DE3687141T2

DE3687141T2 - Verfahren zur herstellung von peptiden.

Info

Publication number: DE3687141T2
Application number: DE8686115833T
Authority: DE
Inventors: Mitsuru Furusawa; Tadashi Horiuchi; Susumu Maeda; Yasumasa Marumoto; Yoshiyuki Saeki; Yoshinari Sato
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-11-14
Filing date: 1986-11-14
Publication date: 1993-04-08
Anticipated expiration: 2006-11-15
Also published as: PL158590B1; IE862999L; FI94260B; DK543686D0; CN1032762C; CN86107784A; HU208340B; NO864486D0; FI864624A; NO864486L; DK175184B1; FI864624A0; AU6518386A; AU604001B2; ATE82590T1; FI94260C; KR870005092A; JPH0797995B2; PL262348A1; BG60255B2

Description

ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft rekombinate Bombyx mori (Seidenraupen) Nuklear Polyhedrosis Viren und ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung dieser rekombinanten Viren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung des Bombyx mori Nuklear Polyhedrosis Virus (BmNPV) wurde bereits beschrieben (Literaturstelle 1; die hierin zitierten Literaturstellen sind am Ende zusammengefaßt).
Das zentrale Merkmal dieses Verfahrens besteht in der Konstruktion eines rekombinanten BmNPV mit einem Strukturgen für ein bestimmtes Protein, welches das Polyhedrinprotein-Strukturgen ersetzt, unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, und in der Vermehrung des rekombinanten Virus in kultivierten Seidenraupen (Bombyx mori)-Zellen oder in lebenden Seidenraupen (Bombyx mori), wobei das gewünschte Protein darin angehäuft wird. Dieses Verfahren ist jedoch im Hinblick auf die Ausbeuten für die gewünschten Proteine unbefriedigend.
Die Produktion von Fusionsproteinen in Escherichia coli ist außerdem in der Praxis bekannt. Die Ausbeuten sind jedoch nicht signifikant besser (Literaturstellen 2-8).
In "Molecular and Cellular Biology", Dezember 1983, Seiten 2156-2165, wird die Produktion eines Fusions (Hybrid)-Proteins beschrieben, bestehend aus β-IFN, welches mit einem Polyhedrinproteinabschnitt verbunden ist, wobei man einen rekombinanten Autographa californica Nuklear Polyhedrosis Virus (AcNPV) verwendet. Es wurden Untersuchungen hinsichtlich der optimalen Insertionsstelle für das β-IFN-Gen in das Polyhedrin-Strukturgen von AcNPV angestellt. Die höchsten β-IFN-Ausbeuten erhielt man bei Verwendung des Vektors pAC38O, der das β-IFN-Gen, jedoch kein Polyhedrin-Strukturgen enthielt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Bombyx mori Nuklear Polyhedrosis Virus, der in dem für das Polyhedrinprotein kodierenden Strukturgenabschnitt der Bombyx mori Nuklear Polyhedrosis Virus DNA ein Strukturgen für ein gewünschtes Protein enthält, welches mit dem gesamten für das Polyhedrinprotein kodierende Strukturgen oder einem Teil davon, mit oder ohne eingeschobener Linker-Basesequenz verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins durch Vermehrung des rekombinanten Virus in kultivierten Bombyx mori-Zellen oder in lebender Bombyx mori.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des gewünschten Proteins durch Schneiden oder Zersetzen des Fusionsproteins an der entsprechenden Linker-Position.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Von den beiliegenden Zeichnungen zeigen
die Fig. 1 bis 6 schematisch die Konstruktionsschemen für Beispiele bestimmter Plasmide zur Produktion des rekombinanten Virus; und
die Fig. 7 und 8 das elektrophoretische Verhalten des gewünschten Fusionsproteins.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

