JPH074253B2 - 組み換え融合タン白質 - Google Patents

組み換え融合タン白質

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JPH074253B2
JPH074253B2 JP60104914A JP10491485A JPH074253B2 JP H074253 B2 JPH074253 B2 JP H074253B2 JP 60104914 A JP60104914 A JP 60104914A JP 10491485 A JP10491485 A JP 10491485A JP H074253 B2 JPH074253 B2 JP H074253B2
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dna sequence
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組み換えDNA技術に関し、特に組み換え融合タ
ン白質およびそのような融合タン白質を切断して、天然
形の外来遺伝子産物を得る方法に関する。
近年、組み換えDNA技術の発展により、バクテリアや酵
母の如き宿主微生物に広範囲のクローン外来遺伝子を発
現できるようになつた。２つの主な方法が使われてい
る。
１つの方法は、外来遺伝子の発現を大腸菌プロモーター
やシヤイン・ダルガルノ配列の如き宿主発現コントロー
ル配列の直接コントロール下に行ない、非融合外来タン
白質およびポリペプチド産物を得る。しかし、この方法
はいろいろな欠点がある。
多くの真核遺伝子を大腸菌にて高レベルで発現させるの
は、大腸菌λPL又はTrpプロモーターの如き強力なプロ
モーターおよび高度に発現させた大腸菌遺伝子由来のシ
ヤイン・ダルガルノ配列を外来遺伝子配列の前に使用し
た場合でも、難しかつた。シヤイン・ダルガルノ配列の
近くにmRNAの２次構造がリボソームに対するmRNAの利用
性に影響し、その結果翻訳効率に影響するから、これら
の困難が生じることは明白である。２次構造は開始コド
ン即ち外来遺伝子配列に続く配列に依るから、このよう
な構築によりしばしば翻訳効率が劣ることになる。
また大腸菌で発現した多くのタン白質はそのN-末端で特
別のメチオニンアミノ酸残基を有し、翻訳を開始するの
に必要な外来遺伝子の５′末端のATG開始コドンから生
じる。この特別なN-末端メチオニンの存在は望ましくな
い。と言うのは、タン白質の安定性や活性に影響しかつ
そのタン白質を臨床的に使用する場合、抗原性の問題を
おこすからである。
更に、直接発現させた外来遺伝子産物は特にあるホルモ
ンの如き比較的小さいポリペプチドである場合、宿主生
物体細胞内でしばしばタン白分解作用を受ける。このた
めに、宿主細胞内の外来遺伝子産物の蓄積は非常に低レ
ベルとなる。
別の方法では、多くの真核タン白質は、高度に発現させ
た大腸菌遺伝子例えばlacZ、tufB、bla、λc11およびλ
Ｎ遺伝子のコード配列に外来遺伝子配列を融合させて得
たハイブリツド融合タン白質の形で大腸菌に多量生産さ
れた。このような構築では、バクテリア遺伝子からの翻
訳の追加（run-on）は高い翻訳効率を伴なう。更に、外
来遺伝子産物に融合したバクテリアタン白質が存在する
と、融合タン白質を耐タン白分解性にし、かつ宿主細胞
内の融合タン白質の区画分け（compartmentalisation）
又はそこからの分泌を供する。融合タン白質発現によ
り、ペプチドホルモンの如き潜在的に生物的危険のある
物質が不活性の「前駆体」で生成し、ついでこれを特異
的切断により試験管内で活性化しうる。
しかし、このようなハイブリツド融合タン白自体は例え
ば臨床用の最終生成物として通常望ましくなく、融合タ
ン白質を特異的に切断して、天然形の外来遺伝子産物を
放出することが必要である。特異的な単一又は二重アミ
ノ酸切断部位は大腸菌タン白質と真核タン白質間の接合
点の融合タン白質内で供された。例えば、臭化シアンに
よる化学処理が単一メチオニンアミノ酸切断部位で切断
するために使われ、トリプシン酵素処理は単一アルギニ
ン又はリジン、あるいは二重アルギニン／アルギニン又
はリジン／リジン切断部位で切断するために使われた。
しかし、切断部位アミノ酸が外来遺伝子産物アミノ酸配
列内に存在するならば、このような単一又は二重繰り返
しアミノ酸切断部位はほんのわずか限られた利用性があ
るだけである。切断処理により外来タン白質の望ましく
ない切断および融合タン白質の結合部に切断を伴なう。
ヨーロッパ特許出願第35,384号（カリホルニア大）に
は、融合タン白質をコードする組み換えDNA配列の構築
において宿主と外来DNA配列間の結合部に特定の切断リ
ンカーを使うことが開示されている。これらは、特定の
酵素切断部位を供する少なくとも２つの異なつたアミノ
酸の配列から成る拡張した特定切断配列をコードする切
断リンカーを含む。特定切断配列中アミノ酸残基の数が
多い程、外来遺伝子産物アミノ酸配列内に生じる類似の
配列の可能性は小さくなる。したがつて、外来タン白質
の望ましくない切断がある危険も低い。ヨーロツパ特許
出願第35,384号には、配列X-（ASP）n-Lys-Y（ｎ＝2-
4）を有する切断リンカーの使用が具体的に開示されて
