WO1996013516A1 - Sequence peptidique formant une chaine de mucine et technique de modification de la proteine a lier a la chaine de mucine - Google Patents

Description

明 細 書 ムチン型糖鎖を形成するべプチド配列および ムチン型糖鎖結合タンパク質への改変技術

[発 明 の 背 景]

発明の分野

本発明は、 タンパク質またはべプチド鎖中にムチン型糖鎖が特異的に導入され るァミノ酸配列、 およびその配列を利用した夕ンパク質またはべプチド中へのム チン型糖鎖の導入技術に関する。

背景技術

動物、 植物、 昆虫など広範囲な生物に見られるタンパク質の多くは糖タンパク 質であり、 その糖鎖の多様な役割力近年次々に明らかにされている。 例えば、 糖 鎖は種々の細胞接着や細胞認、識においてリガンドとして生理学的な機能をしてい るほか、 タンパク質の安定性や溶解性を向上させるという物理化学的な働きを持 つことが知られている。 さらに、 最近ではエリスロポエチン、 インターフニロン などの糖タンパク質性の医薬品が開発されており、 糖鎖構造が薬物動態や体内安 定性などに大きく影響していることが明らかにされている。 このように、 糖タン パク質糖鎖の重要性は明白であるが、 夕ンパク質の特定の位置に糖鑌を導入する 簡便な技術はこれまでに確立されていない。

医薬品の中には本来は糖夕ンパク質であるにも拘わらず、 タンパク質部分だけ を大腸菌などで大 産することを余儀なくされている場合がある。 このような タンパク質を生体に投与すると、 糖鎖を有していないことに起因して体内動態、 安定性、 抗原性などにおいて天然型の糖夕ンパク質と差異が生じてしまうことが しばしば見いだされているつ さらに、 このような差異は、 大量投与時の障害や副 作用の原因となることが考えられる。

また、 動物の培養細胞を用いて^されたタンパク質であっても、 本来の糖鎖 構造と異なる糖タンパク質が生産されることがあり、 その場合には上記と同様の 事態の発生が予想される。

従って、 タンパク質の特定の位置に所望とする糖鎖力導入できれば、 糖鎖の多 様な機能が自由にタンパク質に付与でき、 上記のような課題を解決することがで きると考えられる。 さらに、 医薬品以外の多方面に渡っても非常に利用価値の高 い技術となること力期待される。

さて、 糖鎖のタンパク質への主要な結合様式としては、 ァスパラギン結合型糖 鎖とムチン型糖鎖が知られている。

これまでの種々の報告によれば、 ァスパラギン結合型の場合には、 タンパク質 中の結合部位に- As n- Xa a- S e r/Th r _ ( a a ≠? ι ο ) という共通配列が見られると されている。 し力、しな力くら、 タンパク質中のこの共通配列全てにァスバラギン結 合型糖鎖が結合している訳ではないことも知られている。 一方、 ムチン型糖鎖の 場合には結合部位の周辺配列に S e r、 Th r、 P r o などのアミノ酸が比絞的多く認 められるとの報告がなされているが、 明確な配列の特徴が明らかにされたとの報 告はなされていない。

また、 糖鎖の形成についてもァスバラギン結合型糖鎖とムチン型糖鎖との間に は相違が見られる。 即ち、 ァスバラギン結合型糖鎖の形成はタンパク質鎖の翻訳 と同時に起こり、 その後に糖タンパク質のフォールディングが行なわれるのに対 し、 ムチン型糖鎖の形成はタンパク質の翻訳とフォールディングの後に行なわれ る。 さらに、 ァスバラギン結合型糖鎖の場合には、 タンパク質に 14個の糖から構 成される大きな糖鎖が一度に結合し、 この糖鎖がフォールディングの際にカルネ キシンと呼ばれる^シャペロンに認識され、 正いゝ立 造が形成されるよう 制御されていることが報告されている。 しかし、 厶チン型糖鎖については、 この ような分子シャぺ口ンの存在は見いだされていない。

従って、 前記したように、 ァスパラギン結合型糖鎖の糖鎖結合部位は明らかと なっている力 適当な導入部位の予想は容易ではなく、 また導入後の改変タンパ ク質が本来のタンパク質と同じ立体構造を形成して、 活性が十分に維持されると の保証はない。

一方、 ムチン型糖鎖はタンパク質が立体構造を形成した後に導入されるので、 糖鎖の導入によるタンパク質の立体構造への影響は少ないと思われる。 そのため、 ムチン型糖鎖の導入は、 タンパク質の立体構造と機能とを維持したまま糖鎖の機 能が付与できる有望な糖鎖導入法と考えられる。 しかしながら、 前記したように、 ムチン型糖鎖の糖鎖結合部位に特異的なぺプチド構造の知見がなく、 タンパク質 中の特定の部位に確実に導入することは出来ないのが現状である。

ムチン型糖鎖が結合しているべプチド配列の特徴については後記するような知 見が得られている一方で、 ムチン型糖鎖の GalNAc (N- ァセチルガラク トサミン） をタンパク質に導入する についてはその存在力知られている。 それは、 UDP- GalNAc: ポリペプチド αΐ, 0- GalNAc転移酵素 (0-GalNAc T) と呼ばれるものであ る。 この 0- GalNAc Tは、 ゥシの初乳等に存在するすること力〈知られており、 下記 の式に示すようにタンパク質およびべプチドのセリンまたはスレオニン残基に Ga iMcを転移する。

UDP-GalNAc ^ タンパク質 ― タンパク質- Ga INAe - し' DP

(式中、 UDP はゥリジン 5， ニリン酸、 GalNAcは N-ァセチルガラク トサミ ンを示 す。 ）

この^の存在は広い範囲で確認されている。 例えば、 A. Elhammerらによって ゥシの初乳に . Biol. Chem.、 第 261 巻、 第 5249〜5255頁 （1986) 〕 、 M. Sugi ura らによってラッ ト腹水肝ガン細胞 AH99に ϋ. Biol. Chem.、 第 257 巻、 第 95 01~950ιο 頁 （1982) 〕 、 Y. Wangらによってブ夕 HT腺に 〔：. Bioi, Chem.、 第 26T 巻、 第 12709 - 12716 頁 (1992) 〕 、 J. M. Cot e 11らによってブタ気管に

CBiochem. J. 、 第 283 巻、 苐 299 〜305 頁 （1991) 〕 存在することが報告され ている。 さらに、 この酵素の遺 のクローニングも既に報告されており 〔 し. Homaら、 j. Biol. Chem.、 第 268巻、 第 12609-12616 頁 （1993) 〕 、 遺 工学 的手法により昆虫細胞や動物細胞から大量の が容易に取得できること力 <報告 されている 〔F. L. Homaら、 Protein Expr. Puri 、 第 6 巻、 第 141-148 頁 (1995) 、 および S. Wragg ら、 1. Bio!. Ch 、 第 270 巻、 第 16947 - 16954 頁 (1995) 〕 。 これまでに、 ムチン型糖鎖の結合しているべプチド配列の特徴を分析した例は 幾つか報告されているが、 ほとんどは既知のムチン型糖鎖結合部位周辺のァミノ 酸配列を統計的に処理したものであり、 上記 0-GalNAe Tを用いて実際にその反応 性まで解析したものは僅かである。

I. B. H. Wilsonらはムチン型糖鎖結合部位と非結合部位の比較を行ない、 結合 部位の- 3から τ3の間 （以下、 本明細書において、 ペプチド配列の中におけるアミ ノ酸の位置に関し、 糖力転移するアミノ酸の位置を位置 0、 そこから Ν末端側の アミノ酸の位置を -1、 -2、 -3と、 C 末端側のアミノ酸の位置を *1、 -2、 十 3と呼ぶ） ではプロリン、 セリン、 およびスレオニンが顕著に高い頻度で存在し、 ァラニン 力 <幾らか高い頻度で認められると報告している。 また、 プロリンカ <存在する' ^¾ については- 1と 3が比較的高いと述べている。 しカヽし、 彼らは、 これらの配列的 特徴が必ずしも結合部位だけに存在するものではないことから、 最終的にムチン 型糖鎖結^位の配列的特徴を明らかにすることは困難と結論している。 また、 これらの統f "的処理の結果が正しいか否かを、 実際にべプチドを用いて調べるこ ともしていない CBiochem. 1 .、 第 275 巻、 第 529-534 頁 (1991) 〕 。

A. A. Goo leyらはラッ 卜の CD8 αというムチン型糖タンパク質の糖鎖結 位を ェドマン分解法で解析して、 ムチン型糖鎖が結合する共通配列のモチーフとして Xaa-Pro-Xaa-Xaa (ここで、 Xaa の少なくとも 1ケ所がムチン型糖鎖を結合した スレオニンを表す） を提唱している。 しかし同時に、 このモチーフではその他の ムチン型糖タンパク質の糖鎖結合部位を十分に説明することが出来ないことから、 ~ ^化は困難としている 〔Biocliem. Biophys. Res. Commun. 、 第 178 巻、 第 1194 -1201 頁 （1991) 〕 。 その後、 同グループはムチン型糖タンパク質であるヒト gl ycophorin A CGlycobioIogy^ 第 4 巻、 第 頁 (1994) 〕 ゃゥシ /c-casei n CGlycobiology. 第 4 巻、 第 837- 844 頁 （1994) 〕 を同様に解析して、 以下の 4つにモチーフに拡大して提案している。 なお、 以下で Thr (GalNAc) はムチン型 糖鎖を結合したスレオニンを表す。

1. aa-Pro-Xaa-Xaa

(ここで、 Xaa の少なくとも 1ケ所は Thr (GalNAc) を表す）

2. Thr (GalNAc) -Xaa-Xaa-Xaa

(ここで、 Xaa の少なくとも 1ケ所はスレオニンを表す）

3. Xaa-Xaa-Thr (GalNAc) -Xaa

(ここで、 Xaa の少なくとも 1ケ所はリジンまたはアルギニンを表す）

4. se r (Ga INAc) -Xaa-Xaa-Xaa

(ここで、 Xaa の少なくとも 1ケ所はセリンを表す）

しかし、 これ程に拡張しても、 その他のムチン型糖タンパク質の糖鎖結合部位 の説明には不十分で、 逆に糖鎖をもたないぺプチド配列も含まれてしまうことか ら、 Xaa の部分に制限を加える必要に迫られている。 また、 提案しているモチー フが正しいかをぺプチドを用いて検証することも行なっていない。

ブタ HT腺から調製した 0- GalNAc Tを用い、 合成ペプチドを基質として生体外 で GalNAc受容体活性の測定力く可能であることは J. D. Youn らによって報告されて いる 〔Biochemistry、 第 18巻、 第 44"- 4448 頁 （1979) 〕 。 その中で、 ゥシのミ エリン塩基性タンパク質由来の TPPP、 RTPPP、 PRTPPP、 TPRTPPP、 YTRTPPP 力く Ga INAc受容体活性をもち、 RTPPP が最も高い活性をもつことが示されている。 し かし、 これら一連の数少ない類似したペプチドの結果から、 GalNAc受容体活性を 有するペプチド配列の一般的な特徴が見いだされたとは到底言い難い。 また、 ÷1 から +3までの全てがプロリンであるので、 ムチン型糖鎖をタンパク質またはぺプ チドに導入するためには利用が大きく制限されると予想される。

B. O' Conne らは、 まず、 ムチン型糖鎖結合部位の統計的解析を行ない、 -6、 - +3のアミノ酸が重要と予測した。 そして、 ヒ卜の Von Wi llebrand factor の 糖鎖結合部位周辺の 12残基からなるペプチド PH QVTVGPGL (-6〜- 5) の- 6、 -1、 τ3のアミノ酸をそれぞれ他の 3種類のアミノ酸 （アルギニン、 グルタミン酸、 プ 口リ ンまたはイソロイシン） に変化させた合成べプチドを実際に作製し、 GalN 受容体活性に対する影響を確かめようと試みた。 しかし、 ムチン型糖鎖が結合す るために必要な明確な配列の特徴は見いだせず、 いずれの位置のァミノ酸置換も 大きく活性に影響するとだけ^!侖している [Biochem. Biophys. Res. Commun. 、 第 180 巻、 ^1024- 1030 頁 (1991) 〕。

その後、 B. 0' Coiinel 1らは更に同様のペプチド配列の- 6から τ5までの位置をそ れぞれ 5種類のアミノ酸 （アルギニン、 グルタミン酸、 プロリン、 イソロイシン、 およびァラニン） に置換したぺプチドを合成して GalNAc受容体活性を解析した。 そして、 τ3、 - -2を他のものに置換したり- 1を電荷のあるアミノ酸にすると活 性が減少する力 <、 他の位置はほとんど影響しないと以前と異なる結果を報告して いる。 これは、 統計学的な解析が実際のムチン型糖鎖の結合反応性と必ずしも一 致しないことを如実に示している。 また、 彼らはアミノ酸置換によって反応性が 低下する位置については解析している力 \ 限られたアミノ酸のみの置換であるた め、 いかなるアミノ酸が好ましいかについては、 十分に解析していない。 したが つて、 最終的にムチン型糖鎖が結合する配列の ~«的特徴について結論を導きだ すまでには到達していない [J. Biol. Chem. , 第 267 巻、 第 25010 -25018 頁、

(1992) 〕 。 Ake P El hammerらは _4から- 4までの範囲について統計的解析を行なった後にァ ルゴリズムを作成し、 ムチン型糖鎖が結合する部位におけるべプチドの配列は重 要ではなく、 結合部位の周辺がセリン、 スレオニン、 プロリン、 ァラニン、 およ び/またはグリシンから構成されていれば良いとしている。 そして、 ペプチドの 構造を考慮した上で 想のムチン型糖鎖結合配列の 1つとして PPASTSAPG を提案 し、 この配列と RTPPP など他の 4種類のペプチドとの実際の GalNAc受容体活性を 調べ、 それらの中では最も高い活性をもつことを示している。 し力、し、 比較が類 似の配列を含む 4種類にとどまることから、 真に理想的な配列を導きだしている かは疑問である。 また、 このアルゴリズムによれば GalMcが転移されると考えら れる部位を多数もつタンパク質を実際に基質としても、 反応は進行しないことが 示されており、 広く一般のタンパク質にムチン型糖鎖を導入するためには利用は 困難と考えられる 〔J. Biol. Chem.、 第 268 巻、 第 10029-10038 頁、 (1993) 〕 。 ムチン型糖鎖の語源の糖タンパク質ムチンではタンパク質の中に 20— 30残 基程度のァミノ酸配列がタンデムに並んだ繰り返し領域があり、 この領域に多数 のムチン型糖鎖が結合していることが知られている。 1. Nishimori らは、 ヒトム チン ML'Clの繰り返し領域について合成ペプチドを各種作製し、 ヒト？ 細胞 MCF7 から抽出した 0-GalNAcT の粗酵素液を用いて G a INAc受容体活性を解析した [J. Bi ol. Chem. , 第 269 巻、 第 16123-15130 頁、 (1994)] 。 その結果から、 GalNAc受容 体として最低限必要なぺプチドの領域は- 1から までであり、 τ3のプロリンが Ga INAcの転移を促進する場合があると報告している。 しかしその一方で、 PDTRPAPG S、 PDTRPPAGS、 PDTRAPPGS に Ga INAcの転移が認められないことから + 3のプロリ ンだけでは GalNAc受容体活性をもつぺプチドとして不十分であることを強調して いる。 筆者らは、 転移が阻害される原因として- 1と +1のァスパラギン酸とアルギ ニンの影響であると推定している力 <、 詳細を実際に確かめることは行なっていな い。 したがって、 これらの編侖からは GalNAc受容体活性を示すペプチド配列の特 徵を十分に理解することは困難と思われる。

ムチン型糖鎖の結合配列を遣 換え技術を用いてタンパク質に挿入して、 ムチン型糖タンパク質を作製した例としては、 インターロイキン 2 ( 1 L-2) にム チン型糖鎖を新規に導入した例が E. G r n enho r s t らによって報告されている 〔Eu r. J. B i o c h em. . 第 215 巻、 第 189-197 頁、 (1993) 〕 。 当初、 筆者らは 1い 2に 元来含まれる厶チン型糖鎖結合部位の周辺配列を含む GGKAPTS S STKGG を - 2の 80 番目と 81番目のアミノ酸の間に挿入して昆虫細胞で生産させたが、 新規にムチン 型糖鎖を導入させることは出来なかった。 そこで、 この配列のセリンを全てプロ リンに改変したぺプチド配列 GGKAPTPPPKGGを用いたところ糖鎖が導入された。 し かし、 この配列は思考錯誤と偶然に因るもので、 使用したペプチド配列が 12残基 と比較的長いことやタンパク質の構造に影響が大きいプロリンが 4残基も含まれ ていることを考慮すると、 広く一般のタンパク質に適用することは困難である。 以上のように、 ムチン型糖鎖が結合するためのぺプチド配列の特徴とされるも のは、 統計的な解析による場合には用 、た母集団の数や統計処理の方法によって 異なる。 これは、 天然の厶チン型糖タンパク質の糖鎖結合部位を決定することが 技術的に難しいため、 既知の結合部位の数が少ないことによると思われる。 その ため、 得られたぺプチド配列の特徴は実際の Ga lNAc受容体活性と異なっている場 合が多々あり、 ぺプチド配列の特徴を正確捉えているとは言い難い。

一方、 実際に台成べプチドを用いて I NAc受容体活性を調べた報告力幾つか知 られている力 \ ペプチドの合成が困難であることに起因して、 これまでに解析さ れたペプチドの種類は少ない。 また、 用いられているペプチドは 10残基程度の比 絞的長いものがほとんどで、 ムチン型糖鎖が結合するために必要な短いぺプチド 配列の特徴は、 実質的に明らかにされてない。

したがって、 これまでに報告されているペプチド配列の特徴では、 ムチン型糖 鎖をタンパク質に意図的に導入することは極めて困難である。 また、 ムチン型糖 鎖が結合するとされるぺプチド配列は比較的長いものであることから、 夕ンパク 質やべプチドをわずかに改変するだけでムチン型糖鎖を導入することができない。 そのためそれら配列の利用は非常に限定されたものとなっている。

—方で、 糖鎖のタンパク質への導入は有機合成的手段を考えることも可能であ る。 し力、し、 天然のムチン型糖タンパク質から分かるように、 糖鑌はタンパク質 鎖中の多数のセリンまたはスレオニンの中の特定の部位に結合させる必要がある。 これに対して、 現在の有機合成的手段では、 タンパク質またはペプチド鎖中に多 数存在するセリンとスレオニン中で、 特定の位置に選択的かつ効率的に糖を結合 させることは極めて困難と言わざるを得な L、。

[発 明 の 概 要]

本発明者等は、 ムチン型糖鎖が導入される結合部位のぺプチド配列について検 討した結果、 今般、 ムチン型糖鎖を極めて効率良く導入できる短いペプチド配列 についての知見を得た。 本発明はこの知見に基づく ものである。

従って、 本発明は、 ムチン型糖鎖力く導入される結合部位のペプチド配列の提供 をその目的としている。

また、 本発明は、 0- GalNAc Tの 作用によって厶チン型糖鎖が導入されるべ プチド配列の提供をその目的としている。

さらに、 本発明は、 タンパク質の機能を妨げず、 最^の改変でムチン型糖鎖の 導入を可能にする技術の提供をその目的としている。

そして、 本発明によるタンパク質またはペプチド配列は、 下記の式 （I) で表 わされる配列を含んでなるもの、 である。

X (-D - X (0)-X (l)-X (2)-X (3) (I)

(ここで、

X (- 1)および X (2) は して任意のアミノ酸を表し、

X (0) はスレオニン （T) 又はセリン （S) を表し、 X(l) および X(3) は して任意のアミノ酸を表すが、 少なくともいずれか —方はプロリン （P) を表す。 ）

上記タンパク質またはペプチドは、 UDP-GalNA ポリペプチド α 1, 0- Ga INAc転 移 (0-GalNAc T) の基質として作用し、 タンパク質またはペプチドに、 GalN Acを導入するために用いることが出来る。

さらに、 本発明によるタンパク質鎖またはべプチド鎖中への G a 1 N A cの導入は、 上記の式 （I) で表わされるペプチド配列を含んだ、 タンパク質鎖またはべプチ ド鎖を用意し、 このタンパク質鑌またはペプチド鑌を基質として、 UDP-GalNA ポリペプチド al, 0-GalNAc転移!^ (0-GalNAc T) の存在下で、 L'DP-GalNAc (こ こで、 L'DP はゥリジン 5' 二リン酸、 GalNAcは N- ァセチルガラク トサミンを表 す） と反応させることを含んでなるもの、 である。

また、 本発明によれば、 上記の式 （I) で表わされるペプチド配列を含んだタ ンパク質鎖またはべプチド鎖をコードする DNAを用意し、 真; 胞で分泌発現 させることにより、 ムチン型糖鎖を結合する糖夕ンパク質を生産することができ る。

[誦の簡単な説明]

第 1図は、 各種べプチドの GalNAe受容体活性を示す図である。

第 2図は、 糖鎖結^位のアミノ酸が Tまたは Sのいずれである場合が GalNAc 転移に適しているかを示す図である。

第 3図は、 プロリン 1残基を含む各種ペプチドの GalNAc受容体活性を示す図で あ

第 4図は、 プロリン 2残基を含む各種べプチドの GalNAc受容体活性を示す図で あ 。

第 5図は、 プロリン 3残基を含む各種べプチドの GalNAc受容体活性を示す図で あ 。 第 6図は、 N末端ァミノ酸残基数の異なる各種べプチドの GalNAc受容体活性を 示す図である。

第 7図は、 X (2) を各種アミノ酸に変化させた各種ペプチドの GalNAc受容体活 性を示す図である。

第 8図は、 X (2) のアミノ酸を光学異性な L体または D体に変化させた各種べ プチドの GalNAc受容体活性を示す図である。

第 9図は、 X (-1) を各種ァミノ酸に変ィヒさせた各種べプチドの GalNAc受容体 活性を示す図である。

第 10図は、 ^の位置に各種ァミノ酸を付加させた各種べプチドの GalMc受容 体活性を示す図である。

第 11図は、 GalNAc受容体活性を有するぺプチド配列が C末端側に導入された タンパク質 GST-3X Muc C1 の発現用プラスミ ド pGEX-3X Muc C1の構築を示す図で ある。

第 12図は、 GalNAc受容体活性を有するぺプチド配列が C末端側に導入された GST-3X Muc C1 およびその配列力く導入されていない対照タンパク質への GalNAcの 転移量を示す図である。

第 13図は、 GalNAc受容体活性を有するペプチド配列が N末端側に導入された タンパク質 GST-3X 2A Muc N1の発現用プラスミ ド pGEY-3X 2 A Muc 1 の構築を示 す図である。 なお、 この図は第 14図に続く。

第 14図は、 第 13図に続く、 GalNAc受容体活性を有するぺプチド配列が N末 端側に導入されたタンパク質 GST- 3X 2A Muc N1の発現用プラスミ ド pGEY- 3X 2A M uc N1 の構築を示す図である。

第 15図は、 GalNAc受容体活性を有するぺプチド配列が N末端側に導入された GST-3X 2A Muc N1およびその配^！力く導入されていない対照タンパク質への Ga INAc の転移量を示す図である。 第 16図は、 GalNAe受容体活性を有する各種ペプチド配列が、 C末端側に導入 された GST 変異体を発現するプラスミ ドを製造するための、 プラスミ ド pGEX-3XS の構築を示す図である。

第 17図 （a) 、 (b) 、 および （c) は、 タンパク質 GST-3X Muc C2 、 GST- 3X Muc C3 、 および GST-3X Muc C の発現用プラスミ ド pGEX-3XS Muc C2 、 pGEX -3XS Muc C3 、 および pGEX- S Muc C の構造を示す図である。

第 1 8図は、 タンパク質 GST-3X、 GST-3X Muc CI 、 GST-3X Muc C2 、 GST-3X M uc C3 、 GST-3X Muc C4 、 および GST-3X 2A Muc ^:1への631^(；の転移量を示す図 である。

第 19図 （a) および （b) は、 それぞれ EGST-3X および EGST-3X Muc C1を CO S7細胞で分泌発現させるためのプラスミ ド PSEGST-3X および pSEGST- 3X Muc CIの 構造を示す図である。

第 20図は、 C0S7細胞で分泌発現させて得られたタンパク質 EGST-3X および EG ST-3X Muc CIのグリコシダーゼ処理分析の結果である。

第 21図は、 C0S7細胞で分泌発現させて得られたタンパク質 EGST-Π および EG ST-3X Muc CIのレクチンブロッ卜分析の結果である。

第 22図は、 EGST-3X 、 EGST-3X Muc Cl、 EGST-3X Muc C2、 EGST-3X Muc C3、 EGST-3X Muc C4および EGST-3X Muc C5を分泌発現させるためのプラスミ ド pEEGST -3X 、 PEEGST-3X Muc Cl、 EEGST-3X Muc C2、 pEEGST- 3X Muc C3、 pEEGST-3X u c C4および pEEGST- 3X Muc C5の構造を示す図である。

第 23図は、 C0S7細胞で分泌発現させて得られたタンパク質 EGST-3X 、 EGST-3 X Muc Cl、 EGST-3X Muc C2、 EGST-3X Muc C3、 EGST-3X Muc C4および EGST- 3X Mu c C5を SDS- PAGE分析した結果である。

[発明の具体的説明]

以下の開示において、 または—を伴った数字は、 ペプチド配列中のアミノ酸 丄 の位置に関し、 糖鎖力 <転移するアミノ酸の位置を位置 0、 そこから Ν末端側のァ ミノ酸の位置を- 1、 -2、 -3と、 C末端側のアミノ酸の位置を^、 、 -3と呼ぶこ ととする。

また、 本発明においてァミノ酸はいわゆる一文字標記によって表すものとし、 具体的には次の通りである。

G ： グリシン

Α ： ァラニン

V ：バリン

L ： ロイシン

I ： ィソロイシン

S ： セリン

T ： スレオニン

D ： ァスパラギン酸

E ： グルタミン酸

N ： ァスパラギン

Q ： グルタミン

K ： リジン

R ：アルギニン

C ： システィン

M ： メチォニン

F ： フエ二ルァラニン

Y ： チロシン

W： トリブトファン

H ： ヒスチジン

P ： プロリン 本発明によれば、 まず、 前記式 (I ) で表される配列のペプチドが提供される。 この式 （I ) で表されるペプチドは、 i#mO-Ga Ac Tの基質として効率良く作用 する。 即ち、 高い GalNAc受容体活性を有する。 したがって、 このペプチドを、 UD P-GalNAcと 0- GaiNAc Tの存在下で反応させると、 Ga INAcを効率良くペプチドに導 入することが出来る。 この際、 GalNAcは、 このペプチドの Π0)の Tまたは Sに導 入される。

さらに、 この式 （I ) で表されるペプチド配^!を含んだタンパク質を、 UDP-Ga INAcと^ 0- GalNAc Tの存在下で反応させると、 Ga 1 NAcを効率良くペプチドに導 入することが出来る。 よって、 本発明によれば、 さらに、 前記式 (I) で表され る配列を含んだタンパク質が提供される。

また、 前記式 （I) で表されるペプチド配列を含んだタンパク質を、 遗 fe^且 換え技術を用 L、て真核細胞で分泌発現させると、 厶チン型糖鎖を結合した糖タン '、ク質を効率良く生産することが出来る。

本発明の好ましい態様によれば、 高い GalNAc受容体活性を有する配列として、 式 （I ) において、 Χ Π) または X (3) が Pまたは Aを表し、 少なくともいずれ か一方が Pである配列を含んでなるタンパク質またはべプチドが提供される。 さらに本発明のより好ましい態様によれば、 高い GalNAc受容体活性を有する配 歹 |Jは、 下記の式 （l a ) で表されるぺプチドである。

X (-1) - X (fl) -P- X (2)-P ( l a )

(ここで、 X (- 1.:、 X (0) 、 および X (2) は上記と同じ意味を表す。 ） この態様において好ましくは、 X (- 1)は Y、 A、 W、 S、 G、 V、 F、 T、 お よび Iのアミノ酸を表し、 X (2) は A、 P、 C、 K、 R、 H、 S、 M T、 Q、 V、 I、 Lおよび Eのアミノ酸を表す。

また本発明のより好まし 、態様によれば、 高い G a 1 t c受容体活性を有する配列 は、 下記の式 （l ) で表されるペプチドである。 X(-D- X(0)-X (l)-X (2)-P (l )

(ここで、 X (-l)、 X(0) 、 X (l) 、 および X (2) は上記と同じ意味を表す。 ） この態様において好ましくは、 X (- 1)は Y、 A、 P、 W、 S、 G、 V、 F、 T、 および Iのアミノ酸を表し、 X (2) は A、 P、 C、 K、 R、 H、 S、 M、 T、 Q、

V、 I、 Lおよび Eのアミノ酸を表す。 また、 さらに好ましくは、 X(-l)は Aま たは Pを表し、 X (l) および X (2) は Aを表す。

さらに本発明のより好ましい態様によれば、 高い Ga Ac受容体活性を有する配 列は、 下記の式 （I e ) で表されるぺプチドである。

X (-1：- X (O)-P-X (2)-X (3) ( I c )

(ここで、 X (- 1)、 X (0) 、 X (2) 、 および Χ (3'; は上記と同じ意味を表す。 ） この態様において好ましくは、 Χ (- 1:は Y、 A、 P、 W、 S、 G、 V、 F、 T、 および Iのアミノ酸を表し、 X (2) は A、 P、 C、 K、 R、 H、 S、 M、 T、 Q、

V、 I、 Lおよび Eのアミノ酸を表す。 また、 さらに好ましくは、 X (-l)は Aま たは Pを表し、 X(2) および X (3) は Aを表す。

とりわけ、 式 （l a ) および式 （l b ) で表される配列が好ましい。

さらに、 本発明の好ましい態様によれば、 X (0) は Tを表す。 場合によって、

X (0) が Tであると、 X (0) 力く Sである配列と比較して GalNAc受容体活性が約 50 倍以上となることがある。

また、 本発明の好ましい態様によれば、 X (-l)の更に N末端側に一または二個 のアミノ酸が存在する場合、 そのアミノ酸は A、 P、 G、 E、 Q T、 R、 また は Dであるのが好ましい。 さらに、 X (3) の更に C末端側に一以上のアミノ酸が 存在している場合は、 そのァミノ酸は任意であることが出来る。

また、 本発明によるべプチドまたはァミノ酸は、 L体、 D体いずれであっても よいが、 L体であるのが好ましい。 特に、 X (2) のアミノ酸は L体であるのが好 ましい。 式 （I) で表されるペプチド配列の具体例を挙げれば下記の通りであり、 さら に本発明による好ましいタンパク質の具体例は下記のぺプチド配列を含んでなる ものである。

ATP AP

A A T P A P

AAATP AA

AAATAAP

P AATAAP

A P A T A A P

AAPTAAP

AAATAP P

P AATP AP

AP ATP AP

AAXaTPXbP

(ここで、 Xaおよび Xbは任意のアミノ酸を表すが、 但し および) (bのいずれか 一方は Aを表す）

AAATP APXc

(ここで、 は任意のアミノ酸を表す）

本発明によるタンパク質またはべプチドは、 遺 fe^工学的手法によるかまたは 化学台成によつて製造されてよい。

さらに本発明によれば、 タンパク質またはべプチドにムチン型糖鎖を導入する 方法が提供される。

本発明によるタンパク質またはべプチドへの糖または糖鎖の導入は、 次のよう に行なわれる。 まず、 生体外で行なう場合には、 本発明によるタンパク質または ペプチドを用意し、 これと糖^ "体の L'DP- GalN'Acとを、 0- GalNAc Tの存在下、 好 ましくは MnC 、 トリ トン X-10Q を含む緩衝液中で反応させる。 糖 ^体、 糖受 容体の使用量はいずれも特に限定されず、 飽和量まで使用することができる。 酵 素 0- GalNAc Tの使用量も特に制限されない力 <、 反応溶液 lral当たり 10mU〜lQU 程 度使用するのが好ましい。 緩衝液は PHが 7付近の適当な緩衝液を用いればよく、 代表的な例として pH7. 2付近のィミダゾール- 塩酸緩衝液が例えば好ましく使 用される。 反応は、 通常 25〜37°C¾J で行なわれ、 その反応条件による力 転移反応は数分から数十時間程度で終了する。

また、 本発明によるタンパク質またはペプチドへの糖鎖の導入は、 ^0- GalN Ac Tを有する真核細胞の生台成系を利用することも可能である。 すなわち、

0-GalNAc Tを有する真核細胞中で本発明によるタンパク質またはべプチドを分泌 発現させると、 ムチン型糖鎖が導入されたタンパク質またはべプチドを得ること が出来る。 その際の糖鎖の導入位置は、 式 （I) で表される配列の X (0) となる と考えられる。 0-GalNAc Tを有する真^！田胞の好ましい例としては、 動物細胞の C0S7細胞、 C0S1細胞、 BHK 細胞、 C127細胞、 CH0細胞、 昆虫細胞の Si9 細胞、 Sf 21細胞などを挙げることができる。

本発明において、 糖類の導入を真核細胞の生合成系を利用して行う場合、 細胞 内に発現されたタンパク質は細胞外に分泌されなければならない。 従って、 例え ば糖鎖の導入が意図されたタンパク質またはべクチドが真; T細胞外へそのままで は分泌され難い場合には、 いわゆるシグナルべプチドが付加した前駆体として夕 ンパク質を発現させる。 そして、 そのタンパク質が細胞外に分泌させることで、 糖鑌カ《導入されかつ成熟夕ンパク質として目的のタンパク質を得ることができる _c ここで、 これらの細胞中で本発明によるタンパク質またはべプチドを発現させ るために必要な遺 fe^工学的手法は周知であり、 当業者であれば式 （I) で表さ れる配列を含んだタンパク質またはべプチドをこれらの細胞中にお 、て容易に発 現させることが出来ることは明らかである。 また、 式 （I) の配列はタンパク質 またはべプチドの配列中の所望の箇所に挿入または付加されることによって形成 される力、、 または所望の箇所のアミノ酸配列と式 （I ) の配列が置換されること によって導入されてよい。

より具体的には、 本発明によれば、 ムチン型糖鎖が結合したタンパク質または ペプチドの製造法が提供され、 その方法は、

上記した本発明によるタンパク質またはべプチド配列をコードする D N Aによ つて真核細胞を形質転換し、

該形 Κ¾換細胞中でタンパク質またはべプチド配列を発現させ、 かつ該真 胞外に該夕ンパク質またはべプチドを分泌させること

を含んでなる。

また、 本発明の別の態様によれば、 あるタンパク質またはペプチドの所望の位 置にムチン型糖鎖を導入する方法が提供され、 その方法は、

あるタンパク質またはべプチドをコ一ドする DNA内にあってそのタンパク質 またはべプチドのァミノ酸配列中のムチン型糖鎖の導入を意図する位置に対応す る位置に、 上記の式 （I) で表される配列をコードする DNAを挿入もしくは付 加する力、、 またはその位置に存在する部分 DNA配列と上記の式 （I) で表され る配列をコードする DN Αを置換して、 式 （I) で表される配列をコードする D N Aを含んだタンパク質またはべプチドをコ一ドする DNAを得て、

その DNAによつて真核細胞を形 Κ$έ換し、

その形質転換細胞中でタンパク質またはべプチド配列を発現させ、 真核細胞外 にムチン型糖鎖が結合したタンパク質またはべプチドを分泌させること

を含んでなる。

上記の式 （I)で表される配列をコードする DNAを含んだタンパク質または ぺプチドをコ一ドする DNAは、 ベクターに挿入された形態であるのが好ましい。 より好ましくは種々の発現を促進または制御する配列を含んだ発現ベクターの形 態にあること力《好ましい。 遺&?工学の分野で慣用されているベクターから、 本 発明において使用可能なベクターを選択し、 さらに発現ベクターを構築すること は、 当業者には過度の実験無しに行えるものである。 また、 上記方法において用 いられる真繊田胞は、 上記したような 0-GalNac Tを有する真核細胞であってよい。 さらに、 これら細胞において好ましく用いることができるベクター系は公知であ り (例えば、 olecular Cloning [J. Sambrook^^ Col d S ring Harbor Laborator y Press (1989)]および Baculovi rus Expression V e c t o r s： a laboratory manual [D . R.0' Re illy W. H. Freeman and Company (1992) 参照） 、 それらを本発明にお いて好ましく用いることができる。

よって、 本発明によれば、 さらに上記の式 （I) で表される配列をコードする DNA配列、 および本発明による上記式 （I) で表される配列を含んだタンパク 質またはべプチドをコ一ドする DN A配列が提供される。

上記のような本発明による方法によつて^ Kされる糖タンパク質あるいは糖べ プチドは、 公知または慣用されている方法によって反応終了液から容易に分離精 製可能である。 例えば、 ァフィ二ティーカラムクロマトグラフィー、 ゲル據過カ ラムクロマトグラフィー、 逆相カラムクロマトグラフィーなどがその方法として 挙げられ、 さらに濃縮、 凍結乾燥などの操作により回収することができる。

本発明よる糖鎖の導入法によれば、 構造が明らかなタンパク質鎖またはべプチ ド鎖の所望の位置に、 ムチン型糖鎖を導入することが出来る。 さらに、 本発明に よる式 （I) の配列は僅か 5個のアミノ酸配列からなり、 この配列が存在すれば 高い効率で糖鎖が導入される。 よって、 既に構造の明らかとなっているタンパク 質またはべプチドの構造に影響を与えることなく、 そのタンパク質またはべプチ ド鎖をムチン型糖鎖が結合したものに改変することが出来るので有利である。 し たがって、 本発明による技術は医薬など多くの分野で広く応用が期待される技術 であると言える。 さらに、 本発明による方法によって製造された糖タンパク質あるいは糖べプチ ドは各種糖質分解酵素や糖転移 の基質となり、 各種有用 #Sの検索に用いる ことができる。 例えば、 ムチン型糖鎖に関与する の基質を調製するのに有用 である。 例えば、 AAATPAP を用いて得られる AAAT (α-Gal NAc) PAPは試料中の α - - ァセチルガラク トサミニダーゼあるいは UDP-Gal ： GalNAc- ポリペプチド 1, 3-ガラグトース転移 の検出および測定に用いることができる。 試料として は ^^物、 昆虫、 動物、 植物などの生物あるいはそれらの細胞培養液など力《挙げ られる。

また、 例えば本発明のペプチド配列を調製し、 その後活性化カルボキシルァガロ ースゃ臭ィ匕シアン活性化ァガロースなどに結合させることにより、 ぺプチドが結 合した担体を調製することができる。 このペプチド結合担体は 0- GalNAc Tなどの ムチン型糖転移酵素の精製に有用である。

実 施 例

以下に 例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する力 <、 本発明はこれらに 限定されるものではない。

なお、 以下の実施例において用いた 0-GalNAc T、 ペプチド合成、 およびぺプチ ドの G a 1 N A e受容体活性の測定は次のように行った。

0_-GalNAc Tの精製

ゥシ初乳由来の 0- GalNAc Tの精製は、 A. Elhammer ら [J. Biol. Chem.、 第 26 1 巻、 第 5249〜5255頁 （1986) 〕 によって報告されている方法に基づき行った。 すなわち、 まず、 ゥシ初? ¾4. 8リッ トルを遠^ 理してバター層を除き、 さらに超遠^ 理した。 得られた 3. 2リツ トルの溶液に 80 Omlの g cerolを 加えて粗^液とした。 その後、 この粗 ¾^液から DEAE-Sephacel column c rom atograp y 、 限界 iltia、 apomuc i n- Sepharose 4B col醒 chromatography I · 11 の合計 4段階の精製過程を経て、 高度に精製された部分精製標品を取得した。 一 9 1丄 ― ぺプチド台成

ぺプチドの合成はプロティン ·テクノロジーズ社製 P S 3ぺプチド自動合成機 を用いて Fmo c固相法 〔泉屋信夫ら、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善、 1985 年〕 によって行ない、 精製した。 合成されたペプチドの構造確認および は質 量分析 （パーキンエルマ一社製、 質量分析機 A P I ill ) およびアミノ鹏 TO分 析 （日本電子社製ァミノ酸組成分析機 J LC- 300) によつて行なつた。

ぺプチドの GalMc受容体活性の測定

ペプチドの Gal NAc受容体活性は、 J. M. Cottrellら Biochem. J. 、 第 283 巻、 第 299 -305 頁 (1992) 〕 および Α· P, El hammerら [J. Biol. Chem.、 第 268 巻、 第 10029 - 10038 頁 (1993) 〕 の方法に基づいて測定した。

すなわち、 まず、 10 Onmolの合成ペプチドと 0. 5〜500mUの部分精製 ゥシ初乳由来 0-GalNAc Tを含む容量 50;/ 1 の反応液 （5 OniM Imidazo I e-H C 1 (pH 7. 2) 、 1 OmM MnC l ₀、 0. 5% TritonX— 100、 15 O^ UDP- [³H] Ga l NAc) を調製し、 37°Cで 30分から 5時間 適宜保温した。 10 OmM EDTAを 50 / 1 加えて反応を停止した後、 1ml のイオン交換カラム （バイオラッ ド社、 AG1— X8, Cl~iorm) に供し、 2. 5inlの水で溶出させた。 溶出画分に液体シンチレーシヨン用カクテル （デュポン 社、 アトムライ ト） を 1 Oml加え、 液体シンチレーシヨンカウンターで 2分間測 定した。

なお、 GalNAc受容体活性は、 反応初速度を、 PPASTSAPG を 100%とする相対 値で表した。

H¾例 1 各種ペプチドへの Gal NAc転移反応

第 1図に示されるぺプチドの GalNAc受容体活性を測定した。

なお、 これらのペプチド配列は、 ムチン型糖タンパク質由来のペプチド配列、 あるいは既に 0-GalNAc Tによって Ga 1 NAc力く転移されること力く知られているぺプチ ド配列である。 すなわち、 PGGSATPQ、 SGGSGTPG^ GEPTSTP、 PDAASAAP、 ALQPTQGA は各々ブタ HT腺ムチン、 ヒッジ 腺ムチン、 ゥシ - カゼイン、 ヒトエリス ロポェチン、 ヒト顆粒球コロニー刺激因子由来のペプチドである。 また RTPPP、 VTRTPPP はゥシミエリン由来であって、 l. D. Young ら 〔Biociiemist 、 第 18巻、 ^4444-4448 頁 (1979) 〕 、 PPASTSAPG は A. P. E 1 hamme rら CJ. Biol. Cliem.、 第 268 巻、 第 10029-10(138 頁、 （1993) 〕 によって、 それぞれ Ga INAcが転移される ことが報告されているぺプチドである。

その結果は第 1図に示されるとおりであった。 その結果によれば、 A, P. Elhamm erらが理想的なぺプチド配列として報告している PPASTSAPG が顕著に高い活性を 示し、 ΠΡΡΡ と VTRTPPP 力〈これに次いで高い活性を示した。 これに対し、 天然の ムチン型タンパク質由来のぺプチド配列は、 いずれもこれらよりも低い活性を示 し、 調べた H 腺厶チン由来のぺプチド配列では Gal NAcの転移は殆ど認められな 力、つた。

実施例 2 糖鎖結合部位アミノ酸 （スレオニンまたはセリン） の GalNAc転移に対 する影響

厶チン型糖鎖はべプチドのスレオニンまたはセリンに結合する。 いずれのアミ ノ酸が Ga 1 NAc転移反応に適しているかを調べた。

ぺプチドとしては、 実施例 1で用いた各種べプチドの中で G NAcの転移が認め られ、 かつセリンまたはスレオニンを 1残基のみ含むエリスロポエチン由来とミ エリン由来の配列を選んだ。 そして、 エリスロポエチン由来で PDAATAAPと PDAASA AP、 ミエリン由来のものとして RTPPP および RSPPP を作製した。

その結果は、 第 2図に示される通りであった。 図より明らかなように、 いずれ の場合にもスレオニンの方に 40〜50倍高い活性が存在した。 また、 PDAATAAPは実 施例 1で最も活性の高かった PPASTSAPG の約 4倍の高い活性を示した。

例 3 プロリンを 1残基含むぺプチドへの GalNAc転移反応 ムチン型糖タンパク質では糖鎖が結合しているァミノ酸の周辺配列にプロリン が比較的多く認められること、 また実施例 1および 2から高 L、Ga 1 NAc受容体活性 をもつペプチドがいずれも数個のプロリンを含むこと力 <認められたことから、 Ga l fiAc転移反応におけるべプチド中のプロリン残基の影響を検討した。 この第一段 階として、 AAATAAA を基本とするぺプチド配列中の各ァラニンの位置にプロリン 残基を 1個導入し、 Ga l NAc 受容体活性を比較した。 ペプチドとしては、 AAATAA A、 PAATAAA、 APATAAA、 AAPTAAA、 AAATPAA、 AAATAPA 、 および AAATAAP を作 製した。

Ga l NAc受容体活性は、 第 3図に示される通りであった。 その結果によれば、 AA ATAAA にはほとんど活性が認められないのに対し、 AAATPAA および AAATAAP には 有意に高い活性カ<認められた。 このことから、 Ga l NAc受容体活性には +1および +3 にプロリンが存在することが重要であり、 特に ÷3に大きな効果があること力判明 した。 また、 AAATAAP では PPASTSAPG の約 2倍の高い活性が認められた。

実施例 4 プロリンを 2残基含むペプチドへの Ga l NAc転移反応

実施例 3において、 プロリン 1残基を特定の位置に導入することによって大き な効果が得られることが見いだされた。 そこで次に、 最も活性の高かった AAATAA P の各ァラニンの位置に 2個目のプロリン残基を導入して Ga l NAc 受容体活性を 比較し、 2残基のプロリン導入の効果を調べた。 ペプチドとしては、 AAATAAA、 AAATAAP、 PAATAAP、 APATAAP、 AAPTAAP、 AAATPAP および AAATAPP を作製して Ga l NAc受容体活性を測定した。

その結果は第 4図に示される通りであった。 その結果によれば、 AAATPAP は、 AAATAAP と比較し約 3倍に受容体活性が增加しており、 +1と +3にプロリンを 2個 存在させるとべプチドへの Ga l NAcの転移力相乗的に {£!されることが明らかとな つた。 また、 AAATPAP は PPASTSAPG と比較すると約 7倍という非常に高い活性を 示した。 さらに、 実施例 3で明らかとなった ÷3に存在するプロリンの効果は、 -3、 -2、 - 1、 +2のァラニンをプロリンに変換しても安定して認められ、 これらの位置 のァミノ酸の変化に関わらず発揮されることが示された。

実施例 5 プロリンを 3残基含むペプチドへの Ga l NAc転移反応

実施例 4で示されたように、 ぺプチド配列中の +1と +3の 2残基のプロリンは Ga I NAc受容体活性を大きく上昇させる。 そこでさらに、 AAATPAP の各ァラニンの位 置に 3個目のプロリンを導入して、 プロリン残基の Ga l NAc受容体活性における効 果を調べた。 ペプチドとしては、 AAATAAP、 AAATPAP、 AATPAP、 APATPAP、 AAPT PAP 、 および AAATPPP を作製した。

その結果は第 5図に示される通りであった。 その結果によれば、 ペプチドの +1 と +3のプロリン以外にプロリンを導入しても、 Ga l NAc受容体活性は大きく増加す ることはなく、 と十3のプロリンが Ga l NAc受容体の活性に重要であると考えられ た。 また、 3個目のプロリンの導入では、 -3、 -2、 +2の場合に活性の変動が見ら れなかったが、 - 1に導入すると他と比較して活性の低下力く認められた。 このこと から、 基本的にはよ 1と +3の 2個のプロリンの効果はそれ以外の位置のァミノ酸の 変化に関わらず発揮されると考えられた。 し力、しな力 <ら、 Ga l Mcが転移されるス レオニンの両側 （- 1と が特殊なアミノ酸のプロリンであると、 ペプチド構造 力特別となり効果が低下する可能性が示唆された。

実施例 3から 5までにおいて得られた結果を総合的に勘案すると、 G a 1 N A cが転 移され易いぺプチドとなるためには、 その中に配列プロリンが無作為に存在すれ ば良い訳でなく、 特定の位置に存在することが重要であるとが明らかとなった。 また、 高い Ga l NAc受容体活性を示すためには、 Ga l NAcが転移されるセリンあるい はスレオニンの周辺においてプロリン数を単に増加させれば良いわけでなく、 特 定の位置に限定して置かれること力望ましいこと力く判明した。

実施例 6 N末端側ァミノ酸残基数の異なるぺプチドへの Ga l NAc転移反応

また Hife例 3 ~ 5の結果を総合すると、 -3から- 1にある N末端側のアミノ酸は ァラニンおよびプロリンのいずれであっても Ga l NAc受容体活性にほとんど影響し ていないことが明らかとなった。 そこで、 -3から- 1までのアミノ酸が Ga l NAc受容 体活性に必要であるかを調べるために、 N末端側のァミノ酸残基数を変化させた ペプチドを作製して、 Ga l NAc受容体活性を測定した。 ペプチドとしては、 AAATPA P、 AATPAP. ATPAP 、 および TPAPを用いた。

その結果は第 6図に示される通りであった。 第 6図から分かるように、 ATPAP では高い活性が認められるが、 TPAPでは活性が大きく'减少する。 このことから、 Ga l NAcが転移するスレオニンまたはセリンの N末端側に、 少なくとも 1残基のァ ミノ酸が存在することが重要であることが判明した。 また、 スレオニンより N末 端側のアミノ酸数は 3個までは多いほど活性が高いことから、 N末端側の 2残基 以上のァミノ酸は必須ではないが、 存在する方が望ましいことが明らかとなった。 実施例 7 丁2のァミノ酸を各種のァミノ酸に置換したぺプチドへの Ga l NAc転移反 応

実施例 6から、 高い Ga l NAc受容体活性に必要なペプチド配列の基本は ATPAP で あることが明確となった。 この配列にはプロリンが 2残基存在している力 <、 プロ リンは各種ァミノ酸の中でも構造が特殊であるので、 2残基のプロリンに挾まれ た +2のァミノ酸残基はべプチド構造に大きく影響する可 tl¾が考えられた。 そこ で、 ÷2を 20種類全てのァミノ酸に置換したぺプチドを して Ga l NAc受容体活性 を測定した。 ペプチドとしては、 AAATPAP、 AAATPPP、 AAATPCP、 AAATP P、 AA ATPRP、 AAATPHP、 AAATPSP、 AAATPMP、 AAATPTP、 AAATPQP、 AAATPVP、 AAAT P I P、 AAATPLP、 AAATPEP 、 AAATPGP、 AAATPYP、 AAATPWP、 AAATPFP、 AAATPN P 、 および AAATPDP を用いた。

その結果は第 7図に示される通りであった。 この結果から、 十 2のアミノ酸の側 鎖に関わらず、 十 1と ÷3がプロリンであれば高い Ga l NAc受容体活性を示すことが確 かめられた。 但し、 -2のアミ ノ酸の側鎖によって活性は変化し、 ァラニン、 プロ リン、 システィン、 リジン、 アルギニン、 ヒスチジン、 セリン、 メチォニン、 ス レオニン、 グルタミ ン、 ノ<リ ン、 イソ口シン、 ロイシン、 またはグル夕ミ ン酸の 方が、 グリシン、 チロシン、 トリプトファン、 フエ二ルァラニン、 ァスパラギン、 またはァスパラギン酸よりも高い活性を示すことが分かった。 これらの結果から、 +2のアミノ酸として望ましい性質は主として側鎖が比較的小さいこととプラスに ^していることではないかと推定された。

実施例 8 のァミノ酸を光学異性体に置換したぺプチドへの Ga l NAc転移反応 実施例 7の結果より、 高い Ga l NA e受容体活性をもつ基本ペプチド ATPAP におけ る +2のアミノ酸側鎖は活性に影響を及ぼすものと考えられた。 そこで、 4のアミ ノ酸側鎖の影響を調べるもう一つの方法として、 ÷2のァラニンについて D体と L 体の 2種のぺプチドを作製して Ga l NAc受容体活性を比較した。 ぺプチドとしては、 +2のァラニンが各々 D体と L体である PAATAAP、 APATAAP、 AAPTAAP 、 および AA ATPAP を用いた。

その結果は、 第 8図に示される通りであった。 第 8図より明らかなように、 全 ての場合で L体の方が D体よりも高い活性をもっていた力 <、 D体の場合でも比較 的高い活性をもつ場合力認められた。 したがって、 ÷2のアミノ酸は天然のァミノ 酸とは光学的に対称な D体でもよく、 τ2のァミノ酸残基の側鎖の重要性が低いこ と力《確認された。

実施例 9 - 1のァミノ酸を各種のァミノ酸に置換したぺプチドへの Ga l NA c転移反 応

実施例 6の結果より、 高い G a l NAc受容体活性には G a l NAcが転移するアミノ酸の N末端側の- 1のアミノ酸力重要であることが明らかとなった。 そこで、 - 1を 20種 類全てのァミノ酸に置換したぺプチドを作製して G a l NAc受容体活性を測定した。 ペプチドとしては、 AAYTPAP、 AAATPAP、 AAWTPAP、 AASTPAP、 AAGTPAP、 AAVT PAP、 AAFTPA?、 AATTPAP、 AA I TPAP、 AAHTPAP、 AAMTPA?、 AAQTPA?、 AACTPA P 、 AANTPAP 、 AAPTPAP 、 AALTPAP 、 AARTPAP 、 AAETPAP 、 AADTPAP 、 および AA TPAP を用いた。

その結果は第 9図に示される通りであった。 この結果から、 +1と +3がプロリン であれば- 1のアミノ酸の側鎖に関わらず、 高い Ga l NAc受容体活性を示すこと力く確 かめられた。 し力、し、 -1のアミノ酸の側鎖は活性に比較的大きく影響しており、 チロシン、 ァラニン、 トリプトファン、 セリン、 グリシン、 バリ ン、 フエニルァ ラニン、 スレオニン、 またはイソロイシンの方が、 ヒスチジン、 メチォニン、 グ ルタ ミ ン、 システィン、 ァスパラギン、 プロリ ン、 ロイシン、 アルギニン、 グル タミ ン酸、 ァスパラギン酸、 またはリジンよりも優れていた。 これらの結果から、 - 1のァミノ酸として望ましい性質は側鎖に電荷が存在せず芳香環が存在すること であり、 側鎖の大きさはあまり影響しないものと推定された。

実施例 1 0 +4のアミノ酸を各種のアミノ酸に置換したぺプチドへの Ga l NAc転移 反応

mm ι〜 9の結果より、 非常に高い G a i NA C受容体活性をもつぺプチド配列の モチーフは X (- T-P- X (2) -P (ここで、 X (- 1)と X (2) は任意のアミノ酸 を表す） であることが明確となった。 このモチーフでは +3の位置のプロリンが重 要であり、 これよりも (； 末端側を短くすることは好ましくないと容易に推定され た。 し力、し、 に存在するアミノ酸の影響は不明である。 そこで、 のアミノ酸 を 20種類全てに置換したぺプチドを作製して G a l NAc受容体活性を測定した。 ぺプ チドとしては、 AAATPAP 、 AAATPAPG、 AAATPAPQ、 AAATPAPE. AAATPAPA、 AAATPAPN、 AAATPAPD. AAATPAPR、 AAATPAP (；、 AAATPAP AAATPAPV、 AAATPAPS AAATPAP AA ATPAPY、 AAATPAPし、 AAATPAPT. AAATPAPWヽ AAATPAPMヽ AAATPAPPヽ AAATPAPFおよび AAATPAPHを用いた。

その結果は第 1 0図に示される通りであった。 この結果から、 τ4にアミノ酸を 付加しても活性にはほとんど影響はなく、 -1や を変化させた場合と比較すると、 側鎖の違いによる影響も明らかに低いこと力く判明した。 したがって、 十 4のァミノ 酸は必須ではなく、 影響は極めて低いと考えられる。 し力、しな力《ら、 グリシン、 グルタミ ン、 グルタ ミ ン酸、 ァラニン、 ァスパラギン、 ァスパラギン酸、 アルギ ニン、 システィン、 イソロイシンは、 にアミノ酸が存在しない場合よりも僅か に高い活性を示すことから、 存在している方力好ましい場合もあると推定される。 実施例 1 1 GalNAc受容体活性をもつぺプチド配列のタンパク質への挿入による ムチン型糖鎖結合タンパク質への改変

GalNAc受容体活性を示すペプチド配列を、 タンパク質中に導入し、 これにより そのタンパク質をムチン型糖鎖が結合可能なタンパク質へ改変できるかどうかを α/へた ο

モデルタンパク質として、 二ホンジユウケツキユウチュウ（Schistosoma japo nicum ) 由来グルタチオン- S- トランスフヱラーゼ （GST ) の改変体を用いた。 この GST 改変体 （GST-3X) は、 市販のプラスミ ド!) GEX-3X (フアルマシア ·バイ ォテク社） を利用して大腸菌から容易に大量調製可能である。 また、 それは本来 の GST の C末端にペプチド配列 SDLIEGRGIPGNSSが付 tiaしたものであり、 その遺伝 子としてはプラスミ ド PGEX-3X に含まれているものを使用した。

GST-3Xの C末端側領域に GalNAc受容体活性をもつぺプチド配列を挿入した変異 体遺 i¾Fを構築した。 その構築は第 11図に示されるように行なった。 特に断ら ない場合、 遺伝子組換えの操作は Mole cular Cloning 〔J. Samb rookら、 Cold Spr ing Harbor Laboratory Press (1989) 〕 に記載されている方法で行なった。

GalNAc受容体活性をもつペプチド配列として、 高い活性を示す AAATPAP が含ま れる MAAATPAPM を使用した。 ペプチド配列 MAAATPAPM をコードする遗 は、 以 下のように作製した。 まず、 下記の二種類の一本鎖 DN Aをアプライ ドバイオシ ステムズ社製 394 DNAZRNA合成機で合成した。

5' AAGGATCCCCATGGCAGCAGCAACGCCGGCACCCATGGGGAATTCAA3' (合成 D A 1) 5' TTGAATTCCCCATGGGTGCCGGCGTTGCTGCTGCCATGGGGATCCTT3' (合成 DNA2) その後、 それぞれを 1 nraol含む 50 μ 1の 1 OtnM T r i s— HC 1 (pH 8. 0) 、 5mM MgC l ₂、 10 OmM Na C l、 1 mM 2—メルカプトエタ ノールを調製した。 次に、 この溶液を 75°Cで 10分間保温した後、 室温に放置 してアニーリングさせて 2本鎖 DNAを形成させて、 目的の遺 fc^を得た。 この 反応液の 5 1を用い、 制限酵素の EcoR 1および BamH 1で 2本鎖 DNAを切断後、 常法によりこれを pGEX- 3X の同様の制限酵素部位に挿入して、 プラスミ ド pGEX-3 X Muc CIを構築した。 このプラスミ ドは、 GST- 3Xの 228番目のプロリンと 22 9番目のグリシンとの間に MAAATPAPM が挿入された変異体 (GST-3X Muc C1 ) を コードする遺 を含んでなり、 揷入された領域の塩基配列は 5 ' pGEX Sequenc ing Primer (フアルマシア ·バイオテク社） と PIUSM, Dye Terminator Cycle Se quencingキッ 卜 （アプライ ドバイオシステムズ社） とを使用してアプライ ドバイ ォシステムズ社製 373 A DNAシーケンサで確 I忍した。

GST-3Xの C末端領域にぺプチド配列 MAAATPAPM を挿入した変異体タンパク質の 大腸菌からの調製は次のように行なった。 C a C 1₂ 法により pGEX-3X Muc Πで 形質転換した大腸菌 BL21株 （フアルマシア ·バイオテク社） を、 100 g/ml のアンピシリンを含む 2 X YTG培地 （16 gZ 1 Tryptone、 10 g/ 1 Yea st extract, 5 g/ 1 Na C l、 pH7. 0) 5ml中で、 37 °Cにおいて一晚、 振とうして前培養し、 同様の培地 500mlに移して 37°Cにおいて 2. 5時間振 とうして本培養した （0. D. =0.5〜i.0 ) 。 この'培養液に終濃度 0. 5mMとなるよ うに 10 OmM Isopropyl- 3-D-t h i oga 1 a c t opy r ano s i de (1PTG) を加え、 25°C で 4時間振とうした。 培養液を 5, 000 rpm(4, 470 X 、 10分間、 4°Cで遠心して 集菌した。 菌体を 50mlの 2 OmM Tris-HC 1 (pH 7. 5) 、 14 OmM N a C 1で洗浄した後、 同条件で再度遠心し菌体を集めた。 菌体を 50mlの 20 mM Tris-HC 1 (pH 7. 5) 、 14 OmM N a C 1に再懸濁した後、 氷中 に冷却しながら超音波破砕機で破砕した。 これを i5, 000rpm(27, 70()xg)、 30分 間、 4°Cで遠心し、 その上清をポアサイズ 0. 22 / mのメンブランで濾過後、 10% Triton X— 100を終濃度 0. 1%となるよう添加して、 これを粗 液とした。

粗酵素液は、 4 °Cの条件下で、 予め 2 OmM Tris-HC 1 (pH 7. 5) 、 140 mM N a C 0. 1% Triton X— 100で平衡化しておいた 1 mlの Glutathione Sepharose 4B (フアルマシア ·バイオテク社） カラムに供し、 20 mlの 20mM Tris-HC 1 (p H 7. 5) 、 14 OmM N a C 0. 1% Triton X— 100で洗浄した。 さらに、 1mlの 50mM Tris-HC 1 (pH 8. 0) 、 140mM a C 0. 1 % Triton X- 100. 5m dithiot hreitol 、 1 OmM glutathione (還^) をカラムに添加した後、 室温で 10分 間静置し、 同緩衝液 9mlで溶出して lmlずつ分取した。 溶出画分のタンパク質量 はプロテインアツセィキッ ト （日本バイオラッ ドラボラトリー社） 、 GST活性は GST Detection Module (フアルマシア 'バイオテク社） をそれぞれ用いて測定し た。 また、 タンパク質のゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 分析は、 13%の分離ゲルを 用いてじ. K. Laemmii (Nature (London), 第 227 巻、 第 680-685 頁、 （1970年） 〕 の方法によって行なった。 溶出画分に検出された GST- 3X Muc C1 は、 GST-3Xと同 等の GST 活性を有しており、 SDS- PAGE分析で分子量約 28K のほぼ単一なバンドと して検出された。

対照となる G ST- 3 Xの調製も同様にして行なつた。

GST-3X Mucl Uおよび GST-3Xへの GalN'Acの転移は、 100 tuno 1のペプチドの代 わりに 5nmolの GST-3X変異体を使用して、 ぺプチドの Ga INAc受容体活性測定法と 同様に分析した。

その結果は第 12図に示される通りであった。 すなわち、 GST-3) (への GalNAcの 転移はほとんど認められなかったのに対し、 GST- SX Mucl C1へは経時的に顕著な GalNAcの転移が確認された。 このことは、 GalNAc受容体活性を示したペプチド配 列をタンパク質中に挿入することにより、 このタンパク質をムチン型糖鎖結合可 能なタンパク質へ改変できたことを示している。

実施例 1 2 GalNAc受容体活性をもつぺプチド配列のタンパク質への による 厶チン型糖鎖結合夕ンパク質への改変

実施例 1 1と同様のモデルタンパク質 GST-3Xを用いるが、 但し Ν末端側に GalN Ac受容体活性を示すぺプチド配列を付加して、 このタンパク質をムチン型糖鎖が 結合可能なタンパク質へ改変できるかどうか調べた。

この変異体の遺 の構築は、 第 1 3図および 1 4に示されるように行った。

PGEX-3X 中の GST- 3X遺伝子には N 末端領域に Ga INAc受容体活性をもつペプチド 配列の遺 を挿入できる適当な制限^ ^部位が存在しない。 そこで、 制限 部位 Nco I 力く導入された GST-3X 2 A遺 ^を、 polymerase chain reaction (P CR) を用いて調製した。 まず、 下記のプライマー DNAをアプライドバイオシ ステムズ社製 394 DNA/RNA合成機で合成した。

5' GTATCCATGGCCCCTATACTAGGTTATTGG3' (合成 D N A 3)

5' TACTGCAGTCAGTCAGTCACGATGAATTCC3' (合成 DNA 4)

P CR反応は、 铸型DNAのpGEX-3X 2. 5 n g、 0. 合成 DNA3、

0. 5 βΜ 合成 DNA4、 dNTP mi!ure (宝酒造社） 8 1、 1 0 x Amp 1 iT aq DNA meuse BuHer (宝酒造社） 1 0 1、 Amp I i Taq DNA Polym erase (Perkin-Elmer社） 2. 5ユニットを含む 1 00 t 1の反応液を調製し、 ミネラルオイル （宝酒造社） を 2滴添加した後、 DNA Thermal Cycler (商品 名、 Perkin- Elmer社） で実施した。 反応条件としては、 94°C1分間、 55°C2 分間、 72°C2分間を 35サイクル行なった後、 72°C 1 0分間を経て 4°Cにす る条件を用いた。 反応終了後、 12mgZmlとなるよう Pronase K (ベーリンガー •マンノヽィム社) 、 1 OmMとなるよう e thy 1 enetii ami ne t e t uacn i c acid di sodi um sait (EDTA)、 0. 8 %となるよう sodium dodecyl sulfate (SDS ) をそれ ぞれ添加し、 37 °C 30分間、 65 °C 10分間、 順次保温した。 さらに、 PCR 産物はフエノール抽出、 エタノール沈殿によって精製し、 制限 の Nco 1 と Ps t I で切断後、 常法により PSL1190 (フアルマシア ·バイオテク社） の同様の制 限酵素部位に挿入した。 挿入された DNAの塩基配列は PRISM. Dye Primer Cycl e Sequenungキット （アプライドバイオシステムズ社） を使用してアプライドバ ィォシステムズ社製 373A DNAシーケンサで解析した。 得られた目的の GST-3X 2A 遺 fe^は、 GST- 3Xの N末端から 2番目のセリンカ淛限^部位 Nco I を導入した ことによりァラニンに変更された変異体の遺 である点が特徴である。

次に、 GST- 3X 2A 遺 を pSL1190 力、ら制限酵素 Nco I と Pst 1 で切断して回 収し、 常法により pTrc99A (ファルマンァ ·バイオテク社） の同様の制限 ¾ 部 位に挿入して pGEY- 2Aを作製した。 pGEX-3X と比較すると、 pGEY- 2Aは、 N 末端に遺 fe^の揷入可能な Ncc 1 部位をもつ GST- 3X 2A遺 fe^が含まれることの ほか、 プロモーターが tac から e に変更されている点を除き、 極めて類似した 構造のプラスミ ドである。

最後に、 N末端にペプチド配列 MAAATPAPを付加した GST-3X 2A Muc N1遺伝子を 含むプラスミ ド pGEY-3X 2A Muc N1 を以下のようにして構築した。 ペプチド ΜΑΑΑΤΡλΡをコードする遺 fe^は、 Hife例 11と同様に一本鎖 DN Aの合成 DN A 1および合成 DNA2を合成し、 50 1の 5 OmM Tris-HC 1 (p H 7. 5)、 1 OmM Mg C 1 Ο Λ 10 Om NaC l、 lmM 2—メルカプ卜ェタノ ール中でアニーリングさせて調製した。 この反応液の 5/ 1を用い、 制限 S¾の Nco 1 で 2本鎖 DNAを切断後、常法により!) GEY-3X の Nco [ 部位に挿入して プラスミ ド pGEY-3X 2A Muc N1 を構築した。 このプラスミ ドは、 GST-3Xの N 末端 のメチォニンの上流に AATPAPが¾nされ、 2番目のセリンがァラニンに変匕し た変異体 (GST-3X 2 A Muc N1) をコードする遺 を含んでなる。 挿入された領 域の塩基配列は倉敷紡績社により合成および、 H P L C精製された 5' GTTGACAATT AATCATCCGGCTCGT3' ならびに、 PRISM, Dye Terminator Cycle Sequencingキッ ト (アプライ ドバイオシステムズ社） とを使用してアプライ ドバイオシステムズ社 製 373A DNAシーケンサにより確認した。

変異体タンパク質 GST-3X 2A Muc N1の大腸菌からの調製と分析は、 実施例 11 に記載した GST-3X Muc C1 の場合と同様に行なった。 Glutathione Sepharose 4B カラムの溶出画分に検出された GST-3X 2A Muc N1は、 GST-3Xと同等の GST 活性を 有しており、 SDS-PAGE分析で ^«5¾281( のほぼ単一なバンドとして検出された。

GST-3X 2A Muc N1および GST-3Xへの Ga IMeの転移は、 100 nmo 1のペプチドの 代わりに 5nmolの GST 変異体を使用して、 ペプチドの Ga INAc受容体活性測定法と 同様に分析した。

結果は第 15図に示される通りであった。 すなわち、 GST- 3Xへの GalNAcの転移 はほとんど認められないのに対し、 GST-3X 2A Muc N1へは経時的に顕著な Ga INAc の転移が確認、された。 このことは、 タンパク質に GalNAc受容体活性をもつぺプチ ド配列を¾nしたことによって、 ムチン型糖鎖が結合するタンパク質に改変でき たことを示している。

この結果と実施例 11の結果とから、 GalNAc受容体活性を示すペプチド配列を タンパク質に新たに導入する場合には、 導入する位置がタンパク質中で特に限定 されないことが示された。

実施例 13 GalNAc受容体活性をもつ種々のべプチド配列のタンパク質へ導入と ムチン型糖鎖結合夕ンパク質への改変

実施例 11および 12における GST-3X Muc C1 および GST-3X 2A Muc N1への Ga INAcの転移を、 SDS- PAGEとフルォログラフィ一を組み合わせた分析法で確認した _c また同時に、 実施例 1 1と同様のモデルタンパク質 GST-3Xを用いるが、 C 末端 側に GST-3X Muc C1 と異なる GalMc受容体活性を示すペプチド配列を導入した、 GST-3X Muc C2 、 GST-3X uc C3 、 および GST- 3X uc C4 を調製した。 これらに つ 、て同様の方法で G alNAcの転移を調べた。

プラスミ ド pGEX- 力有する制限 部位は、 C 末端側領域のペプチド配列を 改変するのに用いるには制限がある。 そこで、 最初にモデルタンパク質を様々に 改変するために PCR を用いて pGEX- 3Πを作製した。 プラスミ ドの構築は第 16図 に示されるように行った。

まず、 下記のプライマー DNA をアプライ ドバイオシステムズ社製 394DNA/RNA合成 機を用いて合成した。

5' ATGGTACCATGCGCGCCATTACCGAGT3' (合成 DNA 5)

5' CCGAGCTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT3' (合成 DNA 6)

5' CAGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTA3' (合成 DNA 7)

5' GGACTAGTCATGTTGTGCTTGTCAGCTA3' (台成 DNA 8)

PCR 反応は、 铸型 DNA として pGEX-3X を用い、 プライマーとして台成 DNA 5お よび 6、 または合成 DNA 7および 8の組み合わせを用い、 実施例 12記載の PCR 反応と同様に行なった。 但し、 ΙθΧΑιηρΙ iTaq DNA Polymerase Bu ί ί nと Amp 1 iTaq

DNA Polymerase に代えて、 各々 PCR buffer, 10 cone, with MgS04 (ベーリン ガー ·マンハイム社） 、 Pwo DNA Polymerase (ベーリ ンガー ·マンハイム社） を 使用した。 合成 DNA 7および 8の組み合わせの反応産物は、 ァガロースゲル電気 泳動で分離した後、 約 ΰ.2kb の DNA 断片を回収し、 フヱノール抽出、 エタノール 沈殿によって精製した。 この DNA 断片を制限酵素 Sac I と Sph I で切断後、 常法 により PSL119Q (フアルマシア ·バイオテク社） の同様の制限 Sl^部位に挿入し、 PPGST91 を構築した。 挿入断片の塩基配列は PRISM, Dye Primer Cycle Sequenci ngキッ ト (-21 M13) または PRISM, Dye Primer Cycle Sequencingキッ ト (M13

Rev. ) (アプライ ドバイオシステムズ社） を使用して、 アプライ ドバイオシス テムズ社製 3了 3A DNAシーケンサにより確認した。 一方、 合成 DN'A 5および 6を組 み合わせ反応産物についても同様の操作により約 1.2kb の DNA 断片を分離精製し、 制限 S^S I と Kpn 1 で切断した。 この断片を、 常法により PPGST91 の同様の 制限酵素部位に揷入して PPGST92 を作製した。 さらに、 PGST92を制限^ ^EcoRV と Bal Iで切断した後、 1.3kb 断片を pGEX- 3X の同様の制限 部位に常法に従 つて挿入して、 pGEX- 3XSを作製した。

GST-3 Muc C2 、 GST-3X uc C3 、 および GST-3X uc C を各々発現させるた めのプラスミ ド pGEX- S Muc C2 、 pGEX-3XS Muc C3 および pGEX-3XS Muc C4 の 制限酵素地図はそれぞれ第 17図 （a) 、 （b) 、 および （c) に示した通りで あ 。

これらの構築は次のように行なった。 まず、下記のプライマー DNA を合成した。

5' CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACGATGAAGGCGCGGGGGTCCCAC3' (合成 DNA 9)

5' CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACTATTAAGGCGCGGGGGTCCCAC3' (台成 DNA10 )

5' CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACGATGAAGGCCCGGGGGTCCCAC3' (合成 DNA11 )

PC 反応は、 鏵型 DNA として pGEX- 3X を用い、 プライマーとして合成 DNA 7お よび 9、 合成 DNA 7および 10、 合成 DNA 7および 11の組み合わせで、 上記と同様 に行なった。 反応終了後、 各 PCR産物は実施例 12と同様の方法で精製し、 制限 ^Sac Iと Xba Iで切断した後、 pBluescript IIKS+ (ストラタジーン社） の 同様の制限酵素部位にそれぞれ挿入した。 構築されたプラスミ ドはそれぞれ、 合 成 DNA 7および 9の組み合わせを PBGSTC2 、 合成 DNA 7および 10の組み合わせを PBGSTC3 、 合成 DNA 7および 11の組み合わせを pBGSTC4 と呼ぶこととした。 各挿 入断片の塩基配列は PRISM, Dye Primer Cycle Sequencingキット (-21 M13) ま たは PRISM, Dye Primer Cycle Sequenc i ngキット （M13 Rev. ) (アプライ ドバ ィォシステムズ社） を使用して、 アプライ ドバイオシステムズ社製 3ΠΑ DNAシー ケンサにより確認した。 最後に、 pBGSTC2 、 PBGSTC3 、 および pBGSTC4 をそれぞ れ制限^ mSae Iと ScoR Iで切断し、 約 0.7kb の断片を DGEX-3XSの同様の制限酵 素部位に移し、 GEX-3XS Muc C2、 pGEX-3XS Muc C3 、 および pGEX-3XS Muc C4 を完成させた。

変異体タンパク質 GST- 3X Muc C2、 GST-3X Muc C3 、 および GST-3X Muc C4 の 大腸菌からの調製と分析は、 実施例 11に記載した GST-3X Muc C1 の場合と同様 に行なった。 Gluuthione Sep arose カラムの溶出画分に検出された GST-3X M uc C2、 GST-3X Muc C3 、 および GST- Π Muc C4 は、 いずれも GST-3Xと同等の GS T の比活性を有しており、 SDS-PAGE分析で分子量約 27K のほぼ単一なバンドとし て検出された。

各種 GST 変異体への GaiNAcの転移は、 SDS- PAGEとフルォログラフィーを組み合 わせた以下の方法で分析した。 5nmol の GST- 3X変異体と 50 mUの部分精製ゥシ 初乳由来 0-GalNAc Tを含む容量 50 1の反応液 (50 mM Imidazoie-HCl ( H 7.2)、

10 mM MnCl ₉ , 0.5 ¾ Trnon X-100 . ISO // UDP- [ ³H] Ga INAc) を調製し、 28°Cで 20時間保温した。 2x SDSハ ample buf fer (125 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 4

% SDS、 4 % 2-niercaptoethanol 、 20 % glycerol 、 0.004 % Bromopiienol Blue) を 50 1加えて沸騰水中に 5分間静置した後、 その 30 1を 5%の SDS- PAGEに 供した。 電気泳動後のゲルは固定液 （2-propanol I water I acetic acid (26： 6 5:10) ) に 30分間浸した後、 Ampriiy (アマシャム社） に 30分間浸した。 そして、 80°Cでゲルを真空乾燥させた後、 I 線フィルムと密着させて- 80 °Cに 15日間静置 して感光させた。

その結果は第 18図に示される通りであった。 すなわち、 GST- への GalNAcの 転移は認められないのに対し、 GST-3X Muc CI 、 GST-3X Muc C2、 GST-3X Muc C 3、 GST-3X Muc C4 、 および GST- 3X 2A Muc Nlへは明らかに Ga lMcが転移してい ることが確かめられた。 この結果は、 タンパク質をムチン型糖鎖の結合可能な夕 ンパク質へ改変する場合、 X (-1) -T-P-X (2； 一 P (ここで、 X(-l)と X(- 2:は任意のアミノ酸を表す c という配列のいずれも力 \ タンパク質に導入され て機能することを示している。 また、 ペプチド配列の導入では領域は特に限定さ れず、 挿入、 置換のいずれの手法でも良いことも明らかとなった。 そして、 GST-3X MucC2および GST-3X Muc C4 から明らかなように、 糖鎖が転移するァミノ 酸を含めて僅か 2〜 3残基の置換で、 タンパク質をムチン型糖鎖の結合可能なタ ンパク質へ改変できる極めて有用な技術であること力《確認された。

実施例 14 GalNAc受容体活性をもつぺプチド配列のタンパク質へ導入とムチン 型糖鎖を結合する改変糖タンパク質の真 胞からの分泌生産

実施例 11〜13では、 GalNAc受容体活性を示す種々のペプチド配列をタンパ ク質に導入することにより、 タンパク質を生体外における G a 1 N A c転移反応の基質 となるタンパク質へ改変できることが示された。 大腸菌で生産した組換えタンパ ク質では、 大腸菌がムチン型糖 ί胜合成系を欠損しているために生体外における GalNAc転移反応が必要となるが、真核細胞ではムチン型糖鎖生合成系が存在する ので、 糖鎖力く結合した糖タンパク質を直接^すること力〈期待できる。 そこで、 GalNAc受容体活性を示すぺプチド配列導入した夕ンパク質遺^を C0S7細胞で分 泌生産して、 ムチン型糖鎖を結合した改変糖夕ンパク質が生産可能であるかどう かを確かめた。

モデルタンパク質は前述と同じ GST とし、 例 11および 13において GalN Acが転移されることが示されている GST-3X Muc C1 と 移されない GST-3Xの改変 体とを C 0 S 7細胞で分泌発現させた。

GST は細胞内タンパク質であるので、 分泌^するためにシグナル配列を N末 端に融合した GST- 3Xと GST-3X Muc C1 の遺 fe^を 2段階の PCR反応を利用して作 製した。 以下にシグナル配列としてヒトエリスロポエチン （hEPO) [K. Jacobsら、 Nature, 第 313 巻、 第 806-810 頁、 （1985)] のシグナル配列を用いた例を示す。 まず、 下記の 4種類のプライマー DNA をアプライ ドバイオシステムズ社製 394D NA/RNA合成機により合成した。 5' AACTCGAGAATTCATGGGGGTGCACGAATG3' (台成 DNA12 )

5' CAATAACCTAGTATAGGGGAGCCCAGGACTGGGAGGCCCA3' (合成 DNA13 )

5' TGGGCCTCCCAGTCCTGGGCTCCCCTATACTAGGTTATTG3' (合成 DNA14 )

5' CCTCTAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAT3' (合成匪 15 )

1段階目の PCR反応は、 铸型 DNA として liEPOの cDNAを含むプラスミ ド 〔H. Oha shi ら、 Biosci. Biotech. Biochem. 、 第 58巻、 第 758-759 頁、 （1994) 〕 、 プ ライマーとして合成 DNA12 および 13を使用し、 アニーリング温度を 58°Cとして実 施例 13言己載の PCR反応と同様に行なった。 また同じく、 铸型 DNA として pGEX-3X、 プライマーとして合成 DNA14 および 15を用いた反応を行なった。 各反応産物はク ロロホルム抽出 1回とエタノール沈殿 2回を行なった後、 5 0 1の丁£ buf fer に溶解した。 シグナルペプチド領域と GST の PCR産物の各 1 β 1を混台して铸型 DNA とし、 プライマーとして台成 DNA12 および 15を使用して、 2段階目の PCR反 応を行なった。 反応および反応産物の精製は実施例 13と同様に行ない、 制限酵素 Xho Iと Xba Iで切断した後、 pBluescript IIKS- の同様の制限^部位に常法 にしたがって挿入した。 得られたプラスミ ドは pBEGST-3X と名付けた。 構築され たプラスミ ドの揷入領域の塩基配列は PRISM, Dye Primer Cycle Sequencingキッ 卜 (-21 M13) または PRISM, Dye Primer Cycle Se enc i ngキット (M13 Rev. ) を使用して H½例 1 3と同様に解析して確認した。

GST-3X Muc C1 の分泌型遺伝子の作製も、 pGEX_3X に代えて pGEX-3X Muc CIを 使用して同様に行ない、 PBEGST-3X Muc C1を構築した。

PBEGST-3X または pBEGST-3X Muc C1の挿入領域は、 制限酵素 XIIQ Iと Xba Iと で切断して回収した後、 動物細胞用プラスミ ドベクター pSVL (フアルマシア 'バ ィォテク社） の同様の制限 部位に常法にしたがって移し、 PSEGST-3X または PSEGST-3X Muc C1を構築した。 プラスミ

1 9図 (a) および （b) に示される通りであった。 これらのプラスミ ドを動物細胞へ 導入すると、 本来の GST の N末端側から 2番目のセリンで始まる GST変異体の EG ST-3X と EGST- 3X uc C1が培養上清中へ分泌されると予想された。

PSEGST-3 または pSEGST- 3X Muc CIはエレク トロポレーシヨン法で C0S7細胞

(理研細胞バンク） に導入した。 即ち、 0.8ml の PBS (-) (日水製薬社） 中の約 10° 個の細胞に gのプラスミ ドを加え、 ジーンパルサー （日本バイオラッ ド ラボラトリー社） を使用して、 室温において 160QV 、 25 /xFの条件で遺！^導入 した。 細胞は 90mmのシャーレに移し、 iOmlの 1 のゥシ胎児血清を含む Dulbecco ' s modified Eagle' s 培地 (Base Catalogue No. 12430) (Gibco BRL 社） で 24 時間 3了。 Cで培養後、 10mlの Dulbecco' s modified Eagle' s 培地 (Base Catalogue

No. 26063) (Gibco BRL 社） に培地転換して 3日間 37°Cで培養した。

分泌された GST 変異体の培養上清からの精製は、 0.5ml の Gluuthione Sephar ose を用いて実施例 11に記載の大腸菌由来の粗酵素液の 1/2 スケールで、 同 様に実施した。 さらに、 溶出された活性画分はセントリコン- 10 (グレースジャ パン社） で濃縮および 20mM potassium phosphate buffer ( H 6.2)への緩衝液置 換を行なつた。

以上のようにして得られた EGST-3X および EGST- 3X Muc C1は、 大腸菌で生産し た GST- と同等の GST の比活性を有していた。 これらを用いて、 グリコシダーゼ 処理分析およびレクチンプロッ ト分析を以下に示すような方法で行なった。

グリコシダーゼ処理では Anhr— obacter ureafaciens 由来のノィラミニダーゼ (ベーリンガー ·マンノヽィム社) と、 Diplococcus pneuinoni ae由来の 0-グリカ ナーゼ （ジェンザィム社） とを使用した。 ノィラミニダーゼ処理は、 40 1の 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.2)中の GST 変異体約 300 ng に 4(]mUの it^ を加え、 37°Cで 13時間行なった。 ノィラミニダーゼおよび 0 -ダリカナ一ゼによる 処理は前記と同じノィラミニダーゼ反応液を 37°Cで 1 時間保温した後、 0-グリカ ナ一ゼを 2mU 添加して、 さらに 12時間反応させて実施した。 対照として、 37°Cに 13時間保温したサンプルと無処理のサンプルとを用意した。 各サンプルは等量の li SDS/sampIe bu erを加えて SDS 化した後、 その 15 1を 13%の SDS-PAGEに供 した。 電気泳動後のゲルは 2D-銀染色試薬 · Π 「第一」 （第一化学薬品社） を使 用して染色し、 タンパク質のバンドを検出した _c

レクチンプロッ ト分析は、 DIG グリ力ンディファレンシエーシヨンキッ 卜 （ベ 一リンガー ·マンハイム社） を用いて行なった。 即ち、 グリコシダーゼ処理分析 と同様に SDS-PAGEまで行なった後、 タンパク質を PVDF膜にブロッテイ ングし 〔小 河原緑ら、 生物学研究のためのタンパク質実験法、 羊土社、 1994年〕 、 DIG 標識レクチン PNA を用いて galactose ( 3卜 3) N- ace alacosamine (Gal β\- 3GalNAc ) 構造の検出を行なった。

グリコシダーゼ処理分析の結果は第 20図に示した通りであった。 EGST-3X は 約 のほぼ単一なバンドを示し、 いずれのグリコシダーゼ処理によっても 量が全く変化しなかった。 これに対し、 EGST- Π Muc C1は、 予想されるタンパク 質部分の分子量 28K よりも高分子量側の移動度を示すほぼ単一なバンドとして検 出された。 このバン ドは、 ノィラミニダーゼまたはノィラミニダーゼとともに 0- グリカナーゼで処理することにより、 随時低分子量側へ移動した。 このことから、 EGST-3X Muc C1には典型的なムチン型糖鎖が結合していること力く判明し、 その構 造は 1 ^l-3Ga! Ac にシアル酸が結合するものと推定された。

—方、 レクチンプロッ ト分析の結果は第 21図に示される通りであった。 それ によれば、 EGST- 3X ではグリコシダーゼ処理の有無にかかわらず、 レクチン PNA と反応するバン ドは検出されなかった。 しかしながら、 EGST-3X Muc C1ではノィ ラミニダーゼ処理したサンプルで約 28K のバンドが反応しており、 ノィラミニダ ーゼおよび 0-グリカナーゼによる処理ではバンドが消失していた。 このことから、 EGST-3X Muc C1のタンパク質部分には、 典型的なムチン型糖鎖の G a 1 ^i-3GalNA c にシァル酸が結合した構造が結合していることが確認された。 以上の結果から、 GalNAc受容体活性を示すぺプチド配列をタンパク質に導入し、 真 田胞で分泌発現することにより、 タンパク質を 3糖以上から構成される ft 的なムチン型糖鎖を結合した糖タンパク質に改変できたこと力確かめられた。 実施例 15 GalNAc受容体活性をもつ種々のべプチド配列のタンパク質への導入 とムチン型糖鎖を結合する改変糖夕ンパク質の真核細胞からの分泌生産

