlebten die Infektion.
Die verbleibenden sechs Mäuse in beiden Gruppen wurden dann eine Woche später verwendet um zu verifizieren, ob diese antigene Präparation einen Kreuzschutz gegen den Stamm NCS246 (IIIR) verleihen könnte, der eine serologisch unterschiedliche Kapsel erzeugt. Keine der mit diesem zweiten GBS-Stamm infizierten Mäuse überlebte die Infektion. Dieses letztere Ergebnis legt nahe, dass der Hauptteil der durch Formaldehyd getöteten Stamm C388/90 induzierten schützenden Immunreaktion gegen das Kapsel-Polysaccharid gerichtet ist und dass er auf Stämme dieses bestimmten Serotyps begrenzt sein könnte. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass dieses spezielle Infektionsmodell effizient verwendet werden kann, um den durch eine Impfung verliehenen Schutz zu untersuchen.
Beispiel 3 Immunisierung von Kaninchen mit Formaldehyd- getöteten ganzen GBS-Zellen und passiver Schutz bei Mäusen
Ein Neuseeland-Kaninchen (2,5 kg, Charles River, St-Constant, Québec, Kanada) wurde mit Formaldehyd-getöteten Zellen des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) immunisiert, um ein Hyperimmunserum zu erhalten. Diesen Kaninchen wurde subkutan dreimal in dreiwöchigen Intervallen ungefähr 1,5 × 10⁹ KBE Formaldehyd-getötete ganze Zellen des GBS-Stamms 388/90 (Ia/c) injiziert. Freunds komplettes Adjuvans (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, New York) wurde als Adjuvans für die erste Immunisierung verwendet, während Freunds inkomplettes Adjuvans (Gibco BRL) für die folgenden zwei Injektionen verwendet wurde. Serumproben wurden vor dem Beginn des Immunisierungsprotokolls und zwei Wochen nach der letzten Injektion erhalten. Die Seren wurden bei –20°C eingefroren.
Die Fähigkeit dieses bestimmten Kaninchen-Hyperimmunserums, Mäuse passiv gegen eine lethale Infektion mit GBS zu schützen, wurde ebenfalls untersucht. Eine intraperitoneale Injektion in die Mäuse mit entweder 15 oder 25 μl Hyperimmun-Kaninchenserum 18 Stunden vor der Antigenaussetzung schützte 4 der 5 Mäuse (80%) gegen die Infektion. Zum Vergleich wurden Überlebensraten von weniger als 20% für die Mäuse in der Kontrollgruppe aufgezeichnet, denen PBS oder Serum, erhalten von einem Kaninchen, das mit einer Meningococcen-Außenmembranpräparation immunisiert worden war, injiziert wurde. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass die Immunisierung einer anderen Tierart mit getöteten GBS-Zellen die Produktion von Antikörpern induzieren kann, die Mäuse passiv schützen. Dieses Reagenz wird auch zur Charakterisierung von Klonen verwendet werden. Tabelle 2 Passiver Schutz von CD-1-Mäusen, verliehen durch ein Kaninchenserum, erhalten nach Immunisierung mit Formaldehyd-getöteten Gruppe B-Gesamtstreptococcen (Stamm C388/90 Ia/c)) -Antigenpräparation

¹ Freunds komplettes Adjuvans wurde für die erste Immunisierung verwendet und Freunds inkomplettes Adjuvans für die folgenden zwei Injektionen;
² intraperitoneale Aussetzung mit 1 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium, enthaltend GBS C388/90 (Ia/c) -Suspension, eingestellt auf 2 × 10⁴ KBE.

Beispiel 4 Rekombinante Produktion eines His.Tag-GBS-Fusionsproteins
Die codierende Region des GBS-Gens wurde durch PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) von der genomischen DNA des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) unter Verwendung von Oligos amplifiziert, die Basenverlängerungen für die Addition der Restriktionsstellen BglII (AGATCT) bzw. HindIII (AAGCTT) enthielten. Das PCR-Produkt wurde aus dem Agarosegel unter Verwendung eines Quiaex II Gelelektraktionskits von Qiagen (Chatsworth, CA) gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII (Pharmacia Canada Inc Baie d'Urfe, Kanada) verdaut und mit Phenol:Chloroform vor der Ethanolausfällung extrahiert. Der pET-32b(+)-Vektor (Novagen, Madison, WI), enthaltend die Thioredoxin-His.Tag-Sequenz, wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII verdaut, mit Phenol:Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol ausgefällt. Das BglII-HindIII-genomische DNA-Fragment wurde an den BglII-HindIII pET-32b(+)-Vektor ligiert, um die codierende Sequenz für das Thioredoxin-His-Tag-GBS-Fusionsprotein zu erzeugen, wobei das Gen sich unter Kontrolle des T7-Promotors befand. Die Ligationsprodukte wurden in den E. coli-Stamm XLI Blue MRF'(Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F'proAB lacI^qZΔM15Tn10 (Tet^r)]^c) (Stratagene, La Jolla CA) gemäß dem Verfahren von Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (Hrsg.), Seiten 109-135) transformiert. Das rekombinante pET-Plasmid wurde unter Verwendung eines Qiagen-Kits (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt und die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts wurde durch DNA-Sequenzierung (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA) verifiziert. Das rekombinante pET-Plasmid wurde durch Elektroporation (Gene Pulser II-Apparat, BIO-RAD Labs, Mississauga, Kanada) in den E. coli-Stamm RD494 (DE3) (Δara^–leu7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR ΔmalF3 F'[lac⁺(lacI^q)pro] trxB: :Kan (DE3)) (Novagen, Madison, WI) transformiert. In diesem E. coli-Stamm wird der T7-Promotor, der die Expression des Fusionsproteins kontrolliert, spezifisch von der T7-RNA-Polymerase erkannt (die auf dem λDE3-Prophagen vorliegt), dessen Gen sich unter der Kontrolle des lac-Promotors befindet, der durch Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid (IPTG) induzierbar ist.