いる。このリンカーはエンテロキナーゼにより特異的に
Lysのカルボキシル側鎖について切断される。しかし、
ヨーロツパ特許出願第35,384号に記載される切断部位は
融合タン白質の切断に使用するには完全に満足すべきも
のではない。例えば、エンテロキナーゼはペプチド結合
続いて配列Gly-Gly-Lysのプロココナーゼを切断するこ
とが分つている（アンダースン等、バイオケミストリ
イ、1b、3354、1977）から、エンテロキナーゼ切断は配
列X-（Asp）n-Lys-Yに対しユニークに依存しない様であ
る。
本発明者は融合タン白質をコードする組み換えDNA配列
の構築に使用するのに改良された切断リンカーを考案し
た。各リンカーは４つの異なるアミノ酸配列から成る酵
素切断部位をコードする。これらの切断配列は他のタン
白配列にはめつたにみられないから、これらの切断部位
は広範囲の組み換え融合タン白質の切断に使用するのに
適している。更に、これらの部位で酵素による切断は、
他の拡張された特異的切断配列例えば前に提案されたも
のであるが、厳密には特異的配列であるものの場合にも
よるが、全体の３次元タン白構造に依存しない様であ
る。
したがつて、本発明は血液凝固Xa因子により特異的に切
断される切断部位をコードするDNA配列を供する。
本発明はまた血液凝固Xa因子により特異的に切断される
切断部位をコードするDNA配列から成るベクターおよび
このベクターにより形質転換された宿主生物体を包含す
る。
更に本発明は外来タン白産物をコードするDNA配列およ
び血液凝固Xa因子により特異的に切断される少なくとも
１つの切断部位から成るベクターで宿主生物体を形質転
換させる、天然形の外来遺伝子産物の製造法を供し、こ
の外来遺伝子産物は形質転換生物体により融合タン白質
として発現されそして融合タン白質は活性化血液凝固Ｘ
因子で処理して切断され、天然形の外来遺伝子産物を生
ずる。
本明細書において、「天然形」とは付加的なアミノ酸残
基がなく、例えばN-末端メチオニンアミノ酸残基又はN-
末端宿主タン白アミノ酸残基のない、そのアミノ酸配列
から成るポリペプチド又はタン白質を意味する。
また、「血液凝固Xa因子」とは、任意の哺乳動物又は組
み換え体源由来のXa因子を含む任意の活性化血液凝固Ｘ
因子を意味する。特に、これらにはウシX1a因子とウシX
2因子を含む。
血液凝固Ｘ因子は、結合Arg（274）‐Thr（275）および
Arg（323）‐Ile（324）で特異的に限られたタン白分解
によりプロトロンビンをトロンビンに活性化する、セリ
ンプロテアーゼの酵素原、Xa因子（Ｅ、Ｃ、３、４、2
1、６）である。プロトロンビンでは、両方の切断部位
はXa因子基質認識の決定子として提案された同じテトラ
ペプチド、Ile-Glu−Gly−Argの下流にある（マグナツ
スン・エス等、プロテアーゼと生物学的コントロール
（Proteases and Biological Control）、123-149、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ、ニユー
ヨーク、1975）。Xa因子により切断されることが知られ
るあるペプチド配列は表１に挙げてある。
表1.血液凝固Xa因子により切断されることが知られてい
るペプチド結合 血液凝固Xa因子によるタン白分解切断はP1とP1′部位間
でおきる。
天然のプロトロンビンのXa因子切断は表１で同定される
ペプチドセグメントを含有するキモトリプシンペプチド
の切断と同一である（マグナツスン等、仝上；マグナツ
スン等、タン白分解および物理的調節（Proteolysis an
d Physiological Regulation）、203-238、アカデミツ
ク出版、ニユーヨーク、1976）。
Xa因子の測定に使用する発色性基質の製造について研究
も行なわれた。この点に関しては、次の文献が参照され
る。
「Xa因子活性の測定用に特に意図されるプロトロンビン
の一次構造に基づく発色基質（Chromogenic Substrates
based on the Primary Structure of Prothrombin Esp
ecially intended for the Determination of Factor X
a activity）」、オーレル・エル等、ペプチド（Peptid
es）、1976（第14回欧州ペプチドシンポジウム会報）、
ベルギー、ウエピオン、1976年４月11-17日、191-195、
1976; 「Xa因子の新規感受性と高度特異性発色ペプチド基質
（A New Sensitive and Highly Specific Chromogenic
Peptide Substrate for Factor Xa）″、オーレル・エ
ル等、「スロンボシス・リサーチ（Thrombosis Researc
h）」、11、595-609、1977; “Xa因子の新規発色性ペプチド基質（New Chromogenic
Peptide Substrates for Factor Xa）″、オーレル・エ
ル等、「ヘモスタシス（Haemostasis）」、７、92-94、
1978および “凝固および繊維分解におけるプロテアーゼに親和性を
有する合成小ペプチド（Small Synthetic Peptides wit
h Affinity for Proteases in Coagulation and Fibrin
olysis）”、クレツソン・ジーおよびオーレル・エル、
「ニユーヨーク科学アカデミイ紀要（Annals of the Ne
w York Academy of Sciences）」、370、798-811、198
1。
この仕事で指摘されたことは、P3残基がGluよりGlnであ
る場合、高割合で特異的切断が得られ、そしてP4残基が
IleよりLeu又はProであるか、あるいはP3残基がGluより
Asnである場合、低割合で特異的切断が得られる。
抗トロンビンIIIからキモトリプシンペプチドにおいてA
la−Glu−Gly−Argに続くペプチド結合はXa因子により
切断されることも分つた。
したがつて、Xa因子による認識に必要な構造は切断部位
の局所的配列により決定されるようである。上記の各配
列はP1とP2部位にそれぞれアルギニンとグリシンを含
み、グルタミン酸又はアスパラギン酸又はグルタミン又
はアスパラギン残基はP3部位にある。P4部位のイソロイ
シンはヒトおよびウシプロトロンビンにおけるすべての
Xa因子切断部位に維持されるが、他のデータでは、切断
の要件はP4部位の小さい疎水残基のためのものである様
である。
本発明のDNA配列は上記した特定のXa因子切断配列のす
べてを含む血液凝固Xa因子により特異的に切断される任
意の切断部位をコードすることができる。このDNA配列
はアミノ酸配列 X-Y-Gly-Arg （ＸはIle、Leu、Pro又はAlaであり、ＹはGlu、Asp、Gl
n又はAsnである）をコードする配列であることが望まし
い。更に望ましくは、ＸはIleであり、ＹはGlu又はGln
である。最も望ましくは、DNA配列はアミノ酸配列Ile-G
lu-Gly-Argをコードする配列である。
このDNAに有する特定のヌクレオチドは切断部位の特定
のアミノ酸配列および遺伝子コードに依存する。したが
つて、余分の遺伝子コードからみて、複数の各種DNA配
列は単一切断部位をコードするのに使うことができる。
特定のDNA配列は宿主コドン利用性の選択に関して選ぶ
ことができおよび／又はDNA操作を容易にするため、例
えば便利なエンドヌクレアーゼ制限部位を供するために
選択することができる。Ile-Glu-Gly-Arg切断部位をコ
ードするDNA配列の例は、 ATC GAG GGT AGGおよび ATT GAA GGT CGTである。
上記第１配列は特に、コドンCCTがそれに付加される場
合、エンドヌクレアーゼStu1の制限部位が生成され、AG
GとCCTコドン間に切断が生じる点で有用である。
本発明のベクターは、以下に具体的に記述するベクター
M13mp11FXの如き関連融合タン白コード配列なしで、因
子Xa切断部位をコードするDNA配列から成る。このよう
なベクターは切断部位をコードするDNA配列源を供し、
かつ一般には融合タン白ベクターの構築のために、切断
部位コード配列を切除させる、あるいは他のDNA配列例
えば外来遺伝子配列をクローニングさせる適当なエンド
ヌクレアーゼ制限部位から成る。例えば、M13mp11FXのS
tuI部位はコード配列のクローニングに適切な部位を供
する。
しかし、望ましくは、本発明のベクターはＸ因子の切断
部位をコードするDNA配列に融合される外来遺伝子を特
長的に含む融合タン白発現ベクターから成る。したがつ
て、融合タン白質はXa因子切断配列を介して外来遺伝子
産物に結合されるN-末端メチオニンアミノ酸残基から成
る。しかし、更に一般的には、融合タン白質はXa因子切
断配列を介して外来遺伝子産物に融合される宿主タン白
配列から成り、相当するベクターはXa因子切断部位コー
ド配列を介して外来タン白コード配列に融合される宿主
タン白コード配列から成る。一般的には、宿主タン白お
よび切断部位アミノ酸コード配列は外来タン白コード配
列のN-末端に融合される。
ベクターの開始コドンに関して、外来タン白配列を正し
い読み枠に入れるために、更にヌクレオチド残基をXa因
子切断配列に加えることが必要であることは理解されよ
う。
本発明に係る融合タン白発現ベクターで形質転換させた
室主細胞中のタン白の発現により、Xa因子切断配列を連
結した目的の外来タン白又はペプチドを少なくとも含む
融合タン白質を産生させる。一般に、融合タン白質はXa
因子切断配列を介して目的の外来タン白又はペプチドに
結合した少なくとも一部の宿主タン白から成る。Xa因子
切断部位を含む融合タン白質は本発明の範囲に含まれ
る。
任意の外来遺伝子産物は本発明の融合タン白発現ベクタ
ーを使つて製造することができる。このような生成物は
哺乳動物の如き真核ポリペプチド、および酵素、血清タ
ン白（例えばβ‐グロビン）、ペプチドホルモンおよび
その前駆体（例えばカルシトニン‐グリシン）を含むタ
ン白質を含みうる。
適当な宿主タン白又はその一部は融合タン白発現に使用
することができる。適当なバクテリア宿主タン白遺伝子
の例はlacZ、tufB、trpE、trpD、bla、λC11およびCAT
遺伝子である。
本発明は一般に酵母や哺乳動物細胞を含む宿主体に組み
換え融合タン白質の生産に広く適用できる。しかし、本
発明はバチルス宿主細胞又は特に大腸菌宿主細胞を含む
バクテリア宿主細胞に特に適用できる。本発明のDNA配
列の製造に使用する方法および操作、例えばオリゴヌク
レオチド合成、ベクターの製造、宿主体の形質転換およ
び融合タン白の発現は組み換えDNA技術の分野では公知
である。
本発明の方法において、融合タン白発現ベクターで形質
転換された宿主細胞により発現された融合タン白質は活
性Ｘ因子で処理して切断され、天然形の外来遺伝子産物
を得る。適当な血液凝固Xa因子はヒトXa因子又は望まし
くはウシXa因子を含めて使用することができる。
酵素原、Ｘ因子はヒト、ウシ又はその他の哺乳動物血漿
から容易に製造することができる。例えば、Ｘ因子は、
不溶性バリウム塩にウシ血漿を吸着させ続いてクロマト
グラフ工程にかけ（フジカワ等、「バイオケミストリ
イ」、11、4882-4891、1972）た後、プロテアーゼの汚
染がなく、生物化学的に純粋な形で単離することができ
る。酵素原をその活性形に即ちXa因子に転換するため
に、ラツセルのバイパーベノムによる活性化又は固定化
トリプシン活性を含めて、任意の適当な活性化を使用す
ることができる。酵素／基質のモル比が大体1:100でウ
シ血漿から単離したXa因子を使つて、融合タン白消化は
２時間以内に完了することが分つた。切断に続いて、外
来遺伝子産物を回収し、必要に応じて更に処理すること
ができる。
一般に、外来遺伝子産物のアミノ酸配列は有意に切断効
率に影響しないことも分つた。しかし、他のセリンプロ
テアーゼで得た結果からみて、プロリンアミノ酸残基が
因子Xaの切断部位のアルギニン残基の直ぐ後に続く場
合、Xa因子は切断しないと考えられる。
活性化Ｘ因子による処理は、Xa因子切断部位のアルギニ
ンアミノ酸残基に続くペプチド結合で実質的に本発明の
融合タン白質を切断し、天然形の外来遺伝子産物を遊離
する。したがつて、活性Ｘ因子による処理は、外来遺伝
子産物アミノ酸配列由来のXa因子の切断部位アミノ酸配
列と共に、N-末端メチオニンアミノ酸残基又は宿主タン
白アミノ酸配列を切断するのに使うことができる。
ある場合には、目的の外来タン白質はXa因子により切断
され易いアミノ酸配列を含むことが分つた。その様な場
合に、外来タン白を得るために、本発明方法を使用する
ことも可能である。例えば、外来タン白における影響さ
れ易い配列は動力学的に余り望ましい配列ではなく、例
えばP4でIleの代りにProを有するものであり、又は外来
タン白に「埋没」させることもできる。そのような場合
に、外来タン白の配列が切断される速度は、リンカー配
列が切断される場合より有意に低い。したがつて、反応
条件を調整するかあるいは切断を行なう時間を制限する
ことにより、外来タン白質に配列の有意な切断がなく、
リンカーの実質的に完全な切断を得ることが可能であ
る。
以下の例により更に本発明を説明する。
例１ Xa因子切断部位コード配列の調製とベクターの構築 Xa因子のIle−Glu−Gly−Arg認識部位をコードするDNA
配列を含有するフアージベクターM13mp11FXを構築し
た。λC11タン白質の31-アミノ酸末端残基とヒトβ‐グ
ロビンの完全アミノ酸配列から成るハイブリツド融合タ
ン白質の有効産生を指向する２つのベクターpLcILFXβ
とpLc11βを構築した。前者のベクターはまたλ11とβ
‐グロビンコード配列をリンクするIle−Glu−Gly−Arg
Xa因子切断部位をコードするDNA配列を含む。
方法 すべてのDNA操作はマニアテイス等の方法（モレキユラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド・
スプリング・ハーバー、ニユーヨーク、1982）により行
なつた。温度感受性溶原株MZ-1（gal kam△8att L△ B
amN7N53cI857△HT、his-、ilv-、bio-、N+、ケイ・マツ
ケニイ博士より受領）をλPLプロモーター含有プラスミ
ドの宿主株として使用した。形質転換はリモート等（ジ
ーン（Gene）、15、81-93、1981）の方法により行なつ
た。T4DNAリガーゼは株NM989（マレー等、ジヤーナル・
オブ・モレキユラー・バイオロジイ（J.Molec.Bio
l.）、132、493-505、1979およびテイト等、ジヤーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（J.Biol.Che
m.）、255、813-815、1980）から調製した。制限酵素は
ニユーイングランド・バイオラボから購入した。
（ａ）M13mp11FX ２つのオリゴヌクレオチドαTACCCTCGATGGATCとαCATCG
AGGGTAGGCCは調整した有孔ガラス支持体によるホスホト
リエステル法（スプラウト等、テトリヒドロン・レター
（Tetrahedron Lett.）24、5771-5774。1983）により合
成し、HPLCにより精製（ゲイト等、ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、10、6243
-6254、1982）した。２つのオリゴヌクレオチドはT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（P-Lバイオケミカルス）とｒ
〔γ-32p〕ATP（3,000ci/mM、アマーシヤム）でリン酸
化後アニーリングし、連結して、コンカテマーを得た。
ついでこのDNAをBamH1で消化し、M13mp11の脱リン酸化
部位にクローンし（ビエイラ等、ジーン（Gene）、19、
259-268、1982）、第１図に示すM13mp11FXを得た。この
ベクターはイソプロピル‐β‐D-チオガラクト‐ピラノ
シドと5-ブロモ‐4-クロロ‐3-インドリル‐β‐α‐ガ
ラクトシド（シグマ）の存在下でブループラークを形成
する。
（ｂ）pLc11βとpLc11FXβ 複数制限部位を含むEcoR1-Hind III断片をM13mp10から
切断（ビエイラ等、同上）し、EcoR1-Hind III切断pLc2
45に連結（リモート等、同上）してpLmp10を得た。nut
R、tR1部位およびC11遺伝子の一部を含有する319bp Alu
I断片をpKG1805から切断（マツケニイー・ケイ、学位
論文、ジヨンズ・ホプキンス大、1982）し、β‐ガラク
トシダーゼα‐ペプチド遺伝子に対し同じ配向でM13mp1
0のSma I部位にクローンした。ついでλDNA配列を含むE
coR1-Hind III断片を切断し、pLmp10のEcoR1-Hind III
部位にクローンして、pLc IIを得た。完全ヒトβ‐グロ
ビンcDNA配列は不完全cDNAクローン（pJW102-ウイルソ
ン等、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、５、563-58
1、1978）およびゲノムDNAクローン（ローン等、セル
（Cell）、21、647-651、1980）から調製した制限断片
を結合して再構築し、M13mp9中Sma I-Hind III部位にク
ローンした。こうして得たM13mp9βcDNAは開始コドンに
位置するNco I部位で開き、100μM4αNTPの存在下クレ
ナウDNAポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）で
処理し、フラツシユ 端を形成した。β‐グロビンとcD
NA配列をHind IIIで切り出し、pLc IIのBam HI（フイル
ド・イン）‐Hind III部位に挿入して、第１図に示すプ
ラスミドpLc IIβを得た。pLc IIβでは、β‐グロビン
遺伝子はM13mp10由来の小さいリンカーDNAを介して相中
λc11遺伝子に融合させる。pLc IIFXβを構築するため
に、M13mp9βcDNAはNco Iで開き、40μｇのDNAは200ユ
ニツトの緑豆ヌクレアーゼ（P-Lバイオケミカルス）で3
0mM酢酸ナトリウムpH4.6、50mM NaCl、1mM ZnCl2、５％
グリセロール中０℃/10分間処理して、５′突出末端を
除いた。β‐グロビンcDNA配列をHind IIIで切り出し、
Stu I-Hind III切断M13mp11FXにクローンした。DNA配列
はジデオキシ鎖末端法（シンガー等、PNAS、74、5463-5
467、1977）により測定して、β‐グロビン遺伝子の第
１バリン コドンはIle−Glu−Gly−ArgをコードするDN
A配列より下流であつた。ついでβ‐グロビン配列の一
部を含むBam H1断片を切り出し、Bam III消化pLc IIβ
にクローンし、第１図に示すpLc IIFXβを得た。
（ｃ）大腸菌中λC II/β‐グロビンハイブリツド融合
タン白質の発現 ２時間の誘導でおよび誘導なしで、pLc II、pLc IIβお
よびpLc II FXβを含むHZ-1由来の全細胞タン白質を18
％ポリアクリルアミドSDSゲルで分析し、クーマシイブ
ルーが現われた。生成ゲルは第２図に示す。レーンは次
の様なMZ-1細胞を含むプラスミドと同定される。
（ａ） pLc II、 30℃ （ｂ） pLc II、 42℃ （ｃ） pLc IIβ、 30℃ （ｄ） pLc IIβ、 42℃ （ｅ） pLc II FXβ、 30℃および （ｆ） pLc II FXβ、 42℃ 方法 MZ-1含有発現プラスミドpLc II、pLc IIβおよびpLc II
FXβを2XTY培地（トリプトン16g、酵母エキス10g、NaC
l5g/）中A600＝0.7に30℃で成育させ、培養物を２分
し、各培養物の1/2を予め65℃に加熱2XTY等量と混合
し、42℃に生育させた。全細胞タン白質を等量のフエノ
ールで抽出し、５容のエタノールで沈澱させた後スピン
させた（リモート等、同上）。ペレツトをSDSサンプル
バツフアーに溶解し、リムリイの方法（テイチヤー、22
7、680-685、1970）を使つて上記通り18％ポリアクリル
アミドSDSゲルで分析した。
（ｄ）ウシ血液凝固Xa因子によるC II FXβ‐グロビン
融合タン白質の消化。
C II FXβ‐グロビン融合タン白質サンプルは各種時間
酵素／基質1:100の割合で25℃で消化し、生成物を18％
ポリアクリルアミドSDSゲル（レムリイ、同上）で分析
した。得たゲルは第３図に示す。各種レーンのXa因子添
加後の消化時間は次の通りである。
（ｂ） ５分、 （ｃ） 15分、 （ｄ） 30分、 （ｅ） 60分、 （ｆ） 120分、 レーン（ａ）は未消化C II FXβ‐グロビンについて得
た結果であり、レーン（ｇ）はα（フアーストバンド）
とβ（スローバンド）から成るヒト成人ヘモグロビンで
ある。比較のために、第３図はC IIβ‐グロビン融合タ
ン白質の結果を含み、未処理（レーン（ｉ））又は上記
の（レーン（ｈ））のようにXa因子で120分処理後のXa
因子切断部位を欠いている。結果によれば、C II FXβ
‐グロビンは特異的にXa因子処理により切断され、経時
的に蓄積する真のヒトβ‐グロビンと同じ大きさのタン
白質を生成しかつC IIβ‐グロビンの切断はない。
方法 MZ-1含有pLc II FXβを2xTY培地に生育させた。A600＝
0.7では、培養物を65℃に予熱した500ml2xTYと混合し、
42℃で生育させた。２時間後、細胞を回収し、高塩沈澱
物を調製した（ギルマー等、PNAS、79、2152-2156、198
2）。ペレツトを30ml10mMリン酸ナトリウムpH4、１％SD
S（BDH）、１％β‐メルカプトエタノールに溶解し、沸
騰浴中で５分間培養した。このサンプルは10mMリン酸ナ
トリウムpH6.0、1mMジチオスレイトール、0.1％SDSに対
し透析し、ヒドロキシアパタイト（バイオ・ラツド、DN
Aグレード）カラムで精製した（モス等、ジヤーナル・
オブ・バイオロジイ・ケミストリイ、247、5194-5198、
1972）。C II FXβ‐グロビンハイブリツドタン白質を
限外濾過（アミコン、PM-10膜）により濃縮し、アセト
ン0.1/N HCl6容で沈澱させて、SDSを除いた。沈澱物を
風乾し、8M尿素に溶解し、100mM NaCl、50mMトリスHCl
pH8.0および1mM CaCl2に対し透析した。ウシ血液凝固Ｘ
因子（エム・ピー・エスナフ博士より受領）はラツセル
のバイパーベノムで因子Xaに活性化させた（フジカワ
等、バイオケミストリイ（Biochemistry）、11、4892-4
898、1972）。
例２ Xa因子の狭い基質特異性の実験的証拠を得るために、多
くのタン白質を変性し、各々は、Xa因子で消化する前
に、例１に示したように得た、C II FXβ‐グロビン融
合タン白質に別々に加えた。消化は例１のように行なつ
た。消化の時間コースはSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動に従つた。各実験では、殆んどすべてのβ‐グロ
ビンはハイブリツドタン白質から切断された時まで、変
性タン白基質の70％は未消化のまゝであつた。これら
の各ペプチド（＞1000全体のアミノ酸残基）はXa因子切
断可能なリンカーを含むハイブリツドタン白質から真の
タン白質として回収したことを示す。
方法 ウシ血清アルブミン、ヒトプラスミノーゲン、ウシパン
クレアチントリプシンインヒビターおよびリボヌクレア
ーゼＡを減らし、5Mグアニジン塩酸塩の存在下ヨード酢
酸でアルキル化し、そしてチキンコアヒストンH2a-H2b
ダイマーを1M HClにさらして変性させた。すべて６つの
タン白質を急速にトリプシンで消化し、C II FXβ‐グ
ロビン融合タン白質とXa因子で培養のために使う条件下
で部分的又は完全に変性させた。各タン白質は例１
（ｃ）のように調製しかつ例１（ｄ）のように消化した
等量のC II FXβ‐グロビン融合タン白質に混合した。
例３ （ａ）ベクターpCT20210の構築 ベクターpCT20210を構築し、CATとhCT-Glyポリペプチド
配列間のXa因子切断配列（Ile-Glu-Gly-Arg）を含有す
るクロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
（CAT）ヒトカルシトニングリシン（hCT-Gly）融合タン
白質の発現のためにコードした。上記例の様に、DNA操
作は本質的にマニアテイス等（モレキユラー・クローニ
ング、コールド・スプリング・ハーバー、ニユーヨー
ク、1982）の方法により行なつた。
ベクター20210の構築のための出発点は、CATI-Glu-hCT-
Gly融合タン白質の発現をコードするベクターpCT2026で
あつた。ベクターpCT2026の構築は英国特許第2,104,810
号明細書に詳述されており、その開示を参照する。
第４図については、ベクターpCT2026はAccIとBg 1 IIで
消化し、GluとhCTのアミノ酸残基1-4個をコードするDNA
配列を摘出した。生成したプラスミドDNAを単離し、次
の過量のオリゴヌクレオチドで連結した。
R276 ５′‐GA TCT ATT GAA GGT CGT TGT GGT AAC CTG
T-3′および R2755′‐AGA CAG GTT ACC ACA ACG ACC TTC ATT A-
3′。
生成したプラスミド分子を大腸菌HB101細胞に形質転換
し、その形質転換細胞をアンピシリン（100μg/ml）含
有培地に生育させて選択した。形質転換と選択は生成す
る耐アンピシリンコロニーよりの小規模プラスミド調製
とこれらのDNA分子のBstE IIによる消化に従つた。BstE
II部位含有プラスミド、pCT20210を単離し、そのDNAは
CATとhCTポリペプチドをコードする配列結合領域にて配
列させた。測定したDNA配列は相当するアミノ酸配列
（トツプライン）と共に以下に示す。pCT20210はCATとh
CT-GlyポリペプチドpCT20210の部分配列をコードする配
列間の因子Xa切断配列Ile-Glu-Gly-Argをコードする正
しい配列を含むことを確認する。
