DE3855504T2 - Rekombinante Herstellung von A-Ketten-Polypeptiden von PDGF - Google Patents

Rekombinante Herstellung von A-Ketten-Polypeptiden von PDGF

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Timothy J Knott
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft die Gebiete der Biochemie, der Mölekularbiologie und der Gentechnik. Insbesondere betrifft sie rekombinante Vektoren zum Clonieren und Exprimieren von Genen der A-Kettenpolypeptide und Vorläuferpolypeptide des humanen Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktors (PDGF) (human platelet-derived growth factor) in Hefe und Verfahren zu Gewinnen rekombinanter PDGF-A-Kettenpolypeptide in Hefe.
    • Hintergrund
  • PDGF ist das Hauptmitogen im Serum für Mesenchym-abgeleitete Zellen. PDGF wird in Blutplättchen-α-Granula gespeichert und lokal während der Blutplättchenaktivierung freigesetzt, wenn Blutgefäße verletzt werden. PDGF ist ein potenter Chemolockstoff für Monocyten und Neutrophile und für Fibroplasten und glatte Muskelzellen. Diese Wirkungen machen PDGF zu einem wichtigen Bestandteil der Gewebsreparaturprozesse.
  • Gereinigter nativer PDGF ist ein Glycoprotein von ungefähr 30.000 Dalton und besteht aus zwei Disulfid-verbrückten Ketten. Es existieren zwei Typen von Ketten, die mit A und B bezeichnet werden. Ob nativer PDGF ein Heterodimer, ein Gemisch von Homodimeren oder ein Gemisch eines Heterodimers und eines Homodimers ist, ist nicht bekannt, aber die Dimerenstruktur ist funktionell wichtig, da Reduction die biologische Aktivität von PDGF irreversibel zerstört.
  • Die B-Kette wird durch proteolytische Prozessierung eines Vorläufers mit 241 Aminosäuren erhalten. Der B-Kettenvorläufer wird von dem c- sis-Gen codiert, dem zellulären Gegenstück des transformierenden v-sis- Gens des Affensarcomvirus (SSV) (simian sarccma virus). Die für die B- Kette codierende cDNA wurde zuvor in Nature (1985) 316:748-750 berichtet. Zwischen der B-Kette und dem transformierenden v-sis-Protein gibt es Homologie. Die Clonierung und Expression des v-sis-Gens ist in EP-A- 85112852.0 (Veröffentlichtungs-Nr. 0177957) beschrieben Studien an v-sis deuten darauf hin, daß B-Ketten Homodimere eine mitogene Aktivität besitzen. Ebenso zeigte die Sequenzierung von Schweine-PDGF, daß er nur einen Kettentyp enthält, entsprechend der humanen B-Kette (EMBO J (1984) 3:2963-2967).
  • Johnsson, A., et al., EMBO J (1984) 3:921-928 beschreiben eine Teilaminosäuresequenz der PDGF-A-Kette. Siehe ebenso Nature (1983) 304: 35-39 und Science (1983) 221: 275-277. Heldin, C.H. et al., Nature (1986) 319: 511-514, beschreibt einen Osteosarcom-abgeleiteten Wachstumsfaktor (ODGF) (osteosarcoma-derived growth factor), der strukturell zu dem vermutlichen PDGF-A-Kettenhomodimer verwandt ist. Die Studien an PDGF legen nahe, daß das PDGF-A-Kettenhomodimer biologische Aktivität aufweist. Betsholz et al. besschreiben eine cDNA-Sequenz der humanen PDGF-A-Kette.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Herstellung von Vektoren zum Esprimieren von PDGF-A-Kettenpolypeptiden und der Expression des biologisch aktiven PDGF-A-Kettenproteins, wobei solche Expressionsvektoren verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher einen rekombinanten Hefeexpressionsvektor, umfassend:
  • (i) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die als 87 bis einschließlich 193 in Figur 1 numeriert ist;
  • (ii) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die als 87 bis einschließlich 196 in Figur 1 oder Figur 2 numeriert ist;
  • (iii) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die als 87 bis einschließlich 211 in Figur 1 numeriert ist;
  • (iv) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die als 1 bis einschließlich 196 in Figur 1 oder Figur 2 numeriert ist; oder
  • (v) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die als 1 bis einschließlich 211 in Figur 1 numeriert ist;
  • funtionell an einen Hefehybrid-ADH-GAPDH-Promotor geknüpft.
  • Transformierte Hefezellen, die einen solchen Expressionsvektor enthalten und zur Herstellung von biologisch aktiven (gemessen durch den in § 5 der Beispiele beschriebenen Assay) rekombinantem PDGF, bestehend aus PDGF-A-Kettenpolypeptiden, fähig sind, sind ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung.
  • Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven PDGF-A-Kettenproteinen, bei denen solche Wirte verwendet werden, sind noch ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung.
  • Rekombinantes PDGF aus PDGF-A-Kettenpolypeptid, erhalten durch Züchten von erfindungsgmäßen Hefezellen, ist ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Form des PDGF-A-Kettenvorläufers (als D1 bezeichnet).
  • Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer zweiten Form des PDGF-A-Kettenvorläufers (mit 13-1 bezeichnet).
  • Fig. 3 ist eine Karte des Plasmids pYpA6, beschrieben in den Beispielen (§ 3.1.2).
  • Fig. 4 zeigt die Karte des Plasmids pYpA134, beschrieben in den Beispielen (§ 3.1.2).
  • Fig. 5 ist die Karte des Plasmids pAB24AGMetPDGFAD1/A13.1, beschrieben in den Beispielen (§ 3.2.2).
  • Fig. 6 ist die Karte des Plasmids pAB24AGhSODhPDGFAD1/13.1, beschrieben in den Beispielen (§ 3.3.2).
    • Ausführungsformen der Erfindung 1. Definitionen
  • Der hierin verwendete Ausdruck "rekombinant" zum Charakterisieren von DNA, die für PDGF-A-Kettenpolypeptide codiert, bedeutet DNA genomischer, cDNA, semisynthetischer oder synthetischer Herkunft, die aufgrund ihrer Herkunft oder Manipulation (1) nichtassoziiert ist mit der ganzen oder einem Teil der DNA mit der sie in Natur assoziiert ist oder in Form einer Bank und/oder (2) gekoppelt an DNA an die sie in Natur nicht geknüpft ist.
  • Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z . B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus), das sich wie eine autonome Polynucleotidreplikationseinheit innerhalb einer Zelle verhält, d.h. zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig ist.
  • Ein "Vektor" ist ein Replikon, an das ein anderes Polynucleotidseginent angehängt ist, um die Replikation und/oder Expression des angehangten Segments zu bewirken. Ein "Expressionsvektor" betrifft einen Vektor, der zur autonomen Replikation oder Integration fähig ist und Kontrollsequenzen enthält, die die Transkription und Translation der PDGF-A-Ketten DNA in einem geeigneten Wirt lenkt.
  • Eine "Codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in ein Polypeptid transkribiert und/oder translatiert wird.
  • Eine "Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, die zum Binden von DNA-Polymerase und zur Initiierung der Transkription einer stromabwärts (d.h. in der 3'-Richtung) gerichteten codierenden Sequenz fähig ist.
  • Eine codierende Sequenz ist "unter der Kontrolle" der Promotorsequenz, wenn in einer Zelle die Transkription der codierenden Sequenz auf dem Binden von RNA-Polymerase an die Promotorsequenz resultiert die Translation der resultierenden mRNA führt dann zu dem von der codierenden Sequenz codierten Polypeptid.
  • "Funktionell verknüpft" betrifft eine Nebeneinanderstellung, wobei die Bestandteile so konfiguriert sind, daß sie ihre übliche Funktion ausüben. Daher sind Kontrollsequenzen, die funktionell an eine codierende Sequenz geknüpft sind, fähig zum Bewirken der Expression der codierenden Sequenz.