BmNPV ist den mit Serumkulturen beschäftigten Personen allgemein bekannt. Der Stamm T3 ist ein typischer Stamm, der von den vorliegenden Erfindern isoliert wurde. Die virale DNA (BmNPV DNA) dieses Stamms wurde bei der ATCC in den USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40188 hinterlegt.
Wie in der Literaturstelle 1 beschrieben, eignet sich zur Isolierung eines, das Polyhedrinprotein-Strukturgen enthaltenden Abschnitts aus der viralen DNA unter anderem eine Behandlung mit EcoRI. Ein Escherichia coli-Stamm (E. coli K12JM83 DGB-0036), der das Plasmid pBmE36 enthält, wobei ein EcoRI-Eco- RI-Fragment (etwa 10,5 kb) der viralen DNA an der EcoRI- Schnittstelle in das Plasmid insertiert ist, wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie von Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-813 hinterlegt.
Wie außerdem in Referenz 1 beschrieben ist, liefert pBmE36 bei Behandlung mit HindIII ein etwa 3,9 kb langes Fragment, welches das Strukturgen für das Polyhedrinprotein enthält. Dieses Fragment wird dann in das käuflich erhältliche Plasmid pUC9 (erhältlich bei Pharmacia P-L Biochemicals) insertiert. Durch die anschließende EcoRI-Spaltung, Bal31-Behandlung (wobei Fragmente mit unterschiedlicher Länge durch Einstellen der Behandlungszeit erzeugt werden können) und außerdem durch HindIII- Spaltung oder durch ähnliche Prozeduren erhält man ein Fragment, welches das Polyhedrinprotein-Gen ganz oder teilweise erhält.
Ein Strukturgen für das gewünschte Protein kann mit dem Polyhedrinprotein-Gen oder einem Teil davon verbunden werden, indem man geeignete Linker (DNA) (Referenz 19) verwendet. Außer dem produzierten Fusionsprotein erhält man nach Spaltung mit geeigneten Mitteln im Bereich eines Peptids oder einer Aminosäure (Linkerabschnitt), der in Übereinstimmung mit der Linkerbasensequenz translatiert worden war, das gewünschte Protein, welches dann mit herkömmlichen Methoden isoliert werden kann. Ist das Fusionsprotein per se nützlich, ist natürlich eine Spaltung nicht erforderlich. In solch einem Fall kann der Linker fehlen.
Allgemein bekannt als Peptid oder Aminosäure (Linker)-Abschnitt, der dem Linker entspricht, und den Mitteln, welche zu deren Spaltung oder Abbau dienen, sind u. a. die Sequenz Ile- Glu-Gly-Arg und der Blutgerinnungsfaktor Xa (im folgenden abgekürzt "F-Xa"), der zur Spaltung der Sequenz befähigt ist; Pro- Ama-Gly-Pro (worin Ama eine beliebige Aminosäure bedeutet) und Kollagenase, welche zur Spaltung dieser Sequenz befähigt ist; Arg oder Phe und Trypsin, welches zur Spaltung der Peptidbindung hinter den genannten Aminosäuren befähigt ist; Tyr oder Phe und Chymotrypsin, welches zur Spaltung der Peptidbindung hinter diesen Aminosäuren befähigt ist; Pro-Arg und Thrombin, welches zur Spaltung der dahinter gelegenen Peptidbindung befähigt ist; Tryptophan und N-Bromsuccinimid, welches erstgenannte Verbindung zersetzen kann; und Methionin und Bromcyan, welches die erstgenannte Verbindung zersetzen kann (Referenzen 2-10). Der Linker-Abschnitt und die Mittel zur Spaltung oder Zersetzung sind nicht auf die oben erwähnten Beispiele beschränkt und es können viele andere geeignete Kombinationen von verschiedenen Peptiden oder Aminosäuren und verschiedenen chemischen oder enzymatischen Methoden als Linker-Abschnitte bzw. Spaltungsund Zersetzungsmittel angewendet werden.
Es ist wünschenswert, daß das gewünschte Protein kein Peptid oder keine Aminosäure enthält, das oder die zersetzt wird, wenn man die Spaltung oder Zersetzung des Linker-Abschnittes, beispielsweise wie oben erwähnt, durchführt. Es ist jedoch auch möglich, eine restriktive Zersetzung des Fusionsproteins durch zuführen, wobei man geeignete restriktive, moderate Bedingungen wählt, um das Ziel zu erreichen.
Der Ausdruck "gewünschtes Protein", der hierin verwendet wird, bezeichnet ein eukaryotisches Protein, vorzugsweise ein Säugetier-Protein. Spezielle Beispiele für das gewünschte Protein sind physiologisch aktive Substanzen sowie Substanzen, die als diagnostische Reagentien geeignet sind, wie z. B. Interferone (IFN's), Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukine und andere Lymphokine, Insulin, Wachstumshormon und andere Hormone, Hepatitisvakzin, Influenzavakzin und verschiedene andere Antigenproteine, Gewebsplasminogen-aktivierender Faktor (TPA), Somatomedine, Enzyme zur industriellen Verwendung, wie z. B. Steroidkonvertierende Enzyme, Acylasen, Amylasen, Lipasen und dergleichen, Nahrungsmitteladditive und Futteradditive, und dergleichen. Einige dieser Materialien können eine gebundene Zuckerkette aufweisen. Erfindungsgemäß werden die Peptide in eukaryotischen Zellen hergestellt. Wird ein von einem Eukaryoten abgeleitetes Gen verwendet, so können an dem produzierten Peptid die gleichen Modifikationen oder solche Modifikationen erfolgen, die in vivo in Eukaryoten zu beobachten sind. Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte besitzen somit eine höhere Nützlichkeit im Vergleich zu denjenigen Produkten, welche in Bakterien hergestellt werden.
Die für diese Proteine kodierenden Gene können chromosomale DNA-Moleküle sein, welche aus natürlich vorkommenden Materialien isoliert werden, cDNA-Moleküle, welche über den Umweg natürlicher mRNA hergestellt werden, chemisch synthetisierte DNA-Moleküle oder DNA-Moleküle, welche durch eine geeignete Kombination dieser eben aufgeführten beispielhaften Techniken hergestellt wurden (Referenzen 18 und 19).
Für den Fall, daß das Produkt in der Aminosäuresequenz Unterschiede (Substitution, Deletion oder Addition) zu dem eigentlich gewollten Material aufweist, jedoch weiterhin die erforderlichen Funktionen, wie physiologische Aktivität, aufweist, können entsprechende Modifikationen absichtlich durchgeführt werden. Wenn beispielsweise Methionin durch Bromcyan im oben erwähnten Linker-Abschnitt zu zersetzen ist, so können der oder die Methioninreste, die im gewünschten Protein auftreten, durch einen anderen Aminosäurerest oder andere Aminosäurereste ersetzt werden oder können auch deletiert werden. In diesem Fall ist es empfehlenswert, daß das auf der Grundlage der nach obigem Konzept entworfenen Basesequenz produzierte Polypeptid, daraufhin überprüft wird, ob seine Aktivität für den beabsichtigten Zweck geeignet ist oder nicht.
In bestimmten Fällen kann ein Teil des Aminosäurerestes in dem gewünschten Proteinprodukt verbleiben. Dies ist beispielsweise bei der chemischen Zersetzung von Cystein mit 2-Nitro-5thiocyanobenzoesäure der Fall. In diesem Falle ist es ebenfalls empfehlenswert, das Produkt hinsichtlich seiner Aktivität, wie oben erwähnt, zu überprüfen, um festzustellen, ob das Produkt für den beabsichtigten Zweck geeignet ist oder nicht.
Plasmide (Plasmide zur Rekombination) mit einer Basensequenz, welche das gesamte Polyhedrinprotein-Gen der Bombyx mori Nuklear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA) oder einen Teil davon und ein Strukturgen für das gewünschte Protein in miteinander verbundener Form (entweder mit oder ohne dazwischen liegendem Linker) enthalten, d. h. ein Gen für das Fusionsprotein aufweisen, welches darin insertiert ist, können unter Verwendung konventioneller, rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, wobei man käuflich erhältliche Plasmide, Restriktionsenzyme und andere Materialien verwendet. Die Produktion solcher Plasmide ist unter Berücksichtigung der später beschriebenen Beispiele routinemäßig durchführbar.
Zur Produktion rekombinanter Viren mit Hilfe der oben beschriebenen Plasmide werden Zellen einer etablierten Bombyx mori-Zellinie einer gemischten Infektion mit einem Plasmid zur Rekombination und mit BmNPV unterzogen, gegebenenfalls gefolgt von der Isolierung des rekombinanten Virus mit Hilfe der Plaque-Methode (Referenz 11) oder mit Hilfe der Verdünnungsmethode (Referenz 12), um einige Beispiele zu nennen. Geeignete etablierte Bombyx mori-Zellinien, welche verwendet werden können, umfassen die bekannten Bm-Zellen (BM-N Zellen, beschrieben in den Referenzen 1, 11 und 13; hinterlegt unter ATCC Nr. CRL-9910) und die BM-N Zellen, hinterlegt unter ATCC Nr. CRL-8851, um nur einige Beispiele zu nennen. Zur Produktion des gewünschten Materials in Seidenraupen werden die Seidenraupen mit Virus infiziert, indem man das Virus (entweder ein Gemisch der rekombinanten und nicht-rekombinanten Viren oder des daraus isolierten rekombinanten Virus), der in Zellkulturen vermehrt wurde, perkutan oder in eine Körperhöhle injiziert oder indem man das Virus über Monate hinweg zusammen mit Futter verabreicht. Anschließend füttert man die Seidenraupen mit künstlichem Futter oder mit Maulbeerblättern über einen Zeitraum von mehreren Tagen, um eine Akkumulierung des gewünschten Fusionsproteins zu erreichen. Im allgemeinen ist das Fusionsprotein in Wasser unlöslich und liegt suspendiert in einer Körperflüssigkeit der Seidenraupe vor und kann in üblicher Weise getrennt oder gereinigt werden, wie z. B. durch Chromatographie (Ionenaustauscherharz, Affinitätschromatographie, Gelpermeationschromatographie usw.), Zentrifugation, Extraktion und dergleichen.
Wird die Seidenraupe zerkleinert und mit einem Lösungsmittel, wie eine wäßrige SDS-Lösung, wäßrige Harnstofflösung, wäßrige alkalische Lösung und dergleichen, vermischt oder wird die Seidenraupe in Gegenwart eines solchen Lösungsmittels zerkleinert, so kann das Fusionsprotein in oben beschriebener Weise aus der Lösung abgetrennt oder gereinigt werden. Wenn das Fusionsprotein zu spalten ist, so kann eine Spaltungs-/Zersetzungsprozedur, wie oben beschrieben, durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele, in denen das gewünschte Protein die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II) und α-Interferon sind, dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung. Diese Beispiele bewirken jedoch keine Einschränkung des Schutzumfanges der Erfindung. Die Schemen zur Plasmidkonstruktion sind in den Fig. 1 bis 5 wiedergegeben. Werden keine anderen Angaben gemacht, so ist das 5'- (stromaufwärts gelegene) Ende der DNA-Sequenz auf der linken Seite und das 3p (stromabwturts gelegene) Ende auf der rechten Seite angegeben, wie dies üblicherweise der Fall ist.
Synthese, Spaltung, Screening, Isolierung und andere Behandlungen des Polyhedrinprotein-Gens, der Gene für die gewünschten Proteine und der Gene für die Fusionsproteine können unter Anwendung der in Referenz 1 beschriebenen Techniken sowie der üblicherweise verwendeten Genmanipulationstechniken (z. B. Referenzen 18 und 19) durchgeführt werden.

BEISPIEL 1

A. Konstruktion eines Plasmids ohne Polyhedrin-Gen

Das Plasmid pBmE36 (Referenz 1) spaltet man mit EcoRI glättet die Enden des Spaltproduktes mit Hilfe der DNA- Polymerase I (Klenow-Fragment) in Gegenwart von dNTP's (vier Deoxynukleosidtriphosphat-Spezies). Durch partielles Verdauen mit HindIII, gefolgt von einer Agarosegelelektrophorese, erhält man ein Polyhedringen enthaltendes Fragment. Unter Verwendung der T4-Ligase ligiert man das Fragment mit einem pUC9-Fragment, welches hergestellt wurde durch Spaltung von pUC9 (erhältlich von Pharmacia P-L Biochemicals) mit EcoRI, wobei man im Spaltprodukt mit Hilfe des Klenow-Fragmentes glatte Enden einführt und äußerem mit HindIII spaltet, um das Ligationsprodukt zu erhalten. Das erhaltene Ligationsprodukt verwendet man zur Transformation von Escherichia coli K-12JM83. Das Plasmid isoliert man dann und bezeichnet es als p9BmE36. (Das obige Verfahren ist in Referenz 19 beschrieben).
Eine EcoRV-Erkennungsstelle und eine AatI-Erkennungsstelle werden am Startcodon ATG und am Stopcodon TAA mit Hilfe der in vitro Mutagenese (Referenz 14) eingeführt. p9BmE36 behandelt man mit DNase I in Gegenwart von Ethidiumbromid, wobei man ein geschnittenes Plasmid erhält (Referenz 14), welches anschließend mit den folgenden beiden chemisch synthetisierten DNA-Fragmenten durch Annealing verbunden wird:
Durch anschließende Behandlung mit Polymerase I und T4- Ligase erhält man ein Heteroduplexplasmid, welches anschließend zur Transformation von Escherichia coli K-12JM83 verwendet wird. Die Transformation wird wiederum zur Herstellung einer gewünschten Mutante durchgeführt. Auf diese Weise erhält man das Plasmid p9BmM36.
Zur Eliminierung des Polyhedringens aus p9BmM36 und zur Insertion des Polylinkers werden die folgenden DNA-Fragmente (jeweils 38mer) chemisch synthetisiert:
CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG und
CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG
Diese beiden Fragmente sind zueinander komplementär und weisen SacI, SmaI, EcoRI, NcoI, EcoRV und XbaI Erkennungsstellen auf.
Die oben erwähnten beiden Fragmente werden an dem jeweiligen 5'-Ende mit Hilfe der T4-Kinase phosphoryliert und dann miteinander durch Annealing verbunden. Das nach Annealing erhaltene Produkt wird in Gegenwart von T4-Ligase mit einem Polyhedringen-freien Fragment ligiert, welches man durch Spaltung von p9BmM36 mit EcoRV und AatI erhält. Diese Prozedur führt zur Ausbildung einer BglII-Erkennungsstelle und einer AatI-Erkennungsstelle am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende des Linkers. Das resultierende Plasmid verwendet man zur Trapsformation von Escherichia coli K-12JM83 und wird anschließend isoliert und als pBM030 bezeichnet.
Die DNA-Sequenz und die Schnittstellen im Polylinkerabschnitt von pBM030 sind im folgenden gezeigt und dem Polyhedringen-Abschnitt von p9BmE36 gegenübergestellt.

B. Konstruktion eines Plasmids mit teilweise fehlendem Polyhedrin-Gen

Das Plasmid p9H18 (Referenz 1) wird mit EcoRI gespalten und anschließend mit Bal31 behandelt, um dadurch einen Teil von jeder Seite der Bindungsstelle abzuschneiden. Durch Variation der Bal31-Behandlungszeit erhält man Fragmente mit unterschiedlicher Länge. Diese Fragmente behandelt man mit HindIII und trennt durch Elektrophorese auf einem 0,7%-igen Agarosegel, gefolgt von einer Extraktion, wobei man verschiedene Virus-abgeleitete DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge erhält.
Das Plasmid pUC9 behandelt man mit SmaI und HindIII, gefolgt von einer Ligation mit den vorher erhaltenen DNA-Fragmenten (welche ein geglättetes Ende und ein HindIII-Ende besitzen). Unter Verwendung der auf diese Weise produzierten Plasmide wird Escherichia coli K-12JM83 transformiert und anschließend vermehrt. Man isoliert die Plasmide und bestimmt die Basensequenz vom 3'-Ende her für jedes Virus-abgeleitete Insert- DNA-Fragment mit Hilfe der Dideoxymethode (Referenz 15), wobei ein Primer (15-Basen Sequenzierprimer für M13) verwendet wird, woraus man den viralen Polyhedringen-Abschnitt identifiziert. Auf diese Weise findet man eine Basensequenz, welche der Aminosäuresequenz für das Polyhedrinprotein, beschrieben von Serebryani et al. (Referenz 16) entspricht, unter den Basensequenzen der viralen DNA-Fragmente. Das Translationsstartcodon ATG und das Stopcodon TAA wurden ebenfalls identifiziert.
Unter den verschiedenen Plasmiden (Plasmide der p9B-Serie), welche in Abhängigkeit von der Länge der Bal31-Behandlungszeit erhalten werden, werden diejenigen, welchen 212 bp, 338 bp, 662 bp und 727 bp stromabwärts vom Translationsstartcodon ATG für das Polyhedringen fehlen als p9B240, p9B120, p9B115 bzw. p9B086 bezeichnet. Das Polyhedringen weist einschließlich des Stopcodons TAA eine Länge von 738 bp auf.

C. Konstruktion eines Gens für ein Fusionsprotein, zusammengesetzt aus α-Interferon und Polyhedrin-Protein

pIFN2B310 (Referenz 1) spaltet man mit SmaI und isoliert ein α-IFN-J-Fragment durch Agarosegelelektrophorese. Dieses ligiert man mit SmaI-gespaltenem pBM030, unter Verwendung von T4-Ligase und verwendet das resultierende Plasmid zur Transformation von Escherichia coli K-12JM83. Das rekombinante Plasmid bezeichnet man als pBT310, nachdem festgestellt wurde, daß das α-IFN-J-Gen in richtiger Richtung insertiert ist.
pBT310 spaltet man mit BglII und führt in das Spaltprodukt mit Hilfe des Klenow-Fragments in Gegenwart von dNTP's gerade Enden ein und spaltet anschließend mit ScaI. Durch Agarosegelelektrophorese isoliert man ein α-IFN-J-Gen enthaltendes Fragment.
p9B086 spaltet man mit EcoRI und ScaI und isoliert ein Polyhedrin-Gen enthaltendes Fragment durch Agarosegel-elektrophorese. In dieses Fragment führt man gerade Enden mit Hilfe der S1-Nuklease ein und ligiert mit dem oben erwähnten α-IFN-J- Gen-haltigen Fragment unter Verwendung der T4-Ligase. Man transformiert Escherichia coli K-12JM83 mit dem resultierenden Plasmid. Mit Hilfe der Dideoxymethode überprüft man, daß die DNA-Sequenz des Linkerabschnittes in dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid korrekt ist. Das Plasmid wird mit pIFNF086 bezeichnet.
Die DNA-Sequenz für den Linkerabschnitt ist folgende:

D. Konstruktion eines Gens für ein Fusionsprotein, zusammengesetzt aus IGF-I und Polyhedrin-Protein

Man isoliert das Plasmid pIGF001 aus Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) und spalter mit SalI. In das Spaltprodukt führt man mit Hilfe des Kenow-Fragmentes in Gegenwart von dNTP's gerade Enden ein und spaltet mit AvaII und isoliert ein IGF-I-Gen-haltiges Fragment durch Polyacrylamidgelelektrophorese.
In einem anderen Ansatz spaltet man pBM03O mit EcoRV und SacI.
Es wurde gefunden, daß die Aminosäuresequenz Ile-Glu-Gly- Arg zwischen dem Polyhedrin-Protein und IGF-I bei dem produzierten Fusionsprotein eingefügt werden sollte, so daß das Fusionsprotein erkannt und durch den Blutgerinnungsfaktor Xa (F-Xa) gespalten werden kann. Zu diesem Zweck werden die folgenden beiden DNA-Fragmente chemisch synthetisiert:
ATTGAAGGCAGAG (13mer) und
GACCTCTGCCTTCAATAGCT (20mer).
Diese beiden Fragmente sind zueinander komplementär und bilden nach dem Annealing am stromaufwärts gelegenen Ende ein kohäsives Ende, welches mit einem SacI geschnittenen Ende verbunden werden kann und bilden am stromabwärts gelegenen Ende ein kohäsives Ende, welches mit einem AvaII geschnittenen Ende verbunden werden kann.
Diese beiden Fragmente werden jeweils am 5'-Ende mit Hilfe der T4-Kinase phosphoryliert und miteinander durch Annealing verbunden. Das durch Annealing erhaltene Produkt, das obenerwähnte IGF-I-Fragment und das obenerwähnte gespaltene Plasmid pBM030 werden unter Verwendung der T4-Ligase miteinander ligiert. Mit dem Ligationsprodukt transformiert man Escherichia coli K-12JM83, um ein Plasmid herzustellen. Durch DNA-Sequenzierung mit Hilfe der Dideoxymethode bestätigt man, daß eine korrekte Bindung zwischen der F-Xa-Erkennungsstelle und dem IGF-I-Gen in dem Plasmid (pIFG-I030) vorliegt. pIGF-I030 spaltet man mit BglII und führt anschließend mit Hilfe des Klenow- Fragmentes in Gegenwart von dNTP's gerade Enden ein, spaltet mit ScaI und isoliert ein IGF-I-Gen enthaltendes Fragment durch Agarosegelelektrophorse.
In einem getrennten Ansatz spaltet man p9B086 mit EcoRI und ScaI und führt mit der S1-Nuklease gerade Enden ein, isoliert das Polyhedringen-haltige Fragment durch Agarosegelelektrophorese und ligiert mit dem oben erwähnten IGF-I-Gen-haltigen Fragment mit Hilfe der T4-Ligase. Escherichia coli K-12JM83 transformiert man mit dem resultierenden Plasmid und erhält ein Plasmid, welches das durch korrekte Ligation konstruierte Fusionsprotein enthält. Das Plasmid wird als pIGF-IF086 bezeichnet. Die DNA-Sequenz des Linker-Abschnitts ist im folgenden gezeigt.

