FI101232B - DNA-rakenteet, jotka sisältävät Kluyveromyces-hiivan alfa-tekijän joht osekvenssin ohjaamassa heterologisten polypeptidien erittymistä - Google Patents

Description

101232 DNA-rakenteet, jotka sisältävät Kluyveromyces-hiivan alfa-tekijän johtosekvenssin ohjaamassa heterologisten polypeptidien erittymistä - DNA-konstruktioner innehällande en alfa-faktorledarsek-vens av Kluyveromyces för styrning av avsöndring av he-terologa polypeptider

Esillä oleva keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-teknii-kan alueeseen. Tarkemmin sanottuna se koskee Kluyveromy-ces-hiivan ^-tekijän johtosekvenssien käyttöä heterologisten polypeptidien erittymisen ohjaamiseen hiivassa.

USA:n patenttijulkaisussa no. 4 546 082 selostetaan Saccharomyces cerevisiaen cx-tekijän prekursorigeeniä ja esitellään S^. cerevisiaen johtosekvenssin DNA-raken-teita ja heterologisia geenejä, jotka DNA-rakenteet ovat hyödyllisiä heterologisten geenien ilmentämisessä.

Julkaisussa EPÄ 0 116 210 selostetaan S. cerevisiaen DC-tekijän johtosekvenssin todellista käyttöä ihmisen orvaskeden kasvutekijän ilmentämiseen ja erittymisen aikaansaamiseen hiivassa. USA:n patenttihakemusjulkaisussa no.

522 909, jätetty virastoon 12. elokuuta, 1983, selostetaan S_. cerevisiaen "välikkeettömien" ος-tekijän johtosekvenssien käyttöä heterologisten geenien tehokkaamman erittymisilmen-tymisen aikaansaamiseen.

Julkaisussa Science (1985) 229:1219-1224 selostetaan S. cerevisiaen cx-tekijän signaalisekvenssin käyttöä prokymosiinin erittymisen ohjaamiseen. Selostuksen mukaan suurin osa tuotetusta prokymosiinista oli solun sisällä liukenemattomassa muodossa eikä siis erittyneenä. Vaikka invertaasin johtosekvenssi oli tehokkaampi aktivoitavissa olevan prokymosiinin erittymisen ohjaamisessa, oli laaja mutanttien seulonta tarpeen, jotta prokymo-siiniä saatiin erittymään järkeviä määriä.

Ei ole olemassa mitään aiempaa osoitusta K. lactis-solujen eikä muidenkaan Kluyveromyces-lajien tuottamista paritteluferomoneista ((χ-tekijä ja a-tekijä). Se, ettei 101232 2 tällaisia peptidejä ole voitu tunnistaa K. lactiksesta, voi osittain johtua siitä, että K. lactiksella parittelu on indusoitavissa, kun taas S^. cerevisiaella on paritte-luferomonien tuotanto konstitutiivista.

Vaikka edellä mainitut johtosekvenssit ovatkin tarjolla heterologisten polypeptidien erittymisen ohjaamiseen hiivoissa, on olemassa jatkuva tarve saada käyttöön vaihtoehtoisia sekvenssejä, joilla voitaisiin toteuttaa joidenkin tiettyjen polypeptidien tehokkaampi ja käytännöllisempi tuotanto. Näin ollen patentiha-kijat halusivat saada selville, esiintyykö K. lactiksen D(-tekijää, ja jos esiintyy, olisiko siitä hyötyä heterologisten polypeptidien, kuten prokymosiinin, erittymisen aikaansaamiseksi hiivoissa.

Esillä oleva keksintö tarjoaa Kluyveromyces-hiivan ö(-tekijän johtosekvenssiin perustuvia DNA-rakenteita, joilla ohjataan heterologisten polypeptidien erittymistä hiivoissa. Kluyveromyces-transformantit, jotka sisältävät tällaisen rakenteen, erittävät tehokkaasti polypeptide jä, kuten prokymosiinia.

Näin ollen esillä oleva keksintö koskee ensinnäkin sellaista proteiinia koodittavaa DNA-rakennetta, jonka aminohappojärjestys kattaa Kluyveromyces-hiivasta peräisin olevan, erittymistä ohjaavan ^.-tekijän johtosek-• venssin liittyneenä heterologisen polypeptidin sekvens siin hiivan prosessointisignaalien välityksellä, jotka saavat aikaan mainitun proteiinin prosessoitumisen hetero-logiseksi polypeptidiksi.