  • Die "Kontrollsequenzen" betreffen solche Sequenzen, die die Transkription und/oder Translation der codierenden Sequenz(en) kontrollieren, sie können Promotorsequenzen, Transkriptionsinitiierungs- und Terminierungssequenzen, und Translationsinitiierungs- und Terminierungssequenzen einschließen, sind aber nicht auf diese beschrankt. Zusätzlich betreffen "Kontrollsequenzen" Sequenzen, die das Prozessieren des Polypeptins, das innerhalb der codierenden Sequenz codiert ist, kontrollieren; diese können Sequenzen zur Kontrolle der Sekretion, der Proteasespaltung und der Glycosylierung des Polypeptids einschließen, sind aber nicht auf diese Sequenzen beschränkt.
  • "Transformation" ist die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle. Das exogene Polynucleotid kann als Plasmid enthalten sein oder kann alternativ in das Wirtsgenom integriert sein.
    • 2. Rekombinante PDGF-A-Ketten-DNA
  • Die erfindungsgemäße rekombinante PDGF-A-Ketten-DNA codiert mindestens für die Aminosäuren 87 bis 193 einschließlich der in Fig. 1 gezeigten umrandeten Aminosäuresequenz und für Analoge dieser Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog und funktionell äquivalent dazu sind. Der Ausdruck "im wesentlichen homolog" bedeutet, daß die Zahl der Aminosäureabweichungen (einschließlich Substitutionen und/oder Deletionen) in dieser Sequenz kleiner als etwa 10 ist, vorzugsweise kleiner als etwa 3. Der Ausdruck "funktionell äquivalent" bedeutet, daß die Sequenz des Analogen eine Kette definiert, die ein Protein mit den biologischen Aktivitäten von PDGF (gemessen durch den in § 5 der Beispiele beschriebenen Assay) produziert. Die DNA kann zusätzlich DNA einschließen, die für ein oder mehrere der Aminosäurereste 194 bis 196 codiert, einschließlich der umrandeten Sequenzen aus Fig. 1 oder 2, DNA die für eine oder mehrere der Aminosäurereste 197 bis 211 codiert, einschließlich der in Fig. 1 gezeigten umrandeten Sequenz und/oder DNA die für die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuren 1 bis 86 codiert, einschließlich der in Fig. 1 gezeigten umrandeten Aminmosäuresequenz. Eine bevorzugte DNA-Sequenz, die für die Aminosäuren 87 bis 193 codiert für die Expression in einem Säugetiersystem, ist die in Fig. 1 gezeigte DNA-Sequenz. Fur die Expression in anderen Organismen kann es wunschenswert sein, Sequenzen zu benutzen, die die von dem besonderen Wirt, in dem die DNA exprimiert wird, bevorzugten Codons verwenden.
  • Die rekombinante PDGF-A-Ketten-DNA kann genomische, cDNA oder synthetische DNA sein. Beispielsweise wurden die in den Fig. 1 und 2 gezeigten Sequenzen aus einer cDNA-Bank, die aus mRNA einer PDGF-produzierenden Zellinie gewonnen wurde, erhalten. Die Bank wurde mit zwei Sonden, deren Sequenzen auf der berichteten Teilaminosäuresequenz der PDGF-A-Kette beruhte, abgesucht. Clone, die an beide Sonden hybridisierten, lieferten die beschriebenen Sequenzen. Diese Sequenzen können zum Absuchen humaner genomischer Banken verwendet werden, um analoge genomische DNA die für PDGF-A-Kettenpolypeptide codieren, zu erhalten. Basierend auf der Aminosäuresequenz, die von den beschriebenen Sequenzen abgeleitet wurde, können in vitro synthetische Gene, die für PDGF-A-Kettenpolypeptide codieren, durch Synthetisieren individueller überlappender komolementärer Oligonucleotide und Einfullen von einzelsträngigen nichtüberlappenden Teilen unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart der Desoxyribonucleotid-Triphosphate gewonnen werden.
  • Die in Fig. 1 gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz weicht von der berichteten Teilaminosäuresequenz, die durch Aminosäuresequenzierung der PDGF-A-Kette erhalten wurde, an den Aminosäuren 119, 141 und 143 ab. Den berichteten Reste an diesen Positionen wurden Val, Arg bzw. Thr zugeordnet. Wie in Fig. 1 gezeigt, weist die PDGF-A-Ketten-cDNA anstelle dieser Reste Ile, Gln bzw. Ser auf.
    • 3. Clonierung der PDGF-A-Ketten-DNA
  • Die PDGF-A-Ketten-DNA kann in jedes geeignete Replikon cloniert werden, um einen Vektor zu erzeugen und kann dadurch in einer Zusammensetzung beibhalten werden, die nahezu frei ist an Vektoren, die das PDGF-A-Kettengen nicht enthalten (z.B. andere aus der Bank abgeleitete Clone). Zahlreiche Clonierungsvektoren sind einem Fachmann bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Clonierungsvektors ist eine Frage der Wahl. Beispiele für Vektoren zum Clonieren und Wirtszellen, die sie transformieren können, schließen den Bakteriophagen λ (E. coli), pBR 322 (E. coli), pACYC 177 (E. coli), pKT 230 (gram-negatives Bakterium), pGV1106 (gram-negatives Bakterium), pLAFR1 (gram-negatives Bakterium), pME290 (Nicht-E. coli gram-negatives Bakterium), pHV 14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Actinophage φ31 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) und Pinder-Papillomavirus (Säugetierzellen) mit ein.
    • 4. Expression der PDGF-A-Ketten-DNA
  • Die Polynucleotidsequenz, die für das PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, wird exprimiert durch Insertieren der Sequenz in ein geeignetes Replikon, wobei ein Expressionsvektor erzeugt wird, und Einschleusen des resultierenden Expressionsvektors in einen kompatiblen Wirt.
  • Durch Erzeugen eines Expressionsvektors wird die Sequenz, die für das PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, auf dem Vektor mit den geeigneten Kontrollsequenzen lokalisiert. Im Hinblick auf die Kontrollsequenzen wird die codierende Sequenz so positioniert und orientiert, daß die codierende Sequenz unter der Kontrolle der Kontrollsequenzen transkribiert wird: d.h. der Promotor kontrolliert die Transkription der aus der codierenden Sequenz abgeleiteten mRNA; und die Ribosomen binden an die ribosomalen Bindungsstellen, um den Translationsprozeß zu beginnen; und das Stopp- Codon, das zum Beenden der Translation verwendet wird, befindet sich stromaufwärts zum Transkriptionsterminatorcodon. Kontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren zur Synthese glycolytischer Enzyme ein (Hess et al., J. Adv Enzyme Reg (1968) 7:149; Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900). Zusätzliche Promotoren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, schließen den Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol Chem (1980) 255:2073) mit ein. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil haben, daß die Transkription durch die Wachstumsbedingungen und/oder den genetischen Hintergrund kontrolliert wird, sind die Promotorregionen der Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2), Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, das α-Faktorsystem und Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind. Es wird ebenso angenomen, daß sich die Terminationssequenzen zweckdienlicherweise an den 3'-Enden der codierenden Sequenzen befinden. Solche Terminatoren werden in den nichtübersetzten 3'-Regionen gefunden, die den codierenden Sequenzen in hefeabgeleiteten Genen folgen.
  • Zusätzlich zu den Kontrollsequenzen kann es zweckmäßig sein, regulatorische Sequenzen hinzuzufügen, die eine Regulation der Expression der PDGF-A-Kettengene relativ zum Wachstum der Wirtszelle erlauben. Beispiele regulatorischer Systeme sind solche, die bewirken, daß die Expression eines Gens an- oder abgeschaltet werden kann, in Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich der Gegenwart einer regulatorischen Verbindung. In eukaryotischen Systemem kann bei Metallothionin-Genen eine Induktion mit Schwermetallen und beim Mausemammatumorvirussystem (MMTV) mit Steroiden stattfinden. In diesen Fällen wird die für die PDGF-A-Kettenpolypeptide codierende Sequenz als Tandem mit dem regulatorischen Element angeordnet.