Die Transformante AD494(DE3)/rpET wurde bei 37°C unter Bewegung bei 250 Upm in LB-Brühe (Pepton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l), enthaltend 100 μg Ampicillin (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Kanada) pro ml gezüchtet, bis die A₆₀₀ einen Wert von 0,6 erreichte. Um die Produktion des Thioredoxin.His-Tag-GBS-Fusionsproteins zu induzieren, wurden die Zellen zwei zusätzliche Stunden in Gegenwart von IPTG bei einer Endkonzentration von 1 mM inkubiert. Die bakteriellen Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet.
Das durch AD494(DE3)/rpET32 erzeugte rekombinante Fusionsprotein bei IPTG-Induktion für 2 Stunden wurde teilweise als unlösliche Einschlusskörper erhalten, die aus endogenen E. coli-Proteinen durch Isolation unlöslicher Aggregate gereinigt wurden (Gerlach, G. F. et al. 1992, Infect. Immun. 60:892). Induzierte Zellen von einer 500 ml Kultur wurden in 20 ml 25%igem Saccharose – 50 ml Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) resuspendiert und bei –20°C eingefroren. Eine Lyse der Zellen in der getauten Suspension wurde durch Zugabe von 5 ml einer Lösung Lysozym (10 mg/ml) in 250 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) erreicht, gefolgt von einer Inkubation für 10 bis 15 Minuten auf Eis und die Zugabe von 150 ml Detergensmix (5 Teile 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) – 300 mM NaCl – 2 Deoxycholsäure – 2% Nonidet P-40 und 4 Teile 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) – 50 mM EDTA – 2% Triton X-100), gefolgt von 5minütiger Inkubation auf Eis. Bei Beschallung wurden die Proteinaggregate durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 35.000 × g geerntet und eine Probe der löslichen zellulären Fraktion wurde behalten. Die aggregierten Proteine wurden in 6 M Guanidin-Hydrochlorid löslich gemacht. Die Gegenwart des Fusionsproteins sowohl in den löslichen als auch den unlöslichen Fraktionen wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Serums einer Maus, der Formaldehyd-getötete Zellen des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) injiziert worden waren, und die eine bakterielle Antigenaussetzung durch den korrespondierenden GBS-Stamm überlebte, dargestellt.
Die Reinigung des Fusionsproteins aus der löslichen Fraktion von IPTG-induzierter AD494 (DE3)/rpET wurde durch Affinitätschromatographie, basierend auf den Eigenschaften der His.Tag-Sequenz (6 konsekutive Histidinreste), um an divalente Kationen (Ni²⁺) zu binden, die auf dem His.Bind-Metall-Chelatisierungsharz (Novagen, Madison, WI) immobilisiert waren, durchgeführt. Das verwendete Reinigungsverfahren war dasjenige, das in pET system Manual, 6. Auflage (Novagen, Madison, WI) beschrieben wird. Kurz gefasst wurden die pelletierten Zellen, die aus einer 100 ml-Kultur erhalten wurden, mit IPTG induziert und in 4 ml Bindungspuffer (5 mM Imidazol – 500 mM NaCl – 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) resuspendiert, beschallt und bei 39.000 × g 20 Minuten abzentrifugiert, um Abfall zu entfernen. Der Überstand wurde filtriert (0,45 μm Porengrößenmembran) und auf einer Säule des His.Bind-Harzes, äquilibriert in Bindungspuffer, abgelagert. Die Säule wurde dann mit 10 Säulenvolumen Bindungspuffer gewaschen, gefolgt von 6 Säulenvolumen Waschpuffer (20 mM Imidazol – 500 mM NaCl – 20 mM Tris-HCl, pH 7,9). Das Thioredoxin-His.Tag-GBS-Fusionsprotein wurde mit Elutionspuffer (1 M Imidazol – 500 mM NaCl – 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) eluiert. Die Entfernung von Salz und Imidazol aus der Probe wurde durch Dialyse gegen 3 × 1 l PBS bei 4°C durchgeführt.