Edelleen esillä oleva keksintö koskee ilmentämis-vektoria, joka sisältää hiivaisännässä toimivan repli-koitumis- tai integroitumissysteemin sekä sellaista proteiinia koodittavan DNA-rakenteen, jonka aminohappojärjestys kattaa Kluyveromyces-hiivasta peräisin olevan, erittymistä ohjaavan -tekijän johtosekvenssin liittyneenä heterologisen polypeptidin sekvenssiin hiivan prosessointisignaalin välityksellä, joka saa aikaan mainitun proteiinin prosessoitumisen mainituksi hetero- 101232 3 logiseksi polypeptidiksi.

Edelleen esillä oleva keksintö koskee menetelmää heterologisen polypeptidin tuottamiseksi hiivassa siten, että kasvatetaan hiivaa, joka sisältää edellä mainitut ominaisuudet täyttävän ilmentämisvektorin, ravinnealustas-sa olosuhteissa, joissa mainittu heterologinen polypepti-di ilmentyy ja erittyy hiivan toimesta "propolypeptidinä" ja polypeptidi prosessoituu mainituksi heterologiseksi polypeptidiksi ainakin osittain.

Huomattakoon, että termit johtosekvenssi (engl. leader sequence) ja signaalisekvenssi (engl. signal sequence), niinkuin niitä tässä selostuksessa on käytetty, ovat toistensa synonyymejä.

Kuva 1 esittää strategiaa, jota käytettiin K. lactik-sen »(-tekijän DNA:n tunnistamiseen käytettyjen oligonukleo-tidikoettimien suunnittelussa.

Kuva 2 esittää K. lactiksen{(-tekijää koodittavan DNA-fragmentin täydellistä sekvenssiä.

Kuva 3 on K. lactiksen o(-tekijän ja S. cerevisiaen 0(-tekijän proteiinisekvenssien vertailu.

Kuva 4 on K. lactiksen o(-tekijän ja S^. cerevisiaen ö(-tekijän kaavioesitys.

Kuva 5 on K. lactiksen o(-tekijää ja S. cerevisiaen 0/-tekijää koodittavien geenien DNA-sekvenssien vertailu.

Kuva 6 on kaavioesitys kolmesta plasmidista, joiden rakentaminen on selostettu yksityiskohtaisesti esimerkeissä.

Kuva 7 on reaktiokaavio, joka esittää K. lactiksen o(-tekijän johtosekvenssin DNA:n liittämistä prokymosii-nin DNA:hän.

Kuva 8 esittää plasmidia pAB309, jossa plasmidiin pUC18 on sijoitettuna BamHI/Sali-liitännäinen.

Kuva 9 on kaavioesitys plasmidista pGB901.

Kuva 10 on kaavioesitys plasmidista pGBTeG418.

Kuva 11 esittää K. lactiksen 0(-tekijän johtosekvenssin DNA:n mutatoinnissa käytettyjen alukkeiden sekvens- 101232 4 sejä.

Kuva 12 esittää K. lactiksen o(-tekijän johtosekvens-sin ja prokymosiinin DNA:n välisten liitoskohtien ympärillä olevia DNA-sekvenssejä.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti käytetään hiivasoluja kypsien heterologisten polypeptidien tuotantoon siten, että tällaiset polypeptidit otetaan suoraan talteen ravinne-alustasta. Polypeptidit tuotetaan käyttämällä DNA-raken-netta, joka koodittaa Kluyveromyces-hiivan «K-tekijän johto-sekvenssiä ja prosessointisignaalisekvenssia liittyneinä haluttuun heterologiseen polypeptidiin, joka voi olla yksi ainut heterologinen polypeptidi tai useiden hetrolo-gisten polypeptidien ryhmä, jossa heterologiset polypeptidit ovat prosessointisignaalin toisistaan erottamia.

Kyseinen rakenne koodittaa prepropolypeptidiä, joka sisältää signaalit prepropolypeptidin erittymiseksi ja polypep-tidin prosessoitumiseksi, joko solunsisäisesti tai solun-ulkoisesti, kypsäksi polypeptidiksi.