  • Ebenso gibt es selektive Elemente, die eine DNA-Amplifikation verursachen, die dann wiederum zu höheren Spiegeln der spezifischen Proteinproduktion führen. In eukaryotischen Systemen schließen diese das Dihydrofolat- Reduktasegen (dhfr), das in Gegenwart von Methotrexat amplifiziert wird, und Adneosindeaminase (ADA) in Gegenwart von Dexoycorfomycin mit ein. In diesen Fällen kann die für die PDGF-A-Kettenpolypeptide codierende Sequenz entweder auf dem gleichen Plasmid sein oder auch lediglich zusammen mit dem auswählbaren Element kotransfiziert werden, um die Integration in das Wirtszellgenom in unmittelbarer Nähe zueinander zu erlauben.
  • Andere Typen regulatofischer Elemente können ebenso in dem Vektor anwesend sein, d.h. solche, die nicht notwendigerweise als Tandem mit der für die PDGF-A-Kette codierenden Sequenz vorhanden sein mussen. Ein Beispiel ist die SV40-Enhancer-Sequenz, die durch ihre bloße Anwesenheit eine Verstärkung der Expression der distal zu ihr gelegenen Gene verursacht.
  • Eine Modifikation der für die PDGF-A-Kette codierenden Sequenz vor ihrer Insertion in das Replikon kann zweckdienlich oder notwendig sein, abhängig von gewählten Expressionssystem. Z.B. kann es in einigen Fällen notwendig sein, die Sequenz so zu modifizieren, daß sie in der geeigneten Orientierung an die Kontrollsequenzen angehängt werden kann, d.h. wobei das leseraster erhalten wird. In einigen Fällen kann es zweckdienlich sein, Sequenzen hinzuzufügen, die die Sekretion des Polypeptids aus dem Wirtsorganismus verursachen, wobei anschließend das Sekretionssignal abgespalten wird. Die Techniken zum Modifizieren von Nucleotidsequenzen durch donieren sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Sie schließen z.B. die Verwendung von Restriktionsenzymen, von Enzymen, wie Bal31, zum Entfernen von Überschußnucleotiden und von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, zur Verwendung als Adapter, zum Ersetzen verlorener Nucleotide und in der ortsspezifischen Mutagenese, ein.
  • Die auf geeignete Weise modifizierte Sequenz, die für das PDGF-A- Kettenpolypeptid codiert, kann vor der Insertion in einen Vektor mit den Kontrollsequenzen ligiert werden. Alternativ kann die codierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor cloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsspaltstelle enthält. Zur Expression des PDGF-A-Kettenpolypeptids in Hefe ist es notwendig, daß die Kontrollsequenzen heterolog zu der codierenden Sequenz sind.
  • Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Anwendung von Standardtechniken, die für solche Zellen geeignet sind, durchgeführt Transformationen in Hefe können nach dem Verfahren von Beggs, J.D., Nature (1978) 275:104-109 oder nach Hinnen, A. et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1978) 75:1929, durchgeführt werden.
  • Die transformierten Zellen werden dann unter Bedingungen, die die Expression des PDGF-A-Kettengens und den Zusammenbau des Expressionsprodukts zu einem biologisch aktiven PDGF (d.h. in eine dimere Form) erlauben, gezüchtet. Wie im nachfolgenden experimentellen Teil gezeigt, ergaben anfängliche Versuche, rekombinante PDGF-A-Kettenhomadiiere in Bakterien herzustellen, wenn überhaupt, nur wenig biologisch aktives PDGF. Dies kann an einer Reihe von Grunden liegen, wie z.B. unpassende Dimerenbildung oder unpassende Faltung. Zusätzlich zum Herstellen rekombinanter PDGF-A-Kettenhomodimere erlaubt die vorliegende Erfindung die Herstellung von Heterodimeren aus einer PDGF-A-Kette und einer PDGF-B-Kette durch Koexpression der Gene sowohl für die PDGF-A-Kette als auch die PDGF-B-Kette durch Verwenden getrennter Vektoren oder eines einzigen Vektors, der ein A-Kettengen und ein B-Kettengen enthält. Das so synthetisierte rekombinante PDGF-Protein wird dann aus den Wirts zellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem den PDGF in das Wachstumsmedium sekretiert, wird der PDGF direkt aus dem Medium isoliert. Wird der rekombinante PDGF nicht sekretiert, so wird er aus Zelllysaten isoliert. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und Gewinnungsverfahren liegen innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns. Im Hinblick auf die Reinigung, siehe z.B. EPA-Publikation Nr. 0177957 und Nature (1986) 319:511-514.
    • Verwendung und Verabreichung von rekombinantem PDGF
  • Erfindungsgemäß hergestellter rekombinanter PDGF wird im allgemeinen topisch auf Wunden angewendet, wie z.B. kutane, dermale, mukosale oder epitheliale Wunden von Vertebraten, insbesondere Säugetieren einschließlich des Menschen, gezähmten und landwirtschaftlichen Tieren, Sporttieren und Haustieren. Er kann zur Behandlung jedes Typs tiefer oder oberflächlicher Wunden verwendet werden einschließlich traumatischer Wunden, chirurgischer Wunden, thermischer oder chemischer Wunden (Verbrennungen), Strählungswunden und Geschwüren, wie z.B. dekubitale oder kutane Geschwüre, die durch vaskuläre, hämatologische und metabolische Krankheiten, Infektionen oder Neoplasmen hervorgerufen werden.
  • Der PDGF kann unter Verwendung zur Verfügung stehender Arzneimittelexcipientien und Trägern in Form einer Lotion, eines Sprays, eines Gels, einer Salbe oder in einer Dosierungsform mit kontrollierter oder verzögerter Freisetzung formuliert werden. Zusätzliche Bestandteile, wie andere Wachstumsfaktoren (FGF, CTAP-III, EGF, IGF-1, IGF-2, TGF-β, TGF-α), Puffer, Lokalanästhetika, Antibiotika, Gelatinierungsmittel und ähnliche, können in die Zubereitungsform eingeschlossen sein.
  • Fur die topische Verabreichung, die im Hinblick auf kutane läsionen die geeignetste ist, werden topische Standardformulierungen bzw. -zubereitungsformen angewendet unter Verwendung von z.B. PDGF in 0,1- bis 10%iger Konzentration. Die Konzentration der Zubereitungsform hängt naturlich von der Schwere der Wunde und der Natur des Patienten ab. Bei einigen Therapieplänen wird die Dosis mit der Zeit vermindert, um die Wahrscheinlichkeit des Vernarbens zu vermindern.
  • Zubereitungsformen von rekombinantem PDGF mit kontrollierter oder verzögerter Freisetzung werden durch Einschließen des PDGF im Träger oder Vehikeln, wie Liposomen, nichtresorbierbare semipermeable Polymere, wie Ethylen-Vinylacetatcopolymere und Hytrel -Copolymere, quellbaren Polymere, wie Hydrogele oder resorbierbare Polymere, wie Collagen, und gewisse Polysäuren oder Polyester, wie diejenigen, die zum Herstellen resorbierbarer Nahtmaterialien verwendet werden, hergestellt, um eine verzögerte Freisetzung des PDGFs an die Wunde über einen verlängerten Zeitraum von typischerweise einem Tag bis zu einer Woche bereitzustellen. Dieser Einschluß kann besonders zweckdienlich sein, falls der PDGF in einen Wundverband eingeschlossen wird. Der Mechanismus der PDGF-Freisetzung aus der Zubereitungsform kann durch Diffusion, Osmose, Auslaugen, Auflösen, Erosion oder Kombinationen davon erfolgen. In Zubereitungsformen mit verzögerter Freisetzung durch Diffusion löst sich der PDGF in und diffundiert durch den Träger oder das Vehikel, in dem es eingekapselt/dispergiert ist. In Auslaug- oder Auflösungszubereitungsformen wird das PDGF durch Körperflüssigkeiten aus dem Träger ausgelaugt. Die Konzentration des Polypeptids in der Zübereitungsform mit verzögerter Freisetzung ist normalerweise mindestens 1 µg/ml, üblicherweise zwischen 10 µg/ml und 10 mg/ml. In einigen Fällen kann es zweckdienlich sein, das Behandlungsmittel auf der betroffenen Fläche oder Wundstelle während der Heilungsdauer kontinulerlich zu erhalten. Dies kann durch eine Vielzahl stoßweiser Anwendungen des Behandlungsmittels oder durch Verabreichung des PDGFs über eine verzögerte Freisetzungsdosierungsform, wie die oben beschriebenen, erreicht werden. In dieser Hinsicht bedeutet der Ausdruck "kontinulerlich" eine tatsächlich kontinuierliche Verabreichung, wie sie durch solche verzögerte Freisetzungsdosierungsformen erreicht wird oder durch derartige wiederholte Anwendungen erreicht wird, die ein pharmakokinetisches Muster liefern, das das durch tatsächlich kontinuierliche Verabreichung erzielte nachahmt.
    • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele beschreiben desweiteren die Isolierung von DNA die für PDGF-A-Kettenpolypeptide codiert und die Expression dieser DNA in verschiedenen Wirten, um biologisch aktiven PDGF herzustellen.
  • Im folgenden bedeutet "Verdauung" die enzymatische Spaltung von DNA durch Restriktionsendonucleasen. Restriktionsendonucleasen, üblicherweise als Restriktionsenzyme bezeichnet, sind gut charakterisiert und kommerziell erhaltich und werden in Übereinstimmung mit der Herstellerbeschreibung verwendet. Der Verdauung mit Restriktionsenzymen folgt haufig die Behandlung mit alkalischer Phosphatase, entsprechend der Herstellerbeschreibung, um endständige 5'-Phosphate zu entfernen und so die Selbstligierung eines Vektors mit zwei kompatiblen Enden zu vermeiden.
  • "Auffüllen" betrifft das enzymatische Verfahren zum Erzeugen glatter Enden durch Reparieren überstehender Enden, die durch gewisse Restriktionsenzyme erzeugt werden. Die Reparatur ist eine Funktion des großen DNA-Polymerase-I-Fragments (Klenow) und der Desoxynucleotidtriphosphate und wird entsprechend der Herstellerbeschreibung verwendet.
  • Gelisolierung eines DNA-Restriktionsfragments bezieht sich auf die Gewinnung eines spezifischen Fragments, das entweder auf einem Agarosegel oder Polyacrylamidgel (abhängig von der Größe des Fragments) elektrophoretisch getrennt wurde, entweder durch Elektroelution oder durch Schmelzen und Extrahieren der Gelstücke.
  • Alle DNA-Manipulationen werden entsprechend den Standardverfahren durchgeführt. Siehe Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., 1982. Alle verwendeten Enzyme werden über kommerzielle Hersteller bezogen und entsprechend der Herstellerbeschreibung verwendet.
    • 1. Isolierung und Charakterisierung der PDGF-A-Ketten-cDNA
  • Eine λgt10-cDNA-Bank wurde aus Poly (A)&spplus;-RNA der Human-clonierten Gliomazellinie U-343 MGaCl2:6 konstruiert, wobei das LiCl/Harnstoffverfahren angewendet wurde, modifiziert, wie in Betsholtz, C. et al., Cell (1984) 39:447-457, beschrieben. Oligo(dT)-geprimte Synthese der ds-cDNA wurde entsprechend Gubler, U. und Hoffman, B.J., Gene (1983) 25:263-299 durchgeführt. Die so erhaltene cDNA wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt und in EcoRI-gespaltene λgt10 subcloniert, wobei EcoRI- Linker verwendet wurden. Die rekatinanten Phagen wurden auf E. coli C600hfl ausplattiert.
  • Zwei Oligonucleotidsonden mit PDGF-A-1 und PDGF-A-2 bezeichnet, wurden synthetisiert, basierend auf der bekannten Teilaminosäuresequenz der PDGF-A-Kette. Beide wurden unter Verwendung der Festphasen-Phosphoramiditmethodik hergestellt. Die doppelsträngige PDGF-A-1-Sonde wurde als zwei überlappenden 50-bp-Oligonucleotiden synthetisiert und unter Verwendung der [α-³²P]-Desoxynucleosidtriphosphate und des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I radioaktivmarkiert. PDGF-A-2 wurde aus einer 37basigen Matrize und aus einem 12basigen komplementären Primer synthetisiert und wie PDGF-A-1 radioaktiwnarkiert. Die Nucleotidsequenzen (Einzelstrang) der beiden Sonden sind unten angegeben.
  • Diese Sonden wurden zum Durchmustern der Bank (2 x 106 Clone) verwendet. Zweifache Nitrocellulosefilterabdrücke wurden mit den Sonden bei 42ºC in 20 % Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 5 x Denhardt-Lösung, 0,10 % SDS, 200 µg/ml beschallte Lachssperma-DNA hybridisiert und in 0,5 x SSC, 0,1 % SDS bei 42ºC gewaschen. Die Clone D1 und 13-1 wurden unter denen ausgewählt, die an beide Sonden hybridisierten und durch Didesoxynucleotidkettenterminierung sequenziert nach Subclonierung in M13-Phagenderivate. Teilnucleotidsequenzen von D1 und 13-1 sind in Fig. 1 und 2 angegeben.
  • Das längste offene Leseraster auf D1 sagt einen PDGF-A-Kettenvorläufer von 211 Aminosäuren (in Fig. 1 gezeigt) voraus; der eingerahmte Teil kennzeichnet das 125-Aminosäuren-PDGF-A-Kettenpolypeptid.
  • Die abgeleitete Aminosäuresequenz aus Fig. 1 stimmt mit der beschriebenen Teilsequenz der PDGF-A-Kette, die durch Aminosauresequenzierung erhalten wurde, überein, außer bei den Aminosäuren 119, 141 und 143, von denen gefunden wurde, daß sie Ile, Gln bzw. Ser anstelle der zuvor zugeordneten Val, Arg und Thr sind. Das ATG-Codon bei Aminosäureposition 1 kommt vor einer basischen Aminosäure (Arg), gefolgt von 18 hydrophoben Resten. Dies ist für eine Signalpeptidsequenz charakteristisch und stimmt mit der Beobachtung überein, daß PDGF-A-Kettenhomodimere, die von humanen Osteosarcomzellen produziert werden, sekretiert werden. Ein Vergleich mit bevorzugten Signalpeptidasespaltstellen deutet darauf hin, daß eine Prozessierung zwischen den Aminosäuren Ala20 und Glu21 auftreten kann. Die N-terminale Sequenz der Blutplättchen-PDGF-A-Kette wird bei Aminosäure 87 gefunden, was darauf schließen läßt, daß ein Propeptid von 66 Aminosäuren (44 % geladene Reste) vom Vorläufer abgespalten wird, wobei ein 125-Aminosäuren-A-Kettenprotein erzeugt wird. Diese Spaltstelle tritt nach einem Strang von vier basischen Aminosäuren, Arg-Arg-Lys-Arg, auf. Eine zusätzliche proteolytische Prozessierung kann in der C-terminalen Region auftreten.
  • Das korrespondierende offene Leseraster von 13-1 (Fig. 2) sagt einen PDGF-A-Kettenvorläufer von 196 Aminosäuren voraus, der sequenzidentisch nit dem Vorläufer von D1 identisch ist, dem aber die 15 C-terminalen Reste fehlen. Das reife Polypeptid ist in Fig. 2 wieder umrandet.
    • 2. Isolierung der PDGF-B-Kette
  • Die cDNA der PDGF-B-Kette wurde zur Verwendung in den folgenden Experimenten aus der gleichen cDNA-Bank isoliert, aus der D1, 13-1 und die B-Ketten-cDNA in einer analogen Weise cloniert wurden.
