JPS63276490A

JPS63276490A - 組換え体ｄｎａおよび形質転換体

Info

Publication number: JPS63276490A
Application number: JP62110641A
Authority: JP
Inventors: Masayo Ito; 雅代伊藤; Tetsuhisa Sudo; 哲央須藤
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1987-05-08
Filing date: 1987-05-08
Publication date: 1988-11-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は動物細胞を宿主として、遺伝子組換え技術によ
り種々の生理活性ポリペプチドを大量に産生させること
を目的として５作製した新規組換え体ＤＮＡ、および該
組換え体ＤＮＡによる形質転換体に関する。

〈従来の技術〉人間の生活にかかわる様々な物質を大量に安く生産する
ため、近年急速に発展してきた遺伝子操作技術が、各々
の分野で作用されている。

医薬品として、また生体の研究等で必要な因子として、
生体内の微量な生理活性物質の生産にも広くとり入れら
れる。

生理活性物質の生産方法にはいろいろあるが、正常細胞
の刺激による場合、量産が困難で、がっ純品を得るなめ
に複雑な精製工程を経なければならない。

これに対し、目的とする物質のＤＮＡがクローニングさ
れている場合、遺伝子操作技術を用いて大量の純品を安
価に得る方法が開発されつつあり、実際にインシュリン
をはじめ医薬品の生産にも応用されている。

物質を生産させる宿主としては、大腸菌、酵母、鮎拓草菌、動物細胞などが一最に研究されている。

研究が最も進んでいる大腸菌では、その生産物の蛋白質
部分のみ作られ、糖鎖がつかない。

ところが、生体内生理活性物質の多くは糖付加ポリペプ
チドであり、その中には生理活性の発現や体内動態にお
いて糖鎖を必要とするものがある。

絨毛膜性生殖刺激ホルモン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｒａｇｏ
ｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙ
ｒｏｔｒｏｐｉｎ）、濾胞成熟ホルモン＜ｆｏｌｌｉＬ
ｒｏｐｉｎ）および黄体形成ホルモン（ｌｕｔｒｏｐｉ
ｎ）は、生物活性の発現に糖鎖が必要である（Ｔ、Ｖ、
Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎ　ｅｔ　ａｔ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、　１１．６７０１．１９８４）また、増血因子
の一つエリトロボイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ　ｉ　
ｅｔ　ｉ　ｎ）は末端のシアル酸を除去すると生体内で
の活性が無くなる（Ｐ、　Ｌｏｗｙｅｔ　ａｔ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　１８５　１０２．１９６０）。

一方、血栓を溶解させる作用のある組織型プラスミノゲ
ンアクチベータ［ｔｉｓｓｕｅ　　ｔｙｐｅ　　ｐｌａ
ｓｍｉｎｏｇｅｎ　　ａｃｔｉｖａｔ。

ｒ（ＴＰＡ）］は、糖鎖に加えてシスティン残基を多く
持つなめポリペプチドの複雑な修飾が可能な動物細胞系
でないと作れないと考えられている（Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆ
ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｈｏ１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ
、、　５．１７５０１９８５）。

また、微生物と動物細胞とでは蛋白合成機構がいくらか
異なるために、作られる蛋白のアミノ末端が天然のもの
と異なる場合が多い。実際に天然のヒトインターフェロ
ンγのアミノ末端はＧｉｎであるのに対し、大腸菌で作
られたそれはＭｅｔである。

天然物と大腸菌生産物との、糖鎖やアミノ末端の違いは
、生理活性発現や体内動態に影響を与えるのみならず、
治療薬として長期間又は頻回使用する場合、アレルギー
反応や坑原坑体反応による力価の減少などの問題が懸念
される。

以上の理由から、生体内生理活性物質の生産は動物細胞
系で行うことが望ましいのであるが、この場合の問題の
一つとして大腸菌や他の系に比べ、産生量が少ないこと
があげられる。

この間開に対し、これまでにウィルスのプロモーターや
エンハンサ−をベクターに組込むことが試みられてきた
。これらはベクターＤＮＡの転写効率の向上を計るもの
でそれなりの成果があがっている。

また蛋白質の産生を増大させるには、細胞外への蛋白質
の分泌の効率をあげることも効果があると予想される。

分泌に関４しているリーダーシークエンス部分について
研究が進んでいるが、これまでのところリーダーシーク
エンスに手を加えることにより、動物細胞において産生
量を増した報告はない。

また生理活性ポリペプチドのｃＤＮＡクローニングに際
して、完全なリーダーシークエンスを含まない不完全な
長さのｃＤＮＡがとれた場合は、Ｓ　Ｖ　４０などのプ
ロモーターの下流にこの不完全なｃＤＮＡをつないでも
、動物細胞においては生理活性ポリペプチドは産生され
ない。産生せしめるなめには、完全長のｃＤＮＡを取得
せねばならなかった。

〈発明が解決しようとする問題点〉本発明の目的は、分泌に関する遺伝子を改良することに
より、動物細胞において天然型生理活性ポリペプチドを
高い効率で産生するベクターを作製し、これを動物細胞
に導入して生産物を大量に得ることにある。

また、リーダーシークエンスを含まない不完全なｃＤＮ
Ａを動物細胞で発現させることをも目的とする。

これを更に応用すれば、非分泌蛋白を効率良く分泌させ
得る可能性もある。

く問題点を解決するための手段〉本発明は、真核細胞中で発現が可能なベクター中のプロ
モーター配列の下流に、真核生物由来で、かつ目的の生
理活性ポリペプチド遺伝子のリーダーシークエンスとは
異なるリーダーシークエンス、および目的の生理活性ポ
リペプチド遺伝子を連結してなる組換え体ＤＮＡおよび
該組換え体ＤＮＡによる形質転換体に関する。

本発明の好ましいベクターについて以下に説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。

本発明のベクターの作製は、 ■　真核細胞内で機能するプロモーターの制御下に、分
泌に必要なリーダーシークエンスと、生理活性ポリペプ
チドをコードする遺伝子と、その更に下流に動物細胞で
の発現に必須なｐｏｌｙ　　ｒＡ付加シグナルが置かれ
た遺伝子配列と、■　大腸菌での複製開始点と薬剤耐性
遺伝子とからなる遺伝子配列とを結合することにより達
成せられる。

本発明の真核細胞内で機能するプモーターとは、動物ウ
ィルス遺伝子のプロモーターもしくは動物細胞遺伝子の
プロモーターであって、動物細胞の中で下流の生理活性
ポリペプチドの遺伝子配列をｍＲＮＡへ転写する機能を
有するものであれば何でもよい。

一例としてＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プ
ロモーター、アデノウィルス遺伝子のプロモーター、Ｈ
Ｂウィルス遺伝子のプロモーター、レトロウィルス遺伝
子のプロモーター等が動物ウィルス遺伝子のプロモータ
ーとしてあげられる。

また、チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、メタロ
チオネイン遺伝子のプロモーター、インターフェロン遺
伝子のプロモーター等が動物細胞遺伝子のプロモーター
としてあげられる。この中でも、ＳＶ４０初期フロモー
ター、ＳＶ４０後期プロモーターが好ましい。

真核細胞型プロモーターは一種でも二種以上併用しても
良い。なお、真核細胞型プロモーターの上流には、転写
効率を高めると言われているＨ　ａｒｂｅｙマウス肉種
ウィ少種ウィルスＴＲのエンハンサ−配列やＳＶ４０の
エンハンサ−配列を挿入しても良い。

リーダーシークエンスとしては、目的の生理活性ポリペ
プチドのリーダーシークエンスとは異なるものであれば
特に限定されないが、動物細胞における産生が高い生理
活性ポリペプチド由来のものが好ましい。例えばヒトイ
ンターフェロンβ、ヒトインターフェロンγ、ヒトＧＣ
８Ｆ、マウスＧＭＣＳＦ等に由来するリーダーシークエ
ンスがあげられるが、中でもマウス０ＭＣ８Ｆ由来のも
のが好ましい。

リーダーシークエンスの下流に連結する生理活性ポリペ
プチド遺伝子としては、絨毛膜性生殖刺激ホルモン、甲
状腺刺激ホルモン、濾胞成熟ホルモン、黄体形成ホルモ
ン、エリトロボイエチン、組織型プラスミノゲンアクチ
ベータ、ヒトインターロイキン２、インターロイキン３
等の遺伝子があげられる。

大腸菌における複製開始点および薬剤耐性遺伝子を結合
することは、該ベクターＤＮＡｔ！−簡便、大量かつ純
粋に調製するために有用である。複製開始点としては、
大腸菌染色体ＤＮＡの合成阻害剤で複製の増幅が起こる
ことが知られているコリシンＥ１プラスミド由来のもの
、例えばｐＢＲ３２２およびこれに辺縁のプラスミドが
望ましいが、これに限定されるものではない。

薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、
ストレプトマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子などがあげられる。

但し、これら大腸菌内で機能する遺伝子配列を動物細胞
に導入する場合には、動物細胞内で機能する遺伝子の発
現を抑制する有害配列（ｐｏ　ｉ　５ｏｎｏｕｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ　：　）ｌｏｎｉｃａ　Ｌｕ５ｋｙ　ｅｔ　ａ
ｔ、　Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ。

２９３、　ｐ７９〜８１．１９８１）を除くことは重要
である。

ベクターＤＮＡの調製は一最的な方法で行うことができ
る（Ｔ、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｄ８６〜９６．１９８２
）。

ベクターＤＮＡの真核細胞への導入は既存の方法により
可能である（Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　８１．１０７
０−１０７４．　（１９８４））。

真核細胞としては、マウスＣｌ２７Ｉ、ハムスターＣＨ
Ｏ、マウスミエローマ細胞、ヒトミエローマ細胞、ヒト
ＨｅＬａ細胞、サルＣ０８−１細胞などがあげられる。

中でもＳＶ４０由来の複製開始点を有するベクターの複
製が可能となっている細胞が望ましく、例えば、サル由
来のＴ抗原をもつＣＯＳ−１細胞（Ｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ
、　Ｃｅ１ｌ旦１７５（１９８１））が特に望ましい。

本ベクターは、プロモーターの制御下にある生理活性ポ
リペプチド遺伝子を真核細胞内で発現させ、生産物を細
胞外に分泌させるので、このベクターにより形質転換さ
れた動物細胞を培養し、培養液上清を精製することによ
り、目的の生理活性ポリペプチドを得ることができる。

く実　施　例〉以下実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ベクターｐＣＬ−ＬＳ−ｈＩＬ−２の作製方法を以下に
示す。基本的な遺伝子操作の手法は“ＨＯｌｅｃｕｌａ
ｒ　ｃ１ｏｎｉｎｇ’■Ｈａｎｉａｔｉｓら、（１９８
２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）によった。

（１）ベクターｐＨ３ｍＧＭＣ３Ｆの作製；マウスＧＭ
Ｃ３ＦのｃＤＮＡをクローン化するベクターｐＨ３ｍＧ
ＭＣ３Ｆの作製は以下のようにして行った。マウスＴ細
胞株ＩＨ５，５（Ｍｉｎａｔｏ、Ｎら、”Ｎａｔｕｒａ
ｌ　ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ”　ｅｄ、　Ｈｏ５ｈｉｎｏ、　Ｋｏ
ｒｅｎ、　ａｎｄ　Ｕｃｈｉｄａ、　　Ｅｘｃｅｒｐｔ
ａ　Ｈｅｄｉｃａ　ｐ２２　（１９８４））を１％フィ
トヘマグルチニンと５０　ｎＱ／　ｍｌのフォルボール
ミリステック酸にて刺激し、ＧＭＣＳＦを誘導した後、
細胞よりｍＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡの調製とｃＤＮ
Ａの作製およびベクターへのクローニングは公知の方法
（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｉｆ、ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、　３．２８０（１９８３））に従った。得
られたｃＤＮＡライブラリーの中から公知のＧＭＣＳＦ
ｃＤＮＡ　（Ｇｏｕｇｈ、Ｎ。

Ｈ４ら、Ｎａｔｕｒｅ　　３０９　７６３　（１９８４
））に相補的な塩基配列からなる二つの合成オリゴヌク
レオチド５′ＴＧＧ　　ＡＡＧ　　ＣＡＴ　　ＧＴ＾　
ＧＡＧ　　ＧＣＣ３’　　と　５　　’　　ＣＴＧ　　
ＧＣＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＴＣＣＴＣＡ　３　’とをプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーションにより陽性
の株を選択しベクターｐＨ３ｍＧＭＣＳＦを得た。

（２）ベクターｐＬｓＶ１の作製：動物細胞におけるポリペプチド発現ベクターｐＬＳＶＩ
は次のようにして作製した。概略を第１図に示す。ベク
ターｐ　Ｌ　１　（Ｏｋａｙａｍａ、Ｉｔ、ら、Ｈｏｌ
。

Ｃｅ１１．　Ｒｉｏｔ、　３．２８０　（１９８３））
をＨｉｎｄｌｌｉおよびＰｓｔＩで消化し、ＳＶ４０複
製開始点およびプロモーターを含む約５２０ｂｐのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により分取した。この
ＤＮＡ断片をＡとする。またベクターｐ　ｃ　Ｄ　Ｖ　
１　（Ｏｋａｙａｍａ、ｔｌ、ら、Ｈｏｔ、　Ｃｅ１１
．　Ｂｉｏｌ、　３．２８０　（１９８３））？・をＩ（ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［およびＥｃｏＲＩ閂消化しアガ
ロースゲル電気泳動にてｐＢＲ３２２の複製開始点を含
む長鎖ＤＮＡ断片を分取した。このＤＮＡ断片をＢとす
る。次にＤＮＡ断片Ａ、Ｂおよび末端をＴ４キナーゼで
リン酸化した二つの合成オリゴヌクレオチド５　’　Ｇ
ＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧ３　’と５’ＡＡ
ＴＴＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡ３
　’をＴ４ＤＮＡリガした。アンピシリン１００μｇ／
ｍｌに耐性を示す形質転換体よりベクターＤＮＡを抽出
し、制限酸素切断地図を作製し目的のベクターｐｃＤＶ
Ｐを得た。

次にベクターｐ　ｎ　ｅ　ｏ　５　’　（Ｌｕｓｋｙ、
Ｈ，ら、Ｃｅ１ｌ。

３６、３９１　（１９８４））をＳｓｔ工で消化した後
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片で処理し平
滑末端とした後、Ｓａｌニリンカーをこの末端に’Ｔ’
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。５ａｌＩおよびＣ
１ａ工で消化後、アガロースゲル電気泳動によりモロニ
ー白血病ウィルスのエンハンサ−を含む約５３０ｂｐの
ＤＮＡ断片を分取した。このＤＮＡ断片をＣとする。−
力先に作製したベクターｐｃＤＶＰをＳａｌ工およびＣ
１ａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により長鎖断
片を分取しておく。このＤＮＡ断片をＤとする。ＤＮＡ
断片ＣとＤをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した後、大
腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した。得られたアンピシリ
ン耐性形質転換株よりベクターＤＮＡを調製し、制限酵
素切断地図を作製し目的のベクターｐＬＳＶ−１を得た
。

く３）ベクターｐＬｓＶｍＧＭｃｓＦの作製：マウスＧ
ＭＣ３Ｆを動物細胞で発現するためのベクターｐ　Ｌ　
Ｓ　Ｖ　ｍ　Ｇ　Ｍ　ＣＳ　Ｆは次のようにして作製し
た。概略を第２図に示す。ベクターｐＨ８ｍＧＭｃｓＦ
をＡｖａ［で消化後アガロースゲル電気泳動しマウスＧ
ＭＣＳＦ構造遺伝子を含む約５１０ｂｐのＤＮＡ断片を
分取した。末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ
断片にて平滑末端とした後、５ｓｔＩリンカ−をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結した。次にこれをＨｉｎｆＩ
にて消化して末端を平滑末端とした後、アガロースゲル
電気泳動にて約４３０　ｂｐの断片を得た。これにＫｐ
ｎニリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにて連結した後、Ｓ
ｓｔ工およびＫｐｎ工で消化した。このようにして得ら
れたＤＮＡ断片とｐＬｓＶｌを５ｓｔＩおよびＫ　ｐ　
ｎ　工で消化して得た長鎖ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにて連結した後、大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換
した。アンピシリン耐性を示す株よりベクターＤＮＡを
調製し制限酵素地図を作製しベクターｐＬＳＶｍＧＭＣ
ＳＦを得た。

（４）ベクターｐｃｔ、の作製：マウス（ｍ）ＧＭＣＳＦのリーダーシークエンスを含む
ｐＢＲ３２２であるｐＣＬの作製は以下のように行った
。概略を第３図に示す。

ｐＬｓＶｍＧＭｃｓＦをＫｐｎ工およびＸｂａ■で消化
し、アガロースゲル電気泳動によりｍＧＭＣＳＦ遺伝子
を含む約”；ｏｏｂｐのＤＮＡ断片を分取した。これを
Ｄｄｅ　工で消化し、ＤＮＡポリメラーゼエＫｌｅｎｏ
ｗＦｒａｇｍｅｎｔにて切断部位を平滑末端にした後、
５ｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行って、
ｍＧＭＣＳＦ遺伝子のリーダーシークエンス部分を含む
約６５ｂＤのＤＮＡ断片を分取した。これを断片ａとす
る。

一方、ｐＢＲ３２２をＨｉｎｄＩ［［で消化し、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔで切断部
位を平滑末端にした。これにＴ４キナーゼで末端をリン
酸化した５ｓｔＩリンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
し、Ｅ、ｃｏ　１　ｉＭｃＩ０６１　（）４．＋、　Ｃ
ａ５ａｄａｂａｎら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｌ、、　１３８
．１７９　（１９８０））を形質転換した。

アンピリジン１００μｇ　／　ｍｌに耐性を示す株よリ
ブラスミドＤＮＡを抽出し、５ｓｔＩで一箇所切断され
、かつＨｉｎｄ［［で消化されないプラスミドを分離し
た。このプラスミドＤＮＡをアルカリ法により調製し、
ＢａｍＨＩで消化し、切断部位をＤＮＡポリメラーゼエ
Ｋ］　ｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔにて平滑末端化した。

ここに、Ｔ４キナーゼで末端にリン酸をつけたＫｐｎ■
リンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、Ｅ、ｃ
ｏｌｉＭｃ１０６１（前出）を形贋転換した。アンピシ
リン１００μｇ　／　ｍｌに耐性を示す株よりプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断地図を作り、目的のプ
ラスミドを分離しな。このプラスミドＤＮＡをアルカリ
法により調製し、Ｓｓｔ工およびＫ　ｐ　ｎ　工で消化
し、ｐＢＲ３２２ｏｒｉｇｉｎおよびアンピシリン耐性
部位を含む長鎖断片をアガロース電気泳動により分取し
た。これを断片すとする。

更に既知の方法で化学的に下記のオリゴマーを合成した
。

５　′ＴＧＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＡＣ３”　　、　、
　、　、　ｃ３’　ＡＣＧＴＡＡＧＧＣＡＣ５’　　、
　、　、　、　、　、　ｄ次に、２．９Ｘ１０’μｇの
断片ａ、１．８×１０−４μｇの断片ｂ、０．８７５μ
ｇのオリゴマー〇、０．６３μｇのオリゴマーｄを混合
し１０℃、１５％ポリエチレングリコール存在下でＴ４
ＤＮＡリガーゼにて反応させることによりこれらを連結
し、Ｅ、ｃｏｌｉＭｃ１０６１　（前出）を形質転換し
た。アンピシリン１００μｆ／ｍｌに耐性を示す株より
プラスミドＤＮＡを抽出し、Ｓｓｔ工切断部位から５ｐ
ｈＩ側へｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　２１４．１２０５−１２１０　（１９８
ｔ）／Ｈｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ
、　Ｊ、Ｇｅｎｅ、　１９．２６９−２７６（１９８２
））で塩基配列を決定した。Ｓ　ｓ　ｔ　ＩからＫｐｎ
Ｉ部位下流５ｏｂｐまでを確認し、目的のベクターｐｃ
ｉ、、を得た。

（５）ベクターｐ’ｒｈＩＬ−２−ΔＳＢの作製；特開
昭６１−２４７３８７に記載の方法に従って、ベクター
ｐＴｈｌＬ−２−ΔＳＢを作製した。

（６）ベクターｐＣＬヒト（ｈ）ＩＬ−２の作製二ｍＧ
ＭＣ３Ｆのリーダーシークエンスの下流にｈＩＬ−２を
コードした遺伝子をつないだベクターであるｐＣＬｈＩ
Ｌ−２の作製は以下のように行った。概略を第４図に示
す。

ｐ’ｒｈＩＬ−２−ΔＳＢ（特開昭６ｌ−２４７３８７
）をＣ１ａ工で消化し、マングビーンヌクレアーゼで切
断部位を平滑末端化した。これにり、　Ｃａ５ａｄａｂ
ａｎら、Ｊ、Ｈｏ１．　　Ｂｉｏｌ、、　　１３８　１
７９　（１９８０））を形質転換した。アンピシリン１
００μｇ　／　ｍｌに耐性を示す株よりプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素切断地図を作り目的のプラスミド
を分離した。このプラスミドＤＮＡをアルカリ法で調製
しＢａｍＨＩ消化して、ＤＮＡポリメラーゼエＫＩｅｎ
ｏｗＦｒａｇｍｅｎｔにて切断部位を平滑末端にした。

ここに、Ｔ４キナーゼで末端をリン酸化したＫｐｎニリ
ンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｅ、ｃｏ　ｌ　
ｉＭｃ１０６１　＜前出）を形質転換し、前出の選択で
プラスミドＤＮＡを抽出した。ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩが各
々一箇所あり、ＢａｍＨ工部位工部上しているプラスミ
ドを分離し、アルカリ法でプラスミドＤＮＡを調製した
。これをＮｃｏＩ消化しマングビーンヌクレアーゼで切
断部位を平滑末端化し、更にＫｐｎＩで消化してｈＩＬ
−２の遺伝子を含む約４１０ｂｐの短鎖断片をアガロー
スゲル電気泳動により分取しな。これを断片ａとする。

一方、ｐＣＬをＮ５ｉＩ消化し、切断部位をＤＮＡポリ
メラーゼ１ＫＩ　ｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔにて平滑末
端化した。これをＫｐｎ■消化してアガロースゲル電気
泳動を行い、ｍＧＭＣＳＦ遺伝子のリーダーシークエン
ス部分を含む長鎖断片を分取した。これを断片すとする
。

次に０．１μｇの断片ａと０．１μｇの断片すとを混合
し、１０°ＣでＴ４ＤＮＡリガーゼにて反応させること
によりこれらを連結し、Ｅ、ｃｏｌｉＭｃ１０６１　（
前出）を形質転換した。アンピシリン１００μｚ　／　
ｍｌに耐性を示す株よりプラスミドＤＮＡを抽出し制限
酵素切断地図を作り、目的のベクターｐＣＬｈ　Ｉ　Ｌ
−２を得た。

（７）ベクターｐＣＬ−ＬＳ−ｈ　Ｉ　Ｌ−２の作製ｊ
ｍＧＭｃｓＦのリーダーシークエンスの下流にｈ−ＩＬ
−２構造遺伝子が連結されたｈＩＬ−２発現ベクターで
あるｐＣＬ−ＬＳ−ｈ　Ｉ　Ｌ−２の作製は以下のよう
に行った。概略を第５図に示す。

ｐＣＬ−ｈＩＬ−２を５ｓｔＩおよびＫｐｎ工で消化し
、アガロースゲル電気泳動でｍＧＭＣＳＦのリーダーシ
ークエンスとｈ　Ｉ　Ｌ−２遺伝子を含む短鎖断片を分
取した。これを断片ａとする。

一方、ｐＬＳＶｍＧＭＣ３ＦをＫｐｎ工およびＳｓｔ工
で消化して長銀断片を分取したものを断片すとする。

つぎに５Ｘ１０−３μｇの断片ａと０．１μｇの断片す
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて１０℃で反応させる
ことによりこれらを連結し、Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉＭｃ１
０６１　（前出）を形質転換した。アンピシリン１００
μｇ　／　ｍｌに耐性を示す株よりプラスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素切断地図を作り、目的のベクターｐＣ
Ｌ−ＬＳ−ｈ　Ｉ　Ｌ−２を得た。

実施例２ＣＯＳＩ細胞でのヒト（ｈ）ＩＬ−２ポリペプチドの発
現第沖＝−ｉ図に示したベクターｐＣＬ−ＬＳ−ｈＩＬ−
２は、ｈＩＬ−２遺伝子の上流に５ｖ４０の初期遺伝子
プロモーターおよび複製開始点をもち、更に上流にＨａ
　Ｍ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｒエンハンサ−をもつ、ｈＩＬ
−２遺伝子の下流には、ＳＶ４０の後期遺伝子のｐｏｌ
ｙ　　ｒ　　Ａ付加シグナルをもつ。そして更に、ｐＢ
Ｒ３２２の複製開始点と、アンピシリン耐性遺伝子をも
っている。

本ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあ
るｈ　Ｉ　Ｌ−２道伝子を噴孔動物細胞内で発現させる
ことができる。

そこで、ＳＶ４０由来の複製開始点を有するベクターの
複製が可能となっているサル由来細胞株ＣＯＳ１（Ｙ、
ＧＩｕｚｍａｎ、　Ｃｅｌ　２３．１７５　（１９８５
））　ヘＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法（Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８
１．１０７０−１０７４．（１９８４））により導入し
た。導入後３〜４日の細胞培養液のｈＩＬ−２活性を測
定した。ｈＩＬ−２の力価測定はＣＴＬＬを用いたＧ１
１ｌｉｓらの方法（Ｓ、Ｇ１１ｌｉｓら、Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、、　１２０　２０２７　（１９７８））　、ま
たはＴ、Ｍｏｓｍａｎｎの方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄ、　６５．５５　（１９８３）
）に従った。

比較のため、ｐｔ、ｓｖｈ　Ｉ　Ｌ−２（ｐ　Ｉ　Ｌ−
２−２８，３の５ａｌＩとＣ１ａＩの間にモロニーター
）　、　ｐ　Ｉ　Ｌ−２−２８，３，ｐＳＶｈ　Ｉ　Ｌ
　−２（共に特開昭６２−３２８８５＞を同様にして導
入し、培養液のＩＬ−２活性を測定した。結果を表に示
す。

エンハンサ−の有無（１と３）による発現の差と比べて
、リーダーシークエンスをｍＧＭＣＳＦのものに代えた
ことによる発現向上は大きい。１と２を比べると、５〜
３０倍にあがっていることがわかる。

以下余白〈発明の効果〉本発明により、天然型と酷似した生理活性物質が、高い
産生効率で得られる。

また、ｃＤＮＡのクローニングで、完全なり一ダーシー
クエンスを含まないｃＤＮＡがとれた場合でも、本発明
によりその生理活性物質を動物細胞において発現、分泌
させることができる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はベクターｐＬＳＶＩの作製方法を示す。第２図はベクターｐＬＳＶｍＧＭＣＳＦの作製法を示す
。第３図はベクターｐＣＬの作製方法を示す。第４図はベクターｐｅｔ、ｈＩＬ−２の作製方法を示す
。第５図はベクターｐ　ＣＬ−Ｌ　Ｓ−ｈ　Ｉ　Ｌ−２の
作製方法を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）真核細胞中で発現が可能なベクター中のプロモー
ター配列の下流に、真核生物由来で、かつ目的の生理活
性ポリペプチド遺伝子のリーダーシークエンスとは異な
るリーダーシークエンス、および目的の生理活性ポリペ
プチド遺伝子を連結してなる組換え体ＤＮＡ。
（２）真核細胞中で発現が可能なベクターが、大腸菌中
での複製に必要な複製開始点およびＰｏｌｙｒＡ付加シ
グナルを含むベクターである特許請求の範囲第（１）項
記載の組換え体ＤＮＡ。
（３）プロモーター配列が、ＳＶ４０初期プロモーター
またはＳＶ４０後期プロモーターの配列である特許請求
の範囲第（１）項記載の組換え体ＤＮＡ。
（４）真核生物由来で、かつ目的の生理活性ポリペプチ
ド遺伝子のリーダーシークエンスとは異なるリーダーシ
ークエンスが、マウスＧＭＣＳＦ遺伝子由来のものであ
る特許請求の範囲第（１）項記載の組換え体ＤＮＡ。
（５）目的の生理活性ポリペプチド遺伝子が、インター
ロイキンをコードする遺伝子である特許請求の範囲第（
１）項記載の組換え体ＤＮＡ。
（６）インターロイキンがヒトインターロイキン２であ
る特許請求の範囲第（５）項記載の組換え体ＤＮＡ。
（７）真核細胞中で発現が可能なベクター中のプロモー
ター配列の下流に、真核生物由来で、かつ目的の生理活
性ポリペプチド遺伝子のリーダーシークエンスとは異な
るリーダーシークエンス、および目的の生理活性ポリペ
プチド遺伝子を連結してなる組換え体ＤＮＡにより動物
細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（８）真核細胞中で発現が可能なベクターが大腸菌中で
の複製に必要な複製開始点およびＰｏｌｙｒＡ付加シグ
ナルを含むベクターである特許請求の範囲第（７）項記
載の形質転換体。
（９）プロモーター配列が、ＳＶ４０初期プロモーター
またはＳＶ４０後期プロモーターの配列である特許請求
の範囲第（７）項記載の形質転換体。
（１０）真核生物由来で、かつ目的の生理活性ポリペプ
チド遺伝子のリーダーシークエンスとは異なるリーダー
シークエンスが、マウスＧＭＣＳＦ遺伝子由来のもので
ある特許請求の範囲第（７）項記載の形質転換体。
（１１）目的の生理活性ポリペプチド遺伝子が、インタ
ーロイキンをコードする遺伝子である特許請求の範囲第
（７）項記載の形質転換体。
（１２）インターロイキンがヒトインターロイキン２で
ある特許請求の範囲第（１１）項記載の形質転換体。
（１３）動物細胞が、サル由来のＣＯＳ−１細胞である
特許請求の範囲第（７）項記載の形質転換体。