JPH0198489A - 血小板由来成長因子ａ鎖ポリペプチドの組換え生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生化学２分子生物学、および遺伝子工学の分
野におけるものである。特に１本発明は。

原核生物または真核生物の宿主において、ヒト血小板由
来成長因子（ＰＤＧＦ）　ＡｔＮポリペプチドおよびそ
の前駆体ポリペプチドに対する遺伝子をクローン化し、
そして発現させるための組換えベクターに関する。さら
に１本発明は、＆１１換えＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチド
を生産する方法と１組換えＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチド
を含むＰＤＧＦを生産する方法とに関する。

（従来の技術） ＰＤＧＦは１間葉山来細胞に対する。血清中の主要な分
裂促進因子である。ＰＤＧＦは血小板α顆粒中に貯蔵さ
れ、血管が傷害を受けた場合には、血小板の活性化の間
に局所的に放出される。ＰＤＧＦは、単球および好中球
に対する。ならびに線維芽細胞および平滑筋細胞に対す
る有効な化学誘引物質である。これらの活性を有するた
め、　ＰＤＧＦは組織修復過程における重要な構成要素
である。

精製された天然のＰＤＧＦは、約３０．０００ダルトン
の糖タンパクであり、２本のジスルフィド結合鎖を有す
る。八およびＢと表される２種類の鎖が存在する。天然
のＰＤＧＦが、ヘテロダイマー、ホモダイマーの１昆合
物、またはヘテロダイマーとホモダイマーとの混合物の
いずれであるかは知られていない。

しかし、還元を行うことにより、　ＰＤＧＦの生物活性
が不可逆的に破壊されることから、ダイマー構造は機能
的に重要である。

Ｂ鎖は、２４１個のアミノ酸からなる前駆体を。

加水分解でプロセッシングすることにより銹導される。

Ｂ鎖前駆体は、シミアン肉腫ウィルス（ＳＳＶ）の形質
転換遺伝子ｖ−ｓｉｓに対する細胞内の対応物であるｃ
−１１遺伝子によりコードされている。Ｂ鎖をコードす
るｃＤＮＡは、すてにＮａｔｕｒｅ（１９８５）　３１
６：７４８−７５０に報告されている。Ｂ鎖と形質転換
タンパクシーｓｉｓとの間には相同性が存在する。ｖ−
ｓｉＪ伝子のクローニングおよび発現は２欧州特許出願
第８５１１２８５２．０号（公開番号０１７７９５７）
に記載されている。ｖ−ｓｉｓの研究によると、Ｂ鎖ホ
モダイマーは分裂促進活性を有する。また、ブタＰＤＧ
Ｆは、その配列決定を行うことにより、ヒトＢｔｊ（に
対応する１種類の鎖だけを含むことが明らかにされてい
る（ＥＭＢＯＪ（１９８４）３：２９６３−２９６７）
。

Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、八、ら、　ＥＭＢＯＪ（１９８４）
３：９２１−９２８　は。

ＰＤＧＦ　Ａ鎖の部分的なアミノ酸配列を記載している
。

Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０４：３５−３９および５
ｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２１　：２７５−２７７も
参照されたい。Ｈｅ１ｄｉｎ＋Ｃ，Ｈ，ら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８６）３１９：５１１−５１４は、推定され
るＰＤＧＦ　Ａ鎖ホモダイマーと構造的に関連性のある
骨肉腫由来成長因子（ＯＤＧＦ）を記載している。０Ｄ
ＧＦの研究によると。

ＰＤＧＦ　Ａ鎖ホモダイマーは生物活性を示すことが示
唆される。

（発明の要旨） 本発明は、　ＰＤＧＦ　ＡｔＮポリペプチドをクローン
化し、そして発現させるためのベクターを調製すること
、およびこのような発現ベクターを用いて生物活性を有
するＰＤＧＦ　Ａ鎖タンパクを発現させることに基礎を
置いている。

従って、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコードする組
換えＤＮＡのクローニングベクター、および該組換えＤ
ＮＡを含む発現ベクターは１本発明のある局面である。

このような発現ベクターを含み５そして生物活性（実施
例の０５に記述されている分析法により測定される）を
有する組換えＰＤＧＦ　（ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチド
を含む）を生産し得る宿主（例えば、形質転換された酵
母細胞や哺乳動物細胞）は２本発明の別の局面である。

このような宿主を用いて、生物活性を有するＰＤＧＦＡ
鎖タンパクを生産する方法は、やはり本発明の別の局面
である。

ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドを含む組換えＰＤＧＦは９
本発明のさらに別の局面である。

（発明の構成） ■、定嚢 ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコードする［ｌＮＡを特
徴付けるために、ここで用いられているような［組換え
ＤＮＡ　Ｊという用語は１次のようなゲノムＤＮＡ　。

ｃＤＮＡ、半合成りＮＡ、または合成りＮＡを意味する
。

このＤＮＡは、その起源または操作により、（１）該Ｄ
ＮＡが自然の状態またはライブラリーの形で関連性のあ
るＤＮＡの全体またはその一部とは関連性がないか、お
よび／または（２）該ＤＮＡが自然の状態で連結されて
いるＤＮＡ以外のＤＮＡに連結されている。

「レプリコン」は、細胞内におけるポリヌクレオチド複
製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の
制御下で複製し得る）遺伝的要素（例えば、プラスミド
、染色体、ウィルス）である。

「ベクター」は、別のポリヌクレオチド部分が連結され
、該連結部分の複製および／または発現をもたらすレプ
リコンである。「発現ベクター」とは、自律的に複製ま
たは組み込みを行い得るベクターを意味し、適当な宿主
内でＰＤＧＦ　Ａ鎖ＯＮへの転写および翻訳を制御する
制御配列を含む。

「コード配列」は、転写されるか、および／またはポリ
ペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。

「プロモータ配列」は、　　ＲＮＡポリメラーゼを結合
し、下流（すなわち、３′方向）のコード配列の転写を
開始させ得るＤＮＡ８１１節領域である。

コード配列は、該コード配列の転写がプロモータ配列へ
のＲＮＡポリメラーゼの結合から開始される際には、細
胞内において、該プロモータ配列の「制御下」にある；
次いで、得られたｍＲＮへの翻訳により、コード配列内
にコードされているポリペプチドがもたらされる。

「作動可能なように連結されている」とは、構成要素が
その通常の機能を果たし得るように配置されていること
を意味する。従って、コード配列に作動可能なように連
結された制御配列は、該コード配列の発現を行い得る。

「制御配列」とは、コード配列の転写および／または翻
訳を制御する配列を意味する；これら制御配列には、プ
ロモータ配列、転写開始配列および終結配列、そして翻
訳開始配列および終結配列が含まれるが、これらに限定
されるものではない。

さらに、「制御配列」とは、コード配列内にコードされ
たポリペプチドのプロセッシングを制御する配列を意味
する：これら制御配列には、該ポリペプチドの分泌、プ
ロテアーゼによる切断、およびグリコジル化を制御する
配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。

「形質転換」は、宿主細胞内へ外来のポリヌクレオチド
を挿入することである。この外来のポリヌクレオチドは
、プラスミドとして維持されるか。

あるいは宿主ゲノム内に組み込まれ得る。

２、■批え胆邸」延」■ 本発明の組換えＰＤＧＦ　Ａ鎖ＤＮＡは、少なくとも第
１図において枠で囲まれたアミノ酸配列のアミノ酸８７
〜１９３をコードする。該ＤＮＡはまた。該アミノ酸配
列に対して実質的に相同性を有しかつ機能的に等価な類
似配列をもコードする。「実質的に相同性を有する」と
いう用語は、前記配列におけるアミノ酸の変異（置換お
よび／または欠失を含む）の数が約１０より少ない、好
ましくは約３より少ないことを意味する。「機能的に等
価な」という用語は、類似配列が、　ＰＤＧＦの生物活
性（実施例の且５で記述されている分析法により測定さ
れる）を有するタンパクを生産する鎖を定義することを
意味する。該ＤＮＡには、さらに第１図または第２図に
おいて枠で囲まれた配列のアミノ酸残基１９４〜１９６
の１またはそれ以上をコードするＤＮＡ　、第１図にお
いて枠で囲まれた配列のアミノ酸残基１９７〜２１１の
１またはそれ以上をコードするＤＮＡ　；および／また
は、第１図において枠に囲まれたアミノ酸配列のアミノ
酸１〜８６のすべてまたはその一部をコードするＤＮＡ
が含まれ得る。哺乳動物系において発現を行うのに好ま
しい、前記アミノ酸８７〜１９３をコードするＤＮＡ配
列は、第１図に示されたＤＮＡ配列である。他の生物に
おいて発現させるためには、該ＤＮＡが発現される特定
の宿主により好まれるコドンを用いる配列を使用するこ
とが望ましい。

組換えＰＤＧＦ　Ａ鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、　ｃＤ
ＮＡ、または合、成りＮＡであり得る。実施例として、
第１図および第２図に示された配列を、　ＰＤＧＦ生産
細胞系のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリー
から得た。

このライブラリーは、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖に関して報告さ
れている部分的なアミノ酸配列に基づく配列を有する２
つのプローブを用いて調べた。両方のプローブとハイブ
リダイズするクローンは図示した配列を与えた。これら
の配列を用いてヒトゲノムライブラリーを調べることに
より、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコードする類似
のゲノムＤＮＡを得ることができる。図示した配列から
推定されるアミノ酸配列に基づけば、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖
ポリペプチドをコードする合成遺伝子は、それぞれ重複
した相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、そしてデオ
キシリボヌクレオチド３リン酸の存在下でＤＮ八へリメ
ラーゼを用いて一本鎖の非重複部分を充填することによ
り、インビトロで調製し得る。

第１図に示す推定アミノ酸配列は、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖の
アミノ酸配列分析により得られ報告されている部分的な
アミノ酸配列と、アミノ酸１１９．１４１および１４３
が異なっている。これら部位における報告されている残
基は、それぞれＶａｌ、　Ａｒｇ＋およびＴｈｒである
。第１図から明らかなように、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ｃＤＮ
Ａは、これらの残基がそれぞれＩｌｅ、　Ｇｉｎ、およ
びＳｅｔに置き代わっている。

３６ＰＤＧＦＡｔ″ＤＮＡのクローニングＰＤＧＦ　Ａ
鎖ＤＮＡは、ベクターを構築するために。

適当なレプリコンにクローン化し得る。そして。

それによって、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖遺伝子を有さないベク
ター（例えば、このライブラリーから得られた他のクロ
ーン）を実質的に含まない組成物中に維持され得る。膨
大な数のクローニングベクターが当業者に知られており
、適当なりローニングベクターが適宜選択される。クロ
ーニングベクター、および該ベクターで形質転換し得る
宿主細胞の例としては、バタテリオファージλ（エセリ
ヒア・コリー）　、　ｐＢＲ３２２（エセリヒア・コリ
ー）　、　ｐＡｃＹｃ１７７（エセリヒア・コリー）、
　ｐＫＴ２３０（ダラム陰性菌）。

１）ＧＶ１１０６（ダラム陰性菌）　、　ｐＬＡＦＲｌ
　（ダラム陰性菌）１、）ＭＥ２９０　（エセリヒア・
コリー以外のダラム陰性菌）。

ｐＨＶ１４（エセリヒア・コリーおよびバチルス・サチ
ルス）、　ｐＢＤ９（バチルス）　、　ｐＩＪ６１（ス
トレプトミセス）　、　ｐＵＣ６（ストレプトミセス）
、アクチノファージφＣ３１（ストレプトミセス）　、
　ＹＩｐ５　（サツカロミセス）　、　ＹＣｐ１９　　
（サツカロミセス）、およびウシ乳頭腫ウィルス（哺乳
動物細胞）が挙げられる。