（ｂ）CAT I XahCT Gly融合タン白質の調製 プラスミドpCT20210を含有する大腸菌HB101細胞は20μg
/mlクロラムフエニコールを含有する補充無機塩培地に
て４発酵槽中後期指数増殖期1237℃で培養した。細胞
を遠心分離（1,000rpm×10分）により回収した。この細
胞を100mM NaClと1mM EDTA0.2mlPMSG溶液（エタノール
中3.3mg/ml）を含有する50mMトリスHClバツフアー、pH
8.0、60mlに再懸濁させ、リゾチーム21.4mgをサスペン
ジヨンに加えた。25分後、４％（w/v）デオキシコレー
ト2mlを加え、生成した粘稠サスペンジヨンを更に10分
間放置した。DNアーゼ１ 0.6mgを加え、サスペンジヨ
ンを室温で放置し、粘度を顕著に低下させた。この段階
の終りに、サスペンジヨンを遠心分離（11,000rpm×５
分）した。融合タン白質は不溶性ペレツトフラクシヨン
に主として存在することが分つた。
しかし、不溶性フラクシヨンに存在する若干のCAT-Xa-h
CT-Gly融合タン白質は、CTA1-Glu-hCT-Glyの精製につい
て英国特許第2,104,810号明細書に記載されるCAT基質ア
フイニテイクロマトグラフイにより精製した。
更に、主にCAT-Xa-hCT-Gly融合タン白質を含有するペレ
ツトをさらに次の様に精製した。ペレツトを９容の冷、
バツフアートリトン×100溶液（50mMトリス‐HCl、pH8.
0、10mM EDTA、0.55（v/v）トリトン×100、100mM NaC
l）で洗い、遠心分離（11,000rpm×５分）により回収し
た。この洗浄操作を２度繰り返した。生成ペレツトを上
記のpH8.0トリス‐HClサスペンジヨンバツフアー5mlに
再懸濁させた。融合タン白質を精製のためにSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動によりチエツクし、残りのサ
スペンジヨンを−20℃に貯蔵した。
上記のように、可溶性又は不溶性フラクシヨンから精製
したCAT Xa hCT Gly融合タン白質を、例１（ｃ）の方法
により牛血液凝固Xa因子で処理し、hCT Glyを得た。
例４ チキンミオシン軽鎖c DNAをSau96で消化し、クレナウポ
リメラーゼでフイルド‐インし、そしてMP13mp11FX（例
１の通り製造）のStuI部位に１ローンし、MP13mp11FX-M
LCを得た。すべてのDNA操作は本質的にマニアテイス等
（上記引用）の方法で行なつた。このM13誘導物では、
ミオシンＬ鎖の第１アミノ酸コドンは下記のIle-Glu-Gl
y-ArgテトラペプチドをコードするDNA配列より下流にあ
る。
Bam HI ミオシンＬ鎖cDNA配列を、Xa因子切断配列と共にM13mp1
1FX-MLCから切り出し、例１のように、pLc IIにクロー
ンし、pLc II FX-MLCを得た。
C II FX-MLC融合タン白質は大腸菌中高レベルで産生さ
れ、均質精製した。ついで融合タン白質をペプチド結合
続いてIle-Glu-Gly-Argテトラペプチドのところで因子X
aにより切断し、真のミオシンＬ鎖が遊離した。これら
の操作は例１のように行なつた。
チキンミオシンＬ鎖cDNAはライナツハとフイツシユマ
ン、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジイ、
181、1985に記載されているように得た。
【図面の簡単な説明】 第１図はヒトβ‐グロビンをコードする配列に結合した
Xa因子の切断部位をコードする配列を含む本発明に係る
ベクターの構築の態様を示すDNA配列および酵素制限マ
ツプを示す。 第２図は第１図に示すベクターを使つて融合タン白質発
現の結果を示すポリアクリルアミドSDSゲルを示す。 第３図は第２図に示す融合タン白質の活性化ウシXa因子
による切断の結果を示すポリアクリルアミドSDSゲルを
示す。 第４図はCAT-Xa因子切断部位‐ヒトカルシトニン‐グリ
シン融合タン白質をコードする配列を含む本発明に係る
ベクターの酵素制限マツプを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭56−166200（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，Ｖｏ ｌ．252，Ｎｏ．14（1977）Ｐ．4942− 4957 ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｙ，Ｖｏｌ．22, Ｎｏ．５（1983）Ｐ．1021−1029

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血液凝固第Xa因子により特異的に切断され
    るアミノ酸配列（以下第Xa因子切断部位ともいう）をコ
    ードする第１のDNA配列、及び該第１のDNA配列に融合さ
    せた第２のDNA配列であって、目的のタン白質又はペプ
    チド産物をコードし、かつ該第１のDNA配列に自然状態
    では融合することのない第２のDNA配列、を含む融合DN
    A。
  2. 【請求項２】第１のDNA配列は、アミノ酸配列 Ｘ−Ｙ−Gly−Arg（Ｘは、Ile、Leu、Pro又はAlaであ
    り、ＹはGlu、Asp、Gln又は Asnである） をコードする、特許請求の範囲第１項記載の融合DNA。
  3. 【請求項３】ＸはIleであり、ＹはGlu又はGlnである、
    特許請求の範囲第２項記載の融合DNA。
  4. 【請求項４】第１のDNA配列は、アミノ酸配列 Ile−Glu−Gly−Arg をコードする、特許請求の範囲第３項記載の融合DNA。
  5. 【請求項５】配列 ATC GAG GGT AGG を含有する、特許請求の範囲第４項記載の融合DNA。
  6. 【請求項６】配列 ATC GAG GGT AGG CCT を含有する、特許請求の範囲第５項記載の融合DNA。
  7. 【請求項７】配列 ATT GAA GGT CGT を含有する、特許請求の範囲第４項記載の融合DNA。
  8. 【請求項８】血液凝固第Xa因子により特異的に切断され
    るアミノ酸配列（以下第Xa因子切断部位ともいう）をコ
    ードする第１のDNA配列、及び該第１のDNA配列に融合さ
    せた第２のDNA配列であって、目的のタン白質又はペプ
    チド産物をコードし、かつ該第１のDNA配列に自然状態
    では融合することのない第２のDNA配列、を含む融合DNA
    を含むベクター。
  9. 【請求項９】第１のDNA配列は、アミノ酸配列 Ｘ−Ｙ−Gly−Arg（Ｘは、Ile、Leu、Pro又はAlaであ
    り、ＹはGlu、Asp、Gln又は Asnである） をコードする、特許請求の範囲第８項記載のベクター。
  10. 【請求項１０】ＸはIleであり、ＹはGlu又はGlnであ
    る、特許請求の範囲第９項記載のベクター。
  11. 【請求項１１】第１のDNA配列は、アミノ酸配列 Ile−Glu−Gly−Arg をコードする、特許請求の範囲第10項記載のベクター。
  12. 【請求項１２】配列 ATC GAG GGT AGG を含有する、特許請求の範囲第11項記載のベクター。
  13. 【請求項１３】配列 ATC GAG GGT AGG CCT を含有する、特許請求の範囲第12項記載のベクター。
  14. 【請求項１４】配列 ATT GAA GGT CGT を含有する、特許請求の範囲第11項記載のベクター。
  15. 【請求項１５】以下の制限酵素地図を有する特許請求の
    範囲第８項記載のベクター。
  16. 【請求項１６】以下の制限酵素地図を有する特許請求の
    範囲第８項記載のベクター。
  17. 【請求項１７】以下の制限酵素地図を有するベクター： のStuI部位にチキンミオシン軽鎖をコードするDNA配列
    を挿入してなる特許請求の範囲第８項記載のベクター。
  18. 【請求項１８】クロラムフェニコールアセチルトランス
    フェラーゼ（CAT）とヒトカルシトニングリシン（hCT−
    Gly）のポリペプチド配列の間にアミノ酸配列Ile−Glu
    −Gly−Argを含むCAT/hCT−Gly融合タン白質をコードす
    る、特許請求第８項記載のベクター。
  19. 【請求項１９】第Xa因子切断部位をコードするDNA配列
    がATGコドンにも融合している、特許請求の範囲第８項
    記載のベクター。
  20. 【請求項２０】第Xa因子切断部位をコードするDNA配列
    が、宿主タン白質の少なくとも一部をコードする配列に
    も融合している、特許請求の範囲第８項から第19項のい
    ずれか１項に記載のベクター。
  21. 【請求項２１】宿主タン白質はlacZ、tufB、trpE、trp
    D、bla、λCII又はCATである、特許請求の範囲第20項記
    載のベクター。
  22. 【請求項２２】第Xa因子切断部位をコードするDNA配列
    は目的のタン白質又はペプチド産物をコードするDNA配
    列のＮ−末端に融合している、特許請求の範囲第８項か
    ら第21項のいずれか１項に記載のベクター。
  23. 【請求項２３】目的のタン白質又はペプチド産物は酵
    素、血清タン白、ペプチドホルモン又はその前駆物質で
    ある、特許請求の範囲第８項から第22項のいずれか１項
    に記載のベクター。
  24. 【請求項２４】目的のタン白質又はペプチド産物はβ−
    グロビン、カルシトニン−グリシン又はミオシンＬ鎖で
    ある、特許請求の範囲第23項記載のベクター。
  25. 【請求項２５】血液凝固第Xa因子により特異的に切断さ
    れるアミノ酸配列をコードする第１のDNA配列、及び該
    第１のDNA配列に融合させた第２のDNA配列であって、目
    的のタン白質又はペプチド産物をコードし、かつ該第１
    のDNA配列に自然状態では融合することのない第２のDNA
    配列、を含む融合DNAを含むベクターで形質転換させた
    宿主微生物。
  26. 【請求項２６】前記宿主微生物は大腸菌である、特許請
    求の範囲第25項記載の宿主微生物。
  27. 【請求項２７】前記宿主微生物は大腸菌MZ−１又はHB10
    1細胞である、特許請求の範囲第25項記載の宿主微生
    物。
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