JPH03136000A - 糖鎖を有するｂ細胞分化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は真核生物細胞により生産されたｔ１鎖を有する
ヒトＢＣＤＦに関する。

ヒト　ＢＣＤＦは制癌剤、自己免疫疾患治療剤及び血小
板減少症治療剤として汎く応用できる有用な物質である
。

〔従来の技術〕

ヒト及びマウスにおいて成熟Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分
化させる因子をＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）と総称する
。

ヒトの体内においてこのような重要に作用を有するヒト
ＢＣＤＦについて、本発明者等は研究を重ね、そのＤＮ
Ａ配列、及びアミノ酸配列を決定（特開昭６３−４２６
８８　、６３−５６２９１　）　Ｌ、大腸菌によるヒト
ＢＣＤＰの生産に成功している（特開昭６３−１５７９
９６　）。

またヒトＢＣＤＦが感染症及び癌の治療に有効な免疫療
法剤となる事（特開平１−６３５２４　）　、骨髄移植
療法の有効な支持剤となる事（特願昭６３−３１０５７
８）　、ワクチン効果増強側となる事（特願昭６３−１
８３０８３　）　、及び血小板減少症治療剤となる事（
特願平１−２８２２９７）も見い出している。

なおヒトＢＣＤＦをＢＳＦ−２あるいはインターロイキ
ン６　（ＩＬ−６）と呼ぶことも提唱されているが、（
Ｎａｔｕｒｅ　、」、　　７３　（１９８６）　、　Ｅ
ＭＢＯ，Ｊ、、ｉ。

１２１９　（１９８７）　）ここでは従来よりのＢＣＤ
Ｆなる名称を用いる。またここで用いるヒトＢＣＤＦは
インターフェロン活性を有さす、よってインターフェロ
ン活性を持つＩＮＦ−β２評品（ヨーロッパ出願公開Ｎ
α０２２０５７４　）とは異なる。

先にも述べたとおりこのように有用な物質であるヒトＢ
ＣＤＦを大量に取得するために、本発明者等は研究を重
ね、エシェリヒア・コリ細菌等の原核生物によるヒトＢ
ＣＤＦの生産に成功している。（特開昭６３−１５７９
９６　）　Ｌかしながら、このような原核細胞により生
産されたポリペプチドには、糖鎖が付加されないことが
知られている。一方で、天然タンパク質のほとんどが糖
鎖付加されていることが知られており、これら糖タンパ
クの糖鎖が、活性・特に生体内での活性、あるいは安定
性に関与しているという説もある。

さて、ヒト　ＢＣＤＦを真核生物細胞を用いて生産した
場合はＩｌ！鎖を有するものが生産されるので、快）　
ＢＣＤＦの真核生物細胞により生産する技術の確立も１
つの課題である。

さて、ヒト真核細胞によって生産されるＢＣＤＦについ
ての報告は多くあり（Ｊ、Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ　ｅｔ　
ａｌ、Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｅｅｄ、皿９１４（１９８７）　Ｊ、Ｖａｎ　
Ｄａｍｍｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６８５４３（１９８７）、Ｊ、
Ｂａｕｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｌｏｏｄ。

”ｌｌ−１１３４（１９８Ｂ）、Ｌ、Ｔ、Ｍａｙ、　ｅ
ｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂ、ｃ、２６３７７６０（１９８８）　
、　　） これらはＰ！鎖の検出等を報告している。

一方、工業的に組換えＤＮＡ体を有する真核生物細胞に
より、ヒト　ＢＣＤＦを生産する技術は既にイエダ社が
開示している（特開昭６２−２６３２００号公報）。

しかし、特開昭６２−２６３２００にはＮ末端配列を含
めて生産される物質の構造については全く言及されてい
ない。従ってどのようなＮ末端構造を有するものが生産
されているのかについては全く分からないのが現状であ
る。

〔本発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の課題は真核生物細胞によって生産される
Ｉ！鎖を有し、しかも従来確認及び報告されていない、
Ｎ末端配列を有する各種ヒト　ＢＣＤＦの提供である。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明者等は上記課題を解決する為に、鋭意検討を重ね
た結果、ヒＩ−ＢＣＤＦ遺伝子を持つプラスミドにより
形質転換された真核生物細胞を培養液中で培養すること
により、目的とする糖鎖を有し、しかも従来知られてい
ないＮ末端配列を有するヒトＢＣＤＦを提供することが
でき本発明を完成に至らしめた。即ち、本発明は組換７
えＤＮＮ棒体有する真核生物細胞を培養して生産される
糖鎖を有するヒトＢＣＤＰである。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明に用いるプラスミドとは以下のようなものである
。原則として本物質の生産に用いられるプラスミドは真
核細胞内で転写可能なプロモーター及びポリ（Ａ）付加
シグナルを有している。

プロモーターとしては普通Ｓν４０初期プロモーター　
（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙと略する）　ＳＶ４０後期プロ
モーター（ＳＶ４０１ａｔｅと略する）、あるいはメタ
ロチオネインプロモーター（ＭＴと略する）、マウス乳
癌ウィルスプロモーター（ＭＭＴＶと略する）などの誘
発可能なプロモーターを用いれば良い。また、ポリ（Ａ
）付加シグナルとしてはＳＶ４０スプライシングシグナ
ル、ラビットβアクチンｐｏｌｙＡ付加シグナル等を用
いることができる。

もちろん上記プロモーター及びポリ（Ａ）付加シグナル
を含むベクター類は市販されており例えばｐＭＡＭ　、
　ｐＥＵＫ　−Ｃ１というプラスミドがクロンチック社
から市販されている。

もちろん、上記プロモーター及びポリ（Ａ）付加シグナ
ル以外のプロモーター及びポリ（Ａ）付加シグナルを用
いてもかまわない。

このプロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルの間に目的
の遺伝子即ちヒｌ−ＢＣＤＦ遺伝子が挿入されるわけで
ある。

プラスミドとしては好ましくは真核細胞内での選択マー
カー（例えば抗生物質Ｇ４１８耐性となるＮｅｏ遺伝子
、ミコフェノール酸耐性となるＥｃｏｇｐ　を遺伝子、
チミジンキナーゼ遺伝子、又はアミノ酸生合成遺伝子）
を有する方がよい。

更に好ましくは薬剤の濃度が上昇するに従って細胞内で
増幅される遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈ
ｆｒ）遺伝子を有する方がよい。

また同一プラスミド内に選択マーカー又はｄｈｆｒ遺伝
子を有していなくても別のプラスミド上に選択マーカー
又はｄｈｆｒ遺伝子を有している場合でもよい、この時
は、両者を一緒にして形質転換を行なわせる。また、プ
ロモーター中に転写活性を上昇させるようなエンサンサ
ー配列（例えば５Ｖ４０７２ｂρくり返し、レトロウイ
ルスロングターミナルリピー）　（ＬＴＲ）中に存在す
るエンハンサ−配列）を有していることも好ましい。

さて、このようなプラスミドの転写単位（プロモーター
）の下流に目的とするヒトＢＣ叶の遺伝子を導入する。

導入するヒＩ−ＢＣ叶遺伝子としては以下のものが用い
られる。例えば最低ではヒトＢＣＤＦ蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を用い、また、長いものでは、実際ヒト　
ＢＣＤＦを産生じている細胞に存在するヒトＢＣＯＦ　
ｍＲＮＡと同等の塩基配列を有するＤＮＡ配列を用いて
もよい。

尚、ヒトＢＣ叶蛋白質をコードするＤＮ＾配列と言えば
第１図において通し番号１のＮＥＴに対応するＡＴＧか
ら、２１３１３番目了コードであるＴＡＧまでの配列の
ことをいう。尚、シグナル配列はＭＥＴに対応するＡＴ
Ｇから、２８番目のＡＬＡに対応するＧＣＣまでである
。しかし、本発明者等はヒトＢＣＤＦのＮ末端は生体膜
を透過する時の微妙なプロセッシングメカニズム等によ
り、あるヒトＢＣＤＦのＮ末端は２８番目のＡＬＡであ
ったり、２９番目のＰＲＯであったり、３０番目のＶＡ
Ｌであったり、３１番目のＰＲＯであったり、３２番目
のＰＲＯであったり、３３番目のＧＬＹであったりする
ことを見い出した。

しかしいずれのタイプも同等のヒトＢＣＤＦ活性を有す
ることも発見した。またヒトＢＣＤＦをコードする遺伝
子に５゛側非翻訳領域及び／又は３′側非翻訳領域が付
加されているものを用いてもよい。

尚、本発明においては今後ヒトＢＣＤＦと言えば、上述
した各種タイプの総称を意味するものとする。

尚、ヒト　ＢＣＤＦの遺伝子は第１図に示す。

さて、好ましいプラスミドの形としてはＳＶ４０初朋プ
初子プロモーター４０　ｅａｒｌｙ）　、ヒトＢＣＤＦ
遺伝子、ＳＶ４０スプライシングシグナル（ＳＶ４０　
ｓｐｌｉｃｉｎｇ　＆ｐｏｌｙＡ）　、　ｄｈｆｒ等の
遺伝子を含有するプラスミドがよい、尚、ＳＶ４０スプ
ライシングシグナルはＲ，Ｃ。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＰ、Ｂｅｒｇにより報告（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　ｖｏｌ　７８　、２０７２−７０
７６　（１９８１）に記載されていて、しかも入手可能
である。さて、好ましいプラスミドの例を具体的に示す
と、ブラスミＦ　ｐＳＤ　（ｘ）　／ヒト　ＢＣＤＦΔ
ＳＶ４０初期プロモーター−ヒトＢＣＤＦ遺伝子−５Ｖ
４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プ０−１−
−ターーｄｈｆｒ遺伝子−５Ｖ４０７．プライシングシ
グナルである。

あるいは、細胞内で自律複製するＤＮＡ断片、例えばウ
シパピローマウィルス（ＲＰＶと略する）のＤＮＡをプ
ラスミド中に有するものも好ましい。好ましいプラスミ
ドの形としては、ＲＰＶ　ＤＮＡ−Ｎｅｏ遺伝子−ＭＴ
プロモーター−ラビットβアクチンスプライシングシグ
ナル−ヒトＢＣ叶遺伝子−ラビットβアクチンｐｏｌｙ
（Ａ）付加シグナルである。

本発明でいう形質転換法としてはＤＮＡをカルシウムリ
ン酸と共澱させるリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ、
Ｆ、Ｌ　　ｖａｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｂ、Ａ、Ｊ：Ｖｉｒ
ｏｌｏｇＳｌ、５２，４５６（１９７３）　）　、ある
いはＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｔｏｗ、Ｎ、Ｄ、ｅ
ｔ　ａｌ：Ｊ、Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　３３．４４７（１
９７６））＋ミクロマニピュレーターを用いて核内に遺
伝子を導入する微注入法（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ、Ａ、
、ｅｔ　ａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏ１．
６５．８１６（１９８０））、リン脂質を懸濁して得ら
れるリポソーム中に遺伝子を入れ標的細胞と融合させる
リポソーム融合法（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｇ、ｅｔ
ａｌ　２８３．８１４（１９８０））　、目的遺伝子を
有する原核細胞生物をプロトプラスト化もしくは、スフ
ェロプラスト化にし標的細胞とＰＥＧ存在下で融合させ
る本発明で用いる真核生物細胞としては酵母（例えば、
サツカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャン
ディダ属、クリュウベロマイセス属）及び培養可能な動
物細胞、例えば、ヒト急性単球性白血病細胞のＴＨＰ−
１，（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　筐：１７１−１７６
（１９８０）　）　、ヒト急性骨髄性白血病細胞のＨＬ
−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ　２４０）　、ヒト急性単球性
白血病細胞Ｕ　−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９３　
）　、ヒト慢性骨髄性白血病細胞のに−５６２（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ　２４３）　、ヒト急性骨髄性白血病細胞のに
Ｇ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ　２４６）　、ヒト単球性白血
病細胞のＪ　−１１１（ＡＴＣＣＣＣＬ　２４　）　、
ヒト願下腺腫細胞のＡ　−２５３（ＡＴＣＣＨＴＢ　４
１）を用いることができる。好ましくはハムスターＣ）
１０細胞を用いるのが良い。

次に、このように形質転換した細胞を適当な培地で培養
して、目的とするヒトＢＣＤＦポリペプチドを製造する
。

本発明の培養法は用いた真核生物細胞及びプラスミドに
依存する、例えば培養細胞を用い選択マーカー又は増幅
可能遺伝子を有しているプラスミドであるとすると、０
．５％〜ｌＯ％の血清、及び選択マーカーに対する薬剤
、又は増幅に必要な薬剤を有している培地を用い、５％
ＣＯ２存在下、３７°Ｃで培養を行なえばよく、好まし
くは、出来るだけ簡便な培地（例えば無血清培地）が良
い。

このように真核生物細胞を培養することにより、培養液
中に生成、蓄積されたヒトＢＣ叶の精製は抗ヒトＢＣＤ
Ｆ抗体を用いた公知の精製法（Ｍａｔｓｕｄａ、　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｕｎｕａｌ　Ｌｌｌ、　
９５１−９５６　（１９８８）　）により精製される。

このようにして得られたヒｌ−ＢＣＤＦは公知の方法（
Ｓｕｚｕｋｉ　、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ　ＢＢＲＣ、■Ｌ、
９３３−９３８（１９８９））に従って定量される。

またヒト　ＢＣＤＦ活性についても公知の方法（Ｇｏｌ
ｄｓｓ＋ｉｔｈ　Ｋ、Ｐ、Ａｎａｌ、旧ｏｃｈｅｍ、１
１１．５３−６０（１９８１）　）に従って測定される
。本発明の生産法に従ってヒトＢＣＤＦを生産した時は
培養液中約１．７■／１以上もの多量のヒト　ＢＣＤＦ
が生産される。

以下本発明を実施例に基づいて説明する。

〔実施例１〕 ヒトＢＣ［１Ｆ遺伝子をハムスターＣＨＯ細胞において
発現させる為に、以下のようにプラスミドｐＳＤ　（ｘ
）／ＢＳＦ−２を構築した（第２図）。

ｉ）まずｐｃＤαを制限酵素Ｈｐａ　　Ｉで切断し、ア
ガロース電気泳動により大きなりＮＡ断片を回収した（
第２図）。

ｉｉ　）ヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを有するプラスミドｐ
ＢｓＦ２−３８（丁、旧ｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔ
ｕｒｅ」ハ、　７３　（１９８６）　）を制限酵素Ｂａ
ａ＋ＨＩとＢａｎ　ＩＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ
処理した後、アガロースゲル電気泳動によりヒトＢＣＤ
Ｆ　ｃＤＮＡを含む断片を回収した（第２図）。

ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡは第１図で示している。

１ｊ）ｉ）とｉｉ）で得られた２種類のＤＮＡ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第２図）。

得られた組み換えＤＮＡを大腸菌Ｈ８１０１株へ導入し
アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られた株
からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断試験を
行なうことによりプラスミドｐｃＤＢＳＦ−２と保持す
る菌を選定した。

ｉｖ）ファージＤＮＡ　　λ　Ｂ５Ｆ２．５　（Ｔ、旧
ｒａｎｏ　ｅｔ　ａｔＮａｔｕｒｅ　３２４　、７３　
、　（１９８６））をＥｃｏＲＩで切断し、アガロース
電気泳動によりヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを含む最も小さ
な断片を回収した（第２図）。

■）プラスミドｐｓｐ　６５　（アマジャム社製）を制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後これを■）で精製したＤ
ＮＡ断片とＴ４　ＤＮＡ−リガーゼを用いて結合させる
ことにより、プラスミドρＢ５Ｆ２−１０８６を構築し
た（第２図）。得られた組換えＤＮＡを大腸菌１１８１
０１株へ導入しアンピシリン抵抗性を有する株を選択し
た。得られた株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素に
よる切断試験を行なうことによりプラスミドｐＢＳＦ２
−１０ｓ６を保持する菌を選定した。

ｖｉ）上述のｉｎ）で得たプラスミドｐｃｏ　ＢＳＰ−
２を制限酵素χｈｏ　ｌとＸｂａ　　Ｉで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動により小さな断片を回収した（第３
図）。

ｖｉ）上述のＶ）で得たプラスミドｐＢｓＦ２−１０５
６を制限酵素５Ｌｌａ　　Ｉで切断した後、↑４　ＤＮ
Ａリガーゼを用いてＷｈｏ　Ｉリンカ−を結合し、さら
に制限酵素Ｘｈｏ　　ＩとＸｂａ　　（を切断してアガ
ロースゲル電気泳動によりヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡの後
半部分を含む断片を回収した（第３図）。

ｖｉ）プラスミドρ５Ｏ（ｘ）を制限酵素χｈｏ　　１
で切断した後に、この断片とｖｉ）で得た断片及びｖｉ
）で得た断片の３者をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させた（第３図）。

即チ、７’　ラスミ）’ｐｓＤ（ｘ）／ＢＳＰ−２ΔＳ
Ｖ４０初期プロモーターーｄｈｆｒ遺伝子−５Ｖ４０ス
プライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーターーヒ
トＢＣＯＦ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルを
構築した。

この構築したプラスミドを大腸菌８８１０１株へ導入し
、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。

得られた株からプラスミドＤＮＡを調製した制限酵素に
よる切断試験を行ったことによりプラスミドｐｓＤ（ｘ
）　／ＢＳＦ−２を保持する株を選定した。

尚最終的に用いたヒｌ−ＢＣＤＦの遺伝子第１図の塩基
配列において１番目のＮＥＴに対応するＡＴＧの９塩基
前方から、３゛非翻訳領域のポリ（Ａ）までである。

（２）　　プラスミドｐｓＤ（ｘ）　／　８ＳＦ−２を
カルシウムリン酸法に従ってハムスターＩＯ細胞に導入
し、核酸非要求株を選択した。その培養上清をＥＬＩＳ
Ａ法により測定したところ、１００Ｕ／＋＋１１．のヒ
トＢＣＤＦ活性を示した。

（３）　　（２）で得られたＣＨＯ細胞株をｌＸｌ０−
”Ｍメントレキセート（Ｍ↑Ｘ）を含む培地で培養した
ところ、培養上清中のヒトＢＣＤＦ活性は２００Ｕ／ｍ
ｌ！に上昇した。また、さらにｌ　Ｘ　１０−’Ｍ　Ｍ
Ｔχを含む培地で培養したところ、ヒトＢＣＤＦ活性は
８００Ｕ／１１１に上昇した。尚、この菌、即ちＣＨＯ
−ＢＳＰ２は微工研に寄託されており、その寄託番号は
ＦＥＲＭＰ−９９７０である。

（実施例２〕 実施例１で得られた細胞の培養上清から抗ヒトＢＣＤＦ
抗体カラムを用いてヒトＢＣＤＦを精製した。精製ヒト
ＢＣＤＦは逆相ＨＰＬＣで単一ピークを示した。精製ヒ
トＢＣＤＦのＮ末端をＮ末端ミークエンサーを用いて決
定したところ、６種類のＮ末端が検出された。この６種
類のタンパクのヒトＢＣＤＰ活性を測定したところ、こ
れらは大腸菌で産生されたヒトＢＣＤＦと同じ比活性を
保持していた。

以下に示すように６種類のポリペプチドはＮ末端アミノ
酸が少し異なるだけで、残りの部分は同一の構造をして
いた。この現象はポリペプチドが生体膜を透過する時の
、微妙なプロセッシングにより生じたものと考えられる
。さて６種類のポリペプチドの内、１種類は以下のよう
な構造をしていた。

ポリペプチド（１）のアミノ酸配列： （Ｎ末端） ＰＲＯＶＡＬ　　ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　　ＧＬＵ　　Ａ
ＳＰ　　ＳＥＲＬＹＳ　　ＡＳＰ　　ＶＡＬＡＬＡ　Ａ
ＬＡ　ＰＲＯＨｌｓ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＰＲＯＬＥＤ　
ＴＨＲＳＥＲ５ＥＲＧＬＩＩ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＡＳＰ
　ＬＹＳ　ＧＬＮ　ＩＬＩｌｉ　ＡＲＧ　ＴＹＲＩＬＥ
　ＬＥｔｌＡＳＰ　　ＧＬＹ　　ＩＬＥ　　ＳＥＲＡＬ
Ａ　　ＬＥｔｌ　　ＡＲＧ　　ＬＹＳ　ＧＬＵ　　ＴＩ
ＩＲＣＹＳＡＳＮ　　ＬＹＳ　ＳＥＲＡＳＮ　　）ＩＥ
Ｔ　ＣＹＳ　ＧＬＩＪ　　ＳＥＲＳＥＲＬＹＳ　ＧＬＩ
ＩＡＬＡ　　ＩＥｔｌ　　ＡＬＡ　　ＧＬＵ　　ＡＳＮ
　　ＡＳＮ　　ＩＪＵ　　ＡＳＮ　　ＬＥＤ　ＰＲＯＬ
ＹＳＭＥＴ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　　ＡＳＰ　ＧＬ
Ｙ　　ＣＹＳ　ＰＢＥ　ＧＬＮ　　ＳＥＲＧＬＹＰ）Ｉ
Ｅ　　ＡＳＮ　　ＧＬＵ　　ＧＬＵ　　ＴＨＲＣＹＳ　
　ＬＩｌｉＵ　　ＶＡＬ　　ＬＹＳ　　ＩＬＥ　　ＩＬ
ＥＴＨＲＧＬＹ　　ＬＥｔｌ　　ＬＩｉｔｌ　ＧＬｔｌ
　ＰＨＩ！　ＧＬＵ　　ＶＡＬ　ＴＹＲＬＥｔｌ　ＧＬ
ｔｌＴＹＲＬＥｔｌ　ＧＬＮ　　ＡＳＮ　　ＡＲＧ　　
ＰＨＥ　ＧＬｔｌ　　ＳＥＲＳＥＲＧＬＵ　ＧＬＵＧＬ
Ｎ　　ＡＬＡ　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＶＡＬ　ＧＬＮ　
ＭＥＴ　ＳＥＲＴＨＲＬＹＳ　ＶＡＬＬＥＩＪ　　ＩＬ
Ｅ　　ＧＬＮ　　ＰＩＥ　　ＬＥＤ　　ＧＬＮ　　ｔＪ
ｓ　　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＬＹＳ　　ＡＳＮＬＥｔｌ
　ＡＳＰ　ＡＬＡ　　ＩＬＩ　ＴＨＲＴＨＲＰＲＯＡＳ
Ｐ　ＰＲＯＴＨＲＴＨＲＡＳＮ　ＡＬＡ　ＳＥＲＬＥｔ
ｌ　ＬＨＬＩ　ＴＨＲＬＹＳ　ＬＥＤ　ＧＬＮ　ＡＬＡ
　ＧＬＮＡＳＮ　ＧＬＮ　ＴＲＰ　ＬＥｔｌ　ＧＬＮ　
ＡＳＰ　ＭＥＴ　ＴＨＲＴ）ＩＲＨｌｓ　ＬＥＤＩＬＥ
　　ＬＥｕ　ＡＲＧ　　ＳＥＲＰＩＥ　ＬＹＳ　ＧＬＵ
　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　５ＥＲ５ＥＲＬＥｔＪ　Ａ
ＲＧ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＧＬＵ　ＭＥＴ尚、他
の５種類のポリペプチドのＮ末端付近のアミノ酸配列を
以下に示した。前述したように、それ以下のアミノ酸配
列はポリペプチド（１）と全く同一であった。

（ａ）　　ポリペプチド（ｎ）のＮ末端付近のアミノ酸
配列： ＡＬＡ　　ＰＲＯＶＡＬ　　ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　　Ｇ
Ｌｔｌ　　ＡＳＰ（ｂ）ポリペプチド（ＩＩＩ）のＮ末
端付近のアミノ酸配列： ＶＡＬ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　ＧＬＩＪ　ＡＳＰ（Ｃ）
　　ポリペプチド（ＩＶ）のＮ末端付近のアミノ酸配列
： ＰＲＯＰＲＯＧＬＹ　　ＧＬＵ　　ＡＳＰ（ｄ）　　ポ
リペプチド（Ｖ）のＮ末端付近のアミノ酸配列： ＰＲＯＧＬＹ　ＧＬＵ　ＡＳＰ （ｅ）　　ポリペプチド（Ｖｌ）のＮ末端付近のアミノ
酸配列： ＧＬＹ　　ＧＬＵ　　ＡＳＰ このようにＣＩＯ細胞で生産されたヒトＢＣ叶の構造を
決定したのは我々が最初であった。

（２）上述の（１）で得られた精製ヒトＢＣＤＦをニト
ロセルロース膜に吸着させ、ペルオキシダーゼ結合レク
チンに対する結合性を調べた所、ＰＨＡＥ、及びＲＣＡ
１２Ｇに対する結合性を有しており、これらのポリペプ
チドが１！鎖付加されていることが確認された。大腸菌
由来の精製ヒト　ＢＣＤＦはレクチンに対する結合性が
みられなかった。

〔実施例３〕 ヒトＢＣＤＦ遺伝子をハムスターＣＨＯ細胞において、
更に高発現させる為に、以下のようにプラスミドｐＳＤ
（ｘ）　／　ＢＳＦ−２−３を構築した（第４図）。

（１）ｉ）（実施例１〕で得られたプラスミドｐＳＤ（
ｘ）／ＢＳＦ−２を制限酵素Ｂａｎ　ｌで切断し、ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理した後、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用
いてＸｈｏ　　Ｉリンカ−を結合し、さらに制限酵素Ｘ
ｈ。

１で切断してアガロースゲル電気泳動により３′非翻訳
領域をほとんど含まないヒトＢＣＤＦ　ｃＤＮＡを含む
断片を回収した（第４図）。

この３′非翻訳領域中には、ｍＲＮＡの不安定化シグナ
ルが存在し、発現量を低下させる原因となっていること
が示唆されている（Ｎ、Ｔｏｕｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ
。

Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，１，１０５６（１９８９）　）　。

ｉｉ　）プラスミドｐｓＤ（ｘ）を制限酵素Ｘｈｏ　　
Ｉで切断した後に、この断片とｉ）で得た断片を７４　
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第４図）。

即ち、プラスミドｐＳＯ（Ｘ）／ＢＳＦ−２△ＳＶ４０
初期プロモーター　ｄｈｆｒ遺伝子−５Ｖ４０スプライ
シングシグナル−５Ｖ４０初期プロモーターー・３′非
翻訳領域を含まないヒトＢＣＤＰ遺伝子−５Ｖ４０スプ
ライシングシグナルを構築した。

この構築したプラスミドを大腸菌１８１０１株へ導入し
、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。

得られた株からプラスミドＤＮＡ　＠ｔＡ製した制限酵
素による切断試験を行ったことによりプラスミドｐｓＤ
（ｘ）　／ＢＳＦ−２−３を保持する株を選定した。

尚最終的に用いたヒトＢＣＤＦの遺伝子は第１図の塩基
配列において１番目のＮＥＴに対応するＡＴＧの９塩基
前方から、終止コドン↑ＡＧの８塩基後方までである。

（２）プラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２−３をカル
シウムリン酸法に従ってハムスターＣＩＯ細胞に導入し
、核酸非要求株を選択した。その培養上清をＥＬＩＳＡ
法により測定したところ、ＬＯＯＵ／＋ａｊ！のヒトＢ
Ｃ叶活性を示した。

（３）　　（２）で得られたＣＨＯ細胞株をＩ　Ｘ　１
０−＠Ｍメソトレキセー）　（？ｔＴＸ）を含む培地で
培養したところ、培養上清中のヒトＢＣＤＦ活性は５０
０Ｕ／ｍｆに上昇した。さらに、培地中のＭＴＸ　濃度
を上昇させ、３　Ｘ　１０−’Ｍ　ＭＴＸを含む培地で
培養したところ、ヒトＢＣＤＦ活性は７００００　Ｕ／
　ｍｌｌに上昇した。

尚、この菌、ＣＨＯ／ｐｓＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２−３は
微工研に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ　Ｐ
−１１２５７である。

〔実施例４〕 〔実施例３〕で得られた細胞の培養上清から実施例２と
全く同様に、抗ヒトＢＣＤＦ抗体カラムを用いてヒトＢ
ＣＤＦを精製した。精製ヒｌ−ＢＣＤＦは逆相ＦＩＰＣ
Ｃで単一ピークを示した。この精製ヒトＢＣＤＦのＮ末
端をＮ末端シークセンサーを用いて決定したところ、実
施例２で検出したのと全く同じ６種類のＮ末端が検出さ
れた。

〔効　果〕

本発明により、糖鎖を有する各種Ｎ末端構造を有するヒ
トＢＣＤＦを提供できることより、Ｆ！鎖のないヒトＩ
ＩＣＤＦを投与した場合には常に問題となる生体内安定
性、及び生体内活性等の問題を解決できる可能性が与え
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＢＣＤＦのアミノ酸配列及びその塩基配列
を示す。 第２図はプラスミドｐＣＤ　ＢＳＦ−２及びプラスミド
ｐＢＳＦ２−１０Ｓ６の構築図を示す。 第３図はプラスミド９５口（ｘ）／ＢＳＦ−２の構築図
を示す。 第４図はプラスミドｐｓＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２−３の構
築図を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）組換えＤＮＡ体を有する真核生物細胞を培養して
   生産される糖鎖を有するヒトＢ細胞分化因子（以下ヒト
   ＢＣＤＦと称する）。
2. （２）Ｎ末端付近のアミノ酸配列が下記のような配列を
   有する請求項（１）記載のヒトＢＣＤＦ。 ￥Ｎ末端付近のアミノ酸配列￥ （Ｎ末端）ＡＬＡＰＲＯＶＡＬＰＲＯＰＲＯ（３）Ｎ末
   端付近のアミノ酸配列が下記のような配列を有する請求
   項（１）記載のヒトＢＣＤＦ。 ￥Ｎ末端付近のアミノ酸配列￥ （Ｎ末端）ＰＲＯＶＡＬＰＲＯＰＲＯＧＬＹ（４）Ｎ末
   端付近のアミノ酸配列が下記のような配列を有する請求
   項（１）記載のヒトＢＣＤＦ。 ￥Ｎ末端付近のアミノ酸配列￥ （Ｎ末端）ＶＡＬＰＲＯＰＲＯＧＬＹＧＬＵ（５）Ｎ末
   端付近のアミノ酸配列が下記のような配列を有する請求
   項（１）記載のヒトＢＣＤＦ。 ￥Ｎ末端付近のアミノ酸配列￥ （Ｎ末端）ＰＲＯＰＲＯＧＬＹＧＬＵＡＳＰ（６）Ｎ末
   端付近のアミノ酸配列が下記のような配列を有する請求
   項（１）記載のヒトＢＣＤＦ。 ￥Ｎ末端付近のアミノ酸配列￥ （Ｎ末端）ＰＲＯＧＬＹＧＬＵＡＳＰＳＥＲ（７）Ｎ末
   端付近のアミノ酸配列が下記のような配列を有する請求
   項（１）記載のヒトＢＣＤＦ。 ￥Ｎ末端付近のアミノ酸配列￥ （Ｎ末端）ＧＬＹＧＬＵＡＳＰＳＥＲＬＹＳ