E. Konstruktion eines Gens eines Fusionsproteins, zusammengesetzt aus IGF-II- und Polyhedrin-Proteinen unterschiedlicher Länge

Das Plasmid pIGF002 wird aus Escherichia coli K12 MC1061 IGF002 (FERM BP-933) isoliert, teilweise mit SalI verdaut, an den Enden in Gegenwart von dNTP's mit Hilfe des Klenow-Fragments geglättet und anschließend mit HaeIII gespalten. Dann führt man eine Polyacrylamidgelelektrophorese durch, mit deren Hilfe man ein IGF-II-Gen-haltiges Fragment isoliert. Dieses Fragment ligiert man mit SmaI-gespaltenem Plasmid pBM030, wobei man T4-Ligase verwendet. Das Ligationsprodukt verwendet man zur Transformation von Escherichia coli K12JM83. Für die auf diese Weise erhaltene Transformante überprüft man, daß sie ein Plasmid (pIGF-II030) enthält, worin das IGF-II-Gen in richtiger Orientierung insertiert ist.
pIGF-II030 verdaut man teilweise mit EcoRI und spaltet anschließend mit ScaI und isoliert ein IGF-II-Gen enthaltendes Fragment durch Agarosegelelektrophorese. Dieses Fragment ligiert man in Gegenwart von T4-Ligase mit einem Fragment, welches einen Teil des Polyhedrin-Gens enthält und durch Agarosegelelektrophorese nach Spaltung der Plasmide p9B240, p9B120 bzw. p9B115 mit EcoRI und SacI isoliert wurde.
Escherichia coli K-12JM83 transformiert man mit den resultierenden Plasmiden. Durch DNA-Sequenzierung mit Hilfe der Dideoxymethode wird bestätigt, daß die von den resultierenden Transformanten getragenen Plasmide das jeweils konstruierte Fusionsproteingen in der richtigen Weise enthalten.
Diese Plasmide bezeichnet man als pIGF-IIF240, pIGF-IIF120 bzw. pIGF-IIF115.
Die DNA-Sequenz für die Linker-Abschnitte in dem jeweiligen Plasmid sind im folgenden angegeben:

BEISPIEL 2

Transfektion von Bm-Zellen

Virale DNA des BmNPV T3-Stammes (ATCC Nr. 40188) und pIFNF086 mischt man in einem molaren Verhältnis von 1:100 mit den Lösungen I und II, welche die folgenden Zusammensetzungen aufweisen:
I. Destilliertes Wasser 2,1 ml
Träger DNA (Lachstestikel, 1 mg/ml) 50 ul
BmNPV DNA 10 ul
pIFNF086 DNA 50 ug
2 M Calciumchlorid 300 ug
II. 50 mM HEPES Puffer (pH 7,1) enthaltend 0,28 M Natriumchlorid 2,5 ml
Phosphatpuffer (35 mM Na&sub2;HPO&sub4;35 mM NaH&sub2;PO&sub4;) 50 ul
Eine 1 ml-Portion der resultierenden Suspension gibt man zu 4 ml eines Bm-Zellen-Kulturmediums (TC-10 Medium, enthaltend 10% fetales Kälberserum; Referenz 17) und das Gemisch gibt man zu den Bm-Zellen (ATCC Nr. CRL-8910, 2·6&sup6; Zellen), wodurch die obenerwähnte DNA in die Bm-Zellen eingeführt wird. 20 h später erneuert man das Medium. Nach einer weiteren 5-tägigen Inkubation isoliert man das Medium und zentrifugiert und führt mit dem Überstand einen Plaque-Test durch (Referenz 11), wobei der rekombinante Virus in Form eines Klones isoliert wird. Diesen bezeichnet man als vIFNF086.
In gleicher Weise erhält man rekombinante virale Klone vIGF-IF086, vIGHF-IIF240, vIGF-IIF120 und vIGF-IIF115, indem man die Plasmide pIGF-IF086, pIGF-IIF240, pIGF-IIF120 bzw. pIGF-IIF115 verwendet.