    • 3. Hefeexpression
  • Aufgrund der wähigkeit von Hefe, Proteine zu sekretieren und zu prozessieren, wurden die Gene der reifen PDGF-A-Kette und B-Kette mit der α-Faktor-Leader-Sequenz, einer sekretorischen Signalsequenz in Hefefusionisert, die die Sekretion von PDGF erlauben sollte. Von Hefe, die mit diesen Plasmiden transformiert wurde, wurde angenommen, daß sie ein Protein synthetisiert, das eine NH&sub2;-terminalen α-Faktor-Leadersequenz und eine durch Lys-Arg getrennte COOH-terminale PDGF-Kette enthält. Da dieses Molekül zur Sekretion vorgesehen ist, sollte die Spaltung nach der Prozessierungsstelle Lys-Arg durch die Hefe zur Sekretion des reifen Wachstumsfaktors funren. Lys-Arg ist die Prozessierungsstelle, die von dem natürlich Prepro-PDGF ebenso wie von dem Prepro-α-Faktor verwendet wird.
    • 3.1. Regulierbare Sekretion in Hefe
  • PDGF-B-Kettenprotein und die beiden Formen des A-Kettenproteins D1 und 13-1 werden von dem Hefestamm Saccharomyces cervisiae AB110 (Mata, uara 3-52, leu 2-04 oder beiden leu 2-3 und leu 2-112, pep 4-3, his 4.580, cirº) hergestellt und sekretiert, der mit den Hefeexpressionsplasmiden pYpnB4, pYpA6 bzw. pYpA134 transformiert wurde. Die Plasmide enthalten die Sequenz, die für das jeweilige reife PDGF-Protein codiert mit pBR322-Sequenzen einschließlich des Replikationsursprungs und des Ampicillinresistensgens, ebenso wie Hefesequenzen einschließlich des 2 µ und der selektierbaren leu und ura-Markergene. Die Expression der reifen PDGF-Gene ist unter Kontrolle des regulierbaren Promotors ADH2-Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und des α-Faktorterminators (siehe § 3.1.4).
    • 3.1.1. Konstruktion des pYpNB4: Ein Hefeexpressionsvektor für die PDGF-B-Kette
  • Das gesamte Gen, das für die reife PDGF-B-Kette codiert, wurde durch automatische Oligonucleotinsynthese auf einem Silicaträger synthetisiert, wie in Urdea et al., Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80:7461-7465, unter Verwendung von N,N-Diisopropylphosphoamiditen. Von Hefe bevorzugte Codons wurden verwendet. Das synthetische Gen wurde als ein 350-bp-XbaI- SalI-Fragment in pAG cloniert (siehe § 3.1.4), der mit XbaI und SalI verdaut und gelisoliert wurde, wobei man pAGSB-4 erhält.
  • Die Expressionskassette, die das synthetische PDGF-B-Kettengen enthalt, wurde als ein BamHI-Fragment herausgeschnitten und in den Hefe- Schaukel-Vektor pAB24 (siehe § 3.1.4) cloniert, der zuvor mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, wobei pYpNB4 erhalten wurde.
    • 3.1.2. Konstruktion des pYpA6 und pYpA134: Hefeexpressionsvektoren für die PDGF-A-Kette
  • Die in vitro Mutagenese wurde verwendet, um an den Enden der beiden unterschiedlichen reifen PDGF-A-Kettengene XbaI- und SalI-Stellen zu erzeugen, um die Gene in pAG (siehe § 3.1.4) zu donieren. Die in vitro Mutagenese wurde nach dem Verfähren von Zoller und Smith, DNA (1984) 3(6):479-488 durchgeführt. Ein SacI-HindIII-Fragment, das die gesamte dierende Region des reifen Polypeptids enthielt, wurde von jedem der PDGF-A-Kettengene in M13mp19 cloniert, um einzelsträngige Matrizen zu erzeugen. Die folgenden synthetischen Oligonucleotide wurden als Mutagene Primer verwendet.
  • Mutagenese am Clon D1 wurde durchgeführt unter Verwendung der Primer 1 und 2; Primer 1 und 3 wurden für den don 13-1 verwendet. Ein ungefähr 400-bp großes XbaI-SalI-(Teil-)Fragment aus dem Clon D1 und ein ungefähr 360-bp großes XbaI-SalI-(Teil-)Fragment des Clons 13-1 wurden jeweils isoliert und in pAG cloniert, das mit XbaI und SalI verdaut und gelisoliert wurde, wobei man pAG-AD1 und pAGA13.1 erhielt. Die Expressionskassetten, die die beiden reifen PDGF-A-Kettengene enthielten, wurden als BamHI-Fragmente ausgeschnitten und jeweils in pAB24 cloniert, das zuvor mit BamHI und alkalischer Phosphatase behandelt worden war, wobei die Plasmide pYpA6 und pYpA134 erhalten wurden.
    • 3.1.3. Hefetransformation und Expression
  • Die Hefeexpressionsplasmide pYpNB4, pYpA6 und pYp134 wurden in dem Hefestamm S. cerevisiae AB110 (Mata, ura 3-52, leu 2-04 oder beide leu 2-3 und leu 2-112, pep 4-3, his 4-580, cirº) wie in Hinnen et al. (Proc Natl Acad Sci USK (1978) 75:1929-1933) beschrieben, transformiert und auf ura&supmin;-Platten mit 8 % Glucose und Sorbit ausplattiert. Die Trans formanten wurden während 24 h in leu&supmin;-Flüssigmedium mit 8 % Glucose gezüchtet und dann auf leu&supmin;-Platten mit Glucose und Sorbit ausplattiert, um Einzelkolonien zu erhalten. Einzelkolonien wurden aufgenommen und in 3 ml leu- Medium mit 8 % Glucose während 24 h bei 30ºC gezüchtet und dann in 1 l ura&supmin;Medium mit 1 % Glucose inokuliert (1:50) und während 75 h bei 30ºC gezüchtet. Das Hefekulturmedium wurde mit dem humanen Vorhautfibroblastenmitogen-Assay (siehe § 5) auf eine PDGF-Aktivität geprüft. Die Hefetransformante pYpNB4-2 sekretierte PDGF-B-Kette in einer Rate von 500 ng/ml in das Medium, die Transformante pYp6-NT1 sekretierte die PDGF-A- Kette (D1-Form) in einer Rate von 750 ng/ml in das Medium und die Transformante pYpA134-NT1 sekretierte die PDGF-A-Kette (13-1-Form) in einer Rate von 325 ng/ml in das Medium.
  • Proteine der obigen Kulturen wurden auf einem 15%igen Polyacrylamid-SDS-Gel laufengelassen. Die B-Kette wanderte zu der erwarteten Größe von 14,5 Kd. Die 13.1-Form der A-Kette wanderte als zwei Banden bei 18 bzw. 18,5 Kd. Die Größe der erwarteten Einzelspezies ist 18 Kd. Die D1- Form der A-Kette wandert als drei Banden bei 19, 18,5 und 18 Kd. Seine erwartete Größe auf dem gleichen Gel wurde für eine Einzelspezies als 19,5 Kd berechnet. Die zusätzlichen Banden beider A-Ketten stammen aus proteolytischer Spaltung entweder am Aminoterminus und/oder am Carboxyterminus.
    • 3.1.4. Verwendete Plasmide für die Herstellung von Hefeexpressionsvektoren
  • pAG ist ein allgemeiner Hefeexpressionskassettenvektor, abgeleitet von pAG-TNF, wobei pA-TNF nur gelegentlich zum Clonieren mit dem erfindungsgemäß relevanten p-Konstrukt verwendet wurde.
  • Der Expressionskassettenvektor pAG-TNF enthält den regulierbaren ADH2-GAPDH-Promotor, die (1-Faktor-Leader-Sequenz, das synthetische TNF- Gen und den α-Faktorterminator, cloniert in pBRΔRI-Sal. Der ADH2-GAPDH- Promotor wurde als ein 1,0-Kbp-BamHI-NcoI-Fragment aus pAGΔXbaGAP1 isoliert. Das 5'-Ende der α-Faktor-Leader-Sequenz wurde als ein synthetischer Adapter für die folgende Sequenz zur Verfügung gestellt und hat NcoI- und PstI-kompatible überstehende Enden:
  • Das 3'-Ende der α-Faktor-Leader-Sequenz, das synthetische TNF-Gen und der α-Faktorterminator wurden als ein PstI-BamHI-Fragment aus pHG100-TNF isoliert. Die drei Fragmente wurden zusammenligiert und in pBRΔRI-Sal cloniert, das zuvor mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war.
