DE3586750T2

DE3586750T2 - Rekombinante fusionsproteine.

Info

Publication number: DE3586750T2
Application number: DE8585303414T
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nagai; Hans Christian Thogersen
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1984-05-16
Filing date: 1985-05-15
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2005-05-16
Also published as: DK217985A; EP0161937A3; DE3586750D1; EP0161937B1; AU4247485A; CA1340381C; US6010883A; DK217985D0; GB8412517D0; GB8512333D0; AU585857B2; ATE81529T1; JPH074253B2; GB2160206A; GB2160206B; EP0161937A2; DK171278B1; JPS61135591A

Description

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie und insbesondere mit rekombinanten Fusionsproteinen sowie mit Verfahren zur Spaltung derartiger Fusionsproteine, um Fremdgenprodukte in nativer Form zu gewinnen.
In den letzten Jahren machten die Entwicklungen auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie die Expression einer Vielzahl geklonter Fremdgene in Wirtsorganismen, wie in Bakterien und Hefen, möglich. Es kamen dabei zwei hauptsächliche Methoden zum Einsatz.
Bei einer Methode wurde die Expression des Fremdgens unter die direkte Kontrolle von Expressionssteuerungssequenzen des Wirtes, z. B. einen E. coli-Promotor und eine Shine-Delgarno-Sequenz, gestellt, um nichtfusionierte Fremdprotein- und Fremdpolypeptidprodukte zu gewinnen. Diese Methode hat jedoch verschiedene Nachteile.
Hochgradige Expression in E. coli erwies sich bei vielen eukaryotischen Genen als schwierig, selbst wenn ein starker Promotor, wie der E. coli-lambda-PL- oder Trp-Promotor, und die Shine-Delgarno-Sequenz eines hochgradig exprimierten E. coli-Gens vor der Fremdgensequenz eingesetzt wurden. Diese Schwierigkeiten ergeben sich offenbar dadurch, daß die Sekundärstruktur der mRNA in der Nachbarschaft der Shine-Delgarno- Sequenz die Erreichbarkeit der mRNA durch das Ribosom und infolgedessen den Wirkungsgrad der Translation beeinflußt. Da die Sekundärstruktur von der dem Initiationscodon folgenden Sequenz, d. h. der Fremdgen- Sequenz, abhängt, ergeben solche Konstruktionen oft eine geringe Translationswirkung.
Auch haben viele in E. coli exprimierte Proteine einen zusätzlichen Methionin-Aminosäurerest an ihrer N-Endstelle, der aus dem zur Initiierung der Translation erforderlichen ATG-Initiationscodon an dem 5'-Ende des Fremdgens stammt. Die Anwesenheit dieses zusätzlichen N-terminalen Methionins ist unerwünscht, da es die Stabilität und die Aktivität des Proteins beeinflussen und bei klinischer Verwendung des Proteins Probleme mit der Antigenizität verursachen kann.
Außerdem unterliegen direkt exprimierte Fremdgenprodukte, insbesondere, wenn sie relativ kleine Polypeptide sind, wie manche Hormone, einer proteolytischen Umwandlung innerhalb der Zellen des Wirtsorganismus. Das führt zu sehr niedrigen Anreicherungsniveaus des Fremdgenproduktes innerhalb der Wirtszellen.
Bei einer anderen Methode wurden viele eukaryotische Proteine in grober Menge in E. coli in Form von hybriden Fusionsproteinen produziert, die durch Fusion der Fremdgensequenz an die Codierungssequenz eines hochgradig exprimierten E. coli-Gens, wie den lacZ-, tufB-, bla-, lambda-CII- und lambda-N-Genen, erhalten werden. In derartigen Konstruktionen liefert die fortlaufende Translation von dem Bakterien-Gen eine hochgradige Translationswirkung. Außerdem kann die Anwesenheit eines an das Fremdgenprodukt fusionierten bakteriellen Proteins das Fusionsprotein gegen proteolytische Umwandung resistent machen und kann auch eine Aufteilung des Fusionsproteins innerhalb der Wirtszellen oder dessen Ausscheidung aus denselben bewirken. Durch Expression von Fusionsproteinen können auch Substanzen, die möglicherweise biologisch unsicher sind, wie Peptidhormone, in einer in aktiven "Pro-Form" produziert werden, welche dann in vitro durch spezifische Spaltung aktiviert werden kann.
Solche Hybrid-Fusionsproteine selbst sind jedoch normalerweise als Endprodukte, z. B. für den klinischen Einsatz, nicht geeignet und es ist notwendig, das Fusionsprotein spezifisch zu spalten, um das Fremdgenprodukt in nativer Form freizusetzen. Es wurden spezifische einzelne oder doppelte Aminosäurespaltstellen innerhalb der Fusionsproteine an der Verbindung zwischen dem E. coli-Protein und dem eukaryotischen Protein vorgesehen. Beispielsweise wurde eine chemische Behandlung mit Bromcyan zur Spaltung an einzelnen Methionin-Aminosäurespaltstellen eingesetzt oder es wurde eine enzymatische Trypsin-Behandlung zur Spaltung an einzelnen Arginin- oder Lysin-Spaltstellen oder an doppelten Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysin-Spaltstellen verwendet. Solche einzelne oder doppelte wiederholte Aminosäurespaltstellen sind jedoch nur begrenzt einsetzbar, denn wenn die Aminosäuren der Spaltstelle innerhalb der Aminosäuresequenz des Fremdgenproduktes ebenfalls vorliegen, wird die Spaltungsbehandlung zu unerwünschter Aufspaltung des Fremdproteins ebenso wie zur Spaltung an der Verbindungsstelle des Fusionsproteins führen.