４、　ＰＤＧＦ　Ａ言［の ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド配列は、適当なレプリコンに該配列を挿入すること
により発現ベクターを構築し、得られた発現ベクターを
適合し得る宿主に導入することにより発現される。

発現ベクターを構築する際には、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリ
ペプチドをコードする配列は、適当な制御配列を存する
ベクター内に配置される。制御配列に対するコード配列
の位置および方向は、該コード配列が制御配列の制御下
で転写されるようなものである：すなわち、プロモータ
がコード配列から得られるｍＲＮＡの転写を制御し、そ
してリポソームがリポソーム結合部位に結合して翻訳過
程を開始する；および、翻訳を終結するために用いられ
る終止コドンは転写終結部位から上流にある。一般的に
用いられる原核生物の一制御配列には、β−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（里）プロモー
タ系（ｃｈａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９
８：１０５６）。

トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Ｇｏｅｄｄｅ
ｌら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８０）８：
４０５７）、そしてラムタ゛由来ＰＬプロモータおよび
Ｎ遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉａ＋ａｔａｋｅら
、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）のよう
な一般的に用いられているプロモータが含まれる。酵母
ベクターの制御配列には、解糖酵素の合成に対するプロ
モータ（Ｈｅｓｓら、　Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒ
ｅｇ（１９６８）７：１４９；Ｈｏ１ｌａｎｄら、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７８）１７：４９００　
）が含まれる。当該分野に知られている他のプロモータ
には、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモータ（
ＩＩｉｔｚｅｎ＋ａｎら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（
１９８０）２５５　：　２０７３）がある。増殖条件お
よび／または遺伝的背景により転写が制御されるという
付加的な利点を有する他のプロモータは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２　（ＡＤＨ２）、イソチトクロームＣ
２酸性ホスフアターゼ、窒素代謝に関連のある分解酵素
群、そしてマルトースおよびガラクトースの資化の原因
となるα因子系および酵素群のプロモータ領域である。

また、ターミネータ配列はコード配列の３゛末端に存在
することが望ましいと考えられる。このようなターミネ
ータは、酵母由来の遺伝子では、コード配列に続り３′
非翻訳領域に見い出される。ＶＥＲＯ細胞、　Ｈｅ１ａ
細胞、またはＣ１１０細胞のような哺乳動物細胞に対す
る発現ベクターは９通常、このような細胞と適合し得る
プロモータおよび制御配列を含んでいる：例えば、−船
釣に用いられるシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）由
来の初期プロモータおよび後期プロモータ（Ｆｉｅｒｓ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）　；
あるいは、ポリオーマ、アデノウィルス２．ウシ乳頭腫
ウィルス、またはトリ肉腫ウィルスに由来するような他
のウィルスプロモータ。制御可能なプロモータ、　ｈＭ
Ｔｒｌ（Ｋａｒｉｎ、Ｍ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）２９９ニア９７−８０２）も
用いられ得る。

制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に対応してＰＤＧＦ
　Ａ鎖遺伝子の発現を調節し得る調節配列を加えること
が望ましい。調節系の例は、調節化合物の存在を含めて
、化学的または物理的な刺激に応答して遺伝子の発現を
開始または停止させるようなものである。原核生物系で
は、迩およびη１オペレータ系がこれに含まれる。真核
生物系では。

メタロチオネイン遺伝子は重金属により、マウス乳癌ウ
ィルス（ＭＭＴＶ）系はステロイドにより、誘導を起こ
すことができる。これらの場合、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリ
ペプチドをコードする配列は調節要素とタンデムに配置
される。

高レベルの特異的タンパク生産をもたらし得るＤＮＡ増
幅を起こす選択的な要素も存在する。真核生物系では、
メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）、およびデオキシコルホ
マイシンの存在下におけるアデノシンデアミネース（Ａ
ＤＡ）が含まれる。これらの場合、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポ
リペプチドをコードする配列は、同じプラスミド上に存
在させるか、あるいは単に選択可能な要素と共に同時に
形質転換させて。

互いに近接した宿主細胞ゲノム内に組み込ませ得る。

他の種類の調節要素（すなわち、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖をコ
ードする配列とタンデムには存在していない調節要素）
もベクター内に存在し得る。例としては。

ＳＶ４０エンハンサ−配列力ある。該エンハンサ−配列
は、単に存在するだけで、該配列から遠く離れて存在す
る遺伝子の発現を促進させる。

ＰＤＧＦ　Ａ鎖をコードする配列を、レプリコンへの挿
入に先立って修飾することは２選択した発現系によって
は、望ましいか、あるいは必要であり得る。例えば、あ
る場合には、該配列が適当な方向で制御配列に連結され
得るように修飾すること（すなわち、リーディングフレ
ームを維持すること）が必要であり得る。ある場合には
、宿主生物からポリペプチドを分泌させ９次いで分泌シ
グナルの切断を引き起こす配列を加えることが望ましい
。

クローニングを利用してヌクレオチド配列を修飾する技
術は当業者に公知である。これらの遺伝子は９例えば、
制限酵素の使用；過剰のヌクレオチドを除去するＢａ１
３１のような酵素の使用；そして。

アダプターとして用いて欠失したヌクレオチドと置き換
えられるか、および部位特異的変異処理において用いら
れる。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの使用を
包含する。

ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコードし、適当に修飾さ
れた配列は、ベクターへ挿入する前に、制御配列に連結
させ得る。あるいは、このコード配列は。

すでに制御配列と適当な制限酵素切断部位とを含む発現
ベクターに直接クローン化させ得る。原核生物および酵
母においてｌ’ＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドを発現させる
場合には、制御配列はもちろんコード配列に対して非相
同的である。ＰＤＧＦ　Ａ鎖遺伝子をを椎動物由来の細
胞系で発現させなければならない場合、制御配列は、特
定の細胞系によっては。

非相同的または相同的であり得る。

使用した宿主細胞に依存し、このような細胞に適する標
準的な技術を用いて形質転換が行われる。

塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法（ｃｏｈｅｎ
。

Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（
ＬＩＳＡ）　（１９７２）６９：２１１０に記載されて
いる）、またはＲｂＣ１２法（Ｍａｎｉａｔｉｓら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ΔＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、２５４お
よびｌ１ａｎａｈａｎ。

Ｄ、、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（１９８３）１６６：５
５’？−５８０に記載されている）は、細胞壁に実質的
な障壁を有する原核生物または他の細胞に用いることが
できる。このような細胞壁を有さない哺乳動物細胞に対
しては。

Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム
沈降法（この方法は、必要に応じて、　Ｗｉｇｌｅｒ、
　Ｍ、ら、　Ｃｅ１ｌ（１９７９）１６：　７７７−７
８５に従って変更される）を用いることができる。酵母
の形質転換は、　Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７８）２７５：１０４−１０９の方法、また
はＨｉｎｎｅｎ＋　Ａ、ら、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃ
ａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９７８）７５：１９２
９の方法に従って実施し得る。

次いで、形質転換細胞は、　ＰＤＧｒ’　Ａ鎖遺伝子を
発現し、そしてその発現産物を、生物活性を有するＰＤ
ＧＦに（すなわち、ダイマーの形に）組み立てることを
可能にするような条件下で増殖させる。以下の実施例で
示すように９組換えＰＤＧＦ　Ａ鎖ホモダイマーを細菌
内で生産させる最初の試みは、生物活性を有するＰＤＧ
Ｆを、たとえ生産できても少ししか生産できなかった。

これは、不適当なダイマーが形成されたか、あるいは不
適当な鎖の折りたたみのような２種々の理由に起因する
ものであり得る。組換えＰＤＧＦ　Ａ鎖ホモダイマーを
生産することに加えて９本発明は、別々のベクターを用
いるか。

またはへ鎖遺伝子とＢ鎖遺伝子とを含む単一のベクター
を用いて、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖およびＰＤＧＦ　Ｂ鎖の両
方の遺伝子を同時に発現させることにより、　ＰＤＧＦ
　Ａ鎖とＰＤＧＦ　Ｂ鎖とのヘテロダイマーの生産を可
能にする。このようにして合成された組換えＰＤＧＦタ
ンパクは２次いで宿主細胞から単離され、そして精製さ
れる。発現系がＰＤＧＦを増殖培地中に分泌する場合に
は、　ＰＤＧＦは培地から直接単離される。組換えＰＤ
ＧＦが分泌されない場合には、＆Ｆｔ換えＰＤＧＦは細
胞溶解物から単離される。適当な増殖条件の選択および
回収方法は当該分野の技術範囲内のものである。精製に
関しては２例えば欧州特許出願公開第０１７７９５７号
、およびＮａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：５１１−５
１４を参照されたい。

（以下余白） えＰＤＧＦの　　　゛よび１ 本発明に従って調製したＰＤＧＦは、一般にを椎動物、
特に人間、家畜、競技用動物、およびペットを包含する
哺乳動物において、皮膚、真皮、粘膜。

または上皮の傷のような創傷に対して局部的に適用され
る。ＰＤＧＦは、外傷、外科的創傷、熱または化学的な
傷（やけど）、放射線による（■傷、および血管、血液
、および代謝の疾患、感染、または新生物によって生じ
る褥癒および皮膚潰瘍のような潰瘍を包含する層全体ま
たは部分的な創傷のあらゆるタイプを治療するために使
用し得る。

ＰＤＧＦはローション、スプレー、ゲル、軟膏の形で、
あるいは放出を調節または持続させる投与形態で、入手
可能な賦形剤および担体を用いて処方され得る。他の成
長因子（ＦＧＦ、　ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、　ＥＧＦ。

ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＴＧＦ−β、　ＴＧＦ−αな
ど）、緩衝液。

局部麻酔剤、抗生物質、ゲル化剤などのような添加成分
がこの製剤に含有され得る。

皮膚の創傷に関して最も適当な局所的投与のためには１
例えば、０．１〜１０％の濃度のＰＤＧＦを用いた標準
的な局所的製剤が使用される。製剤の濃度は、もちろん
創傷の程度および被検体の性質に依存する。治療のため
の処方箋によっては、傷跡が残る可能性が低下するまで
、用量を時間とともに少なくする。

組換えＰＤＧＦの放出を調節または持続させる製剤は、
担体または賦形剤中にＰＤＧＦを混入することにより作
製される。このような担体または賦形剤としては、リポ
ソーム、エチレン−酢酸ビニルコポリマーおよびハイト
レル＠　（ｌｌｙｔｒｅｌ［Ｆ］）コポリマーのような
非再吸収性の半透過性ポリマー、ハイドロゲルのような
膨潤性のポリマー、あるいはコラーゲンのような再吸収
性ポリマー、およびある種の縮合酸、または吸収性のあ
る縫合糸を作製するのに用いられるポリエステルが挙げ
られ、上記製剤は典型的には１日から１週間という長い
時間にわたり創傷部位にＰＤＧＦの放出を持続する。特
に。

傷を保護する包帯剤にＰＤＧＦを含有させることが望ま
しい。製剤からのＰＤＧＦ放出機構は、拡散、浸透。

浸出、溶解、浸食またはこれらを組み合わせたものであ
り得る。拡散を持続放出させる製剤においては、　ＰＤ
ＧＰがカプセル化／分散された担体または賦形剤を通し
て、該ＰＤＧＦが溶解および拡散する。