Esillä olevan keksinnön mukaiset rakenteet kattavat DNA-sekvenssin, jolla on seuraava polypeptidiä koodattava kaava: (XY-(ZW)n-geeni*)y jossa kaavassa X on lysiinin tai arginiinin kodoni; Y on arginiinin kodoni; W on alaniinin tai proliinin kodoni; Z on aminohapon kodoni, mielellään seriinin, lysiinin tai asparagiinin kodoni, kun W koodittaa proliinia, ja glutamiinihapon, asparagiinin, asparagiinihapon tai seriinin kodoni, kun W koodittaa alaniinia; y on kokonaisluku, joka on vähintään yksi ja tavallisesti korkeintaan 10, tavallisemmin korkeintaan neljä, mahdollistaen monomeerit ja multimeerit;

Geeni* on muu geeni kuin Kluyveromyces-hiivan vil-lityyppinen, johtosekvenssiin liittyvä 0^- teki jän geeni 101232 5 eli hiivaisännälle vieras geeni, tavallisesti kasvin tai nisäkkään geeni; ja n on O tai kokonaisluku, joka yleensä on välillä 1-8, tavallisesti 3-7. Mielellään n on 0.

Tässä kaavassa määrittelevät X:n, Y:n, Z:n ja W:n koodittamat aminohapot *-tekijän prosessointisignaalin niin, että X;n ja Y:n koodittamat aminohapot määrittelevät didpeptidikatkaisukohdan ja Z:n ja W:n koodittamat aminohapot' määrittelevät oligopeptidivälikkeen. Kuten seikasta, että n voi olla nolla, ilmenee, voi välike olla läsnä tai se voi puuttua. Jos välike on läsnä, sisältää rakenne tyypillisesti lisäsekvenssejä, jotka mahdollistavat välikkeen määrittelemien N-pään tähteiden poiston niin, että syntyy geeni*:n koodittama. kypsä proteiini.

Enimmäkseen on keksinnönmukaisilla rakenteilla vähintään seuraava kaava: L-(XY-(ZW;)n-geeni*)y joka koodittaa prepropolypeptidiä, jossa L on Kluyveromy-ces-hiivan johtosekvenssi, joka saa aikaan prepropolypepti-din erittymisen, ja muut symbolit ovat edellä määriteltyjä. Voidaan käyttää mitä tahansa Kluyveromyces-hiivan johtosekvenssiä, joka saa aikaan erittymisen, mutta yleensä johtosekvenssien pituus on noin 20 - 120 aminohappoa, tavallisesti noin 30 - 100 aminohappoa, sisältäen hydrofobisen alueen ja metioniinin N.-päässä.

Johtosekvenssi L voi olla täyspitkä ^-tekijän johto-sekvenssi, joka on peräisin mistä tahansa Kluyveromyces-lajista, kuten K. lactiksesta tai K. fragiliksesta, tai toiminnallinen (so. kykenevä ohjaamaan erittymistä) frag-. mentti, mutaatio, joka voi olla konservatiivinen tai epä- konservatiivinen sisältäen tavallisesti korkeintaan 5, tavallisemmin korkeintaan 3 poikkeavaa aminohappoa, tai joku näiden analogi. Toiminnalliset fragmentit voidaan tunnistaa valmistamalla rakenteita, jotka kattavat täys-pitkän villityyppisen sekvenssin eri pituuksilta, ja seulomalla ne erittymisenohjauskyvyn suhteen. Kuvassa 2 101232 6 on esitetty lactiksen villittyypisen 0(.-teki jän geenin sekvenssi niin, että johtosekvenssiä edustava DNA koodit-taa aminohappoja 1-83. Kuvan 2 mukainen DNA-sekvenssi ei ole välttämätön. Mikä tahansa sekvenssi, joka koodittaa toimivaa Kluyveromyces-johto-oligopeptidiä, op· riittävä. Eri sekvenssit tulevat luetuiksi enemmän tai vähemmän tehokkaasti. On edullista, jos ainakin suurin osa sekvenssissä käytetyistä kodoneista on hiivoissa tavallisesti esiintyviä.

DNA-sekvenssejä, joita voidaan käyttää hyvin ilmen-tämiskasetteina, ovat seuraavan kaavan mukaiset

Tr- L- (XY-(ZW)n-(geeni*)d)y jossa kaavassa

Tr tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka koodittaa trans-kriptionsäätelysignaaleja, erityisesti promoottoria ja sellaisia muita säätelysignaaleja, kuin operaatttori, aktivaattorit, cap-signaali tai jokin muu transkription-tai luennan säätelyyn osallistuva sekvenssi; d on 0 tai 1 niin, että se on 1, kun y on suurempi kuin 1.