実施例 14において、 ぺプチド配列 MAAATPAPM が挿入された GST 変異体が C0S7 細胞より分泌発現され、 得られた EGST- 3X Muc C1が典型的なムチン型糖鎖を結合 していることが示された。 そこで、 実施例 13において GST- 3X Muc C1 と同じく 生体外で GalNAc転移反応の基質となった GST-Π Muc C2、 GST-3X Muc C3 、 およ び GST- 3X MucC4についても、 シグナルペプチドを融合して C0S7細胞で分泌発現さ せ、 発現タンパク質である EGST-3X Muc C2. EGST-3X Muc C3、 および EGST- 3X Mu c C4にムチン型糖鎖が結合しているかを調べた。 また、 EGST- 3X の C末端側領域 に + 1がプロリンの GTPGNSS 配列を含む EGST- 3X Muc C5を同時に作製して同様に 分析した。

EGST-3X、 EGST-3X Muc 、 EGST-3X Muc C2、 EGST-3X Muc Π、 EGST-3X Muc C4、 および EGST- Π Muc C5を分泌発現するために、 以下に示す方法でプラスミ ド PEEGST-3X、 pEEGST-3X Muc Cl、 pEEGST- 3X Muc C2、 PEEGST-3X Muc C3 pEEGST -3X Muc C4および pEEGST_3X Muc C5を作製した。 これらの制限酵素地図および変 異を導入した領域のアミノ酸配列は第 2 2図に示した通りである。

実施例 14に記載されている pBEGST- 3X を制限！^ Xba 1で切断後、 制限酵素 Ec oRI で部分消化し、 EGST- 3X の完全長の構造遺 fe^が含まれる約 0. 9kbbの DN A 断片を取得した。 この断片を常法に従って、 pEFISS [T. Katoら、 j. Bioctieci、 第 118 巻、 第 229 - 236 頁、 （1995) 、 および S. Mizuslnmaら、 Nucieic Acid R es. 、 第 18卷、 第 5322頁、 （1990) ] の EcoR 1、 ba I部位に挿入し、 pEEGST-3 X を構築した。 pEFISSは、 実施例 14で用いたブラスミ ドベクター DSVLの GST 変 異体発現量があまり高くなかったので、 高発現を期待して使用した。

PEEGST-3X Muc C1は、 pBEGST-3 に代えて pBEGST- 3X Muc Uを用いて同様に構

^tCし / o

PEEGST-3X Muc C2は、 実施例 13記載の pBGST C2を制限酵素 8al Iおよび Xba Iで切断して約 0. 5kbの DNA 断片を取得し、 pEEGST- 3X の同様の制限酵素領域 と置換して構築した。 これと同様にして、 pEEGST- 3X Muc C3および pEEGST-3X Mu c C4を、 実施例 1 3記載の PBGST3および!) BGSTC4 を利用して構築した。

PEEGST-3X Muc C 5次のような方法で構築した。 まず、 下記のプライマー DNA を 合成した。

5' CGTCTAGACCGTCAGTCAGTCACGATGAATTGCCGGGGGTCCCAC3' (合成 DM 16) 铸型 DNA として pGEX-3X を用い、 プライマーとして実施例 13記載の合成 DNA 7と 16とを組み合わせ、 実施例 13と同様に PCR反応を行つた。 反応終了後、 PCR産物は実施例 12と同様の方法で精製し、 制限酵素 S Iと !） Iで切断し た後、 pBluescript II KS- (ストラタジーン社） の同様の制限酵素部位に揷入し た。 構築されたプラスミ ドは、 PBGSTC5 と呼ぶこととし、 挿入断片の塩基配列は PRISM. Dye Primer Cycle Sequencing キット （-21M13) あるいは P!USM. Dye Prim er Cycle Sequencing キッ ト ひ 113Rev. ) (アプライドバイオシステムズ社） を使 用してアプライ ドバイオシステムズ社製 3ΠΑ DNAシーケンサで確^ Iした。 pBGSTC 5 を制限酵素 B a I Iおよび X Iで切断して約 0. 51^の0^ 断片を取得し、 5 EGST-3 の同様の制限酵素領域と置換して、 pEEGST-3X Muc C5を完成させた。 プラスミ ド pEEGST- 3X 、 PEEGST-3X Muc Cl、 pEEGST-3X Muc C2、 pEEGST-3X Mu c C3、 pEEGST- 3X Muc C4、 および pEEGST- Muc C5の C0S7細胞への遺伝子導入、 そして分泌された各 GST 変異体の培養上清からの精製および濃縮は、 実施例 14 と同様に行なった。 得られた EGST-3X 、 EGST-3X Muc Cl、 EGST-3X Muc C2、 EG ST-3X Muc C3、 EGST-3X Muc U、 および EGST- Muc C5は、 大腸菌で生産した GS T-3Xとほぼ同等の GST の比活性を有していた。 これらのサンプルの一部を実施例 14と同様に 13%の SDS-PAGEおよび銀染色して分析し、 タンパク質のバンドを 検出した。

その結果は第 23図に示される通りであった。 実施例 14において糖鎖が結合 していないことが示されている EGST-Π は、 実施例 14と同様に約 27K の単一 なバンドを示した。 これに対し EGST- 3X Muc C1では大部分は実施例 14でムチン 型糖鎖が結合していることが示されている位置にシグナルを与え、 少量はタンパ ク質のみからと考えられる約 28k 付近にシグナルを示した。 また、 EEGST- 3X Muc C2 、 卩 EEGST - Π uc C3、 および pEEGST- 3X Muc C4についても、 EGST-3X Muc CI と同じように大部分がムチン型糖鎖が結合しているバンドとして検出された。 一 方、 EGST- Muc C5では、 僅かなムチン型糖鎖が結合するバンドと大部分のタン パク質のみのバンドか 1忍められた。

以上の結果から、 様々な GalNAe受容体活性を示すペプチド配列について、 これ らをタンパク質へ導入して真核細胞で分泌発現することにより、 タンパク質を典 型的なムチン型糖鎖結合糖タンパク質に改変できることが確かめられた。 すなわ ち、 実施例 1〜10までで明らかとした特徴を有する GalNAc受容体活性を示す種 々のペプチド配列は、 いずれもタンパク質に導入された場合に、 真核細胞におけ る vivo のムチン型糖鎖生合成系で機能することが明らかとなった。 また、 ぺ プチド配列の導入では、 糖鎖が転移するァミノ酸を含めて僅か 1〜 3残基の極め て少ない変換で、 タンパク質をムチン型糖鎖の結合可能なタンパク質へ十分に改 変できる非常に有用な技術であることが確認された。 なお、 -1にのみプロリンが 存在する EGST-3X Muc C5と- 1と +3のプロリンが存在する EGST-3X Muc C4の結果の 比較から、 より強い GalNAcの受容体活性を示す後者の配列を導入した方力 効率 良くムチン型糖鎖結合糖タンパク質の生産が行なえることが示された。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 下記の式 （I) で表わされる配列を含んでなる、 タンパク質またはぺプ チド。

X (-1、― X ίθ) -X ίΐ) -X (2： -X (3) (I)

(ここで、

X (- i)および X (2) は ¾5：して任意のアミノ酸を表し、

X (0) は Tまたは Sを表し、

X (1) および X (3 は 3ϋして任意のアミノ酸を表すが、 少なくともいずれか 一方は Ρを表す。 ）

2. X (1) または X ） が Ρまたは Αを表し、 少なくともいずれか一方が Ρ である請求項 1記載のタンパク質またはペプチド。

3. X (l) 力く Pである請求項 1または 2記載のタンパク質またはペプチド。

4. X (3) が Pである請求項 1または 2記載のタンパク質またはペプチド。

5. X (1) および X (3; が Pである請求項 1または 2記載のタンパク質また はぺプチド。

6. X (- 1)力く Y、 A、 W、 S、 G、 V、 F、 T、 および Iであり、 X (2) が A、 P、 C、 K：、 R、 H、 S、 M、 丁、 Q、 V、 I、 L、 および Eである、 請求 項 1〜 5の記載のタンパク質またはべプチド。

7. X (0) 力く Tである請求項 1〜6のいずれか一項に記載のタンパク質また はべプチド。

8. X (-1)の更に N末端側に、一または二個のアミノ酸が存在し、 そのアミ ノ酸が A、 P、 G、 E、 Q、 T、 R、 または Dである、 請求項 1〜7のいずれか 一項に記載のタンパク質またはべプチド。

9. 下記から選択される、 請求項 1記載のペプチド。 ATP AP

AATP AP AAATP AA AAATAAP P A A T A A P AP ATAAP AAPTAAP AAATAP P P AATP AP A P A T P A P A AXaT PXbP

(ここで、 Xaおよび Xbは任意のアミノ酸を表すが、 但し Xaおよび Xbのいずれか 一方は Aを表す）

AAATP APXc

(ここで、 Xcは任意のアミノ酸を表す）

10. 請求項 9記載の配列を含んでなる、 請求項 1記載のタンパク質または ぺプチド。

1 1. UDP-GalNAc: ポリペプチド α 1, O-Ga INAc転移 (0-GalNAc T) の基 質として作用し、 GalNAcが導入された夕ンパク質またはべプチドの製造のための、 請求項 1〜1 0のいずれか一項に記載のタンパク質またはべプチドの使用。

12. タンパク質鎖またはペプチド鎖中にムチン型糖鎖を導入する方法であ つて、

請求項 1〜 10のいずれ力、一項に記載のタンパク質またはべプチドを用意し、 このタンパク質またはべプチド鎖を基質として、 ムチン型糖鎖を結合させる反 応を実施すること を含んでなる、 方法。

1 3. タンパク質鎖またはべプチド鎖中に INAc ( - ァセチルガラク トサ ミン） を導入する方法であって、

請求項 1〜 1 0の 、ずれか一項に記載のタンパク質またはべプチドを用意し、 このタンパク質またはペプチド鎖を基質として、 UDP- GalNAc: ポリペプチド α 1, 0-GalNAc転移酵素 (0-GalNAc T) の存在下で、 UDP-Ga!NAc (ここで、 UDP はゥ リジン 5' 二リン酸、 GalNAcは N- ァセチルガラク トサミンを表す） と反応させ ることを含んでなる、 方法。

1 4. 請求項 1〜1 0のいずれか一項に記載のタンパク質鎖またはペプチド 鑌カ \ 遺 fc^組換えまたは化学合成により製造されたものである、 請求項 1 3ま たは 1 4記載の方法。

1 5. 請求項 12~ 1 4のいずれか一項に記載の方法によって製造された、 ムチン型糖鎖が結合した夕ンパク質またはべプチド。

1 6. ムチン型糖鎖が結合したタンパク質またはペプチドの製造法であって、 請求項 1〜 1 0のいずれか一項に記載のタンパク質またはべプチド配列をコー ドする D N Aによつて真核細胞を形質転換し、

該形質転換細胞中でタンパク質またはべプチド配列を発現させ、 かつ該真 胞内外に該タンパク質またはべプチドを分泌させること

を含んでなる、 方法。

1 7. タンパク質またはべプチドの所望の位置に厶チン型糖鎖を導入する方 法であって、

前記夕ンパク質またはべプチドをコ一ドする DN A内にあって前記タンパク質 またはべプチドのァミノ酸配列中のムチン型糖鎖の導入を意図する位置に対応す る位置に、 請求項 1に記載の式 （ I ) で表される配列をコードする DN Aを挿入 または付加する力、、 または該位置に存在する部分 DNA配列ど請求項 1に記載の 式 （I) で表される配列をコードする DN Aを置換して、 前記式 （I) で表され る配列をコードする DN Aを含んだ前記夕ンパク質またはべプチドをコ一ドする DNAを得て、

該 D N Aによつて真攝田胞を形質転換し、

該形質転換細胞中でタンパク質またはべプチド配列を発現させ、 かつ該真, 胞外に該タンパク質またはべプチドを分泌させること

を含んでなる、 方法。

18. 前記真核細胞が動物細胞である、 請求項 16または 17記載の方法。

19. 前記式 （I) で表される配列をコードする DN Aを含んだ前記タンパ ク質またはべプチドをコ一ドする DN Aがベクターに挿入された形態にある、 請 求項 16または 17記載の方法。

20. 請求項 16または 17に記載の方法によって製造された、 ムチン型糖 鎖が結合したタンパク質またはべプチド。

21. 請求項 1に記載の式 （I) で表される配列をコードする、 DNA配列 _c

22. 請求項 1~10のいずれか一項に記載のタンパク質またはべプチドを コードする、 DNA配列。

23. ベクターに挿入された形態にある、 請求項 21または 22記載の DN A配列。