  • pBRΔRI-Sal wurde durch Verdauung von pBR322 mit EcoRI und SalI konstruiert, wobei die überstehenden Enden mit Klenow-Fragment aufgefüllt und mit BamHI-Linkern ligiert wurden. Der Vektor und die Linker wurden mit BamHI verdaut und der BamHI-BamHI-3,8-kb-Vektor wurde gelisoliert und durch Selbstligierung rezirkuliert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pBRΔRI-Sal bezeichnet.
  • Das Plasmid pAGΔXbaGAP1 enthält den ADH2-GAPDH-Hybridpromotor und den GAPDH-Terminator, cloniert in pBRΔRI-Sal. Der ADH2-GAPDH-Promotor (die einzige sich auf diese Anmeldung beziehende Sequenz) wurde als ein 1,1-kb-BamHI-NcoI-Fragment aus pJS103 (unten beschrieben) isoliert. Zusätzlich wurde eine etwa 90-bp-XbaI-XbaI-Deletion am 5'-Ende des Promotorfragments eingeführt durch Spalten des Plasmids mit XbaI, Auffüllen der überstehenden Enden mit Klenow-Fragment und dNTPs und Rezirkularisierung des Plasmids, wobei pAGΔXbaGAP1 erhalten wurde.
  • pHG100-TNF enthält den α-Faktorpromotor, die Leader-Sequenz und den Terminator, wobei das synthetische Gen, das für TNF codiert, im Leseraster am 3'-Ende der Leader-Sequenz insertiert ist. Das aus diesem Plasmid isolierte 1,0-kb-Pst-BamHI-Fragment enthält 240 bp des 3'-Endes der α-Faktor-Leader-Sequenz, das synthetische 494-bp TNF-Gen (als ein XbaI-SalI-Fragment) und den 272-bp-α-Faktorterminator. Die α-Faktorsequenzen, die die einzig relevanten Sequenzen für diese Anmeldung sind, leiten sich aus pAB114 ab. pAB114 ist in EP-O-0 116 201, S. 14-18 und Brake, A.J., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1984), 81:4642-4646, beschrieben. Der einzige Unterschied ist eine stumme Mutation, die durch M13-Mutagenese eingeführt wurde, um eine XbaI-Stelle am 3'-Ende der Leader-Sequenz zu erzeugen, um das donieren der heterologen Gene zu erleichtern.
  • Der unten gezeigte Vergleich des 3'-Endes der DNA-Faktor-Leader-Sequenz des Wildtyps (pAB114) gegenüber dem veränderten α-Faktor (pHG100) zeigt, daß eine stumme Mutation eingeführt wurde, die für eine XbaI- Stelle genau 5' zur Prozessierungsstelle (LysArg) codiert. Dies erlaubt die Insertion heterologer Gene ohne die "Spacer"-Codons (mussen die LysArg-Prozessierungsstelle enthalten und das Leseraster erhalten).
    • pJS103
  • Das Plasmid pJS103 enthalt den induzierbaren Hybridpromotor ADH2- GAPDH. Der Hybridpromotor ist aus der Transkriptions- und der Translations-Initiationsregion des GAPDH-Promotors aufgebaut und steht unter der regulatorischen Kontrolle der Transkriptions-ADH2-Regulationsregion. Die Transkriptions-ADH2-Regulationsregion wird in Abwesenheit einer leicht verfugbaren Quelle wie Glucose (ohne einen exogenen Induktor) dereprimiert. Indem man die Hefekultur, nachdem sie bis zu einer hohen Dichte gewachsen ist, an Glucose erschöpfen läßt, wird die Transkriptions- Kontrollregion dereprimiert, und es kommt zur Expression des gewünschten Peptids.
  • Das Plasmid pJS103 wurde wie folgt konstruiert. Der ADH2-Teil des Promotors wurde konstruiert durch Schneiden eines Plasmids, das das Wildtyp-ADH2-Gen des Plasmide pADR2 (Beier et al., Nature (1982) 300:724-728) enthält, mit dem Restriktionsenzym EcoRV, das an der Stelle +66 relativ zum AFG-Startcodon schneidet, ebenso wie an zwei anderen Stellen in außerhalb der ADH2-Region. Das erhaltene Gemisch eines Vektorfragments und zweier kleinerer Fragmente wurde mit der Exonuclease Bal31 herausgeschnitten, um 300 bp zu entfernen. Synthetische XhoI-Linker wurden mit der Bal31-behandelten DNA ligiert. Das erhaltene DNA-Linkervektorfragment (etwa 5 kb) wurde von den Linkern durch Säulenchromatographie getrennt, mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten, zurückligiert und dazu verwendet, E. coli mit einer Ampicillinresistenz zu transformieren. Die Stellen der XhoI-Linker wurden durch DNA-Sequenzieren bestimmt. Ein Plasmid, das einen XhoI-Linker innerhalb der 5'-nichttranskribierten Region des ADH2-Gens (-232-Stelle von ATG) enthielt, wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten, mit Nuclease S1 behandelt und nachfolgend mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt, um ein lineares Vektormolekul mit einem glatten Ende an der XhoI-Linkerstelle und ein EcoRI-Ende zu erzeugen. Der GAP-Teil des Promotors wurde konstruiert durch Schneiden des Plasmids pPGAG1 mit den Enzymen BamHI und EcoRI, gefolgt von der Isolierung des 0,4-Kbp-DNA-Fragments. Dieses gereinigte Fragment wurde dann mit dem Enzym AluI vollständig verdaut und ein ungefähr 200-bp-Fragment wurde isoliert.
  • Dieses GAP-Promotorfragment wurde mit dem ADH2-Fragment, das auf dem oben beschriebenen linearen Vektor vorhanden ist, ligiert, wobei das Plasmid pJS103 erhalten wurde.
    • pPGAP1
  • pPGAP1 ist ein Hefeexpressionskassettenvektor, der einen Polyrestriktionsspaltstellenlinker zwischen dem GAPDH-Terminator und einer verkürzten GAPDH-Promotorregion hat. Die Polyrestriktionsspaltstellen enthalten die Erkennungsstellen für NcoI, EcoRI und SalI, und die Kassette kann als BamHI-Fragment herausgeschnitten werden. Die Herstellung von pPGAP1 ist in EPO 0 164 556 und Travis, J., et al., J. Biol Chem (1985) 260(7) :4384-4389, beschrieben. In beiden Referenzen wird pPGAP1 als pPGAP bezeichnet.
    • pAB24
  • pAB24 ist ein Hefe-Schaukel-Vektor, der die vollständigen 2 µ-Sequenzen (Broach, In: Molecular Biology of the Yeast Saccharatomyces, 1:445, Cold Spring Harbor Press (1981)) und pBR322-Sequenzen enthält. Er enthält ebenso das Hefegen URA3 aus dem Plasmid YEp24 (Botstein et al., Gene (1979) 8:17) und das Hefegen LEU2d, abgeleitet aus dem Plasmid pCl/1 (beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichtungs-Nr. EPO 116201). Die Expressionskassette wurde an der BamHI-Stelle des pBR322 insertiert, wobei das Gen der bakteriellen Resistenz gegen Tetracyclin unterbrochen wird.
    • 3.2. Intrazelluläre Expression in Hefe
  • PDGF-B-Kette und die beiden Formen des A-Kettenproteins D1 und 13.1 können intern durch den Hefestamm S. cerevisiae AB110, der mit pAB24- AGMetPDGF-SB, pAB24-AGMetPDGF-AD1 bzw. pAB24-AGMetPDGF-A13.1 transformiert wurde, hergestellt werden. Die Plasmide enthalten die Sequenz, die für ihr jeweiliges reifes PDGF-Protein codiert, mit einem zusätzlichen Methionin am Aminoterminus, das eine direkte Expression erlaubt. Die Expression der reifen PDGF-Gene steht unter der Kontrolle des regulierbaren Pramotors ADH2-GAPDH und des GAPDH-Terminators.
    • 3.2.1. Konstruktion des pAB24-AGMetPDGF-SB: Ein Hefeexpressionsvektor für die PDGF-B-Kette
  • Um die reife B-Kette intern in Hefe zu exprimieren, wird das Plasmid pAGSB-4 (§ 3.1.1) mit BglII verdaut und dann mit S1-Nuclease behandelt, um die überstehenden 5'-Reste zu entfernen und ein glattes Ende zu erzeugen. Ein Linker der folgenden Sequenz:
  • (der die überstehenden Reste von BglII, ein Startcodon und das Codon, das für die erste Aminosäure, Serin, der reifen PDGF-B-Kette codiert, wiederherstellt, enthält) wird mit pAGSB4 ligiert, und dann wird das Plasmid mit BglII und Sall verdaut. Das 345-bp-BglII-SalI-Fragment wird gelisoliert und in das BglII und XhoI verdaute pRSP101 ligiert, wobei das Plasmid pAB24-AGMetPDGF-SB erzeugt wird.
  • Das Plasmid pRSP101 ist ein Hefeexpressionsvektor, der den regulierbaren ADH2-GAPDH-Promotor und den GAPDH-Terminator enthält und wurde aus pAB24 und pRSP100 abgeleitet. Das Plasmid pRSP100 wurde durch Herausschneiden der BamII-Kassette aus pRSP100 und seiner Ligation in pAB24 das zuvor mit BamHI verdaut und mit Phosphatase behandelt worden war, konstruiert. Der Zwischenvektor wurde dann mit NcoI und SalI verdaut, um das Fragment zwischen dem Promotor und dem Terminator zu entfernen und dann mit S1-Nuclease behandelt, um die einzelsträngigen überstände zu entfernen und glatte Enden herzustellen. Ein Linker der folgenden Sequenz:
  • wurde dann hineinligiert, um einmalige Stellen für BglII und XhoI hinzuzufügen. Das Plasmid pBS100 ist ein Hefeexpressionskassettenvektor, der in das pBR322-Derivat pAB12 cloniert ist. Die Expressionskassette enthält den ADH2-GAPDH-Hybridpromotor und den GAPDH-Terminator, die ein Gensegment des HIV-Hüllgens flankieren. Der ADH2-GAPDH-Promotor ist ein 1200- bp-BamHI-NcoI-Fragment, isoliert aus pJS103 (§ 3.1.4) und der GAPDH-Terterminator ist ein 900-bp-SalI-BamHI-Fragment, isoliert aus dem Plasmid pPGAP1 (§ 3.1.4). Das Plasmid pBS100 enthält ebenso ein nichtnotwendiges Fragment zwischen der NcoI- und der SalI-Stelle, das durch die interessierenden Genfragmente ersetzt wird. Die Expressionskassette kann aus pBS100 durch Verdauung mit BamHI entfernt und zur Einschleusung in Hefezellen in einen Hefe-Schaukel-Vektor cloniert werden.
  • Das Plasmid pAB12 ist ein pBR322-Derivat, dem der Bereich zwischen den einzelnen HindIII- und SalI-Stellen fehlt und das den BamHI-Linker, insertiert zwischen die beiden alleinigen EcoRI-Stellen, enthält. Dieser Vektor wurde konstruiert durch vollständige Verdauung von pBR322 mit HindIII und SalI, gefolgt von einer limitierten Verdauung mit Bal31- Nuclease, Reparatur der so erhaltenen Enden mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I und glattendige Ligation mit T4-DNA-Ligase, um wieder einen kreisförmigen kovalent geschlossenen Vektor zu erhalten. Das Plasmid wurde dann mit EcoRI geöffnet, mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I behandelt (um die 5'-überstehenden Reste aufzufüllen), die glatten Enden mit BamHI-Linkern ligiert, mit BamHI verdaut, um überschüssige Linker zu entfernen und dann ligiert, um geschlossene kreisförmige Plasmide zu erhalten.
    • 3.2.2. Konstruktion des pAB24-AGMetPDGF-AD1 und des pAB24- AGMetPDGF-A13.1: Hefeexpressionsvektoren der PDGF-A-Kette
  • Um die beiden reifen PDGF-A-Ketten, die in Hefe intern exprimiert werden sollen, zu donieren, wurden die semisynthetischen NcoI-HindIII- Fragmente des internen bakteriellen Expressionsvektors pSOD-MethPDGF-AD1 und pSOD-MethPDGF-A13.1 (§ 4.2) isoliert. Diese Fragmente enthalten das Translationsstartcodon ATG, gefolgt von dem reifen PDGF-A-Kettengen und die 3'-nichtübersetzte Region. Die ungefähr 613 bp und 544 bp NcoI- HindIII-Fragmente, die für D1 bzw. 13.1 codieren, werden jeweils in pBS100 ligiert, der zuvor mit NcoI und HindIII (schneidet im 5'-Ende der Terminatorregion) verdaut worden waren, wobei die resultierenden Plasmide pAGMetPDGF-AD1 und pAGMetPDGF-A13.1 erhalten wurden. Die Expressionskassette, die den ADH2-GAPDH-Hybridpromotor, das reife PDGF-A-Kettengen und den GAPDH-Terminator enthält, wird als ein BamHI-Fragment ausgeschnitten und in pAB24, der zuvor mit BamHI verdaut und mit Phosphatase behandelt worden war, ligiert, um die Plasmide pAB24AGMetPDGF-AD1 und pAB24-AGMetPDGF-A13.1 zu erhalten.
    • 3.2.3. Hefetransformation und Expression
  • Die Hefeexpressionsplasmide, die die MetPDGF-B-Kette und zwei Formen der A-Kette enthalten: mit pAB24-AGMetPDGF-SB, pAB24-AGMetPDGF-AD1 und pAB24-AGMetPDGF-A13.1 wurde die Hefe-S. cerevisiae-AB110, wie zuvor in § 3.1.3. beschrieben, transformiert.
    • 3.3. Interne Espression als eine SOD-Fusion 3.3.1. Konstruktion des pAB24-AGhSOD-hPDGF: Ein Hefeexpressionsvektor für ein SOD-PDGF-B-Kettenfusionsprotein
  • Um das obige Plasmid zu erhalten, wurde das BglII-SalI-Fragment, das für die reife PDGF-B-Kette codiert, aus pYpNB4 herausgeschnitten. Der folgende Linker wurde mit dem 5'-Ende ligiert:
  • Dieser Linker enthält eine lys-arg-Spaltstelle für die Kex2-Protease, um eine Trennung der humanen Superoxiddismutase (hSOD) und der PGDF-B-Kette zu erlauben. Das EcoRI-SalI-Fragment wird dann in das Phosphatase-behandelte pSI4 (beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 86104066.5, Veröffentlichungs-Nr. 0196056), verdaut mit EcoRI und SalI, cloniert. Die BamHI-Kassette wird dann herausgeschnitten und in Phosphatase-behandeltes BamHI verdautes pAB24 subcloniert.
    • 3.3.2. Konstruktion des pAB24-AGSOD-hPDGF-A (13.1 oder D1): Ein Hefeexpressionsvektor für ein SOD-hPDGF-A (13.1 oder D1) Fusionsprotein
  • Um das obigen Plasmid zu erhalten, wurden die 102 und 87 N-terminalen Aminosäuren der reifen PDGF-A-Kettenformen D1 bzw. 13.1. enthaltende SalI-Fragmente isoliert. Sie wurden mit Linkern ligiert, die die ersten 23 Aminosäuren der PDGF-A-Kette wiederherstellen, eine lysarg-(Kex2) Spaltstelle zwischen SOD und PDGF und eine EcoRI-Restriktionsspaltstelle am 5'-Ende einführen.
  • Die EcoRI-SalI-Fragmente (355 und 392 bp für die Clone 13.1 bzw. D1) werden dann in mit Phosphatase behandeltes und EcoRI und SalI verdautes pSI4 ligiert. Die BamHI-Kassette wird herausgeschnitten und in Phosphatase-behandeltes mit BamHI verdautes pAB24 sübeloniert.