Die Mengen des erhaltenen Fusionsproteins entweder aus den löslichen oder unlöslichen Zytoplasmafraktionen von E. coli wurden durch Coomassiefärbung eines Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgels mit seriellen Verdünnungen dieser Proteine und einem Rinderserumalbuminstandard (Pierce Chemical Co. Rockford, Ill.) geschätzt.
Beispiel 5 Rekombinante Produktion des GBS-Proteins unter Kontrolle des λP_L-Promotors
Der DNA-codierende Bereich eines GBS-Proteins wurde stromabwärts vom Promotor λ-P_L in den Translationsvektor pURV22 inseriert. Dieses Plasmid stammte von p629 ab (George et al., 1987, Bio/Technology 5:600), wovon der codierende Bereich für einen Teil des Herpes-simplex-Virus Typ I (HSV-I)-Glycoproteins (gD-1) entfernt wurde und das Ampicillin-Resistenzgen durch eine Kanamycin-Kassette ersetzt wurde, erhalten vom Plasmidvektor pUC4K (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Kanada). Der Vektor enthielt eine Kassette des Bakteriophagen λ cI857 temperaturempfindlichen Repressorgens, wovon der funktionelle PR-Promotor deletiert worden war. Die Inaktivierung des cI857-Repressors durch Temperaturanstieg von den Bereichen von 30 bis 37°C auf 37 bis 42°C führte zu der Induktion des Gens unter der Kontrolle von λ-P_L. Die Translation des Gens wurde durch die Ribosomen-Bindungsstelle cro, gefolgt stromabwärts von einer BglII-Restriktionsstelle (AGATCT) und dem ATG:
ACTAAGGAGGTTAGATCTATG kontrolliert.
Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurden gemäß den Verkäufern verwendet (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Kanada und New England Biolabs Ltd., Mississauga, Kanada). Die Agarosegelelektrophorese der DNA-Fragmente wurde wie von Sambrook et al. (Molecular cloning : A laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.) beschrieben, durchgeführt. Chromosomale DNA der GBS-Bakterien wurde gemäß den in Jayarao et al. (J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2774) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die DNR-Amplifikationsreaktionen durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden unter Verwendung des DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer, San Jose, CA) durchgeführt. Die für die DNA-Sequenzierung verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung der Plasmidkits von Qiagen (Chatsworth, CA) gereinigt. Die DNA-Fragmente wurden aus Agarosegels unter Verwendung von Qiaex II-Gelextraktionskits von Qiagen (Chatsworth, CA) gereinigt. Die Plasmidtransformationen wurden durch das von Hanahan (DNA Cloning, Glover (Hrsg.), Seiten 109-135, 1985) beschriebene Verfahren durchgeführt. Die Sequenzierung der genomischen DNA-Inserts in die Plasmide wurde unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide durchgeführt, die durch das Oligonukleotid synthesizer Modell 394 (Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div. (ABI), Foster City, CA) synthetisiert wurden. Die Sequenzierungsreaktionen wurden durch PCR unter Verwendung des Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit (ABI, Foster City, Ca) durchgeführt und die DNA-Elektrophorese auf einem automatisierten DNA sequencer 373A (ABI, Foster City, CA) durchgeführt. Die Anordnung der DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Program Sequencer 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) durchgeführt. Die Analyse der DNA-Sequenzen und ihrer vorhergesagten Polypeptide wurden mit dem Programm Gene Works Version 2.45 (Intelligenetics, Inc., Mountain View CA) durchgeführt.
Der codierende Bereich des GBS-Gens wurde durch PCR aus dem GBS-Stamm C388/90 (Ia/c) genomischer DNA unter Verwendung von Oligos, die Basenverlängerungen für die Zufügung von den Restriktionsstellen BglII (AGATCT) bzw. XbaI (TCTAGA) enthielten, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde aus Agarosegel unter Verwendung des Qiaex II-Gel-Extraktionskits von Qiagen (Chatsworth, CA) gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BglII und XbaI verdaut und mit Phenol:Chloroform vor der Ethanolausfällung extrahiert. Der pURV22-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und XbaI verdaut, mit Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das BglII-XbaI-genomische DNA-Fragment wurde in den BglII-XbaI pURV22-Vektor ligiert, worin sich das GBS-Gen unter Kontrolle des λ-P_L-Promotors befand. Die ligierten Produkte wurden in den E. coli-Stamm XLI Blue MRF'(Δ (mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F' proAB lac1^qZΔM15 Tn10(TET^r)]^c) (Stratagene, La Jolla CA) gemäß den in Hanahan, supra beschriebenen Verfahren transformiert. Transformanten, die Plasmide mit dem Insert beherbergten, wurden durch Analyse lysierter Zellen identifiziert, die einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen worden waren (Sambrook et al., oben). Das rekombinante pURV22-Plasmid wurde unter Verwendung eines Qiagen Kits (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt und die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Transformante XLI Blue MRF'/rpURV22 wurde bei 34°C unter Bewegung bei 250 Upm in LB-Brühe, enthaltend 50 μg Kanamycin pro ml gezüchtet, bis die A₆₀₀ einen Wert von 0,6 erreichte. Um die Produktion des Fusionsproteins zu induzieren, wurden die Zellen für 4 zusätzliche Stunden bei 39°C inkubiert. Die bakteriellen Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Probenpuffer resuspendiert, 10 Minuten gekocht und bei –20°C gehalten.
Beispiel 6 Subklonierung des GBS-Proteingens in das CMV-Plasmid pCMV-GH
Die DNA-codierende Region eines GBS-Proteins wurde in einer Phase stromabwärts von menschlichem Wachstumshormon-(hGH)-Gen inseriert, die sich unter der transkriptionellen Kontrolle des Zytomegalievirus (CMV)-Promotors im Plasmidvektor pCMV-GH (Tang et al., Nature, 1992, 356:152) befand. Der CMV-Promotor ist in E. coli-Zellen nicht funktionell, wird jedoch bei Verabreichung des Plasmids in eukaryontische Zellen aktiv. Der Vektor beinhaltete auch das Ampicillin-Resistenzgen.
Der codierende Bereich des Gens wurde durch PCR von genomischer DNA des GBS-Stamms C388/90 (Ia/c) unter Verwendung von Oligos amplifiziert, die Basenverlängerungen für die Zugabe der Restriktionsstellen BglII (AGATCT) und HindIII (AAGCTT) enthielten. Das PCR-Produkt wurde aus Agarosegel unter Verwendung eines Qiaex II-Gelextraktionskits von Qiagen (Chatsworth, CA) gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII verdaut und mit Phenol:Chloroform vor der Ethanolausfällung extrahiert. Der pCMV-GH-Vektor (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas), enthaltend das menschliche Wachstumshormon zur Erzeugung von Fusionsproteinen wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdaut, mit Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das 1,3-kb BglII-HindIII-genomische DNA-Fragment wurde in den BamHI-HindIII pCMV-GH-Vektor ligiert, um das hGH-GBS-Fusionsprotein unter Kontrolle des CMV-Promotors zu erzeugen. Die ligierten Produkte wurden in den E. coli-Stamm DH5α[ϕ80 lacZ ΔM15 endA1 recA1 hsdR17 (^rK^–mK⁺) supE44 thi-1λ^– gyrA96 relA1 Δ(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) gemäß den von Hanahan, supra, beschriebenen Verfahren transformiert. Transformanten, die die Plasmide mit dem Insert beherbergten, wurden durch Analyse von lysierten Zellen, die einer Elektrophorese auf Agarosegel unterworfen worden waren (Sambrook, J. et al., supra), identifiziert. Das rekombinante pCMV-Plasmid wurde unter Verwendung eines Qiagen Kits (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt und die Nukleotidsequenz des DNA-Inserts wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 7 Immunologische Aktivität des GBS-Proteins bei einer GBS-Antigenaussetzung
Vier Gruppen von 12 weiblichen CD-1-Mäusen (Charles River, St-Constant, Quebec, Kanada) im Alter von 6 bis 8 Wochen wurde subkutan dreimal in dreiwöchigen Intervallen 0,1 ml der folgenden Antigenpräparationen injiziert: Formaldehyd-getötete Zellen des GBS-Stamms C388/90 (^~6 × 10⁷ KBE), 20 μg Thioredoxin-His.Tag-GBS-Fusionsprotein, erhalten von den unlöslichen Stoffen (Einschlusskörpern) oder 20 μg des Fusionsproteins, das affinitätsgereinigt war (Nickelsäule), aus der löslichen Zytoplasmafraktion in E. coli oder 20 μg affinitätsgereinigtes (Nickelsäule) Thioredoxin-His.Tag-Kontroll-Polypeptid. 20 μg QuilA^TM (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Kanada) wurde zu jeder Antigenpräparation als Adjuvans hinzugefügt. Serumproben wurden von jeder Maus vor der Immunisierung (PB) und an den Tagen 20 (TB1), 41 (TB2) und 54 (TB3) während der Immunisierungsprotokolle erhalten. Die Seren wurden bei –20°C eingefroren.