Tr-sekvenssin pituus on yleensä vähintään noin 100 ep ja korkeintaan noin 2000 ep. Erityisen hyödyllistä on käyttää sitä Tr-sekvenssiä, joka liittyy johtosekvens-siin L, jolloin voidaan käyttää DNA-fragmenttia, joka sisältää transkription- ja luennansignaalisekvenssit, jotka liittyvät isännälle endogeeniseen signaalisekvenssiin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita transkription ja luennan signaaleja, jotka saavat aikaan ilmentymistuot-teen paremman tuotannon.

Muut symbolit ovat edellä määriteltyjä.

Geeni*:n 3'-päätä voidaan muokata helpommin rakenteen muodossa, joka mahdollistaa geeni*:n sijoittamisen ainoaan rakenteessa olevaan restriktiokohtaan. Tällainen edullinen rakenne sisältää restriktiokohdan, johon sijoitettuna geeni* olisi lukuvaiheistuksessa aloituskodonin kanssa.

101232 7 Tällainen rakenne voidaan esittää symbolimuodossa seuraavasti: (Tr) -L-XY- ( ZW) - (SC), -Te

cl Π D

jossa kaavassa: aiemmin määritellyt symbolit ovat tässä samoja; a on 0 tai 1, mikä tarkoittaa, että rakenteessa voi olla transkriptio- ja luentasignaalit tai ne voivat puuttua; SC tarkoittaa lopetuskodonia;

Te on transkriptionlopetussignaali ja voi sisältää muitakin signaaleja, esimerkiksi polyadenyloitumissig-naalin; ja b on kokonaisluku, joka on yleensä välillä 0-4, tavallisemmin välillä 0 - 3, ja on myös selvää, että geeni* voi sisältää oman lopetuskodoninsa.

Geeni*:n yläpuolella oleva sekvenssi voidaan suunnitella siten, että se sisältää edullisia res-triktiokohtia, jotka sallivat geeni*:n korvaamisen muulla geeni*:llä. Tarpeen mukaan voidaan käyttää kytkijöitä ja adaptereita, jotta tällainen korvaaminen saadaan suoritetuksi .

Rakenne muodostaa siirrettävän sekvenssin, joka voidaan sijoittaa vektoreihin niin, että saadaan aikaan haluttu replikaatiosysteemi. Kuten jo edellä on mainittu, saattaa joissakin tapauksissa olla edullista korvata signaalisekvenssiin liittyvä villityyppinen promoottori eri promoottorilla. Hiivoissa saattavat glykolyyttisen reitin entsyymien promottorit saada aikaan korkeita il-mentymistasoja. Nämä promoottorit liittyvät sellaisiin ·. entsyymeihin kuin fosfoglukoisomeraasi, fosfofruktokinaa- si, fosfotrioosi-isomeraasi, fosfoglukomutaasi, enolaasi, palorypälehappokinaasi, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydro-genaasi ja alkoholidehydrogenaasi. Nämä promoottorit voidaan sijoittaa signaalisekvenssin yläpuolelle. Johto-sekvenssin vieressä oleva 5'-alue voidaan säilyttää tai • se voidaan korvata vaihtoehtoisen promoottorin 3'-sek- 101232 8 venssillä. Voidaan valmistaa ja kirjallisuudessa on esitetty vektoreita, joiden sisältämässä promoottorissa on sopiva restriktiokohta promoottorin alapuolella edelläku-vatun kaltaisten rakenteiden sijoittamista varten.

Lopullinen ilmentämisvektori sisältää kyseisen ilmen-tämiskasetin ja replikaatio- tai integroitumissysteemin, joka toimii isännässä ja saa aikaan stabiilin ylläpysy-misen hiivaisännässä. Vektori voi haluttaessa sisältää replikaatiosysteemin, joka mahdollistaa kloonauksen pro-karyoottiin. Lisäksi mukana on yksi tai useampia valinta-merkkejä, jotka mahdollistavat valintapaineen isännässä* ylläpysymiseksi. Edelleen voi vektori olla suuren tai pienen kopiomäärän tuottava niin, että lukumäärä on yleensä välillä noin 1 - 200. Kopiomäärän ollessa suuri, on lukumäärä yleensä vähintään 10, mielellään vähintään 20 ja tavallisesti korkeintaan noin 150, mutta vielä tavallisemmin korkeintaan noin 100. Riippuen geeni*:stä ja siitä vaikutuksesta, joka vektorilla on isäntään, saattavat joko suuret tai pienet kopiomäärät olla edullisia. Jos vektorin ilmentämistuotteella on haitallinen vaikutus isännän elinkykyyn, saattaa pieni kopiomäärä olla toivottava.

Voidaan käyttää erilaisia isäntiä, mielellään mutant-teja, joilla on haluttuja ominaisuuksia. Huomattakoon, että riippuen rakenteen ilmentämistuotteen tuotantomäärästä saattaa prosessointientsyymiä olla riittävä tai riittämätön määrä prosessointia suorittamassa. Tästä syystä on edullista käyttää mutanttia, joka tuottaa paljon prosessointientsyymiä (dipeptidyyliaminopeptidaasi A ja/tai lys-arg-endopeptidaasi), tai suurempi tuotanto voidaan saada aikaan vektorin avulla. Yleensä pitäisi entsyymintuotannon olla suuruusluokaltaan pienempää kuin halutun ilmentymistuotteen tuotannon.

Voi myös esiintyä tilanteita, joissa solunsisäinen prosessoituminen ei ole toivottavaa. Silloin olisi hyvä, jos käytössä olisi mutantti, jossa tapahtuu erittyminen, 101232 9 mutta tuote ei prosessoidu. Tällöin voidaan tuote prosessoida jälkikäteen in vitro.

Saattaa olla edullista käyttää mutantti-isäntiä, joissa ilmentymistä voidaan säädellä. Esimerkiksi, kun esillä olevan keksinnön mukaiset rakenteet saavat aikaan sellaisen fuusioproteiinin ilmentymisen, että transfor-mattien kasvu on hidasta, saattaa olla kyse siitä, että fuusioproteiini on toksinen. Näin ollen, voidaan isäntä kasvattaa suureen tiheyteen, kun ilmentyminen estetään kasvun aikana, ja sen jälkeen voidaan muuttaa olosuhteet sellaisiksi, että ilmentyminen pääsee tapahtumaan.

Edelleen, kuten jo edellä mainittiin, voi geeni*: ssä olla useita sekvenssejä peräkkäin, jotka voivat olla samoja tai erilaisia sekvenssejä, ja joiden välissä on prosessointisignaali. Tällä tavalla tuote voi prosessoitua kokonaan tai osaksi niin, että saadaan eri sekvenssit joko erillisinä tai myöhempää prosessointia varten peräkkäisinä. Monissa tilanteissa saattaa olla edullista saada aikaan eri sekvenssejä niin, että kukin sekvenssi on tietyn proteiinituotteen alayksikkö.

Geeni* saattaa koodittaa mitä tahansa halutuntyyp-pistä proteiinia. Polypeptidi voi olla pieni, kuten 8 aminohapon oligopeptidi, tai se saattaa olla suuruudeltaan 100 000 daltonia tai suurempi. Tavallisesti yksittäisten ketjujen pituus on alle noin 300 000 daltonia, vielä tavallisemmin alle noin 150 000 daltonia. Erityisen mielenkiinnon kohteena ovat noin 5000 - 150 000 dal-tonin ja varsinkin noin 5000 - 100 000 daltonin poly-peptidit. Esimerkkejä mielenkiinnon kohteena olevista proteiineista ovat mm. hormonit ja tekijät, kuten kasvu-hormoni, somatomediinit ja orvaskeden kasvutekijä; endo-kriinisesti erittyvät aineet, kuten luteinisoiva hormoni, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, oksitosiini, insuliini, vasopressiini, reniini, kalsitoniini, follikkelia stimuloiva hormoni, prolaktiini jne., hematopoieettiset tekijät, esimerkiksi erytropoietiini, pesäkkeitä stimuloiva 101232 10 tekijä jne., lymfokiinit; globiinit; globuliinit, esim. immunoglobuliinit; albumiinit, esim. seerumialbumiinit, kuten ihmisen seerumialbumiini; interferonit, kuten , β ja S; repressorit; entsyymit, esimerkiksi kymosiini ja sen tsymogeenit, Λ- ja /3-amylaasi, glukoamylaasi, pullulanaasi, ksylanaasi, glukoosi-isomeraasi, sellulaasi, lipaasi, fosfolipaasi jne., endorfiinit, esimerkiksi β-endorfiini, enkefallini, dynorfiini jne.

Kun on valmistettu vektori, joka sisältää esillä olevan keksinnön mukaisen rakenteen, voidaan saatu vektori siirtää hiivaisäntään. Hiivan laji ja suku eivät ole kriittisiä tekijöitä. Esimerkkejä hiivaisännistä ovat Kluyveromyces ja Saccharomyces. Siirtäminen tapahtuu tavanomaisesti ja on olemassa useita tapoja, joilla DNA:ta saadaan siirretyksi hiivaisäntään. Ks. esimerkiksi julkaisuja Hinnen et. ai., Proc. Acad. Natl. Sei. USA (1978) 75:1919-1933 tai Das et ai., J. Bacteriol. (1984) 158:1165-1167 tai Stinchcomb et ai., EPÄ 0 045 573. Saatuja trans-formantteja voidaan tämän jälkeen kasvattaa sopivassa ravinnealustassa, jossa valitsee sopiva valintapaine trans-formanttien suhteen. Jos ilmentyminen on indusoitavissa, voidaan hiivan antaa kasvaa suureen tiheyteen ja sen jälkeen indsoida ilmentyminen. Tilanteissa, joissa huomattava osa tuotteesta saattaa jäädä periplasmiseen tilaan, ! voidaan tuote vapauttaa käsittelemällä solut entsyymillä, kuten tsymolaasilla tai lytikaasilla.

Tuote voidaan ottaa talteen millä tahansa sopivalla tavalla, mm. puhdistamalla proteiini kromatografisesti, elektroforeettisesti, dialysoimalla, liuotin-liuotinuutol-la jne.

Seuraavan menetelmän avulla voidaan saada esiin geenejä, jotka koodittavat Kluyveromyces-lajin kantojen ^-tekijöitä, jotka kannat ovat muita kuin jäljempänä esimerkkinä esitetty K. lactis-kanta. Valmistetaan radio-aktiivisesti leimattu koetinoligonukleotidi, jonka rakenne on jompi kumpi kuvassa 1 esitetyistä, ja sitä käyte 101232 11 tään muun kannan perimä-DNA:n katkaisutulosten seulontaan. Vaihtoehtoisesti voitaisiin käyttää koettimena S_. cerevisiaen »(-tekijän geenin nick-luettua fragmenttia.

Yksi käyttökelpoinen tekniikka on sijoittaa perimä-DNA:n rajoitetussa endonukleaasikatkaisussa saadut segmentit plasmidiin ja käyttää näin saatuja plasmideja E. colin tai jonkun muun bakteerikannan transformointiin niin, että saadaan plasmidikirjasto. Pesäkkeiden DNA voidaan sen jälkeen helposti hybridisoida koettimen kanssa nitro-selluloosakalvoilla.

Ne DNA-fragmentit, jotka on saatu tunnistetuiksi hybridisoitumisestaan edellä mainittujen koettimien kanssa, katkaistaan erilaisilla restriktioentsyymeillä ja saadut fragmentit analysoidaan Southern-blottauksella tai vastaavalla menetelmällä samoja hybridisointikoettimia käyttäen, jotta saadaan tunnistetuiksi ne restriktiofragmentit, jotka kokonsa puolesta soveltuvat DNA:n sekvenssointiin. Tunnistetut fragmentit puhdistetaan tämän jälkeen ja kloonataan sopiviin vektoreihin, jotta saadaan tuotetuksi riittävästi DNA:ta sekvenssointia varten.

Näitä menetelmiä käyttäen voidaan saada esiin Kluyveromyces-hiivan <X -tekijän geenejä muista kannoista kuin niistä, jotka on tässä selostuksessa nimenomaan mainittu.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan saada aikaan mitä erilaisimpien polypeptidien ilmentyminen niin, että tuotteen saanto on kohonnut suuresti, puhdistus on yksinkertaisempaa, halutun tuotteen hajoaminen on mahdollisimman vähäistä ja prosessointi, laitteet ja insinööritekniikