KR100231235B1

KR100231235B1 - 뮤신 당 사슬을 생성하는 펩티드 서열 및 뮤신 당 사슬과 결합하는 단백질을 변성하는 방법

Info

Publication number: KR100231235B1
Application number: KR1019960703536A
Authority: KR
Inventors: 아루토 요시다; 마코토 다케우치
Original assignee: 마나배게이사꾸; 기린비이루가부시끼가이샤
Priority date: 1994-11-01
Filing date: 1995-11-01
Publication date: 1999-11-15
Also published as: EP0754703A4; AU3815295A; CA2180261A1; TW448184B; US5843713A; EP0754703A1; AU706304B2; WO1996013516A1; CA2180261C; CN1142229A

Abstract

본 발명은 단백질 또는 펩티드 사슬에 뮤신형 당 사슬을 특정하게 삽입할 수 있는 아미노산 서열과 이러한 서열을 이용하여 단백질 또는 펩티드에 뮤신형 당 사슬을 삽입하는 방법에 관한 것이다. UDP-GalNAc(여기서 UDP는 유리딘 5'-디포스페이트를 나타내고, GalNAc는 N-아세틸갈락토사민을 나타낸다)의 GalNAc 잔기는 UDP-GalNAc : 폴리펩티드 α1, O-GalNAc 트랜스퍼라제(O-GalNAc T)의 존재하에서 아미노산 X(0)에 삽입된다.

X(-1) - X(0) - X(1) - X(2) - X(3) (Ⅰ)

상기에서, X(-1)과 X(2)는 각각 임의의 아미노산이고, X(0)는 트레오닌(T) 또는 세린(S)이고, X(1)과 X(3)는 각각 임의의 아미노산을 나타내지만, X(1)과 X(3) 중 적어도 하나는 프롤린(P)을 나타낸다.

Description

[발명의 명칭]

뮤신 당 사슬을 생성하는 펩티드 서열 및 뮤신 당 사슬과 결합하는 단백질을 변성하는 방법

[발명의 배경]

[발명의 분야]

본 발명은 뮤신형 당 사슬이 단백질 또는 펩티드 내에 삽입될 수 있는 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열을 이용하여 단백질 또는 펩티드 내에 뮤신형 당 사슬을 삽입하는 방법에 관한 것이다.

[종래 기술]

동물, 식물 및 곤충에서 발견되는 단백질의 대부분은 당단백질이다. 최근, 당단백질 내의 당 사슬의 다양한 역할이 차츰 밝혀지고 있다. 예를 들면, 당 사슬은 ftpvh 고착 및 세포 인식에서 리간드로서 생리학적 작용을 할 뿐만 아니라 단백질의 안정성 및/또는 용해성을 개선하는 물리화학적 작용을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, 에리트로포에틴(erythropooietin)과 인터페론 등의 당단백질이 근년에 의약으로서 개발되었는데, 당단백질 상의 당 사슬의 구조가 생체 내에서 상기 의약의 약물동력학 및 안정성에 큰 영향을 미친다. 당단백질의 당 사슬의 중요성이 잘 알려져 있기는 하지만 단백질의 특정한 위치에 당 사슬을 간단한 방법으로 삽입하는 방법은 이제까지 알려져 있지 않다.

본래 당단백질인 일부 의약에 있어서, 이들의 단백질 부분은 일반적으로 단지 E.coli에 의해 대량 생산된다. 이러한 단백질을 의약으로서 투여할 경우, 당 사슬이 없기 때문에 생체내에서 이 단백질의 동역학, 안정성 및 항원성은 천연 당단백질과는 다르게 된다. 이러한 차이는 대량 투여 시의 장애 및 부작용 등의 문제를 유발하게 된다.

동물 세포에서 생산되는 단백질 조차도 천연의 것과는 다른 당 사슬을 가지는 당단백질이 될 수 있다. 그러므로, 이러한 단백질도 상기한 바와 같은 문제점을 유발할 수 있다.

상기한 문제점들과 기타 관련 문제들은 단백질 분자의 특정부위에 특정한 당 사슬을 삽입하는 기술에 의해 해결될 수 있다. 또한, 이러한 기술에 의해 당 사슬의 다양한 기능적 특징을 선택적으로 단백질 내에 삽입할 수 있다. 상기한 기술은 제약 산업과 기타 산업에서 광범위하게 적용될 것이다.

당 사슬이 단백질에 결합하는 2가지 주요 방법으로는 아스파라긴 결합형 당 사슬과 뮤신형 당 사슬이 알려져 잇다.

종래의 보고에 따르면 아스파라긴 결합형 당 사슬은 -Asn-Xaa-Ser/Thr-(Xaa≠Pro)의 공통(consensus)서열에 부착된다. 그러나, 단백질 내에 공통 서열을 가지는 모든 부위가 아스파라긴 결합형 당 사슬을 가지는 것은 아닌 것도 알려져 있다. 한편, 뮤신형 당 사슬에 대하여는 Ser,Thr 및 Pro등의 아미노산이 결합 부위 가까이에서 빈번하게 관찰된다는 보고가 있다. 그러나, 결합 부위 중의 서열의 특징에 대하여는 보고되어 있지 않다.

아스파라긴 결합형 당 사슬은 당 사슬의 생합성에 있어서 뮤신형 당 사슬과는 다르다. 구체적으로, 아스파라긴 결합형 당 사슬은 단백질 합성에서 번역과는 다르다. 구체적으로, 아스파라긴 결합형 당 사슬은 단백질 합성에서 번역과 동시에 생합성된 후 당단백질의 폴딩으로 이어진다. 반면에, 뮤신형 당 사슬은 단백질이 번역되고 폴딩된 후에 삽입된다. 또한, 아스파라긴 결합형 당 사슬에 있어서는 14개의 모노사카라이드를 가지는 거대 당 사슬이 한번에 단백질에 전이되어 칼넥신(calnexin)이라고 불리우는 분자 샤프론에 의해 인지되고 조절되어 적당한 단백질 구조를 형성한다고 보고되었다. 그러나, 뮤신형 당 사슬에 대하여는 이제까지 분자 샤프론은 알려져 있지 않다.

아스파라긴 결합형 당 사슬에서는 당 사슬의 글라이코실레이션에 필요한 공통 서열은 상기한 바와 같이 잘 알려져 있지만, 당 사슬을 삽입하기 위한 단백질 내의 적당한 위치는 알려져 있지 않다. 또한, 당사슬을 가지는 돌연변이 단백질이 그 천연 단백질과 같은 3차원 구조와 생물학적 활성을 나타낼 것이라는 보장도 없다.

한편, 뮤신형 당 사슬에 있어서는 당 사슬이 단백질 분자가 입체구조를 형성한 후에 삽입되므로 당 사슬의 삽입이 단백질 분자에 대하여 상당한 영향을 미치지는 않을 것으로 생각된다. 그러므로, 단백질에 뮤신형 당 사슬을 삽입하는 기술은 단백질 구조와 활성을 변화시키지 않으면서 당 사슬의 작용 특징을 가지는 단백질을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나, 뮤신형 당 사슬의 글라이코실레이션 부위에 매우 특이적인 구조적 특징은 발견되지 않았다. 따라서, 현재까지는 단백질 분자의 특정부분에 뮤신형 당 사슬을 특이적으로 삽입하는 것은 불가능하다.

뮤신형 당 사슬 결합부위 주위의 펩티드 서열의 특징적인 면은 이하에 기재한 바와 같이 알려져 있지만 단백질에 뮤신형 당 사슬의 GalNAc(N-아세틸갈락토사민)를 삽입하는 효소가 알려져 있다. 이 효소는 UDP-GalNAc : 폴리펩티드 α1,O-GalNAc 트랜스퍼라제(O-GalNAc T)라고도 불리운다. O-GalNAc T는 암소의 초유에서 발견되는데, 하기한 바와 같이 단백질 또는 펩티드의 세린 또는 트레오닌에 O-GalNAc가 전이되는 반응을 촉매한다.

UDP-O-GalNAc + 단백질 → 단백질-GalNAc + UDP

상기에서, UDP는 유리딘 5'-디포스페이트이고, GalNAc는 N-아세틸갈락토사민이다.

이 효소의 존재는 넓은 범위에서 확인되고 있다. 예를 들면, A.Elhammer 등에 의해 암소의 초유에서 발견되었고[J. Biol. Chem., Vol.261, pp.5249-5255,(1986)], M. Sugiura 등에 의해 래트의 복수증 간암 세포, AH99에서 발견되었고[J. Biol. Chem., Vol.257, pp.9,501 - 9,507, (1982)], Y. Wang 등에 의해 돼지의 턱밑샘(顎下腺)에서 발견되었으며[J. Biol. Chem., Vol.267, pp.12709 - 12716, (1992)], J. M. Cottrell 등에 의해 돼지의 기관에서 발견되었다[Biochem. J., Vol.283, pp.299 - 305, (1992)]. 이 효소의 유전자 클로닝에 성공하였다는 보고도 있다[F. L. Homa 등, J. Biol. Chem., Vol.268, pp.12609 - 12616, (1993)]. 또한, 유전자 조작 기술을 이용하여 곤충 세포와 동물 세포에서 이 효소를 다량 얻을 수 있었다는 보고도 있다[F. L. Homa 등, Protein Expr. Purif., Vol.6, pp.141 - 148, (1995); S. Wragg 등, J. Biol. Chem., Vol.270, pp.16947 - 16954 (1995)].

뮤신형 당 사슬이 결합하고 있는 펩티드 서열의 특징적인 면에 대한 연구가 몇몇 보고되어 있으나, 이들은 대개 뮤신형 당 사슬이 결합된 부분과 그 주위에서 아미노산 서열을 특정하게 분석한 통계 방법에 의존한다. 상기한 보고중에서 극소수 만이 펩티드 서열의 반응성을 분석하기 위해 O-GalNAc T에 의해 얻어진 펩티드의 실제 이용을 다루었다.

I. B. H. Wilson 등은 뮤신형 당 사슬의 글라이코실레이션 부위의 펩티드 서열과 글라이코실레이션되지 않은 부위의 펩티드 서열을 비교하였다. 이들은 각 결합부위의 -3 내지 +3 위치에서 프롤린, 세린 및 트레오닌이 자주 발견된다고 보고하였다. (이하에서는, 펩티드 서열 내의 아미노산 소재와 관련하여 당 사슬이 전이되는 위치를 포지션 0라하고, 포지션 0 다음에 N-터미널에 연속적으로 접근할 수록 차례로 포지션 -1, -2 및 -3 이라고 하며, 포지션 0 다음에 C-터미널에 연속적으로 접근할수록 포지션 +1, +2 및 +3 이라고 한다.) 또한, 프롤린이 포지션 -1과 +3에서 상대적으로 높은 빈도로 발견되었다. 그러나, 이들이 발견한 특이 서열이 결합 부위 이외의 위치에서 발견되었기 때문에 이들은 뮤신형 당 사슬이 결합하는데 적당한 부위의 특징을 명확하게 기재하기 어렵다고 결론지었다. 또한, 이들은 그들의 통계적 사실을 확인하기 위해서 펩티드에 대한 실제 실험을 실시하지 않았다[Biochem. J., Vol.275, pp.529 - 534 (1991)].

A. A. Gooley 등은 에드만 분해방법으로 CD8 α라고 불리우는 래트의 뮤신형 당단백질의 당 사슬 결합부위를 분석하였다. 그 결과, 이들은 뮤신형 당 사슬의 클라이코실레이션 부위에 대한 공통서열로서 사용될 수 있는 Xaa-Pro-Xaa-Xaa(여기에서 Xaa중 적어도 하나는 뮤신형 당 사슬이 결합하는 트레오닌이다)를 주요 요소로서 제안하였다. 그러나, 이 요소는 다른 공급원으로부터 유도된 당단백질의 뮤신형 당 사슬 결합 부위를 만족스럽게 정의할 수 없기 때문에 광범위한 적용에 적합하지 않다[Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.178, pp.1194 - 1201 (1991)]. 나중에 이들은 또한 뮤신형 당단백질인 사람의 글리코포린(glycophorin) A[Glycobiology, Vol.4, pp.413 - 417 (1994)]와 소의 к-카제인[Glycobiology, Vol.4, pp.837 - 844 (1994)]을 동일한 방법으로 분석하였다. 그 결과, 이들은 앞선 제안의 연장으로서 다음과 같은 4개의 주요 요소를 제안하였다. 하기에서 Thr(GalNAc)는 뮤신형 당 사슬이 결합하는 트레오닌 잔기를 나타낸다.

1. Xaa-Pro-Xaa-Xaa

상기에서 적어도 하나의 Xaa는 Thr(GalNAc)를 나타낸다.

2. Thr(GalNAc)-Xaa-Xaa-Xaa

상기에서 적어도 하나의 Xaa는 트레오닌을 나타낸다.

3. Xaa-Xaa-Thr(GalNAc)-Xaa

상기에서 적오도 하나의 Xaa는 리신 또는 아르기닌을 나타낸다.

4. Ser(GalNAc)-Xaa-Xaa-Xaa

상기에서 적어도 하나의 Xaa는 세린을 나타낸다.

그러나, 이 정도로 확장하여도 상기 주요 요소들이 기타 뮤신형의 당단백질의 당 사슬 삽입부위를 만족스럽게 정의 하지는 못한다. 게다가, 상기한 주요 요소들은 당 사슬을 가지지 않는 펩티드 서열을 포함하므로 어떠한 제한이 Xaa에 대하여 정의되어야만 한다. 또한, 이들은 실제로 주요 요소들을 펩티드에 적용하여 이 주요 요소들을 검증하지 않았다.

J. C Young 등은 기질로서 돼지의 턱밑샘에서 유도된 O-GalNAc T와 합성된 펩티드를 이용하여 시험관 내에서 GalNAc 수용체의 활성을 측정할 수 있다고 보고하였다[Biochemistry, Vol.18, pp.4,444 - 4,448 (1974)]. 이들은 소의 미엘린 염기성 단백질에서 유도된 TPPP, RTPPP, PRTPPP TPRTPPP 및 VTRTPPP가 매우 활성적인 GalNAc 수용체이고 이들 중 VTRTPPP가 가장 활성이 있다고 보고하였다. 그러나, 이 서열들은 연구된 유사한 펩티드의 수가 적기 때문에 GalNAc수용체의 특징으로서 적당하지 않다. 또한 , 프롤린이 포지션 +1 내지 +3 모두에서 발견된다는 사실은 단백질 또는 펩티드에 뮤신형 당 사슬을 삽입하는데 상기 펩티드를 사용하는 것을 상당히 제한할 수 있다.

B. O'Connell 등은 뮤신형 당 사슬이 결합하는 부위에 대한 통계적 분석을 실시하여 포시젼 -6, -1 및 +3의 아미노산이 중요하다고 예측하였다. 이들은 실제로 사람의 von Willebrand 팩터의 당 사슬이 결합하는 부위와 그 주변에서 발견되는 12개의 아미노산 잔기, PHMAQVTVGPGL(포지션 -6 내지 +5)를 가지는 펩티드를 변성하여 포지션 -6, -1 및 +3의 아미노산을 각각 기타 3종류의 아미노산(아르기닌, 글루탐산, 프롤린 또는 이소루이신)으로 변화시켜 펩티드를 합성하고, GalNAc수용체 활성에 대한 이들의 영향을 확인하였다. 그러나, 이들 역시 뮤신형 당 사슬이 결합하는데 필요한 펩티드 서열의 특징을 발견하지 못하고, 단순히 어떤 위치에서의 아미노산 치환도 GalNAc수용체 활성에 상당한 영향을 미친다고 결론지었다[Biochim. Biophys. Res. Commun., Vol.180, pp.1024 - 1030 (1991).

그 후에, B. O'Connell등은 동일한 펩티드의 포지션 -6 내지 +5의 아미노산을 5개의 아미노산(아르기닌, 글루탐산, 프롤린, 이소루이신 및 알라닌)으로 치환하여 펩티드를 제조하고 GalNAc수용체 활성에 대한 이들의 영향을 연구하였다. 그 결과, 이들은 포지션 +3, -3 및 -2의 아미노산을 상이한 아미노산으로 치환하거나, 또는 포지션 -1의 아미노산을 전기적으로 하전된 아미노산으로 치환할 경우 그 활성이 감소된 반면, 다른 포지션은 GalNAc수용체 활성에 대한 영향이 거의 없었다고 보고하였는데, 이러한 결과는 이들의 이전의 보고와는 일치하지 않는 것이다. 이는 상기한 통계적 분석이 뮤신형 당 사슬의 실제 결합 반응성과는 거의 무관하다는 것을 나타낸다. 이들은 어떠한 아미노산 치환이 활성을 감소시키는 위치를 연구하였다. 이들은 한정된 아미노산만을 사용하였기 때문에 어떤 아미노산이 일반적으로 이러한 치환에 바람직하게 사용될 수 있는지를 입증하지 못하였다. 결과적으로, 이들은 뮤신형 당 사슬이 결합하는 펩티드 서열에 대하여 일반적인 결론을 유도하지 못하였다[J. Biol. Chem., Vol.267, pp.25010 - 25018 (1992)].

Ake P. Elhammer 등은 펩티드의 포지션 -4 내지 +4를 통계적으로 분석하여 알고리즘을 작성하고 결합 부위와 그 이웃이 세린, 트레오닌, 프롤린, 알라닌 및/또는 글리신으로 이루어진다면 뮤신형 당 사슬이 결합하는 부위에 있어서 펩티드 서열은 중요하지 않다는 이론을 지지하였다. 또한, 이들은 뮤신형 당 사슬을 삽입하기 위한 가능한 이상적인 펩티드 서열로서 PPASTSAPG를 제안하였다. 제안된 펩티드는 RTPPP를 포함한 다른 4개의 펩티드 서열과 비교하였을 때 실제로 가장 높은 GalNAc수용체 활성을 가졌다. 그러나, 이러한 비교는 유사한 서열을 함유하는 4종유의 펩티드 서열에만 한정되었기 때문에 제안된 서열이 실제로 이상적인지에 대한 의문이 남는다. 또한, 이들의 알고리즘에 따르면 GalNAc는 결합부위인 것으로 예측되는 다수개의 부위를 가지는 단백질에 삽입될 수 없는 것으로 나타났다. 그러므로, 제안된 서열은 다양한 단백질에 뮤신형 당 사슬을 삽입하는데 적당하게 사용되기는 곤란할 것으로 생각된다[J. Biol. Chem., Vol.268, pp.10029 - 10038 (1993)].

뮤신형 당 사슬의 어원인 당단백질 "뮤신"은 20 내지 30개의 잔기를 가지는 아미노산이 세로의 1열로 반복되는 영역을 함유한다. 또한, 뮤신형 당 사슬의 다수가 이 영역에 결합한다고 알려져 있다. I. Nishimori 등은 사람의 뮤신 MUC1의 반복영역에 대한 다양한 펩티드 동족체를 제조하고, 사람의 폐암 세포 MCF7으로부터 추출한 O-GalNAc T의 정제되지 않은 효소 용액을 이용하여 GalNAcT수용체 활성을 연구하였다[J. Biol. Chem., Vol.269, pp.16123 - 16130 (1994)]. 이들은 연구결과, GalNAc수용체에 필수적으로 요구되는 펩티드 영역은 포지션 -1 내지 +4이며 포지션 +3의 프롤린은 GalNAc의 전이를 촉진할 수 있다고 보고하였다. 한편, 이들은 GalNAc의 전이가 PDTRPAPGS, PDTRPPAGS 및 PDTRAPPGS 상에서 관찰되지 않았기 때문에 포지션 +3의 프롤린 만으로는 충분한 GalNAc수용체 활성을 제공할 수는 없다고 강조하였다. 이들은 포지션 -1과 +1의 아스파르트산과 아르기닌이 전이를 방해하는 주요 인자를 제공한다고 추정하였지만 이들의 이론을 확인하는 실험은 실시하지 않았다. 그러므로, 이들의 결론으로부터 GalNAc수용체 활성을 나타내는 펩티드 서열의 특징을 충분히 이해하기는 곤란하다.

유전자 조작기술을 이용하여 뮤신형 당 사슬을 결합하는 서열을 단백질에 삽입하여 뮤신형 당단백질을 제조하는 예로서, E. Gravenhorst등은 뮤신형 당 사슬을 인터루킨-2(IL-2)에 삽입하는 것을 보고하였다[Eur. J. Biochem., Vol.215, pp.189 - 197 (1993)]. 이들은 먼저 IL-2내의 뮤신형 당 사슬이 결합하는 부위의 주변에서 발견되는 서열을 포함하는 GGKAPTSSSTKGG를 IL-2의 80번과 81번 아미노산 사이에 삽입하고 이 서열을 곤충 세포에서 발현시키려 하였으나 실패하였다. 이후에, 이들은 상기 서열의 세린 잔기 모두를 프롤뢴 잔기로 바꾼 GGKAPTPPKGG를 이용하여 당 사슬을 삽입하는데 성공하였다. 그러나, 이 서열은 시행착오의 결과로서 우연한 기회에 얻어진 것이다. 또한, 이 펩티드 서열이 길고 단백질의 구조에 상당한 영향을 미칠 수 있는 프롤린 잔기 4개를 가지는 12개의 잔기를 함유한다는 측면에서 이 펩티드 서열은 광범위한 적용성을 기대할 수 없다.

상기한 바와 같이, 뮤신형 당 사슬이 결합하는 펩티드 서열의 특징은 통계적 분석을 실시하는 경우에는 모집단과 통계 처리에 사용되는 방법에 따라 크게 달라진다. 이는 천연 단백질 내에서 뮤신형 당 사슬이 결합하는 부위를 정확하게 아는 것이 기술적으로 곤란하고, 당 사슬이 결합하는 부위에 대하여는 극히 제한된 수만이 이제까지 확인되었기 때문인 것으로 추측된다. 대부분의 경우에, 임의의 펩티드 서열에 대하여 얻어진 특징은 GalNAc수용체 활성을 가지는 천연 단백질에서 발견된 서열과는 다를 수 있으므로 정확하지 않을 수 있다.

한편, 합성된 펩티드의 GalNAc수용체 활성에 대한 보고도 몇몇 있다. 펩티드 합성 자체가 어렵기 때문에 이제까지 분석된 펩티드의 수는 제한적이다. 연구된 펩티드 서열 대부분은 10개 이상의 잔기를 가지는 비교적 긴 것이고 뮤신형 당 사슬을 삽입하는데 적당하게 이용될 수 있는 짧은 펩티드 서열의 특징은 명확하게 되어 있지 않다.

따라서, 이제까지 보고된 펩티드 서열의 상기한 특징을 기초로 하여 뮤신형 당 사슬을 단백질에 의도적으로 삽입하기는 곤란하다. 또한, 뮤신형 당 사슬을 삽입하는데 적당하다고 생각되는 펩티드 서열이 비교적 길기 때문에 뮤신형 당 사슬은 단백질 또는 펩티드를 약간 변성하여 간단히 삽입할 수는 없다. 그러므로, 상기한 펩티드 서열의 이용 범위는 매우 제한적이다.

한편, 당 사슬이 결합하는 단백질을 화학적으로 합성하는 것이 가능할 수도 있다. 그러나, 천연의 뮤신 당단백질에서 알 수 있는 바와 같이, 당 사슬은 단백질 내의 다수의 세린 또는 트레오닌 잔기 중에서 특정한 잔기에만 결합해야한다. 그러므로, 종래의 유기합성 기술을 이용하여 단백질 또는 펩티드 내의 다수 개의 세린 및 트레오닌 잔기중에서 특정한 부위로 당 사슬을 선택적으로 또는 효과적으로 삽입하기는 극히 어렵다.

[발명의 요약]

뮤신형 당 사슬이 결합하기에 적당한 부위가 되는 펩티드 서열을 찾기 위하여 노력한 결과, 본 발명자들은 뮤신형 당 사슬이 효과적으로 삽입될 수 있는 짧은 펩티드 서열을 발견하였다. 본 발명은 이러한 사실에 기초한다.

그러므로, 본 발명의 목적은 뮤신형 당 사슬이 삽입될 수 있는 결합부위인 펩티드 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 O-GalNAc T의 촉매 활성을 이용하여 뮤신형 당 사슬이 삽입될 수 있는 펩티드 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질의 작용 특성을 손상하지 않고 단백질의 최소한의 변이에 의해 단백질의 뮤신형 당 사슬을 삽입할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 단백질 또는 펩티다는 다음 식(I)로 표시되는 서열로 이루어진다:

X(-1) - X(0) - X(1) - X(2) - X(3) (I)

상기에서, X(-1)과 X(2)는 각각 임의의 아미노산이고, X(0)는 트리오닌(T) 또는 세린(S)이고, X(1)과 X(3)은 각각 임의의 아미노산을 나타내지만, X(1)과 X(3)중 적어도 하나는 프롤린(P)을 나타낸다.

상기 식으로 표시되는 단백질 또는 펩티드는 UDP - GalNAc: 폴리펩티드 α1, O-GalNAc트랜스퍼라제(O-GalNAc T)에 대한 기질로서 작용할 수 있고 단백질 또는 펩티드에 GalNAc를 삽입하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 단백질 또는 펩티드에 GalNAc를 삽입하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 상기 식(I)로 표시되는 서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 제공하는 단계와 UDP-GalNAc: 폴리펩티드 α1,O-GalNAc 트랜스퍼라제(O-GalNAc T)의 존재 하에서 UDP-GalNAc(여기에서 UDP는 유리딘 5'-디포스페이트를 나타내고 GalNAc는 N-아세틸갈락토사민을 나타낸다.)와 기질인 단백질 또는 펩티드를 반응시키는 단계로 이루어진다.

본 발명에 따르면 또한 상기 식(I)로 표시되는 서열을 함유하는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA를 제공하는 단계와 진핵 세포에서 상기 DNA를 분비 발현하는 단계로 이루어진 뮤신형 당 사슬을 가지는 당단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 다양한 펩티드의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제2도는 GalNAc전이에 있어서 당 사슬 결합부위로서 적당한 아미노산이 T 또는 S인지를 나타내는 그래프이다.

제3도는 1개의 프롤린 잔기를 가지는 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제4도는 2개의 프롤린 잔기를 가지는 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제5도는 3개의 프롤린 잔기를 가지는 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제6도는 N-터미널 아미노산 잔기의 수가 다른 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제7도는 X(2)가 여러 가지 아미노산으로 치환된, 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제8도는 X(2)가 L- 또는 D-광학 이성질체로 치환된, 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제9도는 X(-1)이 여러 가지 아미노산으로 치환된, 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제10도는 여러 가지 아미노산이 포지션 +4에 부가된, 다양한 펩티드들의 GalNAc수용체 활성을 나타내는 그래프이다.

제11도는 단백질 GST의 C-터미널 영역에 GalNAc수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 포함하는 단백질 GST-3X Muc C1의 제조에 사용되는 발현 플라스미드 pGEX-3X Muc C1구조를 나타낸 것이다.

제12도는 GalNAc수용체 활성을 가지는 펩티드 서열 단백질 GST의 C-터미널 영역에 포함하는 GST-3X Muc C1 및 이러한 펩티드 서열을 가지지 않는 대조 단백질에 전이된 GalNAc의 양을 나타내는 그래프이다.

제13도는 단백질 GST의 N-터미널쪽에 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 포함하는 단백질 GST-3X 2A Muc N1의 제조에 사용되는 발현 플라스미드 pGEY-3X 2A Muc N1의 구조를 나타낸 것이다. 이 도면은 제 14도로 계속된다.

제14도는 단백질 GST의 N-터미널쪽에 GalNAc수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 포함하는 단백질 GST-3X 2A Muc N1의 제조에 사용되는 발현 플라스미드 pGEY-3X 2A Muc N1의 구조를 나타낸 것이다.

제15도는 GalNAc수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 단백질 GST이 N-터미널쪽에 포함하는 GST-3X 2A Muc N1 및 이러한 펩티드 서열을 가지지 않는 대조 단백질에 전이된 GalNAc의 양을 나타내는 그래프이다.

제16도는 단백질 GST의 C-터미널쪽에 GalNAc수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 포함하는 GST변이체의 제조에 사용되는 발현 플라스미드 pGEX 3XS의 구조를 나타낸 것이다.

제17a도, 제 17b도 및 제 17c도는 각각의 단백질 GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3 및 GST-3X Muc C4의 발현용 플라스미드 pGEX-3XS Muc C2, pGEX-3XS Muc C3 및 pGEX-3XS Muc C4의 구조를 나타내는 챠트이다.

제18도는 단백질 GST-3X, GST-3X Muc C1, GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3, GST-3X Muc C4 및 GST-3X 2A Muc N1에 전이된 GalNAc의 양을 나타내는 그래프이다.

제19a도 및 제 19b도는 COS7세포 내에서의 EGST-3X 및 EGST-3X Muc C1의 분비 발현용 플라스미드 pSEGST-3X 및 pSEGST-3X Muc C1의 구조를 나타낸 것이다.

제20도는 COS7세포 내에서 분비 발현에 의해 얻어진 단백질 EGST-3X 및EGST-3 X Muc C1의 글라이코시드 처리의 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

제21도는 COS7세포 내에서 분비 발현에 의해 얻어진 단백질 EGST-3X 및 EGST-3X Muc C1의 렉틴 브로팅 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

제22도는 각각의 단백질 EGST-3X, EGST-3X Muc C1, EGST-3X Muc C2, EGST-3X Muc C3, EGST-3X Muc C4 및 EGST-3X Muc C5제조용 플라스미드 pEGST-3X, pEEGST-3X Muc C1, pEEGST-3X Muc C2, pEEGST-3X Muc C3, pEEGST-3X Muc C4 및 pEEGST-3X Muc C5의 구조를 나타낸 것이다.

제23도는 COS7 세포에서의 분비 발현에 의해 얻어진 단백질 EGST-3X, EGST-3X Muc C1, EGST-3X Muc C2, EGST-3X Muc C3, EGST-3X Muc C4 및 EGST-3X Muc C5의 SCS-PAGE분석 결과를 나타낸 챠트이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명에서 "+" 또는 "-"표시된 숫자는 펩티드 내의 아미노산 위치를 나타낸다. 당 사슬이 전이된 아미노산의 위치는 포지션 0라고 하고 N-터미널쪽의 위치를 차례대로 포지션 -1, -2 및 -3이다 하였고, C-터니널쪽의 위치를 차례대로 포지션 +1, +2 및 +3이라 하였다.

본 발명에 있어서 아미노산은 하기한 바와 같이 기존의 단일문자 코드로 표시되었다.

G : 글리신 A : 알라닌

V : 발린 L : 루이신

I : 이소루이신 S : 세린

T: 트레오닌 D : 아스파르트산

E : 글루탐산 N : 아스파라긴

Q : 글루타민 K : 리신

R : 아르기닌 C : 시스테인

M : 메티오닌 F : 페닐알라닌

Y : 티로신 W : 트립토판

H : 히스티딘 P : 프롤린

본 발명에 따르면, 먼저 상기 식(I)로 표시되는 펩티드가 제공된다. 상기식(I)로 표시되는 서열을 가지는 펩티드는 효소 O-GalNAc T의 기질로서 효과적으로 작용한다. 즉, 높은 GalNAc수용체 활성을 나타낸다. 그러므로, O-GalNAc T의 존재 하에서 이 펩티드를 UDP-GalNAc와 반응시키므로써 GalNAc를 상기 펩티드에 효율적으로 삽입시킬 수 있다. 이때, GalNAc는 X(0)에서 T또는 S에 삽입된다.

GalNAc는 상기 펩티드를 O-GalNAc T 존재 하에서 UDP-GalNAc와 반응시켜 단백질 내에 효과적으로 삽입시킬 수 있는데, 여기에서 상기 단백질은 상기식(I)로 표시되는 펩티드 서열을 포함한다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 상기시(I)로 표시되는 펩티드 서열을 포함하는 단백질이 제공된다.

뮤신형 당 사슬을 가지는 당단백질은 진핵 세포에서 상기 식(I)로 표시되는 펩티드 서열을 포함하는 단백질을 분비 발현하여 효과적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구형예에 따르면, X(1) 및 X(3)가 P 또는 A이고 이들중 하나는 P인 높은 GalNAc 수용체 활성을 가지는 상기 식(I)의 단백질 또는 펩티드가 제공된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 다음 식(Ia)로 표시되는 높은 GalNAc 수용체 활성을 가지는 서열이 제공된다.

X(-1) - X(0) - P - X(2) - P (Ia)

상기에서, X(-1), X(0) 및 X(2)는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 구현예에 있어서, 바람직하기로는 X(-1)은 Y, A, W, S, G, V, F, T 및 I로부터 선택된 아미노산을 나타내고 X(2)는 바람식하기로는 A, P, C, K, R, H, S, M, T, Q, V, I, L 및 E에서 선택된 아미노산을 나타낸다.

본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 다음 식(Ib)로 표시되는 높은 GalNAct수용체 활성을 가지는 서열이 제공된다.

X(-1) - X(0) - X(1) - X(2) - P (Ib)

상기에서, X(-1), X(0), X(1) 및 X(2)는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 구현예에 있어서, 바람직하기로는 X(-1)은 Y, A, P, W, S, G, V, F, T 및 I로부터 선택된 아미노산을 나타내고 X(2)는 바람직하기로는 A, P, C, K, R, H, S, M, T, Q, V, I, L 및 E에서 선택된 아미노산을 나타낸다. 더욱 바람직하기로는, X(-1)은 A 또는 P를 나타내고, X(1) 및 X(2)는 A를 나타낸다.

또한 , 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 다음 식(Ic)로 표시되는 높은 GalNAc 수용체 활성을 가지는 서열이 제공된다.

X(-1) - X(0) - P - X(2) - X(3) (Ic)

상기에서, X(-1), X(0), X(2) 및 X(3)는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 구현예에 있어서, 바람직하기로는 X(-1)은 Y, A, P, W, S, G, V, F, T 및 I로부터 선택된 아미노산을 나타내고 X(2)는 바람직하기로는 A, P, C, K, R, H, S, M, T, Q, V, I, L 및 E에서 선택된 아미노산을 나타낸다. 더욱 바람직하기로는, X(-1)은 A 또는 P를 나타내고, X(2) 및 X(3)는 A를 나타낸다.

식(Ia)와 (Ib)로 표시되는 펩티드 또는 단백질이 바람직하다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따르면 X(0)는 T이다. 어떤 경우, X(0)가 T이면 X(0)가 S인 경우보다 GalNAc 수용체 활성이 50배 이상 더 크다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, N-터미널 상의 X(-1)으로부터 1 또는 2개의 아미노산이 존재하면 각각의 아미노산은 A, P, G, E, Q, T, R 또는 D가 바람직하다. C-터미널 상의 X(3)으로부터 1이상의 아미노산이 존재하면 이들은 어떤 아미노산도 가능하다.

본 발명에 따른 펩티드 또는 아미노산이 L- 또는 D- 이성질체 중 하나일 수 있다면, L- 이성질체가 바람직하다. 특히, X(2)의 아미노산은 L- 이성질체가 바람직하다.

상기 식(I)로 표시되는 펩티드 서열의 구체적인 예를 하기하였다. 본 발명에 따른 단백질은 바람직하기로는 다음에서 선택된 펩티드 서열을 함유한다.

ATPAP AATPAP

AAATPAA AAATAAP

PAATAAP APATAAP

AAPTAAP AAATAPP

PAATPAP APATPAP

AAXaTPXbP

상기에서 Xa와 Xb는 임의의 아미노산을 나타내지만, Xa 또는 Xb 중 하나는 A를 나타낸다.

AAATPAPXc

상기에서 Xc는 임의의 아미노산을 나타낸다.

본 발명에 따른 단백질 Ehy는 펩티드는 유전자 조작 기술 또는 화학합성방법에 의하여 합성될 수 있다.

본 발명에 따르면 또한 뮤신형 당 사슬을 단백질 또는 펩티드에 삽입하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따라 단백질 또는 펩티드에 당 또는 당 수용을 삽입하는 방법은 하기한 방법으로 실시된다. 시험관 내에서 삽입할 경우, 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드를 제조하고 바람직하기로는 MnC1₂또는 트리톤 X-100을 함유하는 완충용액 중에서 O-GalNAc T의 존재 하에 당 공여체인 UDP-GalNAc와 반응시킨다. 당 공여용체와 당 수용체의 농도는 포화상태까지 제한없이 사용될 수 있다. 효소 O-GalNAc T 역시 제한없이 사용될 수 있지만 반응 용액 1㎖당 약 10mU내지 10U의 비율로 사용되는 것이 바람직하다. 완충용액의 pH는 약 7이 바람직하고, pH가 약 7.2인 이미다졸-염산 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다. 반응은 일반적으로 25 내지 37℃에서 실시하고 조건에 따라 수분 내지 수십 시간 내에 종료한다.

본 발명에 따르면, 당 사슬은 효소 O-GalNAc T를 가지는 진핵 세포의 생합성 경로에 의해 단백질 또는 펩티드에 삽입될 수 있다. 구체적으로는, 뮤신형 당 사슬을 가지는 단백질 또는 펩티드는 효소 O-GalNAc T를 가지는 진핵 세포에서 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드를 분비 발현하여 얻어질 수 있다. 삽입된 당 사슬은 상기 식(I)로 표시되는 서열의 아미노산 X(0)에 결합된 것으로 추정된다. O-GalNAc T를 가지는 진핵 세포의 예로는 COS7, COS1, BHK, C127 및 CHO 등의 동물 세포와 Sf9과 Sf21 등의 곤충 세포 등이 있다.

본 발명에 있어서, 당 사슬이 진핵 세포의 생합성 경로에 의해 삽입되면, 이 단백질은 세포 외로 분비되어야만 한다. 그러므로, 당 사슬이 삽입되는 단백질 또는 펩티드가 진핵 세포 외로 용이하게 분비될 수 없다면, 이 펩티드는 거기에 부착된 시그널 펩티드를 가지는 전구체로서 발현되는 것이 바람직하다. 세포로부터 단백질이 분비됨으로써 당 사슬이 삽입될 수 있으며 의도한 단백질을 성숙한 단백질로서 얻을 수 있다.

이미 알려진 종래의 유전자 조작 기술을 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드를 분비 발현하는데 사용할 수 있다. 상기 식(I)로 표시되는 서열을 가지는 단백질 또는 펩티드를 상기한 바와 같이 세포 내에서 발현하는 것은 이 분야에 숙련된 사람들에게는 자명한 것이다. 상기 식(I)로 표시되는 서열은 단백질 또는 펩티드의 목적하는 위치에 삽입되거나 부가될 수 있으며, 또는 상기 식(I)로 표시되는 서열로 단백질 또는 펩티드의 목적하는 위치에서 치환될 수 있다.

더욱 상세하게는, 본 발명에 따르면 다음 단계들로 이루어진 뮤신형 당 사슬을 가지는 단백질 또는 펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.

진핵 세포를 본 발명에 따른 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA로 형질 전환하는 단계; 및 형질전환된 세포에서 이 단백질 또는 펩티드를 발현하여 진핵 세포로부터 단백질 또는 펩티드를 분비하는 단계.

또한, 본 발명에 따르면, 다음 단계들로 이루어진 흥미 있는 단백질 또는 펩티드의 목적하는 위치에 뮤신형 당 사슬을 삽입하는 방법이 제공된다.

상기 식(I)로 표시되는 서열을 코드하는 DNA를 흥미 있는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA 내에 있고 뮤신형 당 사슬이 삽입되어야 하는 위치에 해당하는 위치에 삽입 또는 부가하거나, 또는 상기 식(I)로 표시되는 서열을 코드하는 DNA로 상기 위치를 포함하는 DNA 부분 절편을 치환하여서 상기 식(I)로 표시되는 서열을 코드하는 DNA를 함유하는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA를 제조하는 단계;

상기 단계에서 얻어진 DNA로 진핵 세포를 형질전환하는 단계; 및 형질전환된 세포에서 상기 단백질 또는 펩티드를 발현하여 뮤신형 당 사슬을 가지는 단백질 또는 펩티드를 세포로부터 분비하는 단계.

상기 식(I)로 표시되는 서열을 코드하는 DNA를 함유하는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA는 벡터의 형태가 바람직하다. 더욱 바람직하기로는 발현을 촉진하거나 조절하는 다양한 서열을 포함하는 발현 벡터 형태이다. 실험이 실시되지 않아도 이 분야에 숙련된 사람들은 유전자 조작 분야에서 사용되는 일군의 벡터로부터 본 발명에 적당한 벡터를 선택하여 본 발명에 유용한 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 진핵 세포는 O-GalNAc T를 가지는 세포이다. 또한 이러한 세포에 사용될 수 있고 본 발명에서 적당하게 사용될 수 있는 벡터는 이미 알려져 있다[Molecular Cloning(J. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 및 Baculovirus Expression Vectors: a laboratory manual(D. R. O'Reilly 등, W. H. Freeman and Company (1992))참조].

그러므로, 본 발명에 따르면 상기 식(I)로 표시되는 서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA서열과 함께 상기 식(I)로 표시되는 서열을 코드하는 DNA 서열이 제공된다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 당단백질 또는 당펩티드는 적당한 종래 방법을 이용하여 반응시킨 후 용액으로부터 용이하게 단리되어 정제시킬 수 있다. 상기한 기술로는 예를 들면, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 및 역상 컬럼 크로마토그래피 등이 있다. 반응 생성물은 농축 및/또는 동결건조에 의해 회수할 수 있다.

본 발명에 따른 당 사슬을 삽입하는 방법으로 뮤신형 당 사슬을 구조가 이미 알려져 있는 단백질 또는 펩티드의 목적하는 위치에 삽입할 수 있다. 또한, 상기 식(I)로 표시되는 서열은 단지 5개의 아미노산으로 이루어진다. 이 서열을 이용하면 당 상슬은 상기한 짧은 서열을 가지는 단백질 또는 펩티드에 고효율로 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 기지의 단백질 또는 펩티드 구조에 영향을 주지 않으면서 단백질 또는 펩티드 사슬을 뮤신형 당 사슬과 결합되도록 유리하게 변성할 수 있다. 본 발명의 방법은 제약 산업과 기타 산업에서 다양하게 적용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 당단백질 또는 당펩티드는 여러 가지 글리코시다제와 글리코실트랜스퍼라제의 기질로서 사용될 수 있다. 그러므로, 이 단백질은 유용한 효소를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 뮤신형 당 사슬의 생성에 참여할 수 있는 효소의 기질을 제조하는데 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로는, AAATPAP를 이용하여 얻어질 수 있는 AAAT(α-GalNAc)PAP는 미생물, 곤충, 동물, 식물 및 이들의 세포 배양액 등의 생체에서 유도되는 샘플에서 α-N-아세틸갈락토사미니다제 또는 UDP-Gal:GalNAc-폴리펩티드 β1, 3-갈락토실트랜스퍼라제를 검출하여 측정하는데 사용될 수 있다.

또한, 펩티드를 가지는 담체는 본 발명에 따른 펩티드를 제공한 후 이것을 활성화된 카르복실아가로스 또는 시아노겐 브로마이드 활성화 아가로스에 결합하여 제조할 수 있다. 이러한 펩티드 결합 담체는 O-GalNAc T등의 뮤신형 클리코실트랜스퍼라제를 정제하는데 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예]

이하에서는 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하였는 바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되지는 않는다.

하기의 실시예에서 O-GalNAc T의 정제, 펩티드 합성 및 합성된 펩티드의 GalNAc 수용체 활성의 측정은 다음 방법으로 실시되었다.

*O-GalNAc T의 정제

소의 초유에서 유도된 O-GalNAc T의 정제는 A. Elhammer등[J. Biol. Chem., Vol.261, pp.5249 - 5255 (1986)]에 의해 보고된 방법에 근거하여 실시하였다.

더욱 상세하게는, 약 4.8ℓ의 소의 초유를 원심분리하여 버터 성분을 제거한 후 초원심분리하였다. 얻어진 3.2ℓ의 용액에 800㎖의 글리세롤을 첨가해서 조효소 용액을 제조하였다. 그 후에, DEAE-세파셀 컬럼 크로마토그래피, 한외 여과 및 아포뮤신-세파로우즈 4B 컬럼 크로마토그래피 I 과 Ⅱ를 포함하는 4단계의 정제 과정을 거쳐서 부분적으로 고도로 정제된 제조물을 생성하였다.

*펩티드 합성

펩티드는 Protein Technologies에서 구입한 PS3 펩티드 자동 합성기를 사용하여 Fmoc 고체상 방법[N. Izumiya 등., Bases and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen, 1985]으로 합성하였다. 합성된 펩티드는 질량 분석기(Mass Amalyzer APIⅢ : Parkin Elmer 제조)와 아미노산 조성 분석(Amino Acid Composition Analyzer JLC-300 : Nippon-Denshi 제조)으로 구조를 분석하고 정량하였다.

*펩티드의 GalNAc 수용체 활성 측정

펩티드의 GalNAc수용체 활성은 J.M.Cottrell등[Biochem. J., Vol.283, pp.299-305 (1992)]과 A.P.Elhammer 등[J. Biol. Chem., Vol.268, pp.10029-10038 (1993)]의 방법에 근거하여 측정하였다.

더욱 상세하게는, 100nmol의 합성 펩티드와 0.5 내지 500mU의 소의 초유에서 유도된 부분적으로 정제된 O-GalNAc T를 함유하는 50㎕의 반응 용액(50mM 이미다졸-HCl (pH 7.2), 10mM MnCl₂, 0.5% 트리톤 X-100, 150μM UDP-[³H]GalNAc)을 제조하고 30분 내지 5시간 동안 약 37℃로 보온하였다. 100mM의 EDTA 50㎕를 첨가하여 반응을 종료하고, 1ml 이온 교환 컬럼(AG1-X8, Cl-형 : Bio-Rad laboratory사 제품)에 넣고 반응 생성물을 2.5ml의 물로 용출시켰다. 용출된 분액에 액체 섬광 계수기용 칵테일(Atomlight : Dupont사 제품)10ml를 첨가한 후 액체 섬광 계수기에서 2분동안 방사능을 측정하였다.

GalNAc 수용체 활성은 반응 개시 속도를 PPASTSAPG 펩티드를 100%로 하여 상대적으로 표시하였다.

[실시예 1]

GalNAc의 각종 펩티드로의 전이

제1도에 기재한 각 펩티드의 GalNAc수용체 활성을 측정하였다.

이 펩티드 서열은 뮤신형 당단백질에서 유도된 펩티드 서열이거나 O-GalNAc T를 가지는 GalNAc수용체로 이미 알려진 펩티드 서열이다. 더욱 상세하게는, PGGSATPQ, SGGSGTPG, GEPTSTP, PDAASAAP와 ALQPTQGA는 각각 돼지의 턱밑샘의 뮤신, 양의 턱밑샘의 뮤신, 소의 к-카제인, 사람의 조혈 촉진인자와 사람의 과립구 콜로니 자극 인자에서 유도된다. RTPPP와 VTRTPPP는 소의 미엘린에서 유도되었고, J. C. Young 등은 GalNAc가 상기 펩티드로 전이된다고 보고하였다[Biochemistry; Vol.18, pp. 4444-4448 (1979)]. PPASTSAPG와 관련하여, A.P.Eohammer 등은 GalNAc가 상기 펩티드로 전이된다고 보고하였다[J. Biol. Chem.; Vol.268, pp 10029-10038 (1993)].

이 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에서 보이는 바와 같이, A. P. Elhammer 등이 이상적인 펩티드 서열로 보고한 PPASTSAPG가 가장 높은 활성을 나타내었고, RTPPP와 VTRTPPP가 그 다음으로 높은 활성을 나타내었다. 반면에, 천연 뮤신형 단백질에서 유도된 펩티드 서열은 모두 낮은 활성을 나타내었다. 또한, 턱밑샘의 뮤신에서 유도된 펩티드 서열에서는 GalNAc 전이가 관찰 되지 않았다.

[실시예 2]

당 사슬 결합 부위의 아미노산, 트레오닌 및 세린의 GalNAc전이에 대한 영향

뮤신형 당 사슬은 트레오닌 도는 세린과 결합한다. 그러므로, 각 아미노산이 GalNAc전이에 바람직한지를 비교 시험하였다.

실시예 1에 기재된 펩티드 중에서, 세린 또는 트레오닌 1 잔기만을 함유하는 조혈 촉진 인자와 미엘린에서 유도된 펩티드가 사용되었다. 이들은 실시예 1에서 사용된 다른 펩티드보다 명백히 더 많은 GalNAc전이를 나타내었다. 다음으로, 조혈 촉진 인장에서 유도된 PDAATAAP와 PDAASAAP 및 미엘린에서 유도된 RTPPP와 RSPPP를 제조하였다.

상기 결과를 제 2도에 나타내었다. 제 2도에서 나타난 것처럼, 각 경우에서 트레오닌은 세린보다 40 내지 50배 더 활성적이다. PDAATAAP는 실시예 1에서 가장 활성이 높았던 PPASTSAPG보다 약 4배 높은 활성을 나타내었다.

[실시예 3]

1개의 프롤린 잔기를 함유하는 펩티드로의 GalNAc의 전이

뮤신형 당 사슬이 결합하는 아미노산의 마라초 서열에서는 프롤린이 비교적 많이 관찰되고, 상기의 실시예 1과 2에서 높은 GalNAc수용체 활성을 나타낸 펩티드가 여러개의 프롤린 잔기를 함유하는 것이 관찰되므로, GalNAc 전이 반응에서 펩티드 중의 프롤린 잔기의 영향을 연구하였다. 제 1단계에서는, AAATAAA에서 알라닌 잔기를 1개의 프롤린으로 치환하여 각종 펩티드를 제조하고 GalNAc 수용체 활성을 비교하였다. 제조된 펩티드는 AAATAAA, PAATAAA, APATAAA, AAPTAAA, AAATPAA, AAATAPA와 AAATAAP였다.

각 펩티드의 GalNAc 수용체 활성을 제 3도에 나타내었다. AAATAAA는 거의 활성을 나타내지 않는 반면, AAATPAA와 AAATAAP는 상당히 높은 활성을 나타내었다. 결과적으로, GalNAc 수용체 활성에는 포지션 +1 및 +3에 프롤린이 존재하는 것이 중요하며, 특히 포지션 +3의 프롤린의 중요성이 발견되었다. AAATAAP에서는 PPASTSAPG 보다 약 2배 높은 활성을 나타내었다.

[실시예 4]

2개의 프롤린 잔기를 포함하는 펩티드로의 GalNAc전이

실시예 3의결과는, 1개의 프롤린 잔기를 특정 위치에 도입하므로써 중요한 효과를 얻을 수 있음을 보여준다. 그러므로, 이 실시예에서는 실시예 3에서 가장 활성이 높았던 AAATAAP의 각 아닐린의 위치에 2번째의 프롤린의 잔기를 도입하여 2번째 프롤린 도입의 효과를 조사하였다. GalNAc 수용체 활성을 비교하기 위하여 제조된 펩티드는 AAATAAA, AAATAAP, PAATAAP, APATAAP, AAPTAAP, AAATPAP와 AAATAPP였다.

상기의 결과를 제4도에 나타내었다. 제4도에 나타난 것처럼, AAATPAT는 AAATAAP와 비교해서 약 3배 더 높은 활성을 나타낸다. 이것은 포지션 +1과 +3에 2개의 프롤린 잔기가 위치할 경우 펩티드로의 GalNAc 전이가 상승 촉진되는 것을 증명한다. AAATPAT는 PPASTSAPG와 비교하여 약 7배 높은 활성을 나타내었다. 포지션 -3, -2, -1과 +2의 알라닌을 프롤린으로 변환하는 경우에도 포지션 +3의 프롤린의 효과는 안정하게 남아 있다.

[실시예 5]

3개의 프롤린을 함유하는 펩티드로의 GalNAc의 전이

실시예 4에서 나타난 바와 같이, 펩티드 서열 중의 포지션 +1과 +3의 2개의 프롤린 잔기를 GalNAc수용체 활성을 매우 향상시킨다. 그러므로, 이 실시예에서는 AAATPAP의 각 알라닌의 위치에 3번째 프롤린을 도입하여 세 번째 프롤린 잔기의 효과를 조사하였다. GalNAc 수용체 활성을 비교하기 위하여 제조된 펩티드는 AAATAAP, AAATPAP, AATPAP, APATPAP, AAPTPAP와 AAATPPP였다.

상기의 결과를 제 5도에 나타내었다. 제 5도에 나타낸 바와 같이, 프롤린 잔기를 포지션 +1과 +3이외의 포지션에 도입하더라도 GalNAc 수용체 활성은 그다지 증가하지 않으므로, 포지션 +1과 +3의 프롤린 잔기 2개가 GalNAc수용체 활성에 중요하다고 간주된다. 3번째 프롤린을 -3, -2와 -2 위치 중 어느 위치에 도입하더라도 활성에 중대한 변화가 나타나지 않는 반면, 포지션 -1에 도입하는 경우에는 활성이 현저히 감소하였다. 상기의 2가지 사실로부터, 기본적으로 포지션 +1과 +3의 2개의 프롤린의 효과는 다른 위치의 아미노산의 변화와는 관계가 없음을 나타낸다. 또한, GalNAc이 전이되는 트레오닌의 양측(-1과 +1)에 특수한 아미노산인 프롤린이 있는 경우에는, 펩티드 구조가 특별하게 형성되어서 활성을 감소시키는 것으로 보인다.

실시예 3 내지 5에서 얻어진 결과를 종합하면, 펩티드가 GalNAc를 수용할 필요 조건은 1이상의 프롤린 잔기가 무작위로 존재하는 것이 아니라 특정 위치에 존재해야하는 것임이 명백하다. 또한, 높은 GalNAc 수용체 활성을 나타내기 위해서는, GalNAc이 전이되는 세린 또는 트레오닌 주위의 프롤린의 수를 단순히 추가시키는 것으로는 충분하지 않으며, 특정한 제한된 위치에 존재하는 것이 필요하다.

[실시예 6]

N-터미널 쪽의 아미노산 잔기 수가 다른 펩티드로의 GalNAc전이

실시예 3 내지 5의 결과를 종합하면, 포지션 -3 내지 -1에 있는 N-터미널 쪽의 아미노산은 알라닌 또는 프롤린에 상관없이 GalNAc 수용체 활성에 그다지 영향을 미치지 않는다는 것이 확실하다. 그러므로, 포지션 -3 내지 -1의 아미노산이 GalNAc 수용체 활성에 필요한지 조사하기 위해서, N-터미널 쪽의 아미노산 잔기 수를 다르게 한 펩티드를 제조해서 GalNAc 수용체 활성을 측정하였다. 제조된 펩티드는 AAATPAP, AATPAP, ATPAP와 TPAP이였다.

상기의 결과를 제 6도에 나타내었다. 제 6도에 나타낸 바와 같이, ATPAP에서는 높은 GalNAc 수용체 활성을 나타내는 반면 TPAP에서는 활성이 매우 감소한다. 그러므로, GalNAc가 전이되는 트레오닌 또는 세린의 N-터미널 쪽에 1이상의 잔기를 가진 아미노산의 존재가 중요하다는 것이 증명되었다. 또한, GalNAc 수용체 활성은 N-터미널 쪽에 아미노산의 수가 3개까지인 경우에 아미노산의 수에 따라 활성이 증가하기 때문에, 트레오닌의 N-터미널 쪽의 2개 이상의 아미노산이 필수적이지는 않지만 바람직하다는 것이 발견되었다.

[실시예 7]

포지션 +2의 아미노산을 각종 아미노산으로 치환시킨 펩티드로의 GalNAc 전이

실시예 6의 결과, 높은 GalNAc 수용체 활성에 필요한 펩티드 서열의 기본은 ATPAP에 있음을 알 수 있다. 이 서열에는 2개의 프롤린 잔기를 가지지만. 프롤린은 각종 아미노산 중에서도 구조가 특수하므로, 2개의 프롤린 잔기사이의 포지션 +2의 아미노산 잔기는 펩티드 구조에 상당히 영향을 미치는 것이 가능하였다. 그러므로, 포지션 +2에 다른 아미노산을 가지는 20개의 펩티드를 제조하여 GalNAc 수용체 활성을 비교하였다. 제조된 펩티드는 AAATPAP, AAATPPP, AAATPCP, AAATPKP, AAATPRP, AAATPHP, AAATPSP, AAATPMP, AAATPTP, AAATPQP, AAATPVP, AAATPIP, AAATPLP, AAATPEP, AAATPGP, AAATPYP, AAATPWP, AAATPFP, AAATPNP와 AAATPDP였다.

상기의 결과를 제 7도에 나타내었다. 제 7도에 나타낸 바와 같이 , 포지션 +2의 아미노산 측쇄에 상관없이 포지션 +1과 +3에 프롤린이 존재하면 일반적으로 높은 GalNAc 수용체 활성을 나타낸다. 반면에, 포지션 +2의 아미노산 측쇄에 따라 활성이 변화할 수 있다. 특히, 알라닌, 프롤린, 시스테인, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 루이신 또는 글루탐산을 가지는 각 펩티드는 글리신, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌, 아스파라긴 또는 아스파르트산을 가지는 펩티드보다 더 높은 GalNAc 수용체 활성을 나타내었다. 이러한 결과는, 포지션 +2의 아미노산은 측쇄가 비교적 작고 양전하를 가지는 것이 바람직함이 증명되었다.

[실시예 8]

포지션 +2의 아미노산을 광학 이성질체로 치환한 펩티드로의 GalNAc 전이반응

실시예 7의 결과, 높은 GalNAc 수용체 활성을 가지는 기본 펩티드 서열인 ATPAP의 +2 위치의 아미노산 측쇄가 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 포지션 +2의 알라닌에 대해서 D-와 L-광학 이성질체를 제조하여 GalNAc 수용체 활성을 비교하였다. 제조된 펩티드는, 포지션+2에 알라닌의 D-와 L-광학 이성질체가 형성된 PAATAAP, APATAAP, AAPTAAP와 AAATPAP였다.

상기의 결과를 제8도에 나타내었다. 제8도에 나타낸 바와 같이, D-이성질체도 높은 활성을 나타내지만, 일반적으로 L-이성질체가 D-이성질체 보다 더 높은 활성을 나타내었다. 결과적으로, 포지션 +2의 아미노산은 천연의 아미노산과는 광학적으로 대칭인 D-이성질체이며, 포지션 +2의 아미노산 잔기의 측쇄는 GalNAc 수용체 활성에 있어서 그 중요성이 거의 없다는 것이 확인되었다.

[실시예 9]

포지션 -1의 아미노산을 각종 아미노산으로 치환한 펩티드로의 GalNAc 전이

실시예 6의 결과에서, GalNAc 수용체 활성에는 포지션 -1의 아미노산이 중요하다는 것이 확인되었다. 그러므로, 포지션 -1에 상이한 아미노산을 가진 20개의 펩티드를 제조하여서 GalNAc 수용체 활성을 측정하였다. 제조된 펩티드는 AAYTPAP, AAATPAP, AAWTPAP, AASTPAP, AAGTPAP, AAVTPAP, AAFTPAP, AATTPAP, AAITPAP, AAHTPAP, AAMTPAP, AAQTPAP, AACTPAP, AANTPAP, AAPTPAP, AALTPAP, AARTPAP, AAETPAP, AADTPAP와 AAKTPAP였다.

상기의 결과를 제 9도에 나타내었다. 제 9도에 나타낸 바와 같이, 포지션 +1과 +3에 프롤린이 존재하면 포지션 -1의 아미노산 측쇄에 상관없이 일반적으로 높은 GalNAc 수용체 활성을 나타내는 것이 확인되었다. 그러나, -1위치의 아미노산 측쇄는 활성에 비교적 큰 영향을 미친다. 특히, 티로신, 알라닌, 트립토판, 세린, 글리신, 발린, 페닐알라닌, 트레오닌 또는 이소루이신을 가지는 각 펩티드는 히스티딘, 메티오닌, 글루타민, 시스테인, 아스파라긴, 프롤린, 루이신, 아르기닌, 글루탐산, 아스파라트산 또는 리신을 가지는 펩티드보다 높은 GalNAc 활성을 나타내었다. 상기 결과에서, 포지션 -1의 아미노산의 바람직한 성질은 측쇄에 전하가 존재하지 않는 방향족 고리이며, 측쇄의 크기는 활성에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

[실시예 10]

포지션 +4의 아미노산을 각종 아미노산에 치환한 펩티드로의 GalNAc 전이

실시예 1 내지 9의 결과에서, 매우 높은 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열의 모티프는 X(-1)-T-P-X(2)-P임이 확인되었으며, 이 식에서 X(-1)과 X(2)는 임의의 아미노산이다. 이 주요인자에서는 포지션 +3의 프롤린이 중요하며 C-터미널쪽은 프롤린보다 짧아서는 안된다. 반면에, 포지션 +4에 존재하는 아미노산의 영향은 명확하지 않다. 그러므로, +4위치에 다른 아미노산을 가지는 20개의 펩티드를 제조해서 GalNAc 수용체 활성을 측정하였다. 제조된 펩티드는 AAATPAP, AAATPAPG, AAATPAPQ, AAATPAPE, AAATPAPA, AAATPAPN, AAATPAPD, AAATPAPR, AAATPAPC, AAATPAPI, AAATPAPV, AAATPAPS, AAATPAPKK, AAATPAPY, AAATPAPL, AAATPAPT, AAATPAPW, AAATPAPM, AAATPAPP, AAATPAPF와 AAATPAPH였다.

상기의 결과를 제 10도에 나타내었다. 제 10도에 나타낸 바와 같이, 포지션 +4에 아미노산을 첨가하여도 GalNAc 수용체 활성에는 거의 영향을 미치지 않으며, 포지션 -1 또는 +2에 아미노산을 첨가한 경우의 측쇄의 효과와 비교하면 측쇄 효과도 적었다. 그러므로, 포지션 +4의 아미노산은 필수적이지 않으며, 영향도 매우 적은 것으로 보인다. 그러나, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 아르기닌, 시스테인과 이솔루이신은 포지션 +4에 아미노산이 존재하는 경우에 비교적 높은 활성을 나타내므로 몇몇 경우에서는 일정한 효과를 가질 수 있다.

[실시예 11]

GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열의 삽입에 의한 뮤신형 당단백질로의 펩티드 변이

GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 단백질 내에 도입하여, 이 단백질을 뮤신형 당 사슬이 결합할 수 있는 단백질로 변이될 수 있는가를 조사하였다.

모델 단백질로는 시스토소마 자파니쿰(Schistosoma japanicum)에서 유도된 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)의 유도체를 사용하였다. 이 GST의 유도체(GST-3X)는 시판중인 플라스미드 pGEX-3X(Pharmacia Biotech사 제품)를 이용하여 E. Coli로부터 용이하게 대량 제조할 수 있다. GST의 유도체는 천연의 GST의 C-터미널에 첨가된 펩티드 서열 SDLIEGRGIPGNSS를 가진다. 플라스미드 pGEX-3X에 함유된 단백질의 유전자를 사용하였다.

GST-3X의 하부 영역에 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열이 삽입된 변이형 단백질을 코드하는 재조합 유전자를 구성하였다. 이 유전자 구조물을 제 11도에 나타내었다. 특별한 언급이 없는 한, 유전자 조작 방법은 Molecular Cloning[J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재된 방법으로 실시하였다.

GalNAc 수용체 활성을 가지는 서열로서 높은 활성을 나타내는 AAATPAP가 함유된 MAAATPAPM 서열을 사용하였다. 펩티드 서열 MAAATPAPM을 코드 하는 DNA를 하기의 방법으로 제조하였다. 하기의 2종류의 단일가닥 DNA를 Applied Biosystems사가 제조한 394DNA/RNA 합성기로 합성하였다.

5'AAGGATCCCCATGGCAGCAGCAACGCCGGCACCCATGGGAATTCAA-3'

(합성 DNA 1)

5'-TTGAATTCCCCATGGGTGCCGGCGTTGCTGCTGCCATGGGGATCCTT-3'

(합성 DNA 2)

이어서, 상기의 각 합성 DNA 1nmol과 10mM 트리스-HCl (pH 8.0), 5mM MgCl₂, 100mM NaCl, 1mM 2-메르캅토에탄올을 함유한 용액 50㎕을 제조하였다. 그 다음에 용액을 75℃에서 10분동안 보온시킨 후 실온 방치로 어닐링해서 이중가닥의 DNA를 생성하여 목적 유전자를 얻었다. 이 반응 용액의 5㎕을 취하여 EcoR I과 BamH I으로 이중 가닥 DNA를 절단한 후 종래의 방법에 따라서 pGEX-3X의 동일한 제한 효소 부위에 삽입하여 플라스미드 pGEX-3X Muc C1을 구성하였다. 이 플라스미드는 GST-3X의 228번째의 프롤린과 229번째의 글리신 사이에 MAAATPAPM이 삽입된 변이체인 GEX-3X Muc C1를 코딩하는 DNA를 함유하는 것으로, 삽입된 영역의 서열은 5'pGEX 시퀀싱 프라이머(Pharmacia Biotech사)와 프리즘, Dye Terminator Cycle Sequencing 장비(Applied Biosystems사)가 있는 373A DNA 시퀀서로 확인하였다.

GST-3X의 C-말단 영역에 펩티드 서열 MAAATPAPM을 삽입한 변이체 단백질의 E. coli로부터의 제조는 하기의 방법으로 실시되었다. CaCl₂방법에 의해 pGEX-3X로 형질 전환된 E. Coli BL21(Pharmacia Biotech사)을 100㎍/ml의 암피실린을 함유한 2 x YTG 배지(16g/l 트립톤, 10g/l 히스트 추출물, 5g/l NaCl, pH 7.0)5ml을, 밤새 37℃에서 진탕하면서 예비 배양하고 동일한 배지 500ml에 옮겨서 37℃에서 2.5시간 동안 진탕하였다.(O.D.=0.5 내지 1.0). 이 배양 용액에 최종 농도가 0.5mM이 되도록 100mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)을 첨가하고 25℃에서 4시간동안 진탕시켰다. 배양 용액을 5,000rpm(4,470 x g)에서 10분동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포를 20mM 트리스-HCl(pH 7.5)과 140mM NaCl의 50ml에 세정한 후 동일 조건하에서 재원심분리하여 균체를 모았다. 세포를 20mM 트리스-HCl(pH 7.5)와 140mM NaCl의 50ml에 재현탁시킨후 초음파 파쇄기로 분해하였다. 생성물을 15,000rpm(27,700 x g), 30분동안 4℃에서 원심분리하고 상청액을 구멍 크기가 0.22㎛인 막으로 여과한 다음 10% 트리톤 X-100을 최종 농도가 0.1%가 되도록 첨가하였다. 생성된 용액을 조효소액(粗酵素液)으로 사용하였다.

조효소액은 4℃의 조건하에서 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 140mM NaCl와 0.1% 트리톤 X-100으로 평형화한 다음 1ml의 글루타티온 세파로우즈 4B 컬럼(Pharmacia Biotech사)의 넣은 다음, 20mM 트리스-HCl(pH 7.5) 140mM NaCl와 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 용액 20㎛로 세정하였다. 이어서, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5) 140mM NaCl와 0.1% 트립톤 X-100, 5mM 디티오트레이톨과 10mM 글루타티온(환원형)을 함유하는 용액 1㎕을 컬럼에 첨가한 후 실온에서 10분동안 방치한 후 9ml의 동일한 완충 용액으로 용출시켜서 1ml 분획을 얻었다. 용출 부분의 단백질 정량은 Protein Assay 장비(Japan Biolaboratory사), GST 활성은 GST 검출 모듈(Pharmacia Biotech)을 각각 사용하여 실시하였다. 단백질의 겔 전자 영동(SDS-PAGE)은 분리 겔로서 13% 겔을 이용하여 U.K.Laemmoi[Nature(London), Vol.227, pp.680-685 (1970)]의 방법으로 실시하였다. 용출 부분에서 검출된 GST-3X Muc C1은 GST-3X와 동일한 GST 활성을 가지며, SDS-PAGE 분석에서는 분자량이 약 28k인 단일 밴드로 검출되었다.

대조군 GST-3X의 제조도 상기의 방법과 동일하게 실시되었다.

GST-3X와 GST-3X Muc C1로의 GalNAc 전이는 100nmol의 펩티드 대신에 5nmol의 GST-3X 변이체를 사용하여, 펩티드의 GalNAc 수용체 활성 측정법과 동일하게 분석하였다.

상기의 결과를 제 12도에 나타내었다. 제 12도에 나타난 것처럼, GST-3X로의 GalNAc 전이는 실제로 관찰되지 않는 반면, GST-3X Muc C1로의 GalNAc 전이는 시간에 따라 증가하는 것이 확인되었다. 상기의 사실은 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 단백질내에 삽입함으로써 이 단백질을 뮤신형 측쇄결합이 가능한 단백질로 변이시킬 수 있음을 나타낸다.

[실시예 12]

GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열의 첨가에 의한 뮤신형 당단백질로의 단백질 변이

이 실시예에서는, 실시예 11과 동일한 모델 단백질 GST-3X을 사용하였으나, 이 실시예에서는 상기 단백질의 N-터미널쪽에 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 첨가해서 이 단백질을 뮤신형 당 사슬이 결합할 수 있는 단백질로 변이될 수 있는지를 확인하였다.

변이체 유전자의 구축은 제 13도와 제 14도에서 예시한 방법으로 실시하였다.

pGEX-3X 내의 GST-3X 유전자에는 N-말단 영역에 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열의 DNA 단편을 삽입할 적당한 제한 효소가 존재하지 않는다. 그러므로, 제한 효소 부위 Nco I 이 삽입되는 GST-3X 2A 유전자를 중합 효소사슬 반응(PCR)을 사용하여 제조하였다. 첫째로, 하기의 프라이머 DNA를 Applied Biosystems사의 394 DNA/RNA 합성기로 합성하였다.

5'-GTATCCATGGCCCCTATACTAGGTTATTGG-3'(합성 DNA 3)

5'-TACTGCAGTCAGTCAGTCACGATGAATTCC-3'(합성 DNA 4)

PCR 반응은 주형 DNA의 pGEX 2.5ng, 0.5μM의 합성 DNA 4, 8㎕의 dNTP 혼합물(Takara Shuzo사), 10㎕의 10 x AmpliTaq DNA 중합 효소 완충 용액(Takara Shuzo사)과 2.5단위의 AmpliTaq DNA 중합 효소(Perkin Elmer사)를 함유하는 반응 용액 100㎕을 제조하여, 미네랄 오일(Takara Shuzo사)을 2방울 첨가한 후, DNA Thermo Cycler(상품명, Perkin-Elmer사)에서 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 1분, 55℃에서 2분과 72℃에서 2분동안을 35주기 실시한후 72℃에서 10분을 실시한 후 온도를 4℃로 떨어뜨렸다. 반응이 끝난 후에, 12mg/ml의 프로나아제 K(Boehlinger Mannheim사), 10mM의 에틸렌디아민테트라아세트산 디나트륨산염(EDTA)과 0.8%의 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 첨가하고, 37℃에서 30분, 65℃에서 10분을 차례로 보온하였다. 그 다음에,PCR반응 생성물을 페놀로 추출하고 에탄올 침전으로 정제한 다음 제한 효소인 Nco I과 Pst I으로 절단해서 목적 DNA를 생성하였다. 그 다음에 종래의 방법에 따라 DNA를 pSLⅡ90(Pharmacia Biotech사)의 동일한 제한 부위에 삽입하였다. 삽입된 SMA의 염기 서열은 프리즘, Dye Terminator Cycle Sequencing 장비(Applied Biosystems사)를 사용하여 Applied Biosystems사가 제조한 373A DNA 시퀀서로 분석하였다. 획득한 목적 GST-3X 2A 유전자는 GST-3X의 N-터미널에서 2번째 아미노산인 세린이 NcoⅠ부위를 삽입함으로써 알라닌으로 변하는 특징을 가진다.

그 다음에, GST-3X 2A의 유전자를 pSL1190에서 제한효소 NcoⅠ과 pSLⅠ로 절단하여 회수하고, 종래의 방법에 의해 pTrc99A(Pharmacia Biotech사)의 동일 제한 효소 부위에 삽입하여 pGEY-3X 2A를 제조하였다. pGEX-3X와 비교해서, pGEY-3X 2A는 N-말단에 유전자의 삽입이 가능한 NcoⅠ 부위를 가진 GST-3X 2A 유전자가 함유된 것과 촉진제가 tac에서 trc로 변경되는 점을 제외하고는 매우 유사한 구조의 플라스미드이다.

최종적으로, N-말단에 펩티드 서열 MAAATPAP를 첨가한 GST-3X-2A Muc C1 유전자를 함유하는 플라스미드 pGEY-3X 2A Muc C1를 하기에 기재한 방법으로 구축하였다. 펩티드 서열 MAAATPAP를 코딩하는 유전자는 실시예 11과 동일하게 단선의 합성 DNA1과 합성 DNA2를 합성하고, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 100mM NaCl과 1mM의 2-메르캅토에탄올을 함유하는 용액 50㎕을 아닐링하여 제조하였다. 이 반응 용액의 5㎕을 사용하여, 제한 효소 NcoⅠ로 이중나선 DNA를 절단한 후 pGEY-3X 2A의 NcoⅠ부위에 삽입하여 플라스미드 pGEY-3X 2A Muc C1를구축하였다. 이 플라스미드는 GST-3X의 N-말단의 상류에 MAATPAP가 첨가되며, GST-3X의 2번째 위치의 세린이 알라닌으로 변화된 변이체인 GST-3X 2A Muc N1을 코딩하는 유전자를 함유한다. 삽입된 영역의 염기 서열은 5'-GTTGACAATTAATCATCCGGCTCGT-3' (Karasiki-Bouseki에서 합성 및 정제)을 사용하여 프리즘, Dye Terminator Cycle Sequencing 장비(Applied Biosystems사)를 사용하여 Applied Biosystems사가 제조한 373A DNA 시퀀서로 분석하였다.

변이체 단백질인 GST-3X 2A Muc N1의 E. Coli로부터의 제조 및 분석은 실시예 11에서 기재한 GST-3X Muc Cl의 경우와 동일하게 실시하였다. 글루타티온세파로우즈 4B 컬럼의 용출된 분획에서 검출된 GST-3X 2A Muc Nl와 GST-3X로의 GalNAc와 같은 GST 활성을 나타내었다. 또한, SDS-PAGE 분석에서는 분자량이 약 28K 단일 밴드가 검출되었다. GST-3X 2A Muc Nl와 GST-3X로의 GalNAc전이는 100nmol 펩티드 대신에 5nmol의 변이체 GST를 사용하여, 펩티드의 GalNAc 수용체 활성 측정법과 동일하게 분석하였다.

상기의 결과를 제 15도에 나타내었다. 제 15도에 나타난 것처럼, GST-3X로 의 GalNAc 전이는 실제로 확인되지 않는 반면, GST-3X Muc Cl로의 GalNAc 전이는 시간에 따른 증가가 확인되었다. 이것은 단백질에 GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 첨가함으로써 임의의 단백질이 뮤신형 당 사슬이 결합하는 단백질로 변이될 수 있음을 나타낸다.

상기의 결과와 실시예 11의 결과에서, GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 단백질에 새로 첨가하는 경우에, 단백질 내의 펩티드 서열의 도입 위치가 특히 제한적임을 나타낸다.

[실시예 13]

GalNAc 수용체 활성을 가지는 각종 펩티드 서열의 단백질에 도입과 뮤신형 당단백질로의 변이

실시예 11과 실시예 12에서는 GST-3X Muc Cl과 GST-3X 2A Muc Nl로의 GalNAc의 전이를 SDS-PAGE 및 형광법을 결합한 분석법으로 확인하였다.

동시에, 실시예 11과 동일한 모델 단백질인 GST-3X를 사용하지만, C-말단측에 GST-3X Muc C1과는 다른 GalNAc 수용체 활성을 나타내는 펩티드 서열을 도입하여 GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3과 GST-3X Muc C4를 제조하였다.

플라스미드 pGEX-3X가 가지는 제한 효소 부위는 C-터미널쪽 영역의 펩티드 서열을 변형하여 사용하는 제한이 있다. 그러므로, 최초에 모델 단백질의 형태를 변형시킨후 PCR을 사용하여 pGEX-3XS을 제조하였다. 플라스미드 구축은 제 16도에 예시된 방법으로 실시하였다.

하기의 프라이머 DNA는 Applied Biosystems사가 제조한 394DNA/RNA 합성기를 사용하여 합성하였다.

5'-ATGGTACCATGCGCGCCATTACCGAGT-3'(합성 DNA 5)

5'-CCGAGCTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3'(합성 DNA 6)

5'-CAGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTA-3'(합성 DNA 7)

5'-GGACTAGTCATGTTGTGCTTGTCAGCTA-3'(합성 DNA 8)

PCR 반응은 주형 DNA인 pGEX-3X를 사용하여 프라이머인 합성 DNA 5와 6 또는 합성 DNA 7과 8과 결합하여 사용되며 실시예 12에 기재한 PCR 반응과 동일하게 실시하였다. 이 실시예에서는, 10 x ApliTaq DNA 중합 효소 완충제와 앰플리태그 DNA 중합 효소를 대신하여 각각 PCR 완충제, 10 x 농축 MgSO₄(Boehlinger Mannheim사)와 Pwo DNA 중합 효소 (Boehlinger Mannheim사)를 사용하였다. 합성 DNA 7과 8을 결합해서 사용한 반응 생성물은 아가로우즈겔 전기영동에서 분리하여 약 0.2kb의 DNA 단편을 회수하였고, 이 DNA단편을 페놀로 추출하고 에탄올 침전법으로 정제하였다. 이 DNA 단편을 제한 효소 SacⅠ과 SphⅠ로 절단한 후 종래의 방법에 의하여 pSL1190(Pharmacia Biotech사)의 동일한 제한 효소 부위에 삽입하여 pPGST91을 구축하였다. 삽입 DNA의 염기 서열은 프리즘, Dye Terminator Cycle Sequencing 장비(-21 M13) 또는 프리즘, Dye Terminator Cycle Sequencing 장비(M13 Rev.)(Applied Biosystems사)를 사용하여 Applied Biosystems사가 제조한 373A DNA 시퀀서로 확인하였다.

합성된 DNA 5와 6을 결합하여 사용한 반응 생성물 역시 동일한 과정을 거쳐서 약 1.2kb DNA 단편을 분리하여 정제하고 제한 효소인 SacⅠ과 KpnⅠ으로 절단하였다. 이 단편을 종래의 방법에 의하여 pPGAT91의 동일한 제한 효소 부위에 삽입하여 pPGST92를 제조하였다. 그 다음에, pGST92를 제한 효소인 EcoRV와 BaⅠ으로 절단한 후, 1.3kb의 단편을 pGEX-3X의 동일한 제한효소 부위에 종래의 방법으로 삽입하여 pGEX-3XS를 제조하였다.

GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3과 GST-3X Muc C4를 발현하기 위해 사용되는 pGEX-3XS Muc C2, pGEX-3XS Muc C3과 pGEX-3XS Muc C4의 제한 효소 지도를 제 17도(a), 제 17도(b) 및 제 17도(c)에 각각 나타내었다.

이러한 구축은 하기의 방법으로 실시된다. 하기의 프라이머 DNA를 합성하였다.

5'-CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACGATGAAGGCGCGGGGGTCCCAC-3'

(합성 DNA 9)

5'-CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACTATTAAGGCGCGGGGGTCCCAC-3'

(합성 DNA 10)

5'-CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACGATGAAGGCCCGGGGGTCCCAC-3'

(합성 DNA 11)

PCR 반응은 주형 DNA인 pGEX-3X와 합성 DNA 7과 9, 또는 합성 DNA 7과 10 및 합성된 DNA 7과 11을 결합하여 상기와 동일하게 실시하였다. 반응이 끝난 후에, 각 PCR의 반응 생성물은 실시예 12와 동일한 방법으로 정제하고, 제한 효소 SacⅠ과XbaⅠ으로 절단한 후 pBluescriptⅡ KS+(Stratagene사)의 동일한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 구성된 플라스미드는 각각 합성 DNA 7과 9의 결합을 pBGSTC2, 합성 DNA 7와 10의 결합을 pBGSTC3, 합성 DNA 7와 11의 결합을 pBGSTC4로 명명하였다. 각각의 삽입 단편의 염기 서열은 프리즘, Dye Primer Cycle Sequencing 키드(-21 M13) 및 (M13 Rev.)(Appoied Biosystems사)를 사용하여 Applied Biosystems사가 제조한 373A DNA 시퀀서로 확인하였다. 최종적으로, pBGSTC2, PBGSTC3 및 pBGSTC4를 각각 제한 효소 SacⅠ과 EcoRⅠ으로 절단하고 약 0.7kb의 단편을 얻었다. 각각의 단편을 pGEX-3XS의 동일한 제한 효소 부위에 삽입해서 pGEX-3XS Muc C2, pGEX-3XS Muc C3 또는 pGEX-3XS Muc C4를 얻었다.

변이형 단백질, GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3 및 GST-3X Muc C4를 E.coli을 이용하여 제조하고 실시예 11에 기재한 GST-3X Muc C1의 경우와 동일하게 분석하였다. 글루타티온 세파로우즈 4B 컬럼의 용출 부분에서 검출된 GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3 및 GST-3X Muc C4는 GST-3X에 비교하여 특정적인 GST활성도를 나타내었다. 또한, SDS-PAGE에서 약 27K의 분자량을 가진 단일 밴드로 검출되었다.

각종 GST 변이체로의 GalNAc 전이는 SDS-PAGE와 형광 사진법을 결합한 하기의 방법으로 분석하였다. 5nmol의 GST-3X 변이체와 50mU의 부분 정제한 소의 초유에서 유도한 O-GalNAc T를 함유하는 50㎕의 반응 용액(50mM 이미다졸-HCl(pH 7.2), 10mM MnCl₂, 0.5% 트리톤 X-100과 150μM UDP-[³H]GalNAc)을 제조하여서 28℃에서 20시간동안 보온하였다. 2 x SDS/샘플 완충액 (125mM Tris-HCl(pH 6.8), 4% SDS, 4% 2-메르캅토에탄올, 20% 글리세롤와 0.004% 브로모페놀 블루)50㎕를 상기 용액에 첨가하고 끊는 물에 5분간 방치하였다. 그리고 나서, 30㎕의 반응 용액을 12.5% SDS-PAGE에 적용하였다. 전기 영동 후에 겔은 고정액(2-프로판올/물/아세트산 (25 : 65 : 10)에 30분동안 침지한 후에 Amplify(Amersham사)에 30분동안 침지하였다. 그 다음에, 겔을 80℃에서 진공 건조시킨 후 -80℃에서 X-ray 필름에 밀착시켜서 15일동안 방치하여서 감광하였다.

상기의 결과를 제 18도에 결과를 나타내었다. GST-3X로의 GalNAc의 전이는 확인되지 않는 반면에, GST-3X Muc C1, GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3, GST-3X Muc C4 및 GST-3X Muc N1로 GalNAc가 전이되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 X(-1)-T-P-X(2)-P로 표시되는 서열이 뮤신형 당 사슬을 가지는 것을 나타내고, 상기 식에서 X(-1)과 X(-2)는 단백질 내의 임의의 단백질 아미노산 작용기이다. 펩티드 서열의 도입에서는 영역에 제한이 없으며, 펩티드 서열의 도입 형태에도 제한이 없는데, 즉 삽입, 첨가 및 치환이 펩티드 서열의 도입에 적절하게 사용될 수 있다. GST-3X Muc C2와 GST-3X Muc C4의 경우에서 나타나는 것처럼, 당 사슬이 전이되는 아미노산을 함유하는 단백질을 2 또는 3개의 아미노산 잔기의 치환으로, 단백질을 뮤신형 당 사슬의 결합 가능한 단백질로 변이시킬 수 있다.

[실시예 14]

GalNAc수용체 활성을 가지는 펩티드 서열의 단백질로의 도입 및 뮤신형 당 사슬을 가지는 변이형 단백질의 진핵세포에서의 분비 발현

실시예 11 내지 13에서는, GalNAc수용체 활성을 가지는 적당한 펩티드 서열을 단백질에 도입함으로써 단백질을 시험관 내에서의 GalNAc전이 반응의 기질 단백질로 변이될 수 있음을 나타내었다. E. coli는 뮤신형 당 사슬의 생합성 경로에서 결여되어 있으므로, 생체외에서의 GalNAc 전이 반응이 필요하지만, 진핵 세포에서는 뮤신형 당단백질의 생합성계가 존재하므로 뮤신형 당단백질을 직접 생산에 사용될 수 있을 것이다. 그러므로, GalNAc 수용체 활성을 가지는 펩티드 서열을 함유하는 변이형 단백질을 코드하는 유전자를 제조하여 COS 7 세포에서 분비 발현시켜서, 변이형 뮤신형 당단백질이 생성될 수 있음을 확인하였다.

이전 실시예와 동일하게 GST를 모델 단백질로 사용하였고, 실시예 11과 13의 GalNAc가 전이되어 나타난 GST-3X Muc C1과 전이되지 않은 변이체 GST-3X를 COS 7세포에서 발현시켰다.

GST는 세포내 단백질이므로, 분비에 대한 시그널 서열이 N-터미널에 첨가된 GST-3X Muc C1의 유전자를 2단계의 PCR 반응을 이용하여 제조 하였다. 사람의 조혈 촉진 인자(hEPO)[K. Jacobs et al., Nature, Vol.313, pp. 806-810 (1985)]의 시그널 서열을 하기의 방법으로 사용하였다.

하기의 4종류의 프라이머 DNA를 Applied Biosystems사가 제조한 394DNA/RNA 합성기로 합성하였다.

5'-AACTCGAGAATTCATGGGGGTGCACGAATG-3' (합성 DNA 12)

5'-CAATAACCTAGTATAGGGGAGCCCAGGACTGGGAGGCCCA-3' (합성 DNA 13)

5'-TGGGCCTCCCAGTCCTGGGCTCCCCTATACTAGGTTATTG-3' (합성 DNA 14)

5'-CCTCTAGATCGTCAGTCACGTCAGATGAAT-3' (합성 DNA 15)

PCR반응의 1단계에서는, 주형 DNA로서 hEPO의 cDNA를 함유하는 플라스미드[H. Ohashi et al., Biosci. Biotech. Vol. 58, pp. 758-759 (1994)]와 프라이머로서 합성 DNA 12 및 13을 사용하여, 어닐링 온도를 58℃로 변경하여 실시예 13에 기재한 PCR반응과 동일하게 실시하였다. 또한, 주형 DNA로서 pGEX-3X, 프라이머로서 합성 DNA 14 및 15을 사용하여 반응을 실시하였다. 각각의 반응 생성물은 클로로포름 추출을 1회, 에탄올 침전을 2회 실시한 후, 50㎕ TE 완충제에 용해시켰다. 1㎕의 신호 펩티드 영역과 1㎕의 GST이 PCR 반응 생성물을 혼합하여 주형 DNA와 프라이머로서 합성 DNA 12 및 15를 사용하여 2단계의 PCR 반응을 실시하였다. 반응 및 반응 생성 정제는 실시예 13과 동일하게 실시하였다. 제한 효소 XhoⅠ과 XbaⅠ으로 절단한 후에, pBluescriptⅡ KS+의 동일한 제한 부위에 종래의 방법에 의하여 삽입하였다. 생성된 플라스미드는 pBEGST-3X로 명명되었다. 플라스미드의 삽입 영역의 염기 서열은 프리즘, Dye Primer Cycle Sequencing 키트 (-21 M31) 및 (M31 Rev.)(Applied Biosystems사)를 사용하여 실시예 13과 동일한 방법으로 분석 및 확인하였다.

GST-3X Muc C1의 분비형 단백질의 유전자를 pGEX-3X 대신에 pGEX-3X Muc C1을 사용한 것을 제외하고 동일한 방법으로 제조하여 pBEGST-3X Muc C1을 얻었다.

pBEGST-3X와 pBEGST-3X Muc C21의 삽입 영역을 제한 효소인 XhoⅠ과 XbaⅠ으로 절단하여 회수한 다음, 포유동물용 플라스미드 벡터 pSVL(Pharmcia Biotech사 제품)의 동일 제한 부위에 종래의 방법에 의하여 삽입한 후 pSEGST-3X와 pSEGST-3X Muc C1을 얻었다. 플라스미드의 제한 효소 지도는 제 19도(a)와 제 19도(b)에 나타나있다. 플라스미드를 포유류 세포에 도입할 때에는, 본래의 GST-3X의 N-말단측부터 2번째인 세린에서 시작되는 GST변이체인 EGST-3X와 EGST-3X Muc C1가 배양물에서 분비될 것이다.

pSECST-3X와 pSEGST-3X Muc C1는 전기이동법으로 COS 7세포(Riken Cell Bank사)에 삽입하였다. 더욱 상세하게는, 0.8ml의 PBS(-)(Nissui Pharmaceutical사)내에 약 5 x 10⁶세포에 10㎍의 플라스미드를 첨가하고, 유전자 펄서(Japan Biolaboratory)를 사용하여 실온에서 1600V 및 25㎌의 조건하에서 DNA를 삽입하였다. 세포는 90mm의 실험용 접시에 놓고 10% 소의 태아 혈청 10ml를 함유하는 Dulbecco의 변성 Eagle 배지(Base Catalogue No. 12,430)(Gibco BRL사)에서 24시간동안 37℃에서 배양한 후 10ml의 Dulbecco의 변성 Eagle 배지(Base Catalogue No. 26,063)(Gibco BRL)에 옮겨서 3일 동안 37℃에서 배양하였다.

분비된 GST 변이체의 배양 상징액으로부터의 정제는, 0.5ml의 글루타티온 세파로우즈 4B 컬럼을 사용하여 실시예 11에 기재된 E. coli에서 유도한 조효소액의 1/2 스케일로 동일하게 실시하였다. 용출된 활성 부분을 농축하여 Centricon-10(Grace Japan사)을 함유하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.2)으로 이동시켰다.

상기의 방법으로 생성된 EGST-3X와 EGST-3X Muc C1은 E. coli에서 생성된 GST-3X와 유사한 특이적인 GST 활성도를 나타내었다. 이들을 글리코시다제 처리 분석과 렉틴 블로팅 분석을 하기의 기재한 방법으로 실시하였다.

글리코시다제 처리에서는 아드로박터 유레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens)에서 유도된 뉴라미니다제(Boehringer Mannheim사)와 쌍구균 폐렴에서 유도된 O-글리카나제(Genzyme사)를 사용하였다. 뉴라미니다제를 사용한 처리는 40㎕의 20mM 인산 칼륨 완충제(pH 6.2) 내의 GST변이체 약 300ng에 40mU의 효소를 첨가한 후, 37℃에서 13시간동안 배양하였다. 뉴라미니다제와 0-글리카나제의 처리는, 상기에 기재한 뉴라미다제의 반응용액을 37℃에서 1시간동안 보온한 후, 2mU의 O-글리카나제를 첨가하고 12시간동안 반응이 되도록 방치하였다. 대조군으로서, 37℃에서 13시간동안 보온한 샘플과 미처리 샘플을 준비하였다. 각 샘플은 동량의 2 x SDS/샘플 완충액을 첨가하여 SDS와 반응시킨 후 반응 생성물 15㎕을 SDS-PAGE에 적용시켰다. 전기영동후의 겔은 2D-은 염색시약Ⅱ "디아키"(Daiichi Parmaceuticals사)로 염색하여 단백질 밴드를 검출하였다.

렉틴 블로팅 분석은 DIG글리칸 분별 키트(Boehlinger Mannheim사)를 사용하여 실시하였다. 이 분석에서, SDS-PAGE 분석으로 가는 과정은 글리코시다제 처리와 동일하다. 다음으로, 단백질을 PVDF 막[M. Ogasawark 등, Protein Experiment Mwthods for the Study of Molecular Biology, Yodosja,1994]에 블로팅하고 갈락토오즈(β1-3) N-아세틸갈라코사민(Gal β1-3 GalNAc)의 구조를 DIG 표지된 렉틴 PNA로 분석하였다.

글리코시다제 처리의 결과를 제 20도에 나타내었다. 생성된 EGST-3X는 실질적으로 약 27k의 분자량을 가진 단일 밴드로 검출되었으며, 이것은 글리코시다제 처리후에도 변하지 않았다. 반면에 EGST-3X Muc C1이 단백질 부분에서 예상되는 분자량인 28K보다 고분자량 쪽으로 이동한 단일 밴드로 검출되었다. 그리고, 이 밴드는 뉴라미니다제 또는 뉴라미니다제와 O-글리카나제의 결합 처리에 의해 저분자량 쪽으로 이동할 수 있었다. 이러한 사실은 전형적인 뮤신형 당 사슬이 EGST-3X Muc C1과 결합한다는 것과 이 구조가 시알산이 있는 Gal β1-3 GalNAc라는 것을 나타낸다.

제21도에 렉틴 블로팅 분석의 결과를 나타내었다. 렉틴 PNA와 반응한 밴드는 글리코시다제 처리에 관계없이 EGST-3X에 대해서 검출되지 않았다. 그러나, 뉴라미니다제로 처리한 EGST-3X Muc C1의 약 28K에서의 밴드가 렉틴과 반응하였다. 또한, 밴드는 뉴라미니다제와 O-글리카나제로 처리한 시료에서는 사라졌다. 그러므로, EGST-3X Muc C1의 단백질 부분은 전형적인 뮤신형 당 사슬인 시알산을 가진 Gal β1-3 GalNAc을 가진다.

상기의 발견으로부터, 단백질은 GalNAc수용체 활성도를 가지는 펩티드 서열과 진핵 세포에서 단백질을 발현시키는 분비 기관을 도입함으로써, 3이상의 상이한 형태의 단당류로 이루어진 전형적인 뮤신형 당 사슬을 가지는 당단백질로 변이될 수 있다.

[실시예 15]

GakNAc수용체 활성도를 가지는 펩티드 서열의 단백질로의 도입 및 진핵 세포에서 뮤신형 당 사슬을 가지는 변이 단백질의 분현

실시예 14는 MAAATPAPM의 펩티드 서열을 삽입해서 생성되는 변이체 GST가 COS7세포에서 발현되는 분비물과 생성된 EGST-3X Muc C1이 전형적인 뮤신형 당 사슬을 가지는 것을 나타내었다. 그러므로, 이번 실시예에서는 실시예 13의 생체외에서 GalNAc에 대한 기질로서 GST-3X Muc C1처럼 기능하는 것이 확인된 각 GST-3X Muc C2, GST-3X Muc C3 및 GST-3X Muc C4가 시그널 펩티드 및 COS7세포에서 발현된 분비물과 용해하여 발현된 단백질인 EGST-3X Muc C2, EGST-3X Muc C3 및 EGST-3X Muc C4가 전형적인 뮤신형 당 사슬과 결합할 수 있는지를 확인하였다. 또한, GTPGNSS의 서열을 가지며, 포지션 +1의 아미노산이 EGST-3X의 C-말단부 영역에서 프롤린인 GST-3X Muc C5를 제조하였다.

EGST-3X, EGST-3X Muc C1, EGST-3X Muc C2, EGST-3X Muc C3, EGST-3X Muc C4 및 EGST-3X Muc C5의 분비 발현을 위해서, pEEGST-3X, pEEGST-3X Muc C1, pEEGST-3X Muc C2, pEEGST-3X Muc C3, pEEGST-3X Muc C4 및 pEEGST-3X Muc C5를 하기에 기재한 방법으로 제조하였다. 제 22도는 제한 효소 지도와 변이된 영역을 가지는 아미노산 서열을 나타낸다.

pBEGST-3X를 제한 효소인 XbaⅠ로 절단한 후에, 제한 효소 EcoRⅠ으로 부분 중해하여 완전한 길이의 EGST-3X를 가진 구조적 유전자를 함유하는 약 0.9kb DNA 단편을 생성하였다. 그다음에 단편을 종래의 방법에 의하여 pEF18S[T. Kato et al., J. Biochem, Vol. 118, pp.229-236 (1995) and S. Mizushima et al., Nucleic Acid Res. Vol. 18, 5322(1900)]의 EcoRⅠ과 XbaⅠ부위의 사이에 삽입하여 pEEGST-3X를 생성하였다. 플라스미드 벡터 pSVL에서의 GST변이체의 발현도는 실시예 14만큼 높지 않으므로, 고발현도를 예상하고 pEF18S를 사용하였다.

pEEGST-3x Muc C1을 pBEGST-3X 대신에 pBEGST-3X Muc C1을 사용하여 상기에 기재한 방법으로 구축하였다.

pEEGST-3X Muc C2은 실시예 13의 pBGST를 제한 효소인 BalⅠ과 XbaⅠ로 절단하여 0.5kb DNA 단편을 생성하고 pEEGST-3X의 동일 제한 효소 부위를 가지는 영역 대신에 단편을 사용하여 구축하였다. pEEGST-3X Muc C3과 pEEGST-3X Muc C4는 또한 실시예 13의 pBGST C3과 pBGST C4로부터 구축하였다.

pEEGST-3X Muc C5는 하기에 기재된 방법으로 구축하였다. 하기의 프라이머 DNA를 합성하였다.

5'-CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACGATGAATTGCCGGGGGTCCCAC-3'

(합성 DNA 16)

주형 DNA로서 pGEX-3X를 사용한 것을 제외하고 실시예 13에 기재한 PCR반응을 실시하고 실시예 13의 합성 DNA 7을 프라이머인 합성 DNA 16과 결합하였다. 반응 후에, PCR 반응 생성물을 실시예 12에서 기재한 방법으로 정제하고 제한 효소인 SacⅠ과 XbaⅠ으로 절단하였다. 단편을 pBluescriptⅡ KS+ (Stratagene사)의 동일 제한 효소 부위에 삽입하였다. 생성된 플라스미드는 pBGSTC5로 명명하였다. 삽입된 단편의 서열은 프리즘, Dye Primer Cycle Sequencing 키트(-21 M13) 및 (M13 Rev.)(Applied Biosystems사)를 사용하여 확인하였다. 플라스미드 pBGSTC5를 제한 효소인 BalⅠ과 XbaⅠ로 절단하고 pEEGST-3X의 동일 제한 효소 부위를 가지는 영역을 pEEGST-3X C5으로 치환하여 약 0.5kb DNA단편을 획득하였다.

pEEGST-3X, pEEGST-3X AMuc C1, pEEGST-3X Muc C2, pEEGST-3X Muc C3d, pEEGST-3X Muc C4 및 pEEGST-3X Muc C5의 제조된 플라스미드 각각을 COS 7세포에 삽입하고 세포에서 배양물로 분비되는 GST변이체를 실시예 14에 기재된 방법으로 정제 및 농축하였다. 생성된 EEGST-3X, EEGST-3x Muc C1, EGST-3x Muc C2, EGST-3x Muc C3, EGST-3x Muc C4 및 EGST-3x Muc C5는 E. coli에 의해 생성된 GST-3X와 비교하여 특이 활성도를 나타내었다. 각 시료의 일부를 13% SDS-PAGE와 은 염색으로 분석하여 단백질 밴드를 검출하였다.

상기의 결과를 제 23도에 결과를 나타내었다. 실시예 14에서 당 사슬이 없는 것으로 판명된 EGST-3X는 약 27K에서 단일 밴드를 나타내었다. 반면에, EGST-3X Muc C1의 경우에는 주요 시그널은 실시예 14에서 뮤신형 당 사슬과 결합하는 것으로 판명된 위치에서 발견되었으며 미세 시그널은 당 사슬이 없는 단백질에 해당하는 28K에서 발견된다. 유사하게, 모든 EEGST-3X Muc C2, pEEGST-3X Muc C3 및 pEEGST-3X Muc C4는 EGST-3X Muc C1의 경우와 유사한 뮤신형 당 사슬을 가지는 단백질에 해당하는 밴드를 생성하였다. 대조적으로, EGST-3X Muc C5는 당 사슬이 없는 단백질에 해당하는 주밴드와 뮤신형 당 사슬을 가지는 단백질에 해당하는 부밴드를 생성하였다.

상기의 결과는 GalNAc수용체 활성을 가지는 각종 펩티드 서열 중 1종류를 단백질에 삽입시키고 진핵 세포내에서 이 단백질을 발현시킴으로써 단백질을 뮤신형 당 사슬을 가지는 전형적인 당단백질로 변이시킬 수 있음을 증명한다. 더욱 상세하게는, 상기의 결과로부터 실시예 1내지 10에 기재한 GalNAc수용체 활성을 가지는 각종 펩티드 서열은 진핵 세포내의 뮤신형 당 사슬의 생체내의 생합성 경로중에서 단백질 내에서 수용체로서 충분히 기능할 수 있음이 명백해졌다. 또한, 펩티드 서열의 삽입 결과는 뮤신형 당 사슬의 변이가 단백질내의 당 사슬 결합 부위를 포함하는 1 내지 3종류의 아미노산 만을 필요로 하므로 본 발명의 기술이 매우 유용함을 증명하였다. 또한, 포지션 +1에만 프롤린을 가지는 EGST-3X Muc C5와 포지션 +1 및 +3모두에 프롤린을 가지는 EGST-3X Muc C4의 비교에서 더 강한 GalNAc수용체 활성을 가지는 EGST-3X Muc C4가 생체내의 뮤신형 당 사슬을 가지는 당단백질의생성에 있어서 유효한 글리코실레이션에 더욱 유리하게 사용될 수 있는 것으로 나타났다.

Claims

변형된 단백질 또는 펩티드를 코드하는 키메릭 DNA 분자로 형질 전환시킨 진핵 세포를 배양하는 단계와 상기 진핵 세로에 의해 생성된 변형된 단백질 또는 펩티드를 수집하는 단계로 이루어지고, 여기서 사어기 키메릭 DNA 분자는 단백질과 펩티드를 코드하는 DNA 분자를 제공하고, 상기 DNA 분자로 하기 식(Ⅰ)로 나타낸 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 삽입하여 제조되는 뮤신형 당 사슬을 갖는 변형된 단백질 또는 펩티드의 제조방법

X(-1) - X(0) - X(1) - X(2) - X(3) (Ⅰ)

상기에서, X(-1)는 Y, A, W, S, G, V, F, T 및 I로 이루어진 군에서 선택되고, X(0)는 T 또는 S 이고, X(2)는 A, P, C, K, R, H, S, M, T, Q, V, I, L 및 E로 이루어진 군에서 선택되고, X(1)과 X(3)는 각각 임의의 아미노산을 나타내지만, X(1)과 X(3) 중 적어도 하나는 프롤린(P)을 나타낸다.
제1에 있어서, X(0)은 T인 제조방법.
제1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 추가적으로 X(-1)의 N-터미널 쪽에 존재하는 하나 또는 두 개의 추가 아미노산을 코드하고, 여기서 상기 추가 아미노산은 A, P, G, E, Q, T, R 및 D로 이루어진 군에서 선택되는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 식(Ⅰ)로 나타낸 펩티드는 ATPAP, AATPAP, AAATPAA, AAATAAP, PAATAAP, APATAAP, AAPTAAP, AAATAPP, PAATPAP, APATPAP, AAXaTPXbP(여기서, Xa 와 Xb는 임의의 아미노산을 나타내지만, Xa 또는 Xb 중 하나는 A를 나타냄), 및 AAATPAPXc(여기서 Xc는 임의의 아미노산을 나타냄)으로 이루어진 군에서 선택되는 제조방법
제1항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포인 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 키메릭 DNA는 벡터 DNA가 추가로 이루어진 제조방법.
하기 식(Ⅰ)으로 타나낸 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스로 이루어진 키메릭 DNA 분자

X(-1) - X(0) - X(1) - X(2) - X(3) (Ⅰ)

상기에서, X(-1)는 Y, A, W, S, G, V, F, T 및 I로 이루어진 군에서 선택되고, X(0)는 트레오닌(T) 또는 세린(S)이고, X(2)는 A, P, C, K, R, H, S, M, T, Q, V, I, L 및 E로 이루어진 군에서 선택되고, X(1)과 X(3)는 각각 임의의 아미노산을 나타내지만, X(1)과 X(3) 중 적어도 하나는 프롤린(P)을 나타낸다.
제7항에 있어서, X(0)은 T인 DNA 분자.
제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 추가적으로 X(-1)의 N-터미널 쪽에 존재하는 하나 또는 두 개의 추가 아미노산을 코드하고, 상기 추가 아미노산은 A, P, G, E, Q, T, R 및 D로 이루어진 군에서 선택되는 DNA 분자.
제7항에 있어서, 상기 식(Ⅰ)으로 나타낸 펩티드는 ATPAP, AATPAP, AAATPAA, AAATAAP, PAATAAP, APATAAP, AAPTAAP, AAATAPP, PAATPAP, APATPAP, AAXaTPXbP(여기서, Xa와 Xb는 임의의 아미노산을 나타내지만, Xa 또는 Xb 중 하나는 A를 나타냄), 및 AAATPAPXc(여기서 Xc는 임의의 아미노산을 나타냄)으로 이루어진 군에서 선택되는 DNA 분자.
제7항에 있어서, 상기 키메릭 DNA는 벡터 DNA가 추가로 이루어진 DNA 분자.
제11항에 따른 DNA 분자로 이루어진 진핵 숙주 세포.
제11항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 진핵 숙주 세포.