浸出または溶解する制剤では、　ＰＤＧＦは体液によっ
て担体から浸出される。放出を持続させる制剤中のポリ
ペプチドの濃度は２通常、少なくともｌμｇ／戚であり
１通常は１０ａｇ／Ｉｄと１０■／ｄとの間である。い
くつかの例においては、治療の間、罹患領域または創傷
部位に治療用組成物を継続的に維持することが望ましい
。これは１種々の治療用組成物の断続的適用によって、
または上述したような持続的放出投与によるＰＤＧＦの
投与によって達成し得る。この事について、゛連続的に
゛という用語は、このような持続的に放出する投与形態
により達成される本来の連続投与、または本来の連続投
与によって達成される状態を模倣した薬力学的パターン
を与えるような繰り返しの適用によって達成される連続
投与を意味する。

（実施例） 以下の実施例では、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの単離、および生物学的に活性なＰ　Ｉ
）Ｇ　Ｆを生産するための種々の宿主内でのＤＮＡの発
現についてさらに詳細に記述する。

以下における“分解°°という言葉は、制限エンドヌク
レアーゼによるＤＮＡの酵素分解を意味する。

通常、制限酵素と呼ばれている制限エンドヌクレアーゼ
は、よく特徴付けられた商品として入手可能であり、製
造業者の説明書に従って使用される。

制限酵素で分解した後に、５゛末端のリン酸基を除去す
るためのアルカリホスファターゼ処理が、製造業者の説
明書に従ってしばしば行われる。この処理によって、２
つの適合する末端を有するヘクターの自己連結が防がれ
る。

“充填′°とは、ある制限酵素に生じた突出末端を修復
することによって、平滑末端を作製する酵素的工程を意
味する。修復は、　　ＤＮＡポリポリーゼ■大フラグメ
ント（クレノー）とデオキシヌクレオチド３す、ン酸と
の作用によるものであり、これらは製造業者の説明書に
従って用いられる。

ＯＮ＾制限断片のゲルによる単離とは、アガロースゲル
またはポリアクリルアミドゲル（断片の大きさに基づく
）のいずれかでの電気泳動で分離した特定の断片を、ゲ
ル切片を電気溶出すること。

または溶融させて抽出することにより回収することを意
味する。

ＤＮＡの操作は、全て標準法に従って行った。

ＭａｎｉａＬｉｓら「分子クローニング」Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ１、ａｂ、　（１９８２）
を参照のこと。使用した全ての酵素は市販のものを購入
することにより入手し、製造業者の説明書に従って使用
した。

１、ＰＤＧＦ−Ａ言゛ｃＤＮへの　　および−ｆｉＯ〉
に七ノ二λｇｔｌｏのｃＤＮＡライブラリーを、　Ｂｅ
ｔｓｈｏｌｔｚ、　Ｃ１ら、　Ｃｅ１ｌ（１９８４）３
９：４４７−４５７に記載のｔ、ｔｃｌ／尿素変法を用
いて、ヒトのクローングリオーム細胞系Ｕ−３４３ＭＧ
ａＣ１１２：６由来のポリ　（八）”　ＲＮＡから作製
した。オリゴ（ｄＴ）プライマーで起動されるｄｓ　ｃ
ＤＮＡの合成は、　Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、およびＨｏｆ
ｆａ＋ａｎ、　Ｂ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ（１９８３）　２５
　：　２６３−２９９に従って行った。得られたｃＤＮ
ＡをＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理し、　　ＥｃｏＲＩ
リンカ−を用いてＥｃｏＲＩで分解した２ｇ　ｔｌＯに
サブクローン化した。組換えファージをＥ、　ｃｏｌｉ
　Ｃ６００ｈｆｌ内に播種した。

ＰＤＧＦ−八−１およびＰＤＧＦ−ミー２と命名した２
つのオリゴヌクレオチドブローフ゛は、　ＰＤＧＦ　Ａ
２真のわかっている一部のアミノ酸配列に基づいて合成
した。両者とも固相ホスホルアミダイト法を用いて作製
した。２本鎖のプローブであるＰＤＧＦ−Ａ−１は、２
つのオーバーラツプした５０ｂｐオリゴヌクレオチドと
して合成し、　〔α−３２Ｐ〕−デオキシヌクレオシド
３リン酸およびＤＮＡポリポリーゼ■のクレノー断片を
用いて放射性標識した。ＰＤＧＦ−Ａ−２は、３７塩基
の鋳型および１２塩基の相補的ブライマーとして合成し
、　ＰＤＧＦ−Ａ−１と同様に放射性標識した。この２
つのプローブのヌクレオチド配列（１本鎖）を以下に示
す。

ＡＩＬ、Ｌ＋Ｌ、ＬＩＪＬ、几ししＬ＋ＩｊＬ、１Ｌｘ
１．、ＬＬ＋シハハし＾ししハｂし八すしらｌし＾これ
らのプローブを、ライブラリー（２Ｘ１０６クローン）
のスクリーニングに用いた。つり上げた２連のニトロセ
ルロースフィルターヲ、２０％ホルムアミド、　　５　
Ｘ５ＳＣ，５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）、　　５　Ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、
　０．１０％ＳＯＳ、および２００μｇ７ｍｌの超音波
処理したサケ精子ＤＮＡの中で４２°Ｃにてハイブリダ
イズさせ、　０．５ＸＳＳＣおよびＯ９１％ＳＤＳで４
２°Ｃにて洗浄した。両方のプローブにハイブリダイズ
したクローンの中からクローンＤ１および１３−１を選
択し１Ｍ１３フア一ジ誘導体中にサブクローン化した後
、ジデオキシヌクレオチド鎖終結により配列決定を行っ
た。旧および１３−１のヌクレオチド配列の一部を第１
図および第２図に示す。

ＤＩの最も長いオープン読取り枠は、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖
前駆体（２１１個のアミノ酸）であると予想される（第
１図に示す）；枠で囲んだ部分は、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ポ
リペプチドの１２５個のアミノ酸を示す。

第１図の推定アミノ酸配列は、　１１９．１４Ｌ　およ
び１４３のアミノ酸が、以前にはＶａｔ、　Ａｒｇ＋　
およびＴｈｒとされていたものが、それぞれＩｌｅ、　
Ｇｉｎ、およびＳｅｔであることがわかったということ
を除いては、アミノ酸配列決定によって得られたＰＤＧ
Ｆ　Ａ鎖の報告されている一部の配列と一致する。アミ
ノ酸の第１番目に位置するＡＴＧコドンの次に塩基性ア
ミノ酸（Ａｒｇ）があり、その後に１８個の疎水性残基
が連なる。これはシグナルペプチド配列の特徴であり、
ヒト骨肉腫細胞により生産されるＰＤＧＦＡ鎖ホモダイ
マーは分泌されるという観察と一致する。好適なシグナ
ルペプチドの切断部位を比較すると、プロセッシングは
２０番目のアミノ酸であるＡｌａと２１番目のアミノ酸
であるＧｌｕとの間で起こり得ると示唆される。血小板
ＰＤＧＦ　ＡＩ￥のＮ−末端配列は、８７番目のアミノ
酸であることが見い出された。これは、アミノ酸１２５
個のＡ鎖タンパクを生じるように、６６個のアミノ酸（
４４％が荷電している残基）のプロペプチドが前駆体か
ら切断されるということを示唆している。この切断は、
４個の一連の塩基性アミノ酸Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇの後で生じ得る。さらなるタンパク分解プロセッ
シングがＣ末端領域で生じ得る。

１３−１に対応するオープン読取り枠（第２図）は。

Ｄｉの前駆体の配列とＣ−末端の１５残基を欠くこと以
外は、１９６個のアミノ酸のＰＤＧＦ　Ａ鎖前駆体はＤ
１前駆体の配列と同じであることを予想している。第２
図において、成熟ポリペプチドを枠で囲んで示す。

同一のｃＤＮＡライブラリーから単離したＰＤＧＦ　Ｂ
ｔｕのｃＤＮＡは、　ＤＩ、　１３−Ｌ　およびＢ鎖ｃ
ＤＮＡを類似の方法でクローン化する以下の実験で使用
した。

２・■１１１１■［Ω久主現 ＰＤＧＦを産生ずる永久細胞系を株化するために。

転写調節因子、ポリアデニル化部位、および転写終結シ
グナルを有する哺乳動物細胞発現ベクターの中にｃＤＮ
Ａ全体をクローン化した。得られたプラスミド（選択可
能なマーカを有する）は、チャイニーズハムスター卵巣
細胞（ｃＩＩＯ）内に導入した。

構築 ３個のｃＤＮＡクローンのそれぞれのＥｃｏＲＩ断片を
単離し、前もってＥｃｏＲＩ分解およびアルカリホスフ
ァターゼ処理したｐＳＶ７ｄ　（以下の９２．４を参照
のこと）に該断片を連結させることによって、３種類の
独立した哺乳動物発現ベクターを構築した。

得られたりｏ　−７ｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ−Ａ１０３（
Ｄｉ）　、　ｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ−Ａ１０２（１３−
１）、およびｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ−Ｂｌ　（Ｂ鎖）を
単離し。

制限酵素で分解することにより特徴付けを行った。

これらのプラスミドは、Ｂ鎖およびＡ鎖を共に発現する
ためのキメラブーｙｘミドｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ　Ａ１
０２−ＢｌおよびｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＰ　Ａ１０３−Ｂ
ｌを作製するために用いた。プラスミドの大量調製を、
記述した全ての構築物について実施した。このＤＮＡを
Ｃｌｌ０細胞を形質転換させるために用いた。

２．２．−リＪ釦既ｑ形ｌ藍喚 形質転換を以下のようにして行った： ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉ
ｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ（１９８０）　
７７：４２１６）を、栄養培地（１，１８ｍｇ／ｌｌ１
ＮａｔＣＯ３，２９２μｇ　／ｄグルタミン。

１１０μｇ／ａＩｌｌピルビン酸ナトリウム、　１００
０／−ペニシリン、　　１００１１／ｍｌストレプトマ
イシン、２００μｇ／ｄプロリン、および１０％ＦＣＳ
を補ったＦ１２）において形質転換を行う前日に、　１
０ｃｍデイツシュにつき５Ｘ１０５〜１０６個の細胞密
度でプレートした。

Ｃｌｌ０細胞は２選択可能なマーカ（アデノウィルス主
要後期プロモータにより作動する叱遺伝子。

以下を参照のこと）を有するプラスミドρＡＤ−ｄｈｆ
ｒと混合した各ｐＳシフｄ−ＰＤＧＦ発現プラスミドで
形質転換させた。この形質転換は、　Ｇｒａｈａｍおよ
びｖａｎ　ｄｅｒＥｂ、　ＶｉｒｏｌｏｇＶ（１９７３
）５２：４５６−４６７に記載の方法の改良法を用いて
行った。合計１０μｇのプラスミドＤＮＡを含有する試
料をデイツシュに添加し、二酸化炭素インキュベーター
（３７°Ｃ）中に細胞を放置した。

６時間後、上清を吸引し、　ＣａおよびＭｇを含まない
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＣＭＦ）を用いて細胞
を穏やかに洗浄し、このデイツシュをおよびアジュバン
トとしての１５％グリセロールに３．５〜４分間接触さ
せた。次いで、上記の培地で細胞を穏やかに洗浄し、培
地を補った。