BEISPIEL 3

Expression von Fusionsprotein in Bm-Zellen

Bm-Zellen (ATCC Nr. CRL-8910, 2·10&sup6; Zellen) infiziert man mit vIFNF086 durch Zugabe einer vIFNF086-Suspension (5·10&sup7; pfu). 30 min später verwirft man den Überstand, gibt 4,5 ml frisches Medium hinzu und inkubiert 4 Tage bei 25ºC. Anschließend zentrifugiert man die Kultur (1000 Upm, 10 min), wobei man ein Präzipitat erhält. Eine frische 500 ul-Portion des Mediums gibt man zu dem Präzipitat hinzu und zentrifugiert das Gemisch (15000 Upm, 10 min) nach 5-maligem Wiederholen eines Gefrier- Auftau-Zyklus. Das auf diese Weise isolierte Präzipitat versetzt man mit 200 ul einer 4%-igen Natriumdodecylsulfat (SDS)10%-igen Mercaptoethanollösung. Eine 5 ul Portion der resultierenden Lösung verwendet man als Probe für eine SDS-14% -Acrylamidgelelektrophorese.
Nach der Elektrophorese beobachtet man eine Bande auf dem Gel, welche dem erwarteten Fusionsprotein entspricht. Zu diesem Zweck bestimmt man die Dichte der Bande mit Hilfe eines Densitometers und vergleicht mit der Dichte der jeweiligen Marker (jede Markerbande enthält 1 ug Protein). Die auf diese Weise geschätzte Ausbeute beträgt 0,3 mg/ml der zuerst erhaltenen Zellkulturbrühe. Da der IFN-Anteil etwa 40% dieses Fusionsproteins auf Molekulargewichtsbasis ausmacht, entspricht diese Ausbeute einer IFN-Ausbeute von 0,12 mg/ml nach erfolgreicher Spaltung und IFN-Isolierung. Diese Ausbeute ist mehr als 20fach höher im Vergleich zu dem Wert von 5·10&sup6; Units/ml (der 0,005 mg/ml entspricht) und den man gemäß dem Bericht über die Expression von IFN in Bombyx mori-Zellen erhält (Referenz 1).
Die Ausbeuten an Fusionsproteinen, welche von Bm-Zellen produziert werden, die mit vIGF-IF086, vIGF-IIF240, vIGF-IIF120 und vIGF-IIF1l5 infiziert wurden, betragen nach Messung in der oben beschriebenen Weise 0,5 mg, 0,1 mg, 0,4 mg bzw. 0,5 mg pro Milliliter Zellkulturbrühe, oder, ausdedrückt in Mengen an IGF- I oder IGF-II, die in den Fusionsproteinen enthalten sind, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml bzw. 0,1 mg/ml.

BEISPIEL 4

A. Expression von Fusionsprotein in Bm-Zellen

Bm-Zellen (ATCC Nr. CRL-8910, 2·10&sup6; Zellen) infiziert man mit vIGF-IIF120 durch Zugabe einer vIGF-IIF120-Suspension (5·10&sup7; pfu). 30 min später entfernt man das Virus, gibt eine frische 4,5 ml-Portion Medium hinzu, inkubiert 4 Tage bei 25ºC und zentrifugiert anschließend die Kulturbrühe (1000 Upm, 10 min). Zu dem auf diese Weise isolierten Präzipität gibt man 500 ul frisches Medium hinzu. Nach 5-maliger Wiederholung eines Gefrier-Auftau-Zyklus zentrifugiert man das Gemisch (15 000 Upm, 10 min), wobei man ein Präzipitat erhält. Diesen Niederschlag wäscht man mit destilliertem Wasser, löst in 0,5% SDS und führt eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie durch [HPLC: TSK Gel Phenyl 5PWRP (hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); Lösungsmittelsystem: 0,1% Trifluoressigsäure - 20-75% Acetronitril mit einem linearen Konzentrationsgradienten]. Auf diese Weise isoliert man eine 2 ml-Fraktion, welche das Fusionsprotein enthält.

B. Spaltung mit Bromcyan (BrCN)

Zum dieser Fraktion gibt man 50 ul 1% SDS, konzentriert das Gemisch bis zur Trockene und löst das Konzentrat in 50 ul destilliertem Wasser. Zu 15 ul der Lösung gibt man 35 ul Ameisensäure und 45 ul 70%-ige Ameisensäure, gefolgt von einer weiteren Zugabe von 5 ul Bromcyanlösung (200 uMol/ml) in 70% Ameisensäure. Nach 24-stündiger Reaktion bei Zimmertemperatur konzentriert man das Reaktionsgemisch bis zur Trockene, löst das Konzentrat in 7,5 ul destilliertem Wasser und führt mit der Lösung eine Elektrophorese durch, wobei man eine Bande erhält, die IGF-II entspricht.
Bei Durchführung der SDS-16% -Polyacrylamidgelelektrophorese ergibt die Fraktion, die man durch Extraktion der vIGF- IIF120-infizierten Bm-Zellen mit wäßriger SDS-Lösung anschließende teilweise Reinigung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie erhält, eine etwa 23 K große Bande, die dem Fusionsprotein entspricht, welches aus dem Polyhedrinprotein (partiell) und IGF-II zusammengesetzt ist, während man nach Bromcyanspaltung ein Produkt erhält, welches eine 7 K Bande zeigt, die dem IGF-II entspricht, und wobei man mehrere Banden bei 10-14 K erhält, welche wahrscheinlich Zersetzungsprodukten des Polyhedrin-Proteins entsprechen (vgl. Fig. 8; worin A die Marker bezeichnet, B das Fusionsprotein bezeichnet und C das Bromcyanzersetzungsprodukt bezeichnet).

C. Bestimmung des N-terminalen Endes von IGF-II

In ähnlicher Weise wie oben beschrieben erhält man etwa 20 mg des Fusionsproteins aus einer 50 ml Kultur von Bm-Zellen, welche mit vIGF-IIF120 infiziert wurden, nach Spaltung des Fusionsproteins mit Bromcyan und Konzentrieren des Reaktionsgemisches.
Das Konzentrat löst man in 5 ml 200 mM Pyridin-Essigsäure- Puffer (pH 3,0) und führt mit der Lösung eine Säulenchromatographie [SP-Toyopearl (hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); Lösungsmittelsystem: 200 mM Pyridin-Essigsäure-Puffer (pH 3,0) - 2,0 M PyridinEssigsäure-Puffer (pH 5,0) mit einem linearen Konzentrationsgradienten] durch. Hierbei isoliert man eine Fraktion, welche IGF-II enthält. Diese Fraktion lyophilisiert man, löst in destilliertem Wasser auf und führt eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie durch [HPLC: ODS-12OT (hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); Lösungsmittelsystem: 0,1% Trifluoressigsäure - 10-65% Acetonitril mit einem linearen Konzentrationsgradienten]. Mit dem auf diese Weise erhaltenen reinen IGF-II führt man eine Peptidsequenzierung durch [470A Protein Sequencer (hergestellt von Applied Biosystems)]. Die aminoterminale Aminosäuresequenz von IGF-II, die auf diese Weise bestätigt wurde, ist im folgenden angegeben:
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu
Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser

BEISPIEL 5

A. Expression von Fusionsprotein in Bm-Zellen

Das Plasmid pIGF001 isoliert man aus Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) und spaltet mit SalI. In das Spaltungsprodukt führt man mit Hilfe des Klenow-Fragments in Gegenwart von dNTP's gerade Enden ein und spaltet mit AvaII und isoliert ein IGF-I-Gen-haltiges Fragment durch Polyacrylamidgelelektrophorese.
Getrennt davon spaltet man pIGF-IIF120 mit EcoRV und EcoRI und entfernt das IGF-II-Gen enthaltende Fragment.
Die Aminosäuresequenz Gly-Pro-Ala wird mehrfach zwischen dem Polyhedrinprotein und IGF-I bei der Produktion des Fusionsproteins eingefügt, so daß das Fusionsprotein durch eine Kollagenase erkannt und gespalten werden kann, welche die Aminosäuresequenz Pro-Ama-Gly-Pro erkennt (Ama: eine beliebige Aminosäure) und zwischen Ama und Gly spaltet. Zu diesem Zweck werden die folgenden DNA-Fragmente chemisch synthetisiert:
AATTGGGCCCAGCTGGTCCAGCTGGTCCCGCGGGTGAATTCATTGAAGGCAGAG
(54mer)
GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC
(53mer)
Diese beiden Fragmente sind zueinander komplementär und bilden nach dem Annealing am stromaufwärts gelegenen Ende ein kohäsives Ende, welches mit einem EcoRI geschnittenen Ende verbunden werden kann und am stromabwärts gelegenen Ende, ein kohäsives Ende, welches mit einem AvaII geschnittenen Ende verbunden werden kann.
Diese beiden Fragmente werden jeweils am 5'-Ende mit Hilfe der T4-Kinase phosphoryliert und miteinander durch Annealing verbunden. Das durch Annealing erhaltene Produkt, das oben erwähnte IGF-I-Fragment und das oben erwähnte gespaltene pIGF- IIF120 werden miteinander mit Hilfe der T4-Ligase ligiert. Escherichia coli H-12JM83 transformiert man mit dem Ligations- Produkt, wobei man ein Plasmid mit der Bezeichnung pIGF-IF120 erhält. Die DNA-Sequenzierung mit Hilfe der Dideoxymethode ergab, daß die Verbindung zwischen der Kollagenase-Erkennungsstelle und dem IGF-I-Gen in diesem Plasmid korrekt ausgebildet war. Die DNA-Sequenz des Linker-Abschnittes ist im folgenden gezeigt.
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, erhält man durch Verwendung von pIGF-IF120 das rekombinante Virus vIGF-IF120.
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 4(a) beschrieben, infiziert man Bm-Zellen mit vIGF-IF120 und nach Gefrieren und Auftauen der aus einer 50 ml Kulturbrühe isolierten Bm-Zellen zentrifugiert man die Zellen (15 000 Upm, 10 min), wobei man einen Niederschlag erhält. Diesen Niederschlag löst in einer 6 M Guanidin-Hydrochloridlösung und zentrifugiert (15 000 Upm, 5 min), um einen Rückstand zu entfernen. Die Lösung dialysiert man gegen destilliertes Wasser und isoliert den resultierenden Niederschlag durch Zentrifugation (15 000 Upm, 10 min).

B. Spaltung mit Kollagenase

Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat löst man in 800 ul einer 10 M Harnstofflösung und gibt anschließend 100 ul 200 mM Calciumchlorid, 200 ul 250 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,4) und 900 ul Kollagenaselösung (hergestellt von Sigma Chemical Co.) (1 500 U/ml) hinzu. Nach 2-stündiger Inkubation bei 30ºC zentrifugiert man das Gemisch (15 000 Upm, 5 min) und isoliert den Überstand. Diesen Überstand unterzieht man einer Ionenaustauscher-Chromatographie [DEAE-Toyopearl (hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); Lösungsmittelsystem: 25 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,4)]. Auf diese Weise isoliert man eine Fraktion, welche IGF-I mit zusätzlichen Aminosäureresten am aminoterminalen Ende aufweist (im folgenden abgekürzt als "IGF-IP").

C. Bestimmung des N-terminalen Endes von IGP-IP

Die IGF-IP enthaltende Fraktion konzentriert man und führt mit dem Konzentrat eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie durch [HPLC: RPSC (hergestellt von Beckman Co.); Lösungsmittelsystem: 0,1% Trifluoressigsäure - 10-65% Acetonitril mit linearem Konzentrationsgradienten). Mit dem auf diese Weise erhaltenen IGF-IP führt man eine Peptidsequenzierung durch (470A Protein Sequencer (hergestellt von Applied Biosystems)]. Dabei ergibt sich, daß das Fusionsprotein durch Kollagenase an der vorherbestimmen Stelle gespalten wird. Die aminoterminale Aminosäuresequenz des auf diese Weise erhaltenen IGF-IP lautet wie folgt:
Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu- Cys-Gly-Ala-Glu-Leu

BEISPIEL 6

Expression von Polyhedrin-IGF-I-Fusionsprotein in Seidenraupen (Bombyx mori)

In Seidenraupen (Bombyx mori) injiziert man am Tag 1 des 5. Instars perkutan eine vIGF-IF086-Suspension in einer Dosis von 0,5 ml/Kopf (10&sup7; pfu) und verfüttert anschließend 3 Tage lang bei 25ºC Maulbeerblätter. Anschließend führt man eine Sammelnadel in den abdomalen Fortsatz ein und sammelt Körperflüssigkeit in einem eisgekühlten Eppendorf-Gefäß. Die Körperflüssigkeit zentrifugiert man (15 000 Upm, 10 min), löst den Niederschlag in 200 ul 4% SDS-10% Mercaptoethanol und verwendet eine 2 ul Portion der resultierenden Lösung als Probe für eine SDS-14%-Acrylamidgelelektrophorese. Man beobachtet eine Bande auf dem Gel nach der Elektrophorese, die dem Fusionsprotein entspricht. Die Dichte der Bande wird mit Hilfe eines Densitometers bestimmt und mit der Dichte eines jeden Markers (jede Bande enthält 1 ug Protein) verglichen. Die auf diese Weise ermittelte Ausbeute beträgt 5 mg/ml Körperflüssigkeit (eine Berechnung auf Basis des Molekulargewichts ergibt, daß IGF-I in einer Ausbeute von 1 mg/ml nach Abtrennung von IGF-I aus dem Fusionsprotein erhalten werden könnte).
Bei der SDS-14%-Polyacrylamidgelelektrophorese der Körperflüssigkeit, die man aus Seidenraupen erhält, welche mit BmNPV- T3 infiziert wurden, erhält man eine andere Bande bei etwa 30 K, die dem Polyhedrinprotein entspricht, während die Körperflüssigkeit aus vIGF-IF086-infizierten Seitenraupen keine Bande ergibt, die dem Polyhedrinprotein entspricht, jedoch eine Bande bei etwa 36 K ergibt, welche charakteristisch für das Fusionsprotein aus Polyhedrinprotein und IGF-I ist (vgl. Fig. 7; worin A Marker, B Körperflüssigkeit nach Infektion mit vIGF-IF086 und C Körperflüssigkeit nach Infektion mit BmNPV-T3 bezeichnet).
Die DNA-Sequenzen für das synthetische Gen von IGF-I und für das synthetische Gen für IGF-II, welche in den obigen Beispielen verwendet werden, sind zusammen mit den entsprechenden Aminosäuresequenzen im folgenden gezeigt.

Referenzen:

1: Nature, 315, 592 (1985)
2: Science, 198, 1056 (1977)
3: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 145289/79 (Der hierin verwendete Ausdruck "OPI" steht für "ungeprüfte veröffentlichte Anmeldung")
4: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 19092/80
5: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 45395/80
6: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 104886/80
7: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 145221/81
8: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 166200/81
9: Nature, 309, 810 (1984)
10: Nature, 285, 456 (1980)
11: J. Seric. Sci. Jpn, 53, 547 (1984)
12: J. Invertebr. Pathol., 29, 304 (1977)
13: Appl. Environ. Microbiol., 44, 227 (1982)
14: Nucleic Acids Res., 9, 3647 (1981)
15: Science, 214, 1205 (1981)
16: J. Invertebr. Pathol., 30, 442 (1977)
17: J. Invertebr. Pathol., 25, 363 (1975)
18: Am. J. Hum. Genet., 31, 531 (1979)
19: T. Maniatis et al.: Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

Claims

1. Rekombinantes Bombyx mori-Nuclear Polyhedrosis Virus, das in dem Strukturgenabschnitt aus der Bombyx mori-Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA), der für das Polyhedrinprotein kodiert, ein Strukturgen für ein bestimmtes Protein aufweist, welches mit dem gesamten Strukturgen, welches für das Polyhedrinprotein kodiert, oder mit einem Teil davon mit oder ohne einer zwischengelagerten Linker-Basensequenz verbunden ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wobei man

ein rekombinantes Nuclear Polyhedrosis Virus konstruiert, das in einem Strukturgenabschnitt aus der Bombyx mori-Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA), der für das Polyhedrinprotein kodiert, ein Strukturgen für ein bestimmtes Protein aufweist, welches mit dem gesamten Strukturgen, welches für das Polyhedrinprotein kodiert, oder mit einem Teil davon mit oder ohne einer zwischengelagerten Linker-Basensequenz verbunden ist, und

das Virus vermehrt, wodurch ein Fusionsprotein produziert wird, welches aus dem gewünschten Protein und dem ganzen Polyhedrinprotein oder einem Teil davon besteht, die mit oder ohne dazwischenliegender Linker-Aminosäure oder dazwischenliegendem Linker-Peptid miteinander verbunden sind.

3. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins, wobei man ein rekombinantes Nuclear Polyhedrosis Virus konstruiert, das einen Strukturgenabschnitt aus der Bombyx mori- Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA), der für das Polyhedrinprotein kodiert, ein Strukturgen für ein bestimmtes Protein aufweist, welches mit dem gesamten Strukturgen, welches für das Polyhedrinprotein kodiert, oder mit einem Teil davon mit oder ohne einer zwischengelagerten Linker-Basensequenz verbunden ist,

das Virus vermehrt, wodurch ein Fusionsprotein produziert wird, welches aus dem gewünschten Protein und dem ganzen Polyhedrinprotein oder einem Teil davon besteht, die mit oder ohne dazwischenliegender Linker-Aminosäure oder dazwischenliegendem Linker-Peptid miteinander verbunden sind, und

anschließend das Fusionsprotein an der Linker-Position spaltet, wodurch man das gewünschte Protein herstellt.

4. Plasmid, enthaltend eine 5'-stromaufwärts gelegene Basensequenz, umfassend den Promoterabschnitt der Bombyx mori- Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA), das gesamte, für das Polyhedrinprotein kodierende Strukturgen der BmNPV DNA oder einen Teil davon, gegebenenfalls eine Linker-Basensequenz, ein Strukturgen für das gewünschte Protein (gegebenenfalls umfassend eine Basensequenz für den Terminator des gewünschten Proteins), und eine 3'-stromabwärts gelegene Basensequenz, enthaltend den Terminatorabschnitt der BmNPV DNA.

5. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Bombyx mori- Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA), wobei man eine kultivierte Bombyx mori-Zellinie oder einen Bombyx mori-Stamm mit einer Bombyx mori-Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA) und einem Plasmid cotransfiziert, welches eine 5'-stromaufwärts gelegene Basensequenz, umfassend den Promoterabschnitt der Bombyx mori-Nuclear Polyhedrosis Virus DNA (BmNPV DNA), das gesamte, für das Polyhedrinprotein kodierende Strukturgen der BmNPV DNA oder einen Teil davon, gegebenenfalls eine Linker- Basensequenz, ein Strukturgen für das gewünschte Protein (gegebenenfalls umfassend eine Basensequenz für den Terminator des gewünschten Proteins), und eine 3'-stromabwärts gelegene Basensequenz, enthaltend den Terminatorabschnitt der BmNPV DNA, umfaßt.