CN117363641A - 一种重组双碱性内肽酶和羧肽酶b的融合表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法，该融合表达方法使用的结构为：重组双碱性内肽酶截断体‑连接肽‑羧肽酶B蛋白酶原，该融合表达方法使用的结构的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明将Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶原基因串联整合在工程菌中，一次发酵可同时生产Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶原，大大缩短蛋白酶的生产周期，在重组蛋白类药物的生产具有很大应用前景，并且使用酵母作为宿主菌，避免了大肠杆菌易形成包涵体、内毒素、易染噬菌体等缺陷。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及到一种重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法。
背景技术
双碱性内肽酶(Kex2蛋白酶)为酵母自身编码的一种前体加工酶，Ca2+依赖型丝氨酸蛋白酶，能够专一性地识别和切割Lys-Arg，Arg-Arg，Pro-Arg等双碱性氨基酸的羧基端肽键。羧肽酶B(CPB蛋白酶)是一种含Zn2+的蛋白酶，可水解蛋白质或多肽C末端Arg或Lys。Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶在酶切位点的选择上都有很高的专一性，且两者通常组合使用，Kex2蛋白酶将蛋白/多肽截短，CPB蛋白酶对截短的蛋白/多肽的C末端进行修饰，经酶切后的目标蛋白/多肽不会引入额外氨基酸。
在研究Kex2蛋白酶的过程中发现，Kex2蛋白酶会出现自降解的现象，产生多条杂条带，酶活性降低，在分析其氨基酸序列后发现，Kex2蛋白自身结构中含有多对连续碱性氨基酸残基位点，这可能是导致其自降解的原因。
通过基因重组的方法制备CPB蛋白酶的方法通常为先经表达得到不具活性的CPB酶原，然后使CPB酶原包涵体经过复杂的变性、复性过程，再经过酶切切去酶原的前肽部分，才能得到有活性的酶，而在所述变性、复性过程中，复性率不可能达到100％，因此该方法费时费力，产率不高，复性后的活性也低，不具有产业化价值。
现有发明中，均为单一表达Kex2蛋白酶或CPB蛋白酶。因此，进行合适的串联编码，在常见的发酵系统中同时生产Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶，在药物生产、科学研究领域具有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法。
本发明所采取的技术方案是：
第一个方面，本发明提供一种重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法，所述融合表达方法使用的结构为：重组双碱性内肽酶截断体-连接肽-羧肽酶B蛋白酶原，所述重组双碱性内肽酶截断体包括重组双碱性内肽酶前导肽区域、重组双碱性内肽酶催化结构域、重组双碱性内肽酶P结构域、重组双碱性内肽酶丝氨酸/苏氨酸富集区。
在一些实例中，所述重组双碱性内肽酶截断体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实例中，所述连接肽的氨基酸序列含有重组双碱性内肽酶的酶切位点KREAEA。
在一些实例中，所述重组双碱性内肽酶和羧肽酶B融合蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.2。
第二个方面，本发明提供第一个方面所述的重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法所编码的基因，所述基因的序列如SEQ ID No.3所示。
第三个方面，本发明提供一种载体，其含有第二个方面所述的基因。
第四个方面，本发明提供一种整合第三个方面所述载体的宿主细胞。
在一些实例中，所述重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法，包括以下步骤：
1)收集权利要求8所述的宿主细胞的发酵液，调节电导至90ms/cm，将其上样至用流动相A平衡好的疏水柱上，收集流穿液；
2)用流动相B进行洗脱填料，得到羧肽酶B蛋白酶原；
3)用胰蛋白酶消化羧肽酶B蛋白酶原，将消化液上样至用流动相C平衡好的镍柱上，用流动相D进行洗脱，得到羧肽酶B；
4)将步骤1)收集的流穿液脱盐，上样至用流动相E平衡好的阴离子交换柱上，用流动相F进行洗脱，得到重组双碱性内肽酶。
在一些实例中，所述流动相组成为：
流动相A：0.58～0.62M硫酸铵、18～22mM Tris，pH 7.9～8.1；
流动相B：水、18～22mM Tris，pH8.0；
流动相C：18～22mM Tris-HCl、290～310mM NaCl、9～11mM咪唑，pH 7.9～8.1；
流动相D：18～22mM Tris-HCl、290～310mM NaCl、240～260mM咪唑，pH 7.9～8.1；
流动相E：9～11mM NaAc-Hac，pH 4.9～5.1；
流动相F：0.49～0.51M NaCl、9～11mM NaAc-Hac，pH 4.9～5.1。
本发明的有益效果是：
本发明将Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶原基因串联整合在工程菌中，一次发酵可生产Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶原；
本发明同时提供了将Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶的纯化制备的方法，大大缩短蛋白酶的生产周期，在重组蛋白类药物的生产具有很大应用前景；
本发明使用酵母作为宿主菌，避免了大肠杆菌易形成包涵体、内毒素、易染噬菌体等缺陷。
附图说明
图1为重组蛋白酶毕赤酵母表达载体构建中的pZTR表达载体图谱。
图2为重组蛋白酶发酵诱导表达中的ZTR发酵液SDS-PAGE检测结果。
图3为重组蛋白酶纯化结果，其中a为纯化后的CPB蛋白酶原及CPB蛋白酶，b为纯化后的Kex2蛋白酶。
图4为CPB蛋白酶活力曲线。
图5为Kex2蛋白酶活力曲线。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
以下实施例中试剂均为分析纯试剂，分子克隆相关酶试剂购于New EnglandBiolabs公司，大肠杆菌菌株为本实验室保存，基因合成、引物合成和基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中未详细描述的分子克隆实验步骤均参考《分子克隆实验指南(第四版)》(M.R.格林、J.萨姆布鲁克主编，贺福初主译，北京：科学出版社，2017)。
实施例1
Kex2蛋白酶序列参考GenBank:AJT04530.1，全长814个氨基酸，其中信号肽和前体肽主要负责Kex2蛋白酶的自我加工；催化结构域中含有高度保守的催化三联体氨基酸和Ca2+结合位点；P结构域有保证正确折叠的作用，并且是酶活关键部位；Ser/Thr富集结构域为糖基化的主要场所；跨膜区以及胞外结构域主要负责Kex2蛋白酶在细胞内各细胞器之间的转换与运输。
CPB蛋白酶原的序列参考GenBank:EDM01081.1，全长415个氨基酸，包含信号肽、前导肽、成熟肽三部分，CPB蛋白酶原经胰蛋白酶切割后被激活成有活性的CPB蛋白酶。
Kex2蛋白酶序列与CPB蛋白酶原序列中间用连接肽串联，连接肽序列优选柔性连接肽GGGGS，本发明实施例选取为GGGGSKREAEAGGGGS，如SEQ ID NO.4所示。柔性肽GGGGS中间插入KREAEA短肽，在后期的分泌表达过程可被酵母自身Kex2酶识别而酶切。
本发明的实施例所设计的融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2，分为8个区域：1-94位氨基酸为Kex2蛋白酶前导肽区域，95-391位氨基酸为Kex2蛋白酶催化结构域，392-605位氨基酸为Kex2蛋白酶P结构域，606-660位氨基酸为Kex2蛋白酶丝氨酸/苏氨酸富集区，661-676位氨基酸为Kex2蛋白酶连接肽区域，677-771位氨基酸为CPB蛋白酶前导肽区域，772-1078位氨基酸为CPB蛋白酶成熟区域，1079-1084为6*HIS标签区域。密码子表达偏好性优化后编码基因序列为SEQ ID NO.3。编码基因是由苏州金唯智生物科技有限公司负责进行合成。
重组蛋白酶毕赤酵母表达载体构建
所需的引物如下：
正向引物P1，如SEQ ID NO.5所示：GAAAAGAGAGGCTGAAGCTTTGGTTTCTTCTCAACAAATT；
反向引物P2，如SEQ ID NO.6所示：CTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTAGTG ATGGTGATGGTGATGATACAGATGTTCGCGCACAT。
以SEQ ID NO.2合成基因作为模板，用正向引物P1和反向引物P2pcr扩增目标片段，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，得到约3.3kb条带。将条带从凝胶中切出，使用凝胶提取试剂盒进行回收，获得pcr片段P1/P2。
将表达载体pIC9k用NotI/EcoRI双酶切，酶切反应体系为30μg质粒(85μL)、3μLNotI、3μLEcoRI、10μL 10*cutsmart，在37度酶切1.5h后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中载体的约9kb条带从凝胶中切出，使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
按照NotI/EcoRI双酶切后的载体pIC9k 70ng、pcr片段P1/P2 300ng、2*无缝克隆试剂盒5μL的体系将载体与外源片段连接，得到重组表达载体并命名为pZTR，重组表达载体图谱见图1。
挑取5个载体用通用引物5’AOX和3’AOX做pcr验证，并将验证正确的载体用引物5’AOX和3’AOX进行测序分析以确保外源序列无突变。
将测序正确的表达载体ZTR线性化，酶切体系为30μg质粒(83μL)、3μLSacI、9.5μL10*cutsmart，在37度酶切1.5h后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，约12kb条带从凝胶中切出，使用凝胶提取试剂盒进行回收，获得线性片段pZTR-SacI。
重组蛋白酶毕赤酵母表达菌株的构建和筛选
所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115电转感受态，转化方法为：将感受态从-80℃冰箱中取出放在冰上，感受态融化后加入约1～2μg实施例2获取的线性表达载体ZTR-SacI，枪头缓慢搅匀冰浴5分钟后电击，电击后加入1mL预冷的YPD液体培养基，30℃220rpm复苏1～2h，涂布在含有500mg/mLG418固体YPD平板上，30℃培养2～3天，挑取转化子验证正确后，用4g/mLG418筛选多拷贝重组表达转化体，命名为ZTR，扩培后用20％终浓度甘油保存于-80℃。
重组蛋白酶发酵诱导表达
从重组表达转化体甘油管中取5μL甘油菌接种于5mLYPD液体培养基中，30℃、220rpm培养。培养至OD60010～15时，按菌液：培养基＝1：100(v:v)接种于100mLBMGY液体培养基中，30℃和220rpm的条件下培养至OD600约为10-15时，收集菌体，用100mL BMMY培养基重悬，在30℃和220rpm的条件下继续培养，之后每24h加入1％甲醇诱导，诱导96h后收集发酵液上清，图2为ZTR发酵液SDS-PAGE检测结果。
重组蛋白酶纯化
纯化步骤如下：
1)收集ZTR发酵液上清液并加入硫酸铵调节电导至90ms/cm；
2)将处理好的发酵上清液上样至用流动相A平衡好的疏水柱上，收集流穿液，CPB蛋白酶原可结合至填料上，Kex2蛋白酶不能结合至填料存在于流穿液中，实现CPB蛋白酶原和Kex2蛋白酶的分离；
3)用流动相B进行洗脱，最终纯化得到CPB蛋白酶原。
4)CPB蛋白酶原按照质量比100:1用胰蛋白酶消化，将消化液上样至用流动相C平衡好的镍柱上，用流动相D进行洗脱，最终纯化得到有活性的CPB蛋白酶，SDS-PAGE检测为单一主条带(图3a)。
5)将步骤2)收集的流穿液脱盐，并上样至用流动相E平衡好的阴离子交换柱上，用流动相F进行洗脱，最终纯化得到Kex2蛋白酶，SDS-PAGE检测为单一主条带，(图3b)。
所需的流动相如下：
流动相A：0.6M硫酸铵、20mM Tris，pH8.0；
流动相B：水、20mM Tris，pH8.0；
流动相C：20mM Tris-HCl、300mM NaCl、10mM咪唑，pH8.0；
流动相D：20mM Tris-HCl、300mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0；
流动相E：10mM NaAc-HAc pH 5.0；
流动相F：0.5M NaCl、10mM NaAc-HAc pH 5.0。
CPB蛋白酶活性检测
CPB蛋白酶活性检测步骤如下：①配制测活缓冲液：25mM Tris、0.1MNaCl，pH7.65，马尿酰-L-精氨酸16.8mg，定容至50mL，25℃条件下充分溶解；②取底物溶液2.9mL，加入CPB蛋白酶100μL混匀，测定时每隔30s读取吸光值A254，记录5分钟，以空白溶液100μL作为对照。③酶活力单位(U)的定义为：在25℃，每分钟水解1μM底物所需的酶量，比活单位为U/mg。
测定结束后以吸光度(A254)为纵坐标，时间(min)为横坐标作图，按以下公式计算出CPB蛋白酶的酶活力：
P＝(A1-A2)/(0.12*T*W)，
其中P为CPB蛋白酶的比活力，单位：U/mg；A1为直线上终止的吸光值；A2为直线上开始的吸光值；T为A1至A2读数的时间，min；W为测定液中供试品的量，单位mg；0.12为在上述条件下，吸光值每分钟改变0.12，即相当于1个重组人CPB活力单位。
经测定CPB蛋白酶活力曲线见图4，本发明CPB蛋白酶比活为226.3U/mg，标品的比活力为176.5U/mg，本发明CPB蛋白酶比活是市售的1.3倍，活力优于市售CPB蛋白酶。
Kex2蛋白酶活性检测
Kex2蛋白酶活性检测步骤如下：①配制测活缓冲液：50mM的Tris-HCl、2mM Ca2+、100μmol/L Boc-QRR-pNA(Boc-Gln-Arg-Arg-pNA)，PH 8.0；②3ml底物溶液中加入适量的酶，测定时每间隔20s记录吸光值A405，记录3min，以不加酶的反应作为对照。③酶活力单位(U)的定义为：在25℃，pH 8.0的条件下，每分钟催化1μmol的Boc-QRR-pNA转化为产物所需要的酶量。
测定结束后以吸光度(A405)为纵坐标，时间(S)为横坐标作图，按以下公式计算出Kex2蛋白酶的酶活力：U＝△A/min×F，/>
其中P为Kex2蛋白酶的比活力，TV为反应总体积(mL)，SV为加入的样品体积(mL)，L为比色皿的光径，L＝1cm，ε为该反应体系被检测物质的摩尔消光系数，ε＝1.02×104[L/(mol·cm)]。
经测定Kex2蛋白酶活力曲线见图5，本发明Kex2蛋白酶比活为15.4U/mg，标品的比活力为13.6U/mg，本发明Kex2蛋白酶酶活高于市售Kex2蛋白酶，因此，本发明Kex2蛋白酶和CPB蛋白酶共表达的方法在蛋白/多肽类药物生产中有广阔的应用前景。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法，其特征在于，所述融合表达方法使用的结构为：重组双碱性内肽酶截断体-连接肽-羧肽酶B蛋白酶原，所述重组双碱性内肽酶截断体包括重组双碱性内肽酶前导肽区域、重组双碱性内肽酶催化结构域、重组双碱性内肽酶P结构域、重组双碱性内肽酶丝氨酸/苏氨酸富集区。
2.根据权利要求1所述的融合表达方法，其特征在于，所述重组双碱性内肽酶截断体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的融合表达方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列含有重组双碱性内肽酶的酶切位点KREAEA。
4.根据权利要求1所述的融合表达方法，其特征在于，所述融合表达方法使用的结构的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
5.权利要求1所述的重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法所编码的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID No.3所示。
7.一种载体，其特征在于，其含有权利要求5所述的基因。
8.一种整合如权利要求7所述载体的宿主细胞。
9.根据权利要求1所述的融合表达方法，其特征在于，所述重组双碱性内肽酶和羧肽酶B的融合表达方法，包括以下步骤：
1)收集权利要求8所述的宿主细胞的发酵液，调节电导至90ms/cm，将其上样至用流动相A平衡好的疏水柱上，收集流穿液；
2)用流动相B进行洗脱填料，得到羧肽酶B蛋白酶原；
3)用胰蛋白酶消化羧肽酶B蛋白酶原，将消化液上样至用流动相C平衡好的镍柱上，
用流动相D进行洗脱，得到羧肽酶B；
4)将步骤1)收集的流穿液脱盐，上样至用流动相E平衡好的阴离子交换柱上，用流动相F进行洗脱，得到重组双碱性内肽酶。
10.根据权利要求9所述的融合表达方法，其特征在于，所述流动相组成为：
流动相A：0.58～0.62M硫酸铵、18～22mM Tris，pH 7.9～8.1；
流动相B：水、18～22mM Tris，pH8.0；
流动相C：18～22mM Tris-HCl、290～310mM NaCl、9～11mM咪唑，pH 7.9～8.1；
流动相D：18～22mM Tris-HCl、290～310mM NaCl、240～260mM咪唑，pH 7.9～8.1；
流动相E：9～11mM NaAc-Hac，pH 4.9～5.1；
流动相F：0.49～0.51M NaCl、9～11mM NaAc-Hac，pH 4.9～5.1。
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