Ein Anstieg der ELISA-Titer wurde nach jeder Injektion des Fusionsproteins aufgezeichnet, was eine gute primäre Reaktion anzeigte und einen Boost der spezifischen humoralen Immunreaktion nach jeweils der zweiten und dritten Verabreichung. Nach Abschluss der Immunisierungszeitspanne waren die Mittel von reziproken ELISA-Titern 456,145 für die Gruppe, die mit 20 μg Fusionsprotein, erhalten von Einschlusskörpern, immunisiert worden war, im Vergleich zu 290,133 für die Gruppe von Mäusen, die mit dem Protein aus der löslichen Fraktion in E. coli immunisiert worden war. Das letztere Ergebnis legt nahe, dass das von den Einschlusskörpern erhaltene Protein immunogener sein könnte als das lösliche Protein. Die Analyse von Mausseren im ELISA unter Verwendung von affinitätsgereinigtem Thioredoxin-His.Tag zur Beschichtung von Platten zeigte, dass vernachlässigbare Antikörpertiter gegen den Thioredoxin-His.Tag-Bereich des Fusionsproteins hergestellt werden. Die Reaktivität der Seren von Mäusen, denen das rekombinante Fusionsprotein injiziert worden war, wurde ebenfalls durch ELISA gegen Formaldehyd-getötete ganze Zellen des GBS-Stamms C388/90 getestet. Die durch Immunisierung mit rekombinantem Fusionsprotein induzierten Antikörper erkannten auch ihre spezifischen Epitope auf GBS-Zellen, was anzeigte, dass ihre Konformation nahe genug an dem nativen Streptococcen-Protein liegt, um kreuzreaktive Antikörper zu induzieren.
Um zu verifizieren, ob die durch Immunisierung induzierte Immunreaktion gegen eine GBS-Infektion schützen könnte, wurden die Mäuse mit 3,5 × 10⁵ KBE der GBS-Stämme C338/90 (Ia/c) und 1,2 × 10⁵ KBE des Stamms NCS246(II/R) Antigen ausgesetzt und die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bzw. 4 illustriert. Die Mäuse, die mit dem Kontroll-Thioredoxin-His.Tag-Peptid immunisiert waren, waren nicht gegen eine Antigenaussetzung mit einem der GBS-Stämme geschützt, während diejenigen, die mit Formaldehyd-getöteten C388/90 ganzen Zellen immunisiert waren, nur einen Schutz gegen eine homologe Antigenaussetzung bereitstellten. Das Thioredoxin- His.Tag-GBS-Fusionsprotein der Erfindung schützte Mäuse vor einer Antigenaussetzung mit beiden GBS-Stämmen. Blut und Milzkulturen dieser Mäuse ergaben nicht die Gegenwart von irgendwelchem GBS. Tabelle 3 Überleben nach GBS-Stamm C388/90 (Ia/c)-Antigenaussetzung¹

¹ Intraperitoneale Verabreichung mit 1 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium, eingestellt auf 3,5 × 10⁵ KBE
² 20 μg verabreicht; die Hinterbeine bei der überlebenden Maus paralysiert; GBS in Blut und Milz nachgewiesen
³ 6 × 10⁷ KBE verabreicht
⁴ 20 μg verabreicht

¹

¹ Intraperitoneale Verabreichung mit 1 ml Todd-Hewitt-Kulturmedium, enthaltend GBS NCS246(II/R)-Suspension, eingestellt auf 1,2 × 10⁵ KBE
² 20 μg verabreicht
³ 6 × 10⁷ KBE verabreicht
⁴ eine Maus starb während der Immunisierung

Beispiel 8 Immunisierung mit einem rekombinanten GBS-Protein verleiht einen Schutz gegen eine experimentelle GBS-Infektion
Dieses Beispiel illustriert den Schutz von Mäusen gegen eine tödliche GBS-Infektion durch Immunisierung mit dem rekombinanten Protein, korrespondierend zu SEQ ID NO: 39.
Gruppen von 10 weiblichen CD-1-Mäusen (Charles River) wurden subkutan dreimal in dreiwöchigen Intervallen mit 20 μg rekombinantem Protein, gereinigt aus dem E. coli-Stamm BLR (Novagen), das den rekombinanten pURV22-Plasmidvektor beherbergte, enthaltend das GBS-Gen, korrespondierend zu SEQ ID NO: 42 in Gegenwart von 20 μg QuilA^TM Adjuvans (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Kanada) oder als Kontrolle mit QuilA^TM Adjuvans allein in PBS immunisiert. Blutproben wurden aus dem Orbitalsinus an den Tagen 1, 22 und 43 vor jeder Immunisierung gesammelt und 14 Tage (Tag 57) folgend auf die dritte Injektion. Eine Woche später wurden die Mäuse mit ungefähr 10⁴ bis 10⁶ KBE verschiedener virulenter GBS-Stämme Antigen ausgesetzt. Proben des GBS-Antigen-Aussetzungsinokulums wurden auf TSA/5% Schafblut-Agarplatten plattiert, um die KBE zu bestimmen und die Antigenaussetzungsdosis zu verifizieren. Die Todesfälle wurden für eine Zeitspanne von 14 Tagen und am Tag 14 nach der Antigenaussetzung aufgezeichnet, die überlebenden Mäuse wurden geopfert und Blut und Milz wurden im Hinblick auf die Gegenwart von GBS-Organismen hin untersucht. Die Überlebensdaten sind in Tabelle 5 dargestellt.
Seren von vor der Antigenaussetzung wurden im Hinblick auf die Gegenwart von Antikörpern analysiert, die mit GBS reaktiv waren und zwar durch Standard-Immunoassays. ELISA- und Immunoblot-Analysen zeigten an, dass die Immunisierung mit rekombinantem GBS-Protein, erzeugt in E. coli, Antikörper hervorrief, die mit beiden, nämlich rekombinantem und nativem GBS-Protein, reaktiv waren. Die Antikörperreaktionen auf GBS sind in Beispiel 9 beschrieben. Tabelle 5 Fähigkeit von rekombinantem GBS-Protein, korrespondierend zu SEQ ID NO: 39, einen Schutz gegen 8 unterschiedliche GHS-Antigenaussetzungsstämme hervorzurufen

¹ Gruppen von 10 Mäusen pro Gruppe wurden verwendet, die Zahl der Mäuse, die die Infektion überlebte und die Zahl der toten Mäuse sind angegeben. Die Überlebenskurven, korrespondierend zu rekombinanten GBS-Protein-immunisierten Tieren wurden mit den Überlebenskurven, korrespondierend zu schein-immunisierten Tieren unter Verwendung des log-rank-Tests für eine Nonparameter-Analyse verglichen.
² Vergleichsanalyse mit NCS915-F-immunisierten Tieren.
³ Die Tiere wurden mit Formaldehyd-getötetem GBS in Gegenwart von QuilA^TM-Adjuvans immunisiert.

Alle Hämokulturen von überlebenden Mäusen waren am Tag 14 nach der Antigenaussetzung negativ. Milzkulturen von überlebenden Mäusen waren negativ, mit der Ausnahme von einigen Mäusen von Experiment MB-11.
Beispiel 9 Impfung mit dem rekombinanten GBS-Protein ruft eine Immunreaktion auf GBS hervor
Gruppen von 10 weiblichen CD-1-Mäusen wurden subkutan mit rekombinantem GBS-Protein, korrespondierend zu SEQ ID NO: 39, wie in Beispiel 8 beschrieben, immunisiert. Um die Antikörperreaktion auf natives GBS-Protein zu bewerten, wurden Seren von Blutproben, die vor jeder Immunisierung und 14 Tage nach der dritten Immunisierung gesammelt wurden, im Hinblick auf Antikörper getestet, die mit GBS-Zellen reaktiv waren und zwar durch ELISA unter Verwendung von Platten, die mit Formaldehyd-getöteten GBS-Zellen vom Typ III-Stamm NCS 954, Typ Ib-Stamm ATCC12401, Typ V-Stamm NCS 535 oder Typ VI-Stamm NCS 9842 beschichtet waren. Die Spezifität der gezüchteten Antikörper für das GBS-Protein wurde durch Western-Blot-Analysen mit GBS-Zellextrakten und gereinigten rekombinanten Antigenen bestätigt. Die in 10 dargestellten Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass die Tiere stark auf das rekombinante GBS-Protein für die Seren, die nach der dritten Immunisierung gesammelt wurden, abhängig von dem beschichtenten Antigen reagieren, das als Immunogen verwendet wird, mit mittleren reziproken Antikörpertitern, die zwischen 12.000 und 128.000 variieren. Alle Präimmunseren waren negativ, wenn sie bei einer Verdünnung von 1 : 100 getestet wurden. GBS-reaktive Antikörper waren in den Seren von jedem Tier nach einer einzelnen Injektion von rekombinantem GBS-Protein nachweisbar.
Beispiel 10 Antigene Konservierung des GBS-Proteins der vorliegenden Erfindung
Monoklonale Antikörper (MAKs), die für das GBS-Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch sind, wurden verwendet, um zu demonstrieren, dass dieses Oberflächenantigen von allen GBS erzeugt wird und dass es auch antigenisch hoch konserviert ist.
Eine Sammlung von 68 GBS-Isolaten wurde verwendet, um die Reaktivität der GBS-spezifischen MAKs zu bewerten. Diese Stämme wurden von dem National Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Canada; Centre Hospitalier Universitaire de Quebec, Pavillon CHUL, Quebec, Kanada; American Type Culture Collection, USA; Laboratoire de Sante Publique du Quebec, Kanada; und Dept. of Infectious Disease, Children's Hospital and Medical Center, Seattle, USA, erhalten. Alle acht MAKs wurden gegen das folgende Stammpanel getestet: 6 Isolate vom Serotyp Ia oder Ia/c, 3 Isolate vom Serotyp Ib, 4 Isolate vom Serotyp II, 14 Isolate vom Serotyp III, 2 Isolate vom Serotyp IV, 2 Isolate vom Serotyp V, 2 Isolate vom Serotyp VI, 2 Isolate vom Serotyp VII, 1 Isolat vom Serotyp VIII, 10 Isolate, die nicht serotypisiert waren und 3 bovine S. agalactiae-Stämme. Der MAK 3A2 wurde ebenfalls mit zusätzlichem GBS: 9 Isolate vom Serotyp Ia/c und 10 Isolate vom Serotyp V umgesetzt. Die Stämme wurden über Nacht auf Blut-Agarplatten bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ gezüchtet. Die Kulturen wurden bei –70°C in heart infusion broth mit 20% (V/V) Glycerin gelagert.
Um die GBS-Protein-spezifischen MAKs zu erhalten, wurden die Mäuse dreimal in dreiwöchigen Intervallen mit 20 μg gereinigtem rekombinantem GBS-Protein (SEQ ID NO: 44) in Gegenwart von 20% QuilA^TM Adjuvans immunisiert. Hybridom-Zellinien wurden durch Fusion der Milzzellen, gewonnen aus immunisierten Mäusen, mit der nicht-sezernierenden SP2/O- Myelomzellinie, wie vorher beschrieben (Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23:163-170), aus immunisierten Mäusen gewonnen. Hybridklon-Überstände wurden im Hinblick auf ihre spezifische Antikörperproduktion durch ELISA unter Verwendung von Formaldehyd-inaktiviertem GBS und gereinigtem rekombinantem GBS-Protein (SEQ ID NO: 39 oder 44) als Beschichtungsantigen, wie früher beschrieben (Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23:163-170), getestet. Spezifische Hybride wurden durch limitierende Verdünnungen geklont, expandiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Produktion von rekombinantem GBS-Protein wurde in den Beispielen 4 und 5 präsentiert. Gereinigtes rekombinantes GBS-Protein oder Formaldehyd-inaktivierte GBS wurden durch Elektrophorese unter Verwendung des diskontinuierlichen Puffersystems von Laemmli, wie vom Hersteller empfohlen, aufgetrennt und dann auf eine Nitrocellulosemembran für einen Western Immunoblot, wie früher beschrieben (Martin et al. 1992. Infect. Immun. 60:2718-2725) übertragen.
Western-Immunoblot-Experimente zeigten deutlich, dass alle acht MAKs eine Proteinbande erkannten, die dem gereinigten rekombinanten GBS-Protein (SEQ ID NO: 39) entsprach. Diese MAKs reagierten auch mit einer Proteinbande, die in allen so weit getesteten GBS-Isolaten vorlag. Die Reaktivität dieser GBS-spezifischen MAKs ist in Tabelle 6 präsentiert. Jeder MAK reagierte gut mit allen 46 GBS. Zusätzlich erkannten diese MAKs auch die 3 S. agalactiae-Stämme vom Rinderursprung, die getestet wurden. Der MAK 3A2 erkannte auch 19 GBS; 9 Isolate vom Serotyp Ia/c und 10 vom Serotyp V. Die anderen MAKs wurden nicht gegen diese zusätzlichen Stämme getestet.
Diese Ergebnisse demonstrierten, dass das GBS-Protein (SEQ ID NO: 39) von allen der 65 GBS und der drei 3 S. agalactiae-Stämme vom Rinderursprung, die bis jetzt getestet wurden, erzeugt wurde. Noch wichtiger zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass die von diesen acht GBS-spezifischen MAKs erkannten Epitope breit verteilt und unter GBS konserviert sind. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass diese Epitope nicht auf serologisch verwandte Isolate begrenzt sind, da repräsentative Beispiele aller bekannten GBS-Serotypen, einschließlich der wesentlichen Erkrankung auslösenden Gruppen getestet wurden.
Als Schlussfolgerung zeigen die in diesem Beispiel präsentierten Daten deutlich, dass das GBS-Protein der vorliegenden Erfindung von allen GBS erzeugt wird und dass das Antigen hoch konserviert ist.

Claims

Isoliertes Polynukleotid, kodierend ein Polypetid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, oder ein Fragment des Polypeptids, wobei sich das Polypeptid oder das Fragment des Polypeptids die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1, kodierend ein Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, wobei das Polypeptid sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid ein Polypeptid mit mindestens 95% Identität zu dem zweiten Polypeptid kodiert.
Isoliertes Polynukleotid, kodierend ein Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid, fähig zur Erzeugung von Antikörpern mit einer Bindungsspezifität für ein Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, oder ein Fragment des Polypeptids, und wobei das Polypeptid oder Fragment des Polypeptids sich die Fähigkeit der Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polynukleotid, kodierend ein Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid, fähig zur Erzeugung von Antikörpern mit einer Bindungsspezifität für ein Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, und wobei das Polypeptid sich die Fähigkeit der Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polynukleotid, das zu dem Polynukleotid von Anspruch 1 oder 2 komplementär ist.
Isoliertes Polynukleotid, das zu dem Polynukleotid von Anspruch 4 oder 5 komplementär ist.
Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Polynukleotid gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid RNA ist.
Polynukleotid gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei das Polynukleotid RNA ist.
Isoliertes Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Komplement eines zweiten Polynukleotids hybridisiert mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 37, SEQ. ID. Nr. 42 und SEQ. ID. Nr. 43, oder ein Fragment des Polynukleotids, wobei das Polynukleotid mindestens 70% Identität mit dem zweiten Polynukleotid aufweist und wobei das Polynukleotid oder Fragment davon ein Polypeptid kodiert, das sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem zweiten Polynukleotid hybridisiert mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 37, SEQ. ID. Nr. 42 und SEQ. ID. Nr. 43, wobei das Polynukleotid mindestens 70% Identität mit dem zweiten Polynukleotid aufweist und wobei das Polynukleotid ein Polypeptid kodiert, das sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Komplement eines zweiten Polynukleotids hybridisiert mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 37, SEQ. ID. Nr. 42 und SEQ. ID. Nr. 43, wobei das Polynukleotid mindestens 95% Identität mit dem zweiten Polynukleotid aufweist und wobei das Polynukleotid ein Polypeptid kodiert, das sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Polynukleotid gemäß Anspruch 14, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement eines zweiten Polynukleotids mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 37 hybridisiert.
Polynukleotid gemäß Anspruch 14, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement eines zweiten Polynukleotids mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 42 hybridisiert.
Polynukleotid gemäß Anspruch 14, das unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement eines zweiten Polynukleotids mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 43 hybridisiert.
Polynukleotid gemäß Anspruch 12, wobei das Polynukleotid mindestens 95% Komplementarität zu dem zweiten Polynukleotid aufweist.
Vektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid operabel an einen Expressionskontrollbereich gebunden ist.
Vektor, umfassend das Polynukleotid gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei das Polynukleotid operabel an einen Expressionskontrollbereich gebunden ist.
Wirtszelle, transfiziert mit dem Vektor gemäß Anspruch 19.
Wirtszelle, transfiziert mit dem Vektor gemäß Anspruch 20.
Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 21 unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen.
Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 22 unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen.
Isoliertes Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, oder ein Fragment des Polypeptids, und wobei das Polypeptid oder Fragment des Polypeptids sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, und wobei das Polypeptid sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 25 oder 26 mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 39.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 25 oder 26 mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 44.
Isoliertes Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid und dazu in der Lage, Antikörper zu erzeugen mit einer Bindungsspezifität für ein Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, oder ein Fragment des Polypeptids, wobei das Polypeptid oder Fragment des Polypeptids sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion gegen Gruppe B-Streptococcus erhält.
Isoliertes Polypeptid mit mindestens 70% Identität zu einem zweiten Polypeptid und dazu in der Lage, Antikörper zu erzeugen mit einer Bindungsspezifität für ein Polypeptid mit einer Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 und SEQ. ID. Nr. 44, wobei das Polypeptid sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion spezifisch für Gruppe B-Streptococcus erhält.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 29 oder 30 mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 39.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 29 oder 30 mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. Nr. 44.
Isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 39 oder Fragmente davon, und wobei das Polypeptid oder Fragment des Polypeptids sich die Fähigkeit zur Induktion einer Immunreaktion, spezifisch für Gruppe B-Streptococcus, erhält.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 33, wobei der N-terminale Met-Rest deletiert ist.
isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 33, wobei die sekretorische Aminosäuresequenz deletiert ist.
Vakzin-Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 25 bis 33 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans.
Vakzin-Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid gemäß Anspruch 34 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans.
Vakzin-Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid gemäß Anspruch 35 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 25 bis 33 für die Herstellung eines Vakzins für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Gruppe B-Streptococcus-Bakterieninfektionen bei einem Tier, das gegenüber einer Gruppe B-Streptococcus-Infektion empfänglich ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 34 für die Herstellung eines Vakzins für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Gruppe B-Streptococcus- Bakterieninfektionen bei einem Tier, das gegenüber einer Gruppe B-Streptococcus-Infektion empfänglich ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 35 für die Herstellung eines Vakzins für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Gruppe B-Streptococcus-Bakterieninfektionen bei einem Tier, das gegenüber einer Gruppe B-Streptococcus-Infektion empfänglich ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 39 bis 41, wobei das Tier ein Rind ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 39 bis 41, wobei das Tier ein Mensch ist.