    • 4. E. coli: Vektoren, die zur Herstellung von Hefevektoren verwendet wurden 4.1. Konstruktion des PSOD-MethPDGF-SB: Ein bakterieller Expressionsvektor der PDGF-B-Kette
  • Der gesamte für die PDGF-B-Kette codierende Bereich wurde synthetisiert, wie zuvor beschrieben (§ 3.1.1), außer, daß eine NcoI-Stelle am 5'-Ende erzeugt wurde anstelle der XbaI-Stelle. Das 350-bp-NcoI-SalI- PDGF-B-Fragment wurde in pSODCF2 ligiert, das zuvor mit NcoI und SalI verdaut und gelisoliert wurde, um das Plasmid pSOD-MethPDGF-SB zu erhalten.
  • pSODCF2 ist ein E. coli-Expressionsvektor, der den TacI-Promotor (ein trp-lac-Hybridpromotor) enthält, gefolgt von einer cDNA-Kopie des hSOD-Gens und einem Polylinker (zum Clonieren COOH-terminaler Fusionen), die in pBR322 cloniert sind. pSODCF2 ist in Steimer, K.S., et al., J Virol (1986) 58:9-16 beschrieben.
    • 4.2. Konstruktion des pSOD-MethPDGF-AD1 und des pSOD-MethPDGF- A13.1: Bakerielle Expressionsvektoren der PDGF-A-Kette
  • Um die beiden Formen der reifen PDGF-A-Kette in E. coli zu exprimieren, wurden die ersten 69 Nucleotide so synthetisiert, daß sie eine NcoI-Stelle einschließen und für ein Methionin am 5'-Ende und eine SalI- Stelle am 3'-Ende codieren. Dieses Fragment wurde sowohl mit dem ungefähr 475-bp-SalI-HindIII-Fragment des Clons 13.1 als auch dem ungefähr 545-bp- SalI-HindIII-Fragment des Clons D1 ligiert.
  • Die erhaltenen semisynthetischen Gene der beiden A-Ketten wurden als NcoI-HindIII-Fragmente in pbaFGFFix cloniert, das zuvor mit NcoI und HindIII verdaut und gelisoliert worden war, um pSOD-MethPDGF-AD1 und pSOD-MethPDGF-A13.1 zu erhalten.
  • Das Plasmid pbaFGFFfix ist das Plasmid pSODCF2 das ein 436-NcoI- SalI-Fragment, das für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) codiert, enthält und wurde wegen der Anwesenheit einer HindIII-Stelle in der FGF- Sequenz nur aus Bequemlichkeit verwendet. Die Translationsstoppcodons für PDGF waren vorhanden, wie durch die Sequenz nachgewiesen wurde.
    • 5. Bioassay der PDGF-Aktivität 5.1. PDGF, hergestellt in Hefe
  • Proben von Überständen von Hefe, die PDGF exprimiert hatten, wurden in Abhängigkeit von der erwarteten Aktivität angemessen verdünnt und dann seriell mit DMEM, das 1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält, verdunnt. Aliquote (10 µl) jeder Verdunnung wurden in die Vertiefungen der Assayplatten gegeben.
    • 5.2. Humaner Vorhautfibroblasten- (HFF) Mitogen-Assay auf PDGF
  • HFF-Stammlösungen wurden gefroren gelagert; gefroren wurde bei Passage 13. Vor der Verwendung wurden HFF aufgetaut und in T75-Kolben bis zur Konfluenz gezüchtet, die ublicherweise nach 5 bis 7 Tagen auftrat. Das Wachstumsmedium enthielt Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 20 % fötales Rinderserum (EBS), 1 mM Natriurmpyruvat, 300 µg/ml L- Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37ºC in einer befeuchteten 7 % CO&sub2;, 93 % Luftatmosphäre inkubiert. Bei Konfluenz wurden die Zellen passiert durch Spulen der Monolayer mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), ohne Ca&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus; durch Dissoziieren der Zellen in Trypsinlösung, die EDTA enthält und durch Verdunnen mit Wachstumsmedium. Nach dem Auftauen wurden die Zellen nicht öfter als 8mal passiert.
  • Um auf PDGF zu testen, wurden HFFs wie folgt plattiert. Die Zellen wurden gespült und mit Trypsin dissoziiert wie oben. Die Trypsin-behandelten Zellen wurden pelletiert und in einer Konzentration von 1 x 10&sup5; Zellen/ml in einem dem Wachstumsmedium ähnlichen Medium resuspendiert, außer, daß 5 % FBS durch 20 % FBS ersetzt wurde; 100 µl der Suspension wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt, und die Zellen wurden während 5 bis 6 Tagen unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert.
  • PDGF in den Proben wurde durch Beobachten der ³H-Thymidinaufaaume in HFF-DNA, die durch PDGF stimuliert wird, bestimmt. Die Proben wurden den Vertiefungen, die die HFF-Monoschichten enthielten, zugegeben, und die Assayplatten wurden wie oben während 18 h inkubiert. Die HEF-Kulturen wurden dann mit [Methyl³H]-Thymidin (10 µCi/ml Endkonzentration, 1 µCi/Vertiefuhg) bei 37C unter den oben beschriebenen Inkubationsbedingungen während 8 h gepulst. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gespult und fixiert. Eine Fixierung wurde durch Inkubation mit 5 % Trichloressigsäure (TCA) und dann 100 % Methanol während 15 min, gefolgt durch Trocknen an der Luft, erreicht. Die Zellen wurden dann mit 0,3 N NaOH solubilisiert und in einem Flüssigszintillationszähler ausgezählt.
  • Kontrollproben wurden, wie die oben beschriebenen Proben, behandelt und wurden wie folgt vorbereitet. Als Positivkontrollen wurde PDGF, gekauft von PDGF, Inc., in einer Endkonzentration von 100 ng/ml in DMEM; das 10 mg/ml BSA enthält, gelöst. Eine Standardkurve wurde hergestellt; der erste Punkt war 10 ng/ml, die restlichen Punkte waren 2fache serielle Verdunnungen. Jede Verdünnung wurde 3fach getestet. Negativkontrollen, die weder Probe noch Kontroll-PDGF enthielten, ließ man ebenso laufen.
  • Modifizierungen der oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, die einem Fachmann auf den verwandten Gebieten der Erfindung offensichtlich erscheinen, sollen im Umfang der folgenden Patentansprüche enthalten sein.

Claims (5)

1. Rekombinanter Hefeexpressionsvektor, umfassend:
(i) eine DNA-sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die 87 bis einschließlich 193 in Figur 1 numeriert ist;
(ii) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die 87 bis einschließlich 196 in Figur 1 oder Figur 2 numeriert ist;
(iii) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die 87 bis einschließlich 211 in Figur 1 numeriert ist;
(iv) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die 1 bis einschließlich 196 in Figur 1 oder Figur 2 numeriert ist; oder
(V) eine DNA-Sequenz, die für ein PDGF-A-Kettenpolypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz enthält, die 1 bis einschließlich 211 in Figur 1 numeriert ist;
operierbar an einen Hefehybrid-ADH-GAPDH-Promotor gekoppelt.
2. Hefeexpressionsvektor nach Anspruch 1, enthaltend weiter eine DNA-Sequenz, die für humane Superoxid-Dismutase codiert, zwischen dem Promotor und der PDGF-A-Kettensequenz.
3. Hefeexpresssionsvektor nach Anspruch 1, welcher ein pYpA6, wie in Figur 3 dargestellt, pYpA134, wie in Figur 4 dargestellt, pAB24-AGMetPDGF-AD1 oder pPAB24-AGMetPDGF-A13, wie in Figur 5 dargestellt, oder pPAB24-AGSOD-hPDGFAD1 oder pAB24-AGSOD-hPDGFA13.1, wie in Figur 6 dargestellt, umfaßt.
4. Hefezellen, transformiert mit dem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 1, 2 oder 3.
5. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten PDGF, umfassend ein PDGF-A-Kettenpolypeptid, wobei das Verfahren das Züchten der Hefezellen nach Anspruch 4 umfaßt.
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