Die EP-A-0 035384 (The Regents of the University of California) beschreibt die Verwendung von spezifischen Spaltungslinkern an der Verbindung zwischen Wirts-DNA- und Fremd-DNA-Sequenzen bei der Konstruktion von rekombinanten DNA-Sequenzen, die für Fusionsproteine codieren. Diese enthalten Spaltungslinker, die für verlängerte spezifische Spaltungssequenzen codieren, in denen eine Sequenz von zumindest zwei unterschiedlichen Aminosäuren vorgesehen ist, die eine spezifische Enzymspaltungsstelle zur Verfügung stellt. Je größer die Anzahl der Aminosäurereste in der spezifischen Spaltungssequenz ist, umso geringer ist die Wahrscheinlichkeit, daß eine ähnliche Sequenz innerhalb der Aminosäuresequenz des Fremdgenproduktes vorkommt, und umso kleiner ist das Risiko einer unerwünschten Spaltung des Fremdproteins. Die EP-A-0 035384 beschreibt speziell die Verwendung eines Spaltungslinkers mit der Sequenz X-(Asp)n-Lys-Y, worin n für 2 bis 4 steht, der an der Carboxylseite des Lys durch Enterokinase spezifisch gespalten wird. Die in der EP-A- 0035384 beschriebenen Spaltungsstellen sind jedoch zur Verwendung bei der Spaltung von Fusionsproteinen nicht ganz zufriedenstellend. Beispielsweise wurde gezeigt (Anderson et al., Biochemistry 16, 3354- (1977)), daß die Enterokinase die Prococoonase an der der Sequenz Gly-Gly-Lys folgenden Peptidbindung spaltet, und daher scheint es, daß die Enterokinase-Spaltung nicht allein von der Sequenz X-(Asp)n-Lys-Y abhängig ist.
Wir haben nun verbesserte Spaltungslinker zur Verwendung bei der Konstruktion rekombinanter DNA-Sequenzen, die für Fusionsproteine codieren, entwickelt. Jeder Linker codiert für eine Enzymspaltungsstelle, die eine Sequenz von 4 verschiedenen Aminosäuren umfaßt. Diese Spaltungsstellen finden sich in anderen Proteinsequenzen nur selten und daher sind diese Spaltungsstellen zur Verwendung bei der Spaltung einer sehr groben Menge rekombinanter Fusionsproteine geeignet. Außerdem scheint es, daß die Spaltung durch das Enzym an diesen Stellen nicht von der allgemeinen dreidimensionalen Proteinstruktur abhängig ist, wie dies bei anderen verlängerten spezifischen Spaltungsstellen, wie etwa bei den früher vorgeschlagenen, der Fall sein kann, wobei die Spaltung jedoch streng sequenzspezifisch ist.
Dementsprechend schlägt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz vor, die für eine spezifisch durch den Blutkoagulationsfaktor Xa spaltbare Spaltungsstelle codiert.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der eine für eine Spaltungsstelle codierende DNA-Sequenz enthält, welche Spaltungsstelle durch den Blutkoagulationsfaktor Xa spezifisch gespalten wird, und betrifft auch die mit einem solchen Vektor transformierten Wirtsorganismen.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fremdgenproduktes in nativer Form, bei welchem Verfahren Wirtsorganismen mit einem Vektor transformiert werden, der DNA-Sequenzen enthält, die für das Fremdgenprodukt und zumindest eine durch den Blutkoagulationsfaktor Xa spezifisch spaltbare Spaltungsstelle codieren, wobei das Fremdgenprodukt von den transformierten Organismen als Fusionsprotein exprimiert und das Fusionsprotein durch Behandlung mit dem aktivierten Blutkoagulationsfaktor X gespalten wird, um das Fremdgenprodukt in nativer Form zu gewinnen.
In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck "in nativer Form" auf ein Polypeptid oder Protein, das dessen Aminosäuresequenz ohne zusätzliche Aminosäurereste, z. B. zusätzliche N-terminale Aminosäurereste, wie einen N-terminalen Methionin-Aminosäurerest oder N-terminale Wirtsprotein-Aminosäurereste, enthält.
Ebenso bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung der Ausdruck Blutkoagulationsfaktor Xa auf irgendeinen aktivierten Blutkoagulationsfaktor X, einschließlich des Faktors Xa, der von irgendeiner Säugetierquelle oder einer rekombinanten Quelle stammt. Insbesondere umfaßt dieser Ausdruck den Rinderfaktor X1a und den Rinderfaktor X2a.
Der Blutkoagulationsfaktor X ist das Proenzym einer Serinprotease, Faktor Xa (E. C. 3.4.21.6), das das Prothrombin durch eine spezifische begrenzte Proteolyse an den Bindungen Arg(274)-Thr(275) und Arg(323)-Ile(324) zu Thrombin aktiviert. In dem Prothrombin geht beiden Spaltungsstellen das gleiche Tetrapeptid Ile-Glu-Gly-Arg voran, das als eine Determinante der Faktor Xa-Substraterkennung vorgeschlagen wurde (Magnussen, S. et al., Proteases and Biological Control (Herausg. Reich, E., Rifkin, D.B. und Shaw, E.) 123-149, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1975). Manche der Peptidsequenzen, von denen es bekannt ist, daß sie durch den Faktor Xa gespalten werden, sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1: Peptidbindungen, die bekanntermaßen durch den Blutkoagulationsfaktor Xa gespalten werden Substrat CIIXβ-Globin humanes Prothrombin Rinderprothrombin Proteolytische Spaltung durch den Blutkoagulationsfaktor Xa findet zwischen den Stellen P&sub1; und P&sub1;' statt.
Die Spaltung von nativem Prothrombin durch den Faktor Xa ist ident mit der Spaltung der chymotryptischen Peptide, die die in Tabelle 1 identifizierten Peptidsegmente enthalten (Magnusson et al., supra, Magnusson et al., Proteolysis and Physiological Regulation, Herausg. Ribbons, D.W. und Brew, K; 203-238, Academic Press, New York 1976).
Es wurden auch Arbeiten hinsichtlich der Herstellung von chromogenen Substraten zur Verwendung bei der Bestimmung von Faktor Xa durchgeführt. In dieser Hinsicht kann Bezug genommen werden auf:
"Chromogene Substrate auf der Basis der Primärstruktur von Prothrombin - Speziell auf die Bestimmung von Faktor Xa-Aktivität ausgerichtet" Aurell, L. et al., Peptides 1976 (Proceedings des 14. Europäischen Peptid-Symposiums, Wepion, Belgien, 11.-17-April 1976, 191-195, 1976;
"Ein neues empfindliches und hochspezifisches chromogenes Peptidsubstrat für den Faktor Xa", Aurell, L. et al., Thrombosis Research, 11, 595-609, 1977;
"Neue Chromogene Peptidsubstrate für den Faktor Xa", Aurell, L. et al., Haemostasis, 7, 92-94, 1978; und "Kleine synthetische Peptide mit Affinität für Proteasen bei der Koagulation und Fibrinolyse: ein Überblick", Claeson, G. und Aurell, L. Annals of the New York Academy of Sciences, 370, 798-811, 1981.
Diese Arbeit deutete darauf hin, daß eine spezifische Spaltung in erhöhtem Ausmaß erreicht werden kann, wenn der P&sub3;-Rest eher Gln als Glu ist, und daß eine spezifische Spaltung in vermindertem Ausmaß erreicht werden kann, wenn der P&sub4;-Rest eher Leu oder Pro als Ile oder der P&sub3;-Rest eher Asn als Glu ist.
Es wurde auch gefunden, daß die an Ala-Glu-Gly-Arg anschließende Peptidbindung in einem chymotryptischen Peptid von Antithrombin III auch durch den Faktor Xa gespalten wird.
Es scheint daher, daß die zur Erkennung durch den Faktor Xa erforderliche Struktur durch die lokale Sequenz an der Spaltungsstelle bestimmt ist. Jede der oben erwähnten Sequenzen enthält Arginin und Glycin an den P&sub1;- bzw. P&sub2;-Stellen und eine Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder Glutamin- oder Asparaginreste an der P&sub3;-Stelle. Isoleucin an der P&sub4;-Stelle wird in humanem und in Rinder-Prothrombin in allen Faktor Xa- Spaltungsstellen konserviert, doch scheint es aus den anderen Daten, daß das Spaltungserfordernis nur für einen kleinen hydrophoben Rest an der P&sub4;-Stelle gilt.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann für eine beliebige Spaltungsstelle codieren, die durch den Blutkoagulationsfaktor Xa spezifisch gespalten wird, inklusive aller oben genannter spezifischer Faktor Xa- Spaltungssequenzen. Vorzugsweise ist die DNA-Sequenz eine für die Aminsäuresequenz
K-Y-Gly-Arg
in welcher X für Ile, Leu, Pro oder Ala und Y für Glu, Asp, Gln oder Asn steht, codierende Sequenz. Insbesondere steht X für Ile und Y für Glu oder Gln. Besonders bevorzugt ist die DNA-Sequenz eine für die Aminosäuresequenz Ile-Glu-Gly-Arg codierende Sequenz.
Die spezifischen, in der DNA vorliegenden Nucleotide hängen von der speziellen Aminosäuresequenz der Spaltungsstelle und dem genetischen Code ab. Daher kann im Hinblick auf die Überfülle des genetischen Codes eine Vielzahl von verschiedenen DNA-Sequenzen zur Codierung für eine einzige Spaltungsstelle verwendet werden. Eine spezielle DNA-Sequenz kann hinsichtlich einer bevorzugten Verwendung eines Wirtscodons und/oder zur Erleichterung der DNA-Manipulationen gewählt werden, beispielsweise um geeignete Endonuclease- Restriktionsstellen zur Verfügung zu stellen. Beispiele von DNA-Sequenzen, die für die Spaltungsstelle Ile- Glu-Gly-Arg codieren, sind
ATC GAG GGT AGG
und ATT GAA GGT CGT
Die erste oben erwähnte Sequenz ist besonders günstig, denn wenn das Codon CCT daran addiert ist, wird die Restriktionsstelle für die Endonuclease Stu 1 gebildet und es findet Spaltung zwischen den Codonen AGG und CCT statt.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codierende DNA-Sequenz ohne assoziierte Codierungssequenzen für das Fusionsprotein enthalten, wie etwa den Vektor M13mp11FK, der im folgenden speziell beschrieben wird. Solche Vektoren bilden eine Quelle für eine DNA-Sequenz, die für die Spaltungsstelle codiert, und enthalten in der Regel geeignete Endonuclease-Restriktionsstellen, um eine Excision der für die Spaltungsstelle codierenden Sequenz oder die Klonierung anderer DNA-Sequenzen, z. B. eine Fremdgensequenz, zur Konstruktion von Fusionsproteinvektoren zu gestatten. Beispielsweise stellt die StuI-Stelle von M13mp11FK eine geeignete Stelle für die Klonierung von Codierungssequenzen zur Verfügung.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Vektoren jedoch Fusionsprotein-Expressionsvektoren, die charakteristischerweise ein Fremdgen enthalten, das an eine für eine Faktor Xa-Spaltungsstelle codierende DNA-Sequenz fusioniert ist. Somit kann das Fusionsprotein einen über die Faktor Xa-Spaltungssequenz an ein Fremdgenprodukt gebundenen Methionin-Aminosäurerest enthalten. Üblicher ist es jedoch, daß das Fusionsprotein eine Wirtsproteinsequenz enthält, die über eine Faktor Xa-Spaltungssequenz an ein Fremdgenprodukt fusioniert ist, und entsprechende Vektoren enthalten für das Wirtsprotein codierende Sequenzen, die über die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codierenden Sequenzen an eine für ein Fremdprotein codierende Sequenz fusioniert sind. Typischerweise sind die Sequenzen, die für die Wirtsprotein- und Spaltungsstellen-Aminosäuren codieren, an den N-Terminus der für das Fremdprotein codierenden Sequenz fusioniert.
Es ist ersichtlich, daß es notwendig sein kann, weitere Nucleotidreste an die Faktor Xa-Spaltungssequenz anzuhängen, um die Fremdproteinsequenz hinsichtlich des Initiationscodons des Vektors in den korrekten Leserahmen zu bringen.
Die Expression der Proteine in den mit den erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Expressionsvektoren transformierten Wirtszellen führt zur der Produktion von Fusionsproteinen, die zumindest ein gewünschtes Fremdprotein oder Peptid enthalten, an das eine Faktor Xa-Spaltungssequenz gebunden ist. Im allgemeinen enthält das Fusionsprotein zumindest einen Teil eines Wirtsproteins, der an das gewünschte Fremdprotein oder Peptid über die Faktor Xa-Spaltungssequenz gebunden ist. Fusionsproteine, die eine Faktor Xa-Spaltungsstelle enthalten, sind durch den Rahmen der Erfindung umfaßt.