細胞にＤＮＡを添加してから４８時間後、細胞を１：２
０に分割して選択培地（上記の成分に加えてウシ胎児血
清と透析したウシ胎児血清との１：１混合物をＤＭＥＨ
に補った培地）に入れた。選択培地で１〜２遍間培養し
た後、生じたコロニーをそれぞれ単離し、増殖させた。

ＰＤＧＦについての分析を、それぞれのクローンで行っ
た（以下の記述を参照のこと）。

へ１貫およびＢ鎖のへテロダイマー（ＰＤＧＦ−ＡＢ）
としてＰＤＧＦを産生ずる細胞系を株化するためには。

０２．１で述べたキメラプラスミドでの形質転換に加え
７．　ｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ−８１＋ｐＳＶ７ｄ−ＰＤ
ＧＦ−Ａｉ０３およびｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ−Ｂｌ　＋
ｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ−Ａ１０２を共沈させたものを用
いた形質転換も行われる。

マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（吐な）遺伝子を有する
プラスミドｐＡＤ−ｄｈｆｒは、マウスｄｈｆｒ　ｃＤ
ＮＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、　　Ｊ　　Ｍｏｌ　　Ｃ
ｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ（１９８２）１：５８４−８６４）
の５′末端に、アデノウィルス−２（ＡｄＭｌ、Ｐ、地
図単位１６〜１７．３）由来の主要後期プロモータを融
合させることにより構築した。

ＳＶ４０スモールも抗原のイントロンおよびＳＶ４０初
期領域ポリアデニル化部位をコードするＤＮＡを９ｐＳ
Ｖ２−　ｎｅｏ　（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ
、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ（１９８２）土
：３２７−３４１）から得て、このｃＤＮＡの３゛末端
に融合させた。これら３つの断片をｐ１３Ｒ３２２にサ
ブクローン化し、プラスミドρＡＤ−ｄｈｆｒを得た。

プライマリ−ＣＩＩＯ形質転換細胞系のいくつがが。

１〜２　ｎｇ／　ｍｌ　／　２４時間のレヘルでＰＤＧ
Ｆを培地中に分泌した。これは、０５に記述したマイト
ジェン分析により測定された。

各形質転換細胞系由来のいくつかのプライマリ−クロー
ンは、メトトレキセートの量を０．０５．０．１゜およ
び１．０μＨの濃度に増加させることによって増幅につ
いての選択を行った。メトトレキセート抵抗性コロニー
の増幅および選択は、　Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｓ。

および５ｈａｒｐ、　Ｐ、八、、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏ
ｌ（１９８２）１じ５９：６０１−６２１に従って行っ
た。

２．３０皿旺見瓜勿持果 Ｃ１１０細胞でのＰＤＧＦ発現の結果を、以下の表１に
まとめて示す。ＰＤＧＦ発現プラスミドで形質転換した
ＣＨＯ細胞系の培地を、９５で記述したＩ’ＤＧＦマイ
トジェン分析により分析した。これらの実験の結果は、
　ＰＤＧＦ　Ａ鎖ホモダイマーが活性であることを示す
。

（以下余白） 表１ 増幅細胞系 増幅細胞系 実ｊ猷よ ２．４　鄭ヱ陵〕列ｌ染 哺乳動物細胞のシャトルヘクタープラスミドｐＳＶ７ｄ
は、　ＳＶ４０の複製起点および初期プロモータ（３１
５ｂｐ。

１７３と１８２の位置の間のｓｂｐのヌクレオチドを欠
失したハ慣ＩＩ　（２７２の位置）−勾遺夏（５１９３
の位置））、ポリリンカー、および５Ｖ４０（７）ポリ
Ａ付加部位（２１７６ｂｐ。

ＢｃＩＩ（２７７５〜２５５８の位置））を有する。Ｂ
ｕｃｈｍａｎ、　Ｌ。

ら°’ＳＶ４０ヌクｌ、オチド配列”ｐｐ７９９〜８４
Ｌ“ＤＮＡ腫瘍ウィつス＃（第２版）、　Ｔｏｏｚｅ、
　Ｊ、’ｌＪＡ。ＳＶ４０領域の配列を第７図に示す。

このＳＶ４０の配列は、　ｐＢＲ３２２の誘導体である
ｐＭＬ（ＬｕｓｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ、Ｃｅ１ｌ　
（１９８４）　、共：３９１）のヌクレオチド４２１０
と投１１　（９３７の位置）との間にクローン化されて
いる。Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、ら’ｐＢＲ３２２のヌクレオチド配列”（１９８３
）、　　ｒ分子クローニング：実験室マニュアル」。Ｓ
Ｖ４０の配列は、初期プロモータからの該配列の転写の
方向が、ヘクターのアンピシリン耐性遺伝子の転写の方
向と同じになるように配置される。このプラスミドの制
限酵素切断地図を第８図に示す。

クローンの選択後、細胞系１０６：３（０，０５μ門の
メトトレキセ−１・で１団地幅させたちの由来）が得ら
れた。この細胞系は７無血清条件下において。

２４時間で１０６個の細胞あたりＰＤＧＦ−ＡＢ　７０
０ｎｇ相当量を分泌する速度で、　ＰＤＧＦレセプター
競争活性を分泌した。無血清条件での培養を行った後の
培地２．５２を集め、遠心分離により細胞の破片を除去
し、　１ｌｅｌｄｉｎら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）
３１９：５１１〜５１４に記載の精製プロトコルを行っ
た。種々の両分中のＰＤＧＦ様活性は、　Ｎ１５ｔｅｒ
ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ
　（１９８４）　８１：９２６−９３０に記載のレセプ
ター競争分析により測定した。簡単に述べると、上記操
作を行った後の培地をサルファデックス（Ｓｕｌｆａｄ
ｅｘ）カラムでのクロマトグラフィーに供した。ＰＤＧ
Ｆ様因子は１．５ＭＮａＣｌ、　０．０１Ｍ　リン酸緩
衝液（ｐＨ７，４＞で溶出され、硫安沈殿により濃縮さ
れ、そしてセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）カラム
にかけられ、　ＬＭ　ＮａＣｌ、　０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）で溶出された。活性画分をプールし
、１Ｍ酢酸に対して透析し、凍結乾燥し。

そしてバイオゲル（Ｂｉｏ　Ｇｅ１）　Ｐ−１５０カラ
ムにかけて１Ｍ酢酸で溶出した。活性画分中の物質は、
最終的には１Ｍ酢酸および２Ｍグアニジン塩酸で平衡化
したＲＰ　８１１ＰＬＣ逆相カラムにかけ、２−プロパ
ツールでの濃度勾配によりグラジェント溶出した。

精製された物質を径の小さいＨＰＬＣカラムで脱塩し。

０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの濃度勾
配によりグラジェント溶出した。ＰＤＧＦレセプター競
争活性の溶出位置は、　”’Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＢ内部標
準の溶出位置に対応するがピークは幅広（、ＰＩ）ＧＦ
−Ａ４．　ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−Ｂ８の溶出
領Ｊ或にまで及んだ。この活性ピークの種々の部分の両
分を、還元または非還元条件下におけるグラジェントゲ
ル（１３〜１８％ポリアクリルアミド）を用いた５ＯＳ
−ゲル電気泳動、および銀染色により分析した。両分３
３〜３４（プールＩ）、３５〜３６（プール■）、およ
び３７〜３８（プール■）は全て、主に約３０ｋＤａの
非還元状態の成分を含有していた。これらを還元すると
、　１６ｋＤａおよび１７ｋＤａのバンドが得られた。

＋１ＰＬＣクロマトグラムのプール■は、Ｎ−末端のア
ミノ酸配列決定によりさらに分析され、およそ等モルの
量でＰＤＧＦ　Ａ鎖およびＢ鎖の配列を有する複配列が
見い出された。このようにして、この精製のプロトコル
により純粋なＰＤＧＦが得られ、１Ａｐｏｒ；ｐの大き
さおよび鎖の組成は、ヘテロダイマー構造および／また
は同じ大きさのホモダイマー混合物と一致した。

＋１ＰＬＣクロマトグラムのプールＩ、　　ＩＩ、およ
び■は、　ＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒの方法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　Ｊ（１９７３）１３３　：５２９−５３
９）によりＩ　２Ｓ１で標識した。この方法により、　
Ａ鎖Ｂ鎖の両方が標識された。次いで。

ＰＤＧＦ鎖に特異的な抗血清でこの１２４１標識物質を
免疫沈降させた。”’Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＢ内部標準と共
に溶出させたプール■は、はぼ等しい量の１７ｋＤａ　
Ａ鎖と。

Ｂ鎖に対応する１６ｋＤａの２つのバンドを含有してい
た。プールｒはＡ鎖を含有していたが、はとんどＢｆＡ
を含有していなかった。一方、プール■はＡおよびＢ鎖
の両方を含有したが、Ｂ鎖をより多く含有していた。

これらのデータは３つの可能なＰＤＧＦダイマー全部の
混合物が存在することと−敗し、これらのダイマーはＩ
ＩＰＬＣ逆相系で部分的に分析され、最初にＰＤＧＦ−
ＡＡ１次にＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢという
順序で溶出された。

プール■、■および■に含まれる異なるダイマーの量は
、　ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢおよび−ＢＢを分離するこ
とのできる固定化金属イオンアフィニティー（鎖ＡＣ）
系により測定した。この方法においては、３つのイオン
化したＩＩＰＬＣプールのそれぞれをトリクロロ酢酸に
より沈殿させ、各１５０．０００ｃｐｍを１ｍＭイミダ
ゾール、　　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，および０．０１Ｍ　リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解させ、同じ緩衝液で平
衡化した団ＡＣカラム（Ｄｅｌｏ−ら、八ｎａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ（１９８７）　１６４：４５７−４６５）に
かけた。このカラムを、イミダゾールの直線勾配（ｉｎ
＋Ｍ／＋ｉｎ）およびＮａＣｌの逆勾配（１０ｍＭ／ｍ
１ｎ）により、　　０．５１１１／ｗｉｎの流速で溶出
した。

ＩＺＳ■標識したグリオーム由来の成長因子、血小板か
ら精製したＰＤＧＦ、およびヒトＰＤＧＦＢ鎖を発現す
る形質転換Ｃ１１０細胞系を培養した培地から精製した
組換えＢ鎖ホモダイマーは、それぞれＰＤＧＦ−ＡＡ。

−ＡＢ、および−ＢＢのマーカとして用いた。プール■
はほとんど全てＰＤＧＦ−ＡＢから成るが、プール■は
主にＰＤＧＦ−ＡＡ　（７２％）とＰＤＧＦ−ＡＢ　（
２４％）との混合物であり、プール■は主にＰＤＧＦ−
ＡＢ　（８１％）とＰＤＧＦ−１１Ｂ（１８％）との混
合物であった。定量は、　Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ
標識した後のＰＤＧＦのｌ１ｔＳ！取り込みが２つの鎖
の間でほぼ等しいという観察に基づいて行った。

ＨＰＬＣ逆相クロマトグラムからの活性ピーク全体に含
まれる種々のダイマーの総量を評価すると、　ＰＤＧＦ
−へへが１９％、　ＰＤＧＦ−ＡＢが６９％、そしてＰ
ＤＧＦ−ＢＢが１２％であることが示された。

組換えＰＤＧＦ−ＡＢとヒト血小板から精製したＰＤＧ
Ｆ−ＡＢとを、２つの機能分析で比較した。これら２つ
の因子は２等モル量がヒト繊維芽細胞に結合する様式で
競争し２両者ともにほぼ同様の用量依存性でヒト繊維芽
細胞内への３Ｈ−チミジンの取り込みを刺激した。

（以下余白） ３、聾１μＦ［え現 酵母がタンパクを分泌しプロセッシングする能力を有す
るという理由で、成熟ＰＤＧＦ　Ａ鎖およびＢ鎖の遺伝
子をα因子のリーダー配列（これはＩ’ＤＧＦを分泌さ
せることのできる。酵母の分泌シグナル配列である）に
融合させた。これらのプラスミドで形質転換された酵母
は、　　Ｎｌｌ！末端にα因子リーダーを、そして、　
Ｃ０ＯＨ末端にＰＤＧＦ鎖を含むタンパク（Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇにより隔てられている）を合成することが期待され
る。この分子は１分泌を目的としているため、酵母によ
るプロセッシング部位Ｌｙｓ−＾ｒｇより後部位での開
裂があれば、成熟成長因子が分泌される。Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇは、プレプロα因子と同様に１本来のプレプロＰＤＧ
Ｆにより使用されるプロセッシング部位である。

３．１．　　　　におしる１　可１狡±泌ＰＤＧＦ　Ｂ
鎖タンパク、およびＡ鎖タンパクの２つの形であるＤｌ
および１３−１は、酵母の発現プラスミドｐＹｐＮＢ４
．　ｐＹｐＡ６およびｐＹｐＡ１３４によってそれぞれ
形質転換された酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ八ＢＩＩＯ株（Ｍａｔａ、ｕｒａ　３
−５２．　ｌｅｕ　２−０４．またはｌｅｕ２−３およ
びｌｅｕ　２−１１２の両者、　ｐｅｐ　４−３．　ｈ
ｉｓ４，５８０゜ｃｉｒ’　）により生産され９分泌さ
れる。上記プラスミドは、複製起点とアンピシリン耐性
遺伝子とを含むｐＢＲ３２２配列とともにそれぞれの成
熟ＰＤＧＦタンパクをコードする配列を含み、そして９
選択可能な２μマーカーであるｌｅｕおよびｕｒａ遺伝
子を含む酵母の配列を含む。成！＄、ＰＤＧＦ遺伝子の
発現は。

調節可能なプロモータＡＤＨ２−グリセルアルデヒド−
３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＩＩ）
およびα因子ターミネータの制御下にある。（９３，１
，４参照）。

成熟ＰＤＧＦ　Ｂ鎖をコードする遺伝子の全体は、　Ｕ
ｒｄｅａら、　　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔ４　　Ａｃａｄ　
　Ｓｅｔ　　ＵＳＡ　　（１９８３）　　旦ρニア４６
１−７４６５に記載されているように、　Ｎ、　Ｎ−ジ
イソプロピルホスホルアミダイトを用い、自動オリゴヌ
クレオチド合成機によりシリカ支持体上で合成された。

酵母に好適なコドンが使用された。この合成遺伝子は、
珈１とジ佳Ｉとで分解されたｐＡＧ（Ｈ３，１，４参照
）中に、　３５０ｂｐのＸｂａｌ−５ａｉｌ断片として
クローン化され、ゲル分離され、　ｐＡＧＳＢ−４が得
られた。

この合成ＰＤＧＦ　Ｂ〜鎖遺伝子を含む発現カセットは
。

勿旧断片として切り出され、酵母シャトルベクターｐＡ
Ｂ２４　（ｉ１３．１．４参照）（このｐＡＢ２４は、
あらかじめＢａｍ１ｌｌで分解され、アルカリホスファ
ターゼで処理されている）中にクローン化され、　ｐＹ
ｐＮ［３４が得られた。

ｐＡＧ（６３，１，４参照）中へのクローン化を目的と
し、２つの異なる成熟ＰＤＧＦ　Ａ鎖遺伝子の末端に。

Ｘｂａｌおよび５ａｌＩの部位をつくり出すためにイン
ビトロでの変異が用いられた。インビトロでの変異は＋
　ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈのＤＮＡ（１９８４）
　３　（６）　：４７９−４８８の手法により行われた
。成熟形ポリペプチドのコード領域全体を含む５ａｃｌ
−坦ｎｄＩ［Ｉ断片は、−本領鋳型を生じさせるために
、　ＰＤＧＦ　Ａ鎖遺伝子から、　Ｍ１３ｍｐ１９にク
ローン化された。次の合成オリゴヌクレオチドが、変異
のためのプライマーとして用いられた。

変異　　　　　　　　　　プラＡ」≧シ因賢凰１、１３
−１およびＤｌの　　　ＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＴＡＧＡ
Ｔ八＾ＧＡＧ八八ＧＣＡＴＣ５°へ端の珈■へへ ２、クローンＤ１の３１末端　ＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＧ
ＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＧの）壮■部位 ３、クローン１３−１の　　　　ＧＡＴＧＡＣＣＣＧＴ
ＣＧＡＣＣ八八ＴＣＣＴＧＧＧ八３゛末端へへ辻■部位 クローへＤ１の変異誘発は、プライマー１と２とを使用
して行った。プライマー１と３とはクローン１３−１に
使用した。クローンＤＩ由来の約４ｏｏｂｐのＸｂａｌ
−３ａｉｌの（部分）断片と、クローン１３−１由来の
約３６０ｂｐのＸｂａｌ−ＳａｌＩの（部分）断片とを
それぞれ単離し、これらをｐＡＧ　（Ｘｂａ　Ｉと５ａ
ｌＩ　とで分解しゲル分離されている）にクローン化し
、それぞれｐＡＧ〜八Ｄ１へよびｐＡＧＡ１３．ｌを得
た。成熟ＰＤＧＦ　Ａ鎖の２つの形を含む発現カセット
は、　　１３ａｏ＋ｌｌＩ断片として切り出され、それ
ぞれρＡＢ２４　（あらかじめＢａｍ１ｌｌで分解し、
アルカリホスファターゼで処理されている）にクローン
化し、プラスミドｐＹｐＡ６　とｐＹｐ＾１３４とを得
た。

３、　１．　３　　　　のノ　云　および酵母の発現プ
ラスミドｐＹｐＮＢ４．　ｐＹｐＡ６およびＰＹｐ１３
４を使用して、酵母Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＢＩ
ＩＯ株（ｈ釦。

ｕｒａ　３−５２．　Ｉｅｔ＋　２−０４．　またはＩ
ｅｕ　２−３およびＩｅｕ　２−１１２の両者、　朋ｉ
（４，ｈｉｓ　４−５８０　ｃｉｒ’　）の形質転換を
行った。これは、　ｌ１ｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ　Ｎａ
ｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　（１９８７）互：１９
２９−１９３３　）に記載されているように、　ｕｒａ
−１８％グルコース、ソルビトールプレートに播種して
行った。形質転換体を、　１ｅｕ−、８％グルコース液
体培地中で２４時間にわたり培養し。

次に＋　Ｉｅｕ−＋　　８％グルコースソルビトールプ
レートに播種し１個々のコロニーを得た。それぞれのコ
ロニーを採取し、ｌｅｕ、８％グルコース培地３Ｉｎｌ
中で２４時間にわたり３０°Ｃで培養し１次に、　ｕｒ
ａ”、　　１％グルコース培地１！中にｌ：５０で植菌
し、３０°Ｃにて７５時間培養を行った。酵母を培養し
た培地につき、ヒト包皮繊維芽差マイトジェン分析法（
６５参照）により、　ＰＤＧＦ活性を調べた。酵母の形
質転換体ｐＹｐＮＢ４−２は、培地中に５００ｎｇ／ｒ
ｎ１のレベルで、　ＰＤＧＦ　Ｂ鎖を分泌し、形質転換
体ｐＹＩ）八６−ＮＴＩは。

培地中に１５０ｎｇ／ｍ１のレベルでＰＤＧＦＡ　Ｉ￥
（Ｄｉ型）を分泌し、そして、形質転換体ｐＹｐＡ１３
４−ＮＴＩは。

培地中に３２５ｎｇ／ｍｅのレベルで、　ＰＤＧＦ　Ａ
鎖（１３−１型）を分泌する。

上記培養で得られたタンパクを１５％ポリアクリルアミ
ドＳＯ８電気泳動にかけた。８１１は、　１４．５ｋｄ
の予想サイズの位置に移動する。Ａ鎖の１３．１型は。

１８および１８５．ｋｄの２つのバンドとして、それぞ
れ移動する。予想される単一種のサイズは１８ｋｄであ
る。Ａ鎖のＤＩ型は、　１９．１８．５および１８ｋｄ
の３つのバンドとして移動する。同じゲルを用いた場合
の。

単一の予想されるサイズは、　１９．５ｋｄであると計
算される。いずれのへ鎖においても余分のバンドは。

アミノ末端および／またはカルボキシ末端でのタンパク
分解に起因する。

ｐＡＧはｐＡＧ−ＴＮＦ由来の一般的な酵母の発現カセ
ットベクターである。ここで、　ｐＡＧ−ＴＮＦは１本
発明に適切なｐＡＧ構築物を使用してクローニングする
のに都合がよいという理由で使用されている。

発現カセットベクターｐＡＧ−ＴＮＦは、　ｐＢＲΔＲ
１−５ａｌにクローン化された調節可能なＡＤＨ２−Ｇ
ＡＰＤＩＩプロモータ、α因子リーダー、合成ＴＮＦ遺
伝子、およびα因子ターミネータを含む。ＡＤＨ２ＧＡ
ＰＤＨプロモータは、　　ｐＡＧΔＸｂａＧＡＰ１由来
のｔ、ｏｂｐのＢａｎ旧−Ｎｃｏ　Ｉ断片として単離さ
れた。α因子リーダーの５゛末端は。

次の配列の合成アダプターとして供給され、そしてそれ
は、　ＮｃｏＩとＰｓｔｌとの両方に適合する突出部分
を有する： ＣＡＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧ
ＣＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＧα因子リ
ーダーの３゛末端１合成ＴＮＦ遺伝子およびα因子ター
ミネータは、　ｐＨＧ１０Ｏ−ＴＮＦから、焉匹■−担
旧断片として単離された。３つの断片は、あらかじめＢ
ａｍ１ｌｌで分解し、アルカリホスファターゼで処理し
たｐＢＲΔＲＩ−Ｓａｌ中に、ともに連結され。

クローン化された。

ｐＢＲΔＲ１−５ａｔは、　ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ
と５ａｌＩとで分解し、突出部分をクレノー断片で充填
し、　　Ｂａｍ１ｌＩ’Ｊンカーに連結することにより
構築された。このベクターおよびリンカ−は、現復旧で
分解し、３．８ｋｂの現復旧−ＢａｍＨＩベクターをゲ
ル分離し、自己連結により再び環化した。得られたプラ
スミドをｐＢＲΔＲ１−３ａｌと命名した。

プラスミドｐＡＧΔＸｂａＧＡＰ１　は、　ＡＤＨ２−
ＧＡＰＤＩＩハイブリッドプロモータおよびＧＡＰＤＩ
Ｉターミネータを。

ｐＢＲΔＲＩ−Ｓａｌにクローン化された形で含んでい
る。

このＡＤＨ２−ＧＡＰＤＨプロモータ（本発明に適切で
ある唯一の配列）は、　ｐＪｓＩ０３　（後述）から、
　１．ｌｋｄの［１ａｍＨＩ−Ｎｃｏ　Ｉ断片として単
離された。さらに、約９０ｂｐのＸｂａｌ−Ｘｂａｌの
削除部分をプロモータ断片の５“末端に導入し、　　ｐ
ＡＧΔＸｂａＧＡＰｌを得た。これは。

このプラスミドをＸｂａｌで切断し、突出部分をクレノ
ー断片とｄＮＴＰとで充填し、このプラスミドを再び環
状とすることによりなされた。

ｐＨＧ１０Ｏ−ＴＮＦは、α因子プロモータ、リーダー
。

およびターミネータを、　ＴＮＦをコードする遺伝子と
ともに有する。このＴＮＦをコードする遺伝子は。

リーディングフレーム内のリーダーの３°末端に挿入さ
れている。このプラスミドから単離された１、０ｋｂｐ
のＰｓｔｌ−Ｂａｍｌｌｌ断片は、α因子リーダーの３
゛末端の２４０ｂｐ　、合成ＴＮＦ遺伝子（珈Ｉ−Σａ
ｌＩ断片として）の４９４ｂρおよびα因子ターミネー
タの２７２ｂｐを含む。本発明に適切な唯一の配列であ
るα因子の配列は、　ｐＡ８１１４由来である。ｐＡＢ
１１４は、　ＥＰＯ０１１６２０１、１４〜１８頁、お
よびＢｒａｋｅ、　Ａ、Ｊ、ら、　ＰｒｏｃＮａｔｌ　
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳ＾（１９８４）　、８１：４
６４２−４６４６に記載されている。唯一の相違は、リ
ーダーの３”末端にＸｂａＩ部位を作り出すために、ｉ
１３変異誘発により。

サイレント変異を導入し、異種遺伝子のクローニングを
容易にしたことである。

野性型（ｐＡＢｌ１４）由来のα因子リーダーの３゛末
端と、変化したα因子（ρｌｌＧ１００）との比較（下
記）により１次のことが示される。つまり、サイレント
変異が、プロセッシング部位（ＬｙｓＡｒｇ）のちょう
ど５”側のＸｂａ　１部位をコードするように導入され
たことが示される。このことにより、「スペーサ」コド
ン（このスペーサコドンは、　ＬｙｓＡｒｇプロセッシ
ングサイトを与え、そしてリーディングフレームを維持
しなければならない）を持たない異種遺伝子が挿入でき
るようになる。

（以下余白） α因子リーダー　　　　　　　　　ブＵセフシング部（
イα因子リーダー　　　　　　　　　ブ■セフシング部
イダｔ　　　　スペーサー　　α因子遺伝子７−　　　
　ＩＬ−２遺伝子 ジ胆月Ｕ プラスミドｐＪｓ１０３は誘導可能なハイブリッドＡＤ
Ｈ２−Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１１プロモータを有する。この
ハイブリッドプロモータはＧＡＰＤ１１プロモータ由来
の転写および翻訳開始領域から作られており、　ＭＤ１
１２転写調節領域の調節制御下にある。　ＭＤＩ＋２転
写調節領域は、グルコースのような容易に利用しうる材
料が存在しないと（外因性の誘導物質なしで）抑制を解
かれる。

酵母培養物が増殖して高密度となった後にグルコースを
枯渇させることにより、転写の制御領域の抑制が解かれ
、所望のペプチドの発現が起こる。

プラスミドｐＪｓ１０３は以下のように構築された。

プロモータのＭＤＩ＋２部分は、プラスミドｐＡＤＲ２
由来の天然型ＡＤＨ２遺伝子を有するプラスミド（Ｂｅ
ｉｅｒら。

Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）３００ニア２４−７２８）を
制限酵素ＥｃｏＲＶで切断することにより構築した。こ
の制限酵素ＨｃｏＲＶは、　　ＡＴＧ開始コドンに関す
る＋６６の位置およびＡＤＨ２領域外のｐＡＤＲ２にお
ける他の２つの部位を切断する。得られたベクター断片
と２つの小断片との混合物は、　　Ｂａ１３１エキソヌ
クレアーゼでさらに切断し、約３００ｂｐを除去した。

合成Ｘｈｏｌ　リンカ−は。

」虹３１処理したＤＮＡに連結させた。得られたＤＮＡ
リンカ−ベクター断片（約５ｋｂ）は、カラムクロマト
グラフィーによりリンカ−から分離し、制限酵素Ｘｈｏ
ｌで切断し、再連結させ、そしてＥ、　ｃｏｌｉを形質
転換してアンピシリン耐性とするのに用いた。Ｘｈｏｌ
　リンカ−の位置は、　　ＤＮＡ配列決定により調べた
。ＡＤＨ２遺伝子の５゛非翻訳領域（ＡＴＧから−２３
２までの位置）内にあるＸｈｏＩ　リンカ−を有する１
つのプラスミドを、ヌクレアーゼＳ１で処理し。

次いで制限酵素ＥｃｏＲＩで処理してリンカ−ベクター
分子を作製した。この分子はＸｈｏｌ　リンカ一部位に
１つの平滑末端を有し、かつＥｃｏＲＩ末端を有する。

プロモーターのＧＡＰ部分は、制限酵素Ｂａｍ１ｌＩお
よびＥｃｏＲＩで切断し１次いで０．４ｋｂｐ　ＤＮＡ
断片を単離することにより構築した。その後、この精製
した断片を酵素Ａｌｕｌで完全分解し、約２００ｂｐ断
片を単離した。

このＧＡＰプロモーター断片を上述のリンカ−ベクター
に存在するＡＤＨ２断片に連結し、プラスミドｐＪｓ１
０３を得た。

ｙ瓜Ｍ刹 ｐｒ’ＧＡｌ’ｌは酵母発現カセットベクターであり、
　ＧＡＰＤＩ＋ターミネータと切断されたＧＡＰＤＨプ
ロモータ領域との間に複数の制限部位を持つリンカ−を
有する。

この複数の制限部位は、　　Ｎｅｏ　Ｉ、　　ＥｃｏＲ
Ｉ、およびＳａｌ　Ｉの認識部位を有し、１旧断片とし
てカセットを切断し得る。ｐＰＧＡＰＩの調製は、　Ｅ
ＰＯ０１６４５５６およびＴｒａｖｉｓ、　Ｊ、ら、　
Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩｌｌ（１９８５）　２６０　（
７）：４３８４−４３８９に記載されている。この両方
の参照文献においては、　ｐＰＧＡＰｌはｐＰＧＡＰと
呼ばれている。

ｄｆｉ虹 ｐＡＢ２４は酵母シャトルベクターであり、完全な２μ
配列（Ｂｒｏａｃｈ　　ｒ酵母サツカロミセスの分子生
物学Ｊ　、　１：４４５．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８１））およびρＢＲ
３２２配列を有する。このベクターは、また、プラスミ
ドＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、　Ｇｅｎｅ（１９
７９）　８　：１７）由来の酵母ＵＲＡ３遺伝子および
プラスミドＰｃｔ／１由来の酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子（欧
州特許出願第１１６２０１号公報に記！３りを有する。

発現カセットはｐＢＲ３２２のＢａｍ８１部位に挿入さ
れ、これによって細菌のテトラサイタリン耐性の遺伝子
を妨害する。

３．２．　　　に番る ＰＤＧＦ　Ｂ鎖タンパク、およびＡｔＪ（タンパクの２
つの形（ＤＩおよび１３．１）はそれぞれ、　ｐＡＢ２
４−ＡＧＭｅｔｌ’ＤＧＦ−３Ｂ、　ｐＡＢ２４−ＡＧ
ＭｅｔＰＤＧＦ−ＡＤＩ、およびｐＡＢ２４−ＡＧＭｅ
ｔＰＤＧＦ−＾１３．１で形質転換された酵母５Ｌｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＢ１１０株の細胞内で生産され得
る。このプラスミドは、それぞれその成熟ＰＤＧＦタン
パクをコードする配列を含み、その配列にはアミノ末端
にメチオニンが付加されており、それにより直接の発現
が可能となる。成熟ＰＤＧＦ遺伝子の発現は、調節可能
なプロモータへ〇　Ｉ＋　２−　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１１
およびＧＡＰＤ■ターミネータの制御下にある。

成熟Ｂ鎖を酵母内で発現させるために、プラスミドｐＡ
ＧＳＢ−４（＠３．１．１）を」■■で分解し２次に８
１ヌクレアーゼで処理し、５′の突出部分を除去し。

平滑末端とする。次の配列を存在するリンカ−；（これ
はＢｇｌＩＩ突出部分および開始コドンを含み。

成７ＱｐｏａＦＢ鎖の第１アミノ酸であるセリンをコー
ドするコドンを再生成する）をｐＡＧＳＢ４に連結し。

次に、このプラスミドを１■と５ａｉｌ　とで分解する
。３４５ｂｐの里ＩＩ　　５ａｉｌ断片をゲルから単離
し。

そして、ＢｇｌｌｌおよびＸｈｏＩで分解したｐＲｓＰ
ｌｏｌに連結し、プラスミドｐＡＲ２４−八ＧＭｅｔＰ
ＤＧＦ−ＳＢを生じさせる。

プラスミドｐＲ５ｒ’ｌｏ１は、調節可能なＡＤＩ１２
−ＧＡｒ’ＤＨプロモータとＧＡＰＤＨターミネータと
を含む酵母発現ベクターであり、　ｐＡＢ２４とｐＲ５
１００とに由来する。

プラスミドｐＲｓＰ１００を、　ｐＲｓｌｏｏの徊旧カ
セットを切り出し、それをｐＡＢ２４　（あらかじめＢ
ａｍ旧で分解し、ホスファターゼで処理を行ったもの）
に連結することにより構築した。次に、中間体ベクター
をＮｃｏｌ　と５ａｌｌ　とで分解し、プロモータとタ
ーミネータとの間の断片を除き、そして次にＳｔヌクレ
アーゼで処理し、１本鎖突出部分を除去し平滑末端とし
た。次の配列のリンカー： を１次に連結し、唯一の地Ｂ■およびＸｈｏ１部位を付
加した。プラスミドｐＢｓ１００は、　ｐＢＲ３２２の
誘導体であるｐＡＩ１１２にクローン化された酵母発現
カセットベクターである。この発現カセットは、バイブ
’）　ッＦＡＤｌ１２−ＧＡＰＤＩＩプロモータと、　
ＨＩＶ外殻タンパク遺伝子由来の遺伝子部分に隣接する
ＧＡｒ’ＤＨターミネータとを含む。ＡＤＩ２−ＧＡＰ
ＤＨプロモータは、　ｐＪｓ１０３（口３．１．４）か
ら単離された１　、　２００ｂｐの坦頃ｌｌｌ一連通Ｉ
断片であり、　ＧＡＰＤＩＩターミネータは、プラスミ
ドｐＰＧＡＰ１　（倍３．１．４）から単離された９ｏ
ｏｂｐの影佳Ｉ−町復旧断片である。プラスミドｐＢｓ
１００はまた。連通Ｉと５ａｉｌ部位との間に必須では
ない断片を含み、この断片は挿入を目的とする遺伝子断
片により置換される。この発現カセットはＲａｍ旧分解
によりｐＲ５１００から除去され、そして、酵母細胞へ
導入するために酵母シャトルベクターにクローン化され
得る。

プラスミドｐＡＢ１２はｐＢＲ３２２の誘導体であり、
単一の１ｌｉｎｄＩ［および５ａｉｌ部位の間の領域を
欠失し。

唯一のＥｃｏＲＩ部位に石旧リンカ−が挿入されている
。このベクターは、　ｐＢＲ３２２をＨｉｎｄｌｌ［と
ΣａｌＩとで完全分解し１次いでＢａ１３１ヌクレアー
ゼで限定分解し、生じた末端をＥ、　ｃｏｌｔ　　ＤＮ
Ａポリポリーゼ■のクレノー断片で修復し、　Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼで平滑末端連結し、閉じた共有環を再形成
することにより構築した。このプラスミドを１次に、　
　ＥｃｏＲＩで開環し、　Ｅ、ｃｏｌｔ　　ＤＮＡポリ
ポリーゼＩのクレノー断片で処理して５”の突出部分を
充填し、平滑末端をＢａｍＨＩリンカ−で連結し、ル徂
旧で分解し、過剰のリンカ−を除去し、そして次に連結
し、閉じた環を形成させる。

フタ− 成熟１’ＤＧＦの４鎖の２種を酵母内で発現させるべく
クローン化するために、内部細菌発現ベクターｐｓＯＤ
−Ｍｅｔｈｌ’ＤＧＦ−ＡＤＩおよびｐｓＯＤ−Ｍｅｔ
ｈＰＤＧＦ−Ａ１３．１　（６４，２）から単離された
半合成Ｎｃｏｌ　−Ｈｌｎｄ　ＤＩ断片を単離した。こ
れらの断片は、翻訳開始コドンΔＴＧと、それに続く成
熟ＰＤＧＦ　ＡＲ１遺伝子および３”未翻訳領域を有す
る。Ｄｌおよび１３．１をそれぞれコードする約６１３
ｂｐおよび５４４ｂｐの違遼■−坦ｎｄＩ［［断片は。

それぞれ、　ｐＢｓｌｏｏ　（あらかじめＮｃｏｌおよ
び１ＩｉｎｄＩ［（により分解されている）に連結され
（この断片は。

ターミネータ領域の５゛末端分に挿入される）、その結
果、それぞれ、プラスミドｐＡＧＭｅｔＰＤＧＦ−ＡＤ
ＩおよびｐＡＧＭｅｔＰＤＧＦ−Ａｌ３．１が生じる。

ＡＤＩ２−ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモータ、成熟Ｐ
ＤＧＦ　Ａｌｌ遺伝子およびＧＡＰＤＨターミネータを
有する発現カセットは、拘但旧断片として切り出され、
そして、あらかじめＢａｍＨＩで分解されたｐＡＢ２４
に連結され、そしてホスファターゼ処理されて、プラス
ミドｐＡＢ２４八Ｇ１１ｅｔＰＤＧＦ−ＡＤＩおよびｐ
ＡＢ２４　ＡＧＭｅｔＰＤＧＦ−Ａ１３．１を生じる。

３、２．３．　　　のノ　−　および ＭｅｔＰＤＧＦ　Ｂ鎖、および４鎖の２つの形を含む酵
母発現プラスミド、　ｐＡＢ２４−八ＧＭｅｔＰＤＧＦ
−ＳＲ，ｐＡＢ２４−＾ＧＭｅｔＰＤＧＦ−八Ｄ１およ
びｐＡＢへ４−ＡＧＭｅｔＰＤＧＦ−Ａｌ３．１で。

それぞれ、酵母Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＢＩ
ＩＯ株（ｌｊ３．１゜３で説明）を形質転換した。

３．３．ＳＯＤ融合体としての内部発現３、　　３．　
　１．　　　八Ｂ２４−ＡＧｈＳＯＤ−ｈＰＤＧＦの　
　　ｉ　　：　　５ＯＤ−ＰＤＧＦ上述のプラスミドを
調製するために、成熟ＰＤＧＦＢ鎖をコードする地ＬＬ
ＩＩ−３ａｉｌ断片をｐＹｐＮＢ４から切り出す。以下
のリンカ−を５′末端に連結する：このリンカ−はＫｅ
ｘ２プロテアーゼのｌｙｓ　ａｒｇ　開裂部位を含み、
ヒト　スーパーオキシドジスムターゼ（ｈｓＯＤ）およ
びＰＤＧＦ　Ｂ鎖を分離し得る。この［１ｃｏＲＩ　−
影け■断片を次に、　ＥｃｏＲＩと５ａｌｔ　とで分解
しホスファターゼ処理したｐｓＩ４　（ヨーロッパ特許
出願第８６１０４０６６．５号、公開番号第０１９６０
５６号に記！ｉ１）にクローン化する。次にＢａｍ旧カ
上カセツトり出し。

ＢａｍＨＩで分解しホスファターゼ処理したｐＡＢ２４
にサブクローン化する。

上記プラスミドを調製するために、成熟ＰＤＧＦ　Ａｌ
Ｍ　Ｄ　Ｉおよび１３．１型のＮ末端アミノ酸の１０２
および８７を含む５ａｉｌ断片を単離する。それらをリ
ンカ−に連結する。このリンカ−によりＰＤＧＦ　Ａ鎖
の最初の２３アミノ酸が復帰し、　ＳＯＯとＰＤＧＦと
の間にｌｙｓａｒｇ　（Ｋｅｘ２）開裂部位が導入され
、そして５゛末端にＥｃｏＲＩ制限部位が導入される。

このＥｃｏＲＩ−Ｓ５佳■断片（それぞれクローン１３
．１およびＤｌに対応する３５５および３９２ｂｐ）を
次に、均遼旧と５ａｌｌとで分解しホスファターゼ処理
したｐＳＩ４に連結する。Ｂａｍ１ｌＩカセツトを切り
出し、　Ｂａｍ１ｌｌで分解しホスファターゼ処理した
ｐＡＢ２４にサブクローン化する。

（以下余白） ４、Ｌ−四月１４啜 Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるＰＤＧＦの発現を安定化するた
めに、　ｐｏｃｐに対する遺伝子を、　Ｈ，ｃｏｌｔに
おいて安定かつ高レベルで発現するｈｓＯＤ配列の３”
に連結した。成熟ＰＤＧＦのＡ鎖（ＤＩおよび１３．１
の形）およびＢ鎖に対する遺伝子をクローン化するため
に、成熟ポリペプチドをコードするＤＮ八へ列を、５゛
末端にＮｃｏ１部位を有するように修飾した。この修飾
は。

読み枠におけるメチオニン開始コドンを残りのコード配
列に生じさせた。

ＰＤＧＦ　Ｂ鎖に対する全コード領域は、５”末端をＸ
ｂａ　Ｔ部位の代わりにＮｃｏ１部位としたこと以外は
前述（６３，１，１）のようにして合成した。３５０ｂ
ｐのＮｃｏｌ　−灸杜Ｉ　ＰＤＧＦ　Ｂ断片をｐｓＯＤ
ｃＦ２　（前もって連速Ｉおよび５ａｉｌで分解し、ゲ
ルにより単離した）に連結し。

プラスミドｐｓＯＤ−ＭｅｔｈＰＤＧＦ−ＳＢを得た。

ｐｓＯＤｃＦ２はＴａｃｔプロモータ（ハイブリッドｔ
ｒｐ−１ａｃプロモータ）を有するＥ、　ｃｏｌｉ発現
ベクターであり。

該プロモータの次にｈｓＯＤ遺伝子のｃＤＮＡコピーお
よびポリリンカー（融合したＣ００ＩＩ末端をクローニ
ングするためのもの）がｐＢＲ３２２にクローン化され
ている。ｐｓＯＤｃＦ２は、　Ｓｔｅｉｍｅｒ、　Ｋ、
Ｓ、　　ら、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ（１９８６）皿：９−１
６に記載されている。

２つの形の成熟ＰＤＧＦ　Ａ鎖をＥ、　ｃｏｌｉで発現
するようにクローン化するために、最初の６９ヌクレオ
チドを、５″末端にＮｃｏ１部位およびメチオニンのコ
ードを有し、３″末端に５ａｉｌ部位を有するように合
成した。この断片を、クローン１３−１からの約４７５
ｂｐＳａｌＩ−坦ｎｄｎｌ断片およびクローンＤ１から
の約５４５ｂｐＳａｌＩ−ｔｌｉｎｄ　ＩＩ［断片のそ
れぞれに連結した。

得られた両方のＡ鎖に対する半合成遺伝子をＮｃｏ　１
−ＨｉｎｄＩ［［断片としてｐｂａＦＧＦｐｉｘ　　（
前もってＮｃｏ　ＩおよびＨｉｎｄｌ［［で分解した）
にクローン化し、ゲル分離してｐｓＯＤ−ＭｅｔｈＰＤ
ＧＦ−ＡＤＩおよびｐＳＯＤ−ＭｅｔｈＰＤＧＦ−＾１
３．ｌのそれぞれを得た。

プラスミドｐｂａＦＧＦｐ＋ｘは線維芽細胞成長因子（
ＦＧＦ）をコードする４３６ｂｐのＮｃｏ　Ｉ　−灸け
Ｉ断片を有するプラスミドｐｓＯＤｃＩ’２であり、　
ＦＧＦ配列内に則ｎｄｌＩＩ部位が存在するので便利で
あるためにこれを使用した。ＰＤＧＦの翻訳停止コドン
が存在し、この存在は配列で証拠づけられている。

４．３．虹匹１Ｌ上脛ｌ転換旦圭グ発■Ｅ、　ｃｏｌｉ
発現プラスミドであるｐＳＯＤ−ＭｅｔｈＰＤＧＦ−Ａ
ＤＩ、　ｐｓＯＤ−ＭｅｔｈＰＤＧＦ−Ａ１３．１．お
よびｐＳＯＤ−ＭｅｔｈＰＤＧＦ−３ＢをＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＲＲΔＭ１５株に導入して形質転換を行った。個々
のコロニーは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
するし一肉汁培地で増殖させ、　ｌｌａｌｌｅｗｅｌｌ
。

Ｒ，Ａ、ら、　Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５（１９８５
）　１３：２０１７−２０３４に記載されているように
して発現を誘導した。このＥ、　ｃｏｌｉの抽出物をＰ
ＤＧＦ活性について分析した。１３．１形の直接の発現
について予期された大きさのタンパクが検出されたが、
活性は検出されなかった。

本工程で用いたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ｃ）
ｔｏ）は１通常、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補っ
た培地で増殖させた。この培地は、　ＦＣ３中に存在す
る天然のウシＰＤＧＦによってもたらされるバックグラ
ウンドのために、　ＰＤＧＦを分析する際に問題を提示
する。このように９組換え体止産物の産生を維持すると
同時にバックグラウンドを減少させるように、培養条件
を工夫する必要があった。ヒトβ−インターフェロン遺
伝子を用いて形質転換させたＣ１１０細胞を用いて、１
０％ＦＣＳで観察されたレベルの約５０％に達する発現
レベルが、５％血小板除去ウマ血漿（ＰＤＨ５）を補っ
た培養培地で見い出された。この培地は、細胞培養かま
たはマイトジェン分析のいずれかにおいて添加した場合
、バックグラウンドを生じない。

ＣＨＯ形質転換体の分析は、５％ＰＤＩＩＳで採取され
る２４時間上清液（希釈が必要な場合には９通常。

２倍および３倍の希釈系列で用いる）の１０μ！を分析
用の９６ウエルプレートのウェルに添加することにより
行った。

５．２　　　で　　されたＰＤＧＦ ＰＤＧＦが発現された酵母の上清試料を１期待する活性
となるように適当に希釈し３次いで１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ　）を含有するＤＭＥＭで連続的に希釈し
た。各希釈液の一定量（１０μりを分析用プレートのウ
ェルに分注した。

ＪＩＦＦ株は凍結保存し、凍結は１３代目を用いて行っ
た。使用に先立ってｌｌＦＦを解凍し、Ｔ７５フラスコ
にて集密となるまで１通常５〜７日間増殖させた。増殖
培地は、ダルベツコの改変イーグル培地（Ｄ肝Ｍ）、２
％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）　、　１　ｍＭピルビン酸ナ
トリウム、３００μｇ／ｙｊ！　Ｌ−グルタミン、　１
０００／雁ペニシリン、および１００μｇ７ｍｌストレ
プトマイシンを含有した。細胞は、加湿した７％ＣＯ□
および９３％空気雰囲気下で３７°Ｃにてインキュベー
トした。集密となった細胞をＣａ”＋およびＭｇ”＋を
除いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で単層を洗浄し
。

ＥＤＴＡを含有するトリプシンで該細胞を解離させ。

そして増殖培地で該細胞を希釈することにより継代した
。細胞は、解凍後８回程度しか継代しなかった。

ＰＤＧＦについて分析するために、　　ＪＩＦＦを以下
のようにプレートした。細胞を、上述のようにトリプシ
ンで洗浄して解離させた。このｌ−リプシン処理した細
胞を沈殿として回収し、増殖培地と同様の培地（２０％
ＦＢＳの代わりに５％ＦＢＳを使用）に１×１０ｓ個細
胞／　ｍｌの濃度で再懸濁した。この懸濁液１００　μ
ｌを９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウェル
に分注し、上述の条件下で５〜６日間インキュベートし
た。

試料中のＰＤＧＦは、　ＰＤＧＩ？で刺激した）ＩＦＦ
　ＤＮＡに取り込まれた３１１−チミジンをモニターす
ることにより測定した。ＨＦＦ単層を入れたウェルに試
料を添加し２分析プレートを上述のように１８時間イン
キュベートした。次いで、　　ＲＦＰ培養物を、　〔メ
チル３１１〕標識チミジン（終濃度１０μｃ／ｍＮ、　
　１　μｃ／ウェル）でパルス標識した。この標識は、
上述のインキュベーション条件下で３７°Ｃにて８時間
行った。

インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、固定化
を行った。固定化は、細胞を５％トリクロ口酢酸（ＴＣ
Ａ）と共にインキュベートし２次いで１００％メタノー
ルで１５分間インキュベートすることにより行い、その
後空気中での乾燥を行った。次いで、この細胞を０．３
Ｎ　ＮａＯＨで溶解し、液体シンチレーションカウンタ
ーでカウントした。

対照の試料は、試料と同様に上述のように処理し、以下
のように調製した。陽性の対照については、　ＰＤＧＦ
社から購入したＰＤＧＦを、　１０■／ｉｊ！ＢＳＡを
含有するＤＭＥＭに１１００ｎ　／ｍｌの終濃度で溶解
させた。

検量線を、最初の点が１０ｎｇ／ｄであり、残りの点が
倍々希釈系列であるように作製した。各希釈液は３連で
試験した。陰性の対照（試料およびＰＤＧＦ対照の両方
を欠く）を、同様に操作した。

本発明を実施するための上述の様式を、関連する技術分
野の当業者に明らかであるように改変することは、特許
請求の範囲内にある。

（以下余白） （発明の要約） ２つの形のＰＤＧＦ　Ａ鎖ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ　；酵母および哺乳動物の細胞において、該ＤＮＡ
を発現させる発現ベクターを構築すること；そして酵母
および哺乳動物の細胞において、該ＤＮＡを発現させる
ことにより、活性なＰＤＧＦ　Ａ鎖ホモダイマーおよび
活性なＰＤＧＰ　Ａ鎖／Ｂ鎖へテロダイマーを生産する
ことが開示されている。

４、　°　　の　　　な舌゛Ｈ 第１図はＰＤＧＦ　Ａ鎖前駆体の第１の形（Ｄｉと表す
）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図
；第２図はＰＤＧＦ　Ａ鎖前駆体の第２の形（１３−１
と表す）のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を
示す図；第３図は実施例で述べたプラスミＦ　ｐＳＶ７
ｄ−ＰＤＧＦ−Ａ１０２（１３−１）の図；第４図は実
施例で述ヘタ７’　ラスミＦ　ｐｓＶ７Ｄ−ＰＤＧＦ−
八１０３（ＤＩ）の図；第５図は実施例で述べたキメラ
プラスミドｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ　Ａ１０２−Ｂｌの構
築を表す模式図；第６図は実施例で述べたキメラプラス
ミドｐＳＶ７ｄ−ＰＤＧＦ　Ａ１０３−Ｂｌの構築を表
す模式図；第７図は実施例で述べたプラスミドｐＳＶ７
ｄを構築するのに用いたＳν４０領域のヌクレオチド配
列を示す図；第８図は実施例で述べたプラスミドｐＳＶ
７ｄの制限酵素切断地図；第９図は実施例（ＩＡ３．１
．２）で述べたプラスミドｐＹｐＡ６の制限酵素切断地
図；第１Ｏ図は実施例（Ｉ１３．１．２）で述べたプラ
スミドｐＹｐＡ１３４の制限酵素切断地図；第１１図は
実施例（ｆｉ　３．２．２）で述べたプラスミドｐＡＢ
２４−八ＧＭｅｔＰＤＧＦＡＤ１／ＡＩ３．１の制限酵
素切断地図；第１２図は実施例（＠３．３．２）で述べ
たプラスミドｐＡＢ２４−ＡＧｈＳＯＤｈＰＤＧＦＡＤ
１／ＡＩ３．１の制限酵素切断地図；第１３図は実施例
（ｆｉ　４．２）で述べたプラスミドｐｓＯＤ−Ｍｅｔ
ｈＰＤＧＦｒ１３．１の制限酵素切断地図；第１４図は
実施例（６４，２）で述べたプラスミドρＳｏｎ−Ｍｅ
ｔｈＰＤＧＦＡＤ１の制限酵素切断地図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペプ
   チドをコードする組換えＤＮＡ配列を含み、かつ該ＤＮ
   Ａ配列を発現させるのに有効な組換え発現ベクター。 ２、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペプ
   チドをコードする組換えＤＮＡ配列を含み、かつ該ＤＮ
   Ａ配列を発現させるのに有効な組換え発現ベクターであ
   って、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図に示される番号
   ８７から１９３までのアミノ酸配列を含む、組換え発現
   ベクター。 ３、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペプ
   チドをコードする組換えＤＮＡ配列を含み、かつ該ＤＮ
   Ａ配列を発現させるのに有効な組換え発現ベクターであ
   って、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図または第２図に
   示される番号８７から１９６までのアミノ酸配列を含む
   、組換え発現ベクター。 ４、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペプ
   チドをコードする組換えＤＮＡ配列を含み、かつ該ＤＮ
   Ａ配列を発現させるのに有効な組換え発現ベクターであ
   って、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図に示される番号
   ８７から２１１までのアミノ酸配列を含む、組換え発現
   ベクター。 ５、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖前駆体ポ
   リペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列を含み、かつ
   該ＤＮＡ配列を発現させるのに有効な組換え発現ベクタ
   ーであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖前駆体ポリペプチドが、第１図または第
   ２図に示される番号１から１９６までのアミノ酸配列を
   含む、組換え発現ベクター。 ６、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖前駆体ポ
   リペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列を含み、かつ
   該ＤＮＡ配列を発現させるのに有効な組換え発現ベクタ
   ーであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖前駆体ポリペプチドが、第１図に示され
   る番号１から２１１までのアミノ酸配列を含む、組換え
   発現ベクター。 ７、（ａ）ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポ
   リペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列と、（ｂ）Ｐ
   ＤＧＦＢ鎖をコードするＤＮＡ配列と、を含み、これら
   ＤＮＡ配列を発現するのに有効な発現ベクター。 ８、前記ＤＮＡ配列が、酵母宿主に適合し得る制御配列
   に作動可能なように連結されている、特許請求の範囲第
   １項に記載の組換え発現ベクター。 ９、前記制御配列が、ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドから形
   成されるＰＤＧＦの分泌を制御する、特許請求の範囲第
   ８項に記載の組換え発現ベクター。 １０、前記ＤＮＡ配列が、哺乳動物宿主に適合し得る制
   御１配列に作動可能なように連結されている、特許請求
   の範囲第１項に記載の組換え発現ベクター。 １１、前記ＤＮＡ配列が、哺乳動物宿主に適合し得る制
   御配列に作動可能なように連結されている。 特許請求の範囲第７項に記載の組換え発現ベクター。 １２、特許請求の範囲第８項または第９項に記載の組換
   え発現ベクターで形質転換された酵母細胞。 １３、特許請求の範囲第１０項または第１１項に記載の
   組換え発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。 １４、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ｂ鎖をコー
   ドするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列を発現するのに
   有効な発現ベクターで形質転換された、特許請求の範囲
   第１３項に記載の哺乳動物細胞。 １５、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペ
   プチドを含む組換えＰＤＧＦの生産方法であって、特許
   請求の範囲第１２項に記載の酵母細胞を増殖させる工程
   を包含する、組換えＰＤＧＦの生産方法。 １６、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペ
   プチドを含む組換えＰＤＧＦの生産方法であって、特許
   請求の範囲第１３項または第１４項に記載の哺乳動物細
   胞を増殖させる工程を包含する、組換えＰＤＧＦの生産
   方法。 １７、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペ
   プチドを含む組換えＰＤＧＰであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図に示された番号
   ８７から１９３までのアミノ酸配列、または該配列に対
   して実質的に相同性を有しかつ機能的に等価な該配列の
   類似配列を含む、組換えＰＤＧＦ。 １８、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペ
   プチドを含む組換えＰＤＧＦであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、（ａ）第１図に示され
   た番号８７から１９６までのアミノ酸配列；（ｂ）第２
   図に示された番号８７から１９６までのアミノ酸配列；
   あるいは、（ｃ）該（ａ）または（ｂ）の配列に対して
   実質的に相同性を有しかつ機能的に等価な該（ａ）また
   は（ｂ）の配列の類似配列を含む、組換えＰＤＧＦ。 １９、ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖ポリペ
   プチドを含む組換えＰＤＧＦであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図に示された番号
   ８７から２１１までのアミノ酸配列、または該配列に対
   して実質的に相同性を有しかつ機能的に等価な該配列の
   類似配列を含む、組換えＰＤＧＦ。 ２０、（ａ）ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖
   ポリペプチドと、（ｂ）ＰＤＧＦＢ鎖と、を含む組換え
   ＰＤＧＦであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図に示された番号
   ８７から１９３までのアミノ酸配列、または該配列に対
   して実質的に相同性を有しかつ機能的に等価な該配列の
   類似配列を含む、組換えＰＤＧＦ。 ２１、（ａ）ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖
   ポリペプチドと、（ｂ）ＰＤＧＦＢ鎖と、を含む組換え
   ＰＤＧＦであって、 該ＰＤＧＦＡ鎖ポリペプチドが、第１図または第２図に
   示された番号８７から１９６までのアミノ酸配列、また
   は該配列に対して実質的に相同性を有しかつ機能的に等
   価な該配列の類似配列を含む、組換えＰＤＧＦ。 ２２、創傷に対し局所施用するための薬剤組成物であっ
   て、 特許請求の範囲第１７項、第１８項、第１９項、第２０
   項、または第２１項に記載の組換えＰＤＧＦの有効量を
   、担体または賦形剤と混合した形で含有する薬剤組成物
   。