Es kann ein beliebiges Fremdgenprodukt durch Verwendung des erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Expressionsvektors hergestellt werden. Derartige Produkte können eukaryotische, z. B. von Säugetieren stammende, Polypeptide und Proteine, inklusive Enzyme, Serumproteine, z. B. β-Globin, und Peptidhormone sowie deren Vorstufen, z. B. Calcitonin-Glycin, umfassen.
Es kann jedes geeignete Wirtsprotein oder ein Teil eines solchen zur Expression des Fusionsproteins verwendet werden. Beispiele geeigneter bakterieller Wirtsprotein-Gene sind u. a. lacZ-, tufB-, trpE-, trpD-, bla-, lambda-CII- und CAT-Gene.
Die Erfindung ist in weitem Maße auf die Herstellung rekombinanter Fusionsproteine in Wirtsorganismen anwendbar, wobei im allgemeinen Hefe- und Säugetierzellen umfaßt sind. Die Erfindung ist jedoch besonders auf bakterielle Wirtszellen, inklusive Bacillus-Wirtszellen oder vor allem E. coli-Wirtszellen anwendbar. Die Verfahren und Methoden, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet werden, z. B. die Oligonucleotid-Synthese, die Herstellung von Vektoren, die Transformation von Wirtsorganismen und die Expression von Fusionsproteinen, sind auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie allgemein bekannt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Fusionsprotein, das von Wirtszellen exprimiert wird, die mit einem Fusionsprotein-Expressionsvektor transformiert wurden, durch Behandlung mit aktiviertem Faktor X gespalten, um das Fremdgenprodukt in nativer Form zu gewinnen. Es kann jeder geeignete Blutkoagulationsfaktor Xa verwendet werden, inklusive des humanen Faktors Xa, doch wird vorzugsweise der Rinderfaktor Xa eingesetzt.
Das Proenzym Faktor X kann leicht aus humanem, bovinem oder anderem Säugetier-Blutplasma hergestellt werden. Beispielsweise kann der Faktor X nach der Adsorption aus Rinderplasma auf unlöslichen Bariumsalzen mit einem anschließenden chromatographischen Schritt in biochemisch reiner Form und frei von verunreinigenden Proteasen hergestellt werden (Fujikawa et al., Biochemistry 11, 4882-4891 (1972)). Es kann jede geeignete Aktivierung zur Umwandlung des Proenzyms in dessen aktive Form, z. B. den Faktor Xa, zur Anwendung kommen, wie etwa die Aktivierung mit Russel'schem Schlangengift oder immobilisierter Trypsinaktivität. Durch Verwendung von aus Rinderplasma isoliertem Faktor Xa mit einem Molverhältnis von Enzym zu Substrat von etwa 1:100 wurde gefunden, daß der Abbau des Fusionsproteins innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen war. Im Anschluß an die Spaltung können die Fremdgenprodukte gewonnen und auf andere Weise beliebig weiterbehandelt werden.
Im allgemeinen wurde festgestellt, daß die Aminosäuresequenz des Fremdgenproduktes die Effizienz der Spaltung nicht deutlich beeinflußt. Es wird jedoch im Hinblick auf mit anderen Serinproteasen erhaltenen Ergebnissen angenommen, daß der Faktor Xa keine Spaltung bewirkt, wenn ein Prolin-Aminosäurerest unmittelbar an den Argininrest der Faktor Xa-Spaltungsstelle anschließt.
Eine Behandlung mit aktiviertem Faktor Xa spaltet die erfindungsgemäßen Fusionsproteine vorzugsweise praktisch ausschließlich an der Peptidbindung, die an den Arginin-Aminosäurerest der Faktor Xa-Spaltungsstelle anschließt, um das Fremdgenprodukt in nativer Form in Freiheit zu setzen. Somit kann die Behandlung mit aktiviertem Faktor X zur Abtrennung eines N-terminalen Methionin-Aminosäurerestes oder von Wirtsprotein-Aminosäuresequenzen gemeinsam mit der Aminosäuresequenz der Faktor Xa-Spaltungsstelle von den Aminosäuresequenzen des Fremdgenproduktes verwendet werden.
Unter bestimmten Umständen kann festgestellt werden, daß das gewünschte Fremdprotein eine Aminosäuresequenz enthält, die durch den Faktor Xa gespalten werden kann. In solchen Fällen kann es nichtsdestoweniger möglich sein, das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung des Fremdproteins einzusetzen. Beispielsweise kann die empfindliche Sequenz in dem Fremdprotein eine kinetisch weniger bevorzugte Sequenz sein, wie eine, die Pro anstelle von Ile bei P&sub4; hat, oder eine, die in dem Fremdprotein "begraben" sein kann. In solchen Fällen kann die Geschwindigkeit, mit der die Sequenz in dem Fremdprotein gespalten wird, deutlich geringer sein als die, mit der die Linkersequenz gespalten wird, und daher kann es sich als möglich erweisen, eine praktisch vollständige Spaltung der Linkersequenz ohne deutliche Spaltung der Sequenz in dem Fremdprotein zu erhalten, indem die Reaktionsbedingungen gesteuert oder die Durchführungszeit der Spaltungsreaktion beschränkt wird.
Die Erfindung wird im folgenden in den angeschlossenen Beispielen allein zur Erläuterung näher beschrieben. Es ist ersichtlich, daß die Erfindung nicht auf die beschriebenen speziellen Beispiele beschränkt werden soll. Die Beispiele beziehen sich auf die angeschlossenen Diagramme, in welchen:
Fig. 1 die DNA-Sequenzen und Enzymrestriktionskarten zeigt, die die Konstruktionsweise eines erfindungsgemäßen Vektors angeben, der eine für eine Faktor Xa-Spaltungsstelle codierende Sequenz, verbunden mit einer für humanes β-Globin codierenden Sequenz enthält;
Fig. 2 ein Polyacrylamid-SDS-Gel zeigt, das die Ergebnisse der Expression von Fusionsprotein unter Verwendung des in Fig. 1 dargestellten Vektors angibt;
Fig. 3 ein Polyacrylamid-SDS-Gel zeigt, das die Ergebnisse der Spaltung des in Fig. 2 dargestellten Fusionsproteins durch aktivierten Rinderfaktor Xa angibt; und
Fig. 4 eine Enzymrestriktionskarte eines erfindungsgemäßen Vektors zeigt, der eine Sequenz enthält, die für ein Fusionsprotein aus CAT-Faktor Xa-Spaltungsstelle und humanem Calcitonin-Glycin codiert.

Beispiel 1:

Herstellung der für Faktor Xa-Spaltungsstelle codierenden Sequenz und Konstruktion der Vektoren.
Es wurde ein Phagenvektor M13mp11FX konstruiert, der eine DNA-Sequenz enthielt, die für die Faktor Xa-Erkennungsstelle Ile-Glu-Gly-Arg codiert. Es wurden auch zwei Vektoren pLcIFXβ und pLcIIβ konstruiert, die die wirksame Produktion eines hybriden Fusionsproteins lenken, das 31 Amino-endständige Reste des lambda-CII-Proteins und die komplette Aminosäuresequenz von humanem β-Globin enthält. Der erste dieser Vektoren enthält zusätzlich eine DNA-Sequenz, die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle Ile-Glu-Gly-Arg codiert, die die lambda-CII- und β-Globin-Codierungssequenzen verbindet.

Verfahren:

Alle DNA-Manipulationen wurden im wesentlichen nach der Beschreibung von Maniatis et al. ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbor, New York, 1982) durchgeführt. Ein temperaturempfindlicher lysogener Stamm MZ-1 (gal KamΔ8 att LΔ Bam N&sub7; N53 c&supmin;&sup8;&sup5;&sup7; ΔH1, his&supmin;, ilv&supmin;, bio&supmin;, N&spplus;; ein Geschenk von Dr. E. MacKenney) wurde als Wirtsstamm für die den lambda-PL-Promotor enthaltenden Plasmide verwendet. Die Transformation wurde nach dem Verfahren von Remaut et al. (Gene 15, 81-93 (1981)) durchgeführt. Die T4 DNA-Ligase wurde aus dem Stamm NM 989 gewonnen (Murray et al., J. Molec. Biol. 132, 493-505(1979) und Tait et al., J. Biol. Chem. 255, 813-815(1980)). Die Restriktionsenzyme wurde von den New England BioLabs gekauft.

(a) M13mp11FX

Zwei Oligonucleotide dTACCCTCGATGGATC und dCATCGAGGGTAGGCC wurden nach der Phosphotriestermethode auf einem Glasträger mit kontrollierten Poren synthetisiert (Sproat et al., Tetrahedron Kett., 24, 5771- 5774(1983)) und durch HPLC gereinigt (Galt et al., Nucleic Acids Research, 10, 6243-6254(1982)). Die beiden Oligonucleotide wurden nach der Phosphorylierung mit T4-Polynucleotid-Kinase (P-L Biochemicals) und r[γ-32p] (3000 Ci/mMol, Amersham) einem Annealing unterzogen und zur Bildung von Konkatameren ligiert. Die DNA wurde dann mit HI abgebaut und in die dephosphorylierte Stelle des M13mp11 geklont (Vieira et al., Gene 19, 259-268 (1982)), um M13mp11FX zu erhalten, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Dieser Vektor bildet blaue Plaques in Gegenwart von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-galactosid (Sigma).

(b) pLcIIβ und pLcIIFXβ

Das R1- III-Fragment, das die Multirestriktionsstellen enthält, wurde aus M13mp10 (Vieira et al., supra) herausgeschnitten und an mit R1- III geschnittenes pLc245 ligiert (Remaut et al, supra), um pLmp10 zu bilden. Das 319 bp AluI-Fragment, das die nutR, tR1-Stellen und einen Teil des CII-Gens enthielt, wurde aus pKG1805 herausgeschnitten (McKenney K., PhD Dissertation Johns Hopkins Universität 1982)) und in die SmaI-Stelle von M13mp10 in gleicher Orientierung wie das β-Galactosidase-α-Peptid-Gen geklont. Das die lambda-DNA-Sequenz enthaltende R1- III-Fragment wurde dann herausgeschnitten und in die R1- III-Stelle von pLmp10 geklont, um pLcII zu ergeben. Es wurde eine vollständige Human-β-Globin-cDNA-Sequenz durch Verbinden der Restriktionsfragmente, die aus einem unvollständigen cDNA-Klon (pJW102
- Wilson et al., Nucleic Acids Research 5, 563-581 (1978)) und einem genomischen DNA-Klon (Lawn et al., Cell 21, 647-651 (1980) hergestellt worden waren, rekonstruiert und in die I- III-Stelle in M13mp9 geklont. Die so erhaltene M13mp9β-cDNA wurde an der I-Stelle geöffnet, die an dem Initiationscodon lokalisiert ist, und wurde mit Klenow DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) in Gegenwart von 100 uM 4dNTP behandelt, um glatte Enden zu erhalten. Die β-Globin-cDNA-Sequenz wurde dann mit III herausgeschnitten und in die HI (aufgefüllt) - III-Stelle von pLcII eingesetzt, um das Plasmid pLcIIβ zu ergeben, wie in Fig. 1 dargestellt ist. In pLcIIβ ist das β-Globin-Gen über eine kleine, von M13mp10 stammende Linker-DNA in Phase an das lambda-CII-Gen fusioniert. Zur Konstruktion von pLcIIFXβ wurde die M13mp9β-cDNA mit I geöffnet und 40 ug DNA wurden mit 200 Einheiten Mung-Bohnen-Nuclease (P-L Biochemicals)in 30 mM Na-Acetat, pH 4,6, 50 mM NaCl, 1 mM ZnCl&sub2;, 5% Glycerin bei 0ºC 10 min lang behandelt, um die vorstehenden 5'-Enden zu entfernen. Die β-Globin-cDNA-Sequenz wurde mit III herausgeschnitten und in den I- III-geschnittenen M13mp11FX geklont. Die DNA-Sequenz wurde nach der Dideoxy-Kettenterminationsmethode (Sanger et al., PNAS 74, 5463-5467(1977)) bestimmt, um sicher zu gehen, daß vor dem ersten Valin-Codon des β-Globin-Gens die für Ile-Glu-Gly-Arg codierende DNA-Sequenz lag. Dann wurde das einen Teil der β-Globin-Sequenz enthaltende HI-Fragment herausgeschnitten und in das mit III abgebaute pLcIIβ geklont, um pLcIIFXβ zu bilden, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist.

c) Expression des hybriden lambda-CII/β-Globin-Fusionsproteins in E. coli.

Die Gesamtzellproteine von MZ-1-Zellen, die das pLcII, pLcIIβ und pLcIIFXβ tragen, wurden mit und ohne zweistündiger Induktion auf einem 18% Polyacrylamid-SDS-Gel analysiert und mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht. Das erhaltene Gel ist in Fig. 2 gezeigt, in welcher die Spuren durch das von den MZ-1-Zellen getragene Plasmid wie folgt identifiziert wurden:
(a) pLcII bei 30ºC;
(b) pLcII bei 42ºC;
(c) pLcIIβ bei 30ºC;
(d) pLcIIβ bei 42ºC;
(e) pLcIIFXβ bei 30ºC; und
(f) pLcIIFXβ bei 42ºC.

Verfahren:

MZ-1, in dem die Expressionsplasmide pLcII, pLcIIβ und pLcIIFXβ untergebracht sind, wurde bis zu A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,7 in 2·TY-Medium (Trypton 16 g, Hefeextrakt 10g, NaCl 5 g/l) bei 30ºC gezüchtet, die Kulturen wurden halbiert und eine Hälfte jeder Kultur wurde mit dem gleichen Volumen auf 65ºC vorgewärmtem 2·TY gemischt und bei 42ºC gezüchtet. Die verbleibenden Hälften wurden bei 30ºC als Vergleich gezüchtet. Das Gesamtzellprotein wurde mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert und nach dem Ausfällen mit 5 Volumsteilen Ethanol abgeschleudert (Remaut et al., supra). Die Pellets wurden in SDS-Probenpuffer gelöst und auf einem 18% Polyacrylamid-SDS-Gel wie oben analysiert, wobei das von Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970) beschriebene Verfahren verwendet wurde.

d) Abbau von CIIFXβ-Globin-Fusionsprotein mit bovinem Blutkoagulationsfaktor Xa.

Proben von CIIFXβ-Globin-Fusionsprotein wurden mit Faktor Xa bei einem Molverhältnis von Enzym zu Substrat von 1:100 bei 25ºC während verschieden langer Zeiträume abgebaut und die entstehenden Produkte wurden auf einem 18% Polyacrylamid-SDS-Gel (Laemmli, supra) analysiert. Das erhaltene Gel ist in Fig. 3 gezeigt, wobei die Abbauzeiten nach der Zugabe von Faktor Xa für die verschiedenen Spuren die folgenden sind:
(b) 5 Minuten;
(c) 15 Minuten;
(d) 30 Minuten;
(e) 60 Minuten;
(f) 120 Minuten;
Spur (a) ist das Ergebnis, das für unabgebautes CIIFXβ-Globin erhalten wurde, und Spur (g) ist adultes Humanhämoglobin, bestehend aus α (schnellere Bande) und β (langsamere Bande). Zum Zweck des Vergleichs enthält Fig. 3 auch Ergebnisse für CIIβ-Globin-Fusionsprotein, das keine Faktor Xa-Spaltungsstelle enthält, sowohl unbehandelt (Spur (i)) oder wie oben 120 min mit Faktor Xa behandelt (Spur (h)). Die Ergebnisse zeigen, daß das CIIFXβ-Globin durch die Behandlung mit Faktor Xa spezifisch gespalten wird und ein Protein mit gleicher Größe wie das authentische Human-β-Globin liefert, das sich mit der Zeit anreichert, und daß keine Spaltung des CIIβ-Globins stattfindet.

Verfahren:

MZ-1, der das pLcIIFXβ aufgenommen hatte, wurde in 500 ml 2·TY-Medium gezüchtet. Bei A&sub6;&sub0;&sub0;= 0,7 wurde die Kultur mit 500 ml auf 65ºC vorgewärmtem 2·TY gemischt, worauf bei 42ºC gezüchtet wurde. Nach 2 Stunden wurden die Zellen geerntet und es wurde mit hoher Salzkonzentration ein Niederschlag gewonnen (Gilmer et al., PNAS 79, 2152-2156 (1982)). Das Pellet wurde in 30 ml 10 mM Na-Phosphat, pH 6,4, 1% SDS (BDH), 1% β-Mercaptoethanol gelöst und in einem siedenden Bad 5 min inkubiert. Die Probe wurde gegen 10 mM Na-Phosphat, pH 6,0, 1 mM Dithiothreitol, 0,1% SDS dialysiert und auf einer Hydroxylapatit-Säule (Bio-Rad, DNA-Qualität) gereinigt (Moss et al. , J. Biol. Chem. 247, 5194-5198 (1972)). Das CIIFXβ-Globin-Hybridprotein wurde durch Ultrafiltration (Amicon, PM-10®-Membran) aufkonzentriert und dann mit 6 Volumsteilen Aceton/0,1 M NaCl gefällt, um das SDS zu entfernen. Der Niederschlag wurde an der Luft getrocknet, in 8 M Harnstoff gelöst und dann gegen 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM CaCl&sub2; dialysiert. Boviner Blutkoagulationsfaktor X (ein Geschenk von Dr. M.P. Esnouf) wurde mit Russel'schem Schlangengift (Sigma) zu Faktor Xa aktiviert (Fujikawa et al., Biochemistry 11,4892-4898(1972)).

Beispiel 2

Um einen experimentellen Beweis für die enge Substratspezifität von Faktor Xa zu erhalten, wurde eine Reihe von Proteinen denaturiert und jedes wurde getrennt zu dem CIIFXβ-Globin-Fusionsprotein, das nach den Angaben von Beispiel 1 erhalten worden war, zugesetzt, bevor mit Faktor Xa abgebaut wurde. Der Abbau erfolgte nach den Angaben von Beispiel 1. Der zeitliche verlauf des Abbaus wurde dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verfolgt.
Bei jedem Versuch blieben ≥ 70% des denaturierten Proteinsubstrates unabgebaut, während welcher Zeit praktisch das gesamte β-Globin von dem Hybridprotein abgespalten wurde, was darauf hindeutet, daß diese Polypeptide (insgesamt > 1000 Aminosäurereste) als authentische Proteine aus Hybridproteinen, die einen mit Faktor Xa spaltbaren Linker enthalten, gewonnen werden können.

Verfahren:

Rinderserumalbumin, Humanplasminogen, Rinderpankreas-Trypsininhibitor und Ribonuclease A wurden reduziert und mit Jodessigsäure in Gegenwart von 5 M Guanidin-Hydrochlorid alkyliert und Hühner-Kernhiston H2a-H2b-Dimer wurde durch Einwirkung von 1 M HCl denaturiert. Alle sechs Proteine wurden rasch mit Trypsin abgebaut und daher teilweise oder vollständig unter den für die Inkubation mit CIIFXβ-Globin-Fusionsprotein und Faktor Xa verwendeten Bedingungen denaturiert. Jedes Protein wurde mit einer äquimolaren Menge CIIFXβ- Globin-Fusionsprotein gemischt, das nach den Angaben von Beispiel 1(c) hergestellt worden war, und wurde nach den Angaben von Beispiel 1(d) abgebaut.

Beispiel 3

(a) Konstruktion des Vektors pCT 20210

Es wurde ein Vektor pCT 20210 konstruiert, der für die Expression eines Fusionsproteins aus Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) und Humancalcitonin-Glycin (hCT-Gly) codierte, welches Fusionsprotein eine Faktor Xa-Spaltungssequenz (Ile-Glu-Gly-Arg) zwischen den Polypeptidsequenzen CAT und hCT-Gly enthielt. Wie in den vorhergehenden Beispielen wurden die DNA-Manipulationen im wesentlichen nach der Beschreibung von Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbour, New York, 1982) durchgeführt.
Der Ausgangspunkt für die Konstruktion des Vektors pCT 20210 war der Vektor pCT 2026, der für die Expression eines CATI-Glu-hCT-Gly-Fusionsproteins codiert. Die Konstruktion des Vektors pCT 2026 ist im Detail in der GB-A-2 104 810 beschrieben.
Unter Bezugnahme auf Fig. 4 wurde der Vektor pCT 2026 mit Acc I und Bgl II abgebaut, um die für Glu und die Aminosäurereste 1-4 des hCT codierende Sequenz herauszuschneiden. Die entstehende Plasmid-DNA wurde isoliert und mit einem Überschuß der folgenden Oligonucleotide ligiert:
R276 5'-GA TCT ATT GAA GGT CGT TGT GGT AAC CTG T-3'
und R275 5'-AGA CAG GTT ACC ACA ACG ACC TTC ATT A-3'
Die entstehenden Plasmidmoleküle wurde in E. coli HB 101-Zellen transformiert und die daraus stammenden transformierten Zellen wurden durch Züchtung auf Ampicillin-haltigen (100 ug/ml) Medien gezüchtet. Auf Transformation und Selektion folgten Plasmidherstellungen in kleinem Maßstab aus den entstehenden ampicillinresistenten Kolonien und Abbau dieser DNA-Moleküle mit Bst E II. Ein Plasmid, das eine BstEII-Stelle enthielt, nämlich pCT 20210, wurde isoliert und seine DNA im Bereich der Verbindung der für die CAT- und hCT-Polypeptide codierenden Sequenzen sequenziert. Die festgestellte DNA-Sequenz ist unten gemeinsam mit der entsprechenden Aminosäuresequenz (obere Zeile) dargestellt, wodurch bestätigt wird, daß das pCT 20210 die korrekte, für die Faktor Xa-Spaltungsstelle Ile-Glu-Gly-Arg codierende Sequenz zwischen den für die CAT- und hCT-Gly-Polypeptide codierenden Sequenzen enthält. Teilsequenz von pCT 20210 Calcitonin-Glycin Faktor XA

(b) Herstellung des CAT I Xa hCT Gly Fusionsproteins

Zellen von E. coli HB101, die das Plasmid pCT 20210 enthielten, wurden bei 37ºC in einem 4 L-Fermenter in einem ergänzten Mineralsalz-Medium mit einem Gehalt von 20 ug/ml Chloramphenicol bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (1000 Upm·10 min) geerntet. Die Zellen wurden in 60 ml 50 mM Tris HCl-Puffer, pH 8,0, mit einem Gehalt von 100 mM NaCl und 1 mM EDTA, 0,2 ml PMSG-Lösung (3,3 mg/ml in Ethanol)) resuspendiert und zu der Suspension wurden 21,4 mg Lysozym zugesetzt. Nach 25 min wurden 2 ml 4%-iges (Gew. /Vol.) Deoxycholat zugesetzt und die entstehende viskose Suspension wurde weitere 10 min stehen gelassen. Es wurden 0,6 mg DNAse 1 zugesetzt und die Suspension wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis die Viskosität deutlich geringer geworden war. Nach Beendigung dieser Stufe wurde die Suspension zentrifugiert (11000 Upm·5 min). Es zeigte sich, daß das Fusionsprotein hauptsächlich in der unlöslichen Felletfraktion vorlag.
Ein gewisser Anteil des CAT-Xa-hCT-Gly-Fusionsproteins, der in der löslichen Fraktion vorlag, wurde durch CAT-Substrat-Affinitätschromatographie im wesentlichen nach der für die Reinigung von CAT1-Glu-hCT- Gly in der GB-A-2 104 810 beschriebenen Weise gereinigt.
Zusätzlich dazu wurde das den Hauptteil des CAT-XA-hCT-Gly-Fusionsproteins enthaltende Pellet wie folgt weiter gereinigt. Das Pellet wurde mit neun Volumsteilen kalter, gepufferter Triton X 100®-Lösung (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,55 (Vol./Vol.) Triton X 1000®, 100 mM NaCl) gewaschen und durch Zentrifugieren (11000 Upm·5 min) wiedergewonnen. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Das entstehende Pellet wurde wie oben in 5 ml des pH 8,0 Tris-HCl Suspensionspuffers resuspendiert. Das Fusionsprotein wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in seiner Reinheit überprüft und die verbleibende Suspension wurde bei -20ºC aufbewahrt.
Sowohl das aus der löslichen als auch das aus der unlöslichen Fraktion nach obiger Beschreibung gereinigte CAT xa hCT Gly-Fusionsprotein wird mit bovinem Blutkoagulationsfaktor Xa im wesentlichen nach der Beschreibung von Beispiel 1(c) behandelt, um hCT Gly zu gewinnen.

Beispiel 4

Die leichte Kette von Hühnermyosin-cDNA wurde mit Sau96 abgebaut, mit Klenow Polymerase aufgefüllt und in die Stu I-Stelle von M13mp11FX (hergestellt nach den Angaben des obigen Beispiels 1) geklont, um M13mp11FX-MLC zu bilden. Die gesamten DNA-Manipulationen wurden im wesentlichen nach der Beschreibung von Maniatis et al. (loc. cit.) durchgeführt. Bei diesem M13-Derivat geht dem ersten Aminosäurecodon des Myosin- Leichtketten-Gens eine DNA-Sequenz voran, die für das Tetrapeptid Ile-Glu-Gly-Arg codiert, wie unten dargestellt ist.
Die Myosin-Leichtketten-cDNA-Sequenz wurde gemeinsam mit der Faktor Xa-Spaltungsstellensequenz aus dem M13mp11FX-MLC herausgeschnitten und in pLcII geklont, um pLcIIFX-MLC zu bilden, was im wesentlichen nach der Beschreibung von Beispiel 1 erfolgte.
Das Fusionsprotein CIIFX-MLC wurde in hohem Ausmaß in E. coli produziert und bis zur Homogenität gereinigt. Dann wurde das Fusionsprotein mit Faktor Xa an der dem Tetrapeptid Ile-Glu-Gly-Arg folgenden Peptidbindung gespalten und die authentische Myosin-Leichtkette in Freiheit gesetzt. Diese Manipulationen wurden ebenfalls im wesentlichen nach der Beschreibung von Beispiel 1 durchgeführt.
Die Hühnermyosin-Leichtketten-cDNA wurde nach der Beschreibung von Reinach und Fischman, J. Mol. Biol. 181, 1985, erhalten.

Claims

1. Fusionsprodukt, das eine erste DNA-Sequenz, die für eine durch den Blutkoagulationsfaktor Xa spezifisch spaltbare Aminosäuresequenz codiert, und eine zweite, an die erste DNA-Sequenz fusionierte DNA- Sequenz enthält, wobei die zweite DNA-Sequenz für ein gewünschtes Protein- oder Peptidprodukt codiert und natürlicherweise nicht an die erste DNA-Sequenz fusioniert ist.

2. Fusionsprodukt nach Anspruch 1, bei welchem die erste DNA-Sequenz für die Aminosäuresequenz

X-Y-Gly-Arg

codiert, in welcher X für Ile, Leu, Pro oder Ala und Y für Glu, Asp, Gln oder Asn steht.

3. Fusionsprodukt nach Anspruch 2, bei welchem X für Ile und Y für Glu oder Gln steht.

4. Fusionsprodukt nach Anspruch 3, bei welchem die erste DNA-Sequenz für die Aminosäuresequenz Ile-Glu- Gly-Arg codiert.

5. Fusionsprodukt nach Anspruch 4, das die Sequenz

ATC GAG GGT AGG

enthält.

6. Fusionsprodukt nach Anspruch 5, das die Sequenz

ATC GAG GGT AGG CCT

enthält.

7. Fusionsprodukt nach Anspruch 4, das die Sequenz

ATT GAA GGT CGT

enthält.

8. Vektor, der ein Fusionsprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.

9. Der Vektor M13mp11FX oder pLc/1FXβ nach der Definition von Beispiel 1 und Fig. 1 oder der Vektor M13mpII FX-MCL, pLcIIFX-MLC oder pCT 20210 nach der Definition der Beispiele 4, 4 bzw. 3.

10. Vektor nach Anspruch 8, in welchem die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codierende Sequenz auch an ein ATG-Codon fusioniert ist.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei welchem die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codierende DNA-Sequenz auch an eine für zumindest einen Teil eines Wirtsproteins codierende Sequenz fusioniert ist.

12. Vektor nach Anspruch 11, bei welchem das Wirtsprotein lacZ, tufB, trpE, trpD, bla, lambda-CII oder CAT ist.,

13. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 12, bei welchem die für die Faktor Xa-Spaltungsstelle codierende DNA-Sequenz an das N-terminale Ende der für das gewünschte Protein- oder Peptidprodukt codierenden DNA- Sequenz fusioniert ist.

14. Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 13, bei welchem das gewünschte Protein- oder Peptidprodukt ein Enzym, ein Serumprotein, ein Peptidhormon oder eine Vorstufe dafür ist.

15. Vektor nach Anspruch 14, bei welchem das gewünschte Protein- oder Peptidprodukt β-Globin, Calciton- Glycin oder die leichte Myosin-Kette ist.

16. Wirtsorganismus, der mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 15 transformiert ist.

17. Zelle von E. coli oder Bacillus, die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 15 transformiert ist.

18. E. coli HB101 oder MZ-1 Zellen, die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 15 transformiert sind.

19. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Protein- oder Peptidproduktes in nativer Form, bei welchem Verfahren:

ein Wirtsorganismus mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 15 transformiert wird,

das gewünschte Protein- oder Peptidprodukt als ein Fusionsprotein, das das gewünschte Protein- oder Peptidprodukt an eine Faktor Xa-Spaltungsstelle fusioniert enthält, exprimiert wird und

das Fusionsprotein mit Faktor Xa gespalten wird, um das Fremdgenprodukt in nativer Form zu gewinnen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem der Faktor Xa durch Aktivieren von Faktor X hergestellt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, bei welchem der Faktor X der Rinderfaktor X&sub1; oder X&sub2; ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, bei welchem das Fusionsprotein zumindest einen Teil eines Wirtsproteins, gebunden an die Faktor Xa-Spaltungsstelle, enthält, wobei das Wirtsprotein durch Affinitätschromatographie reinigbar ist, und bei welchem der Schritt der Reinigung des Fusionsproteins durch Verwendung eines für das Wirtsprotein spezifischen Affinitätschromatographiemediums vor dem Spaltungsschritt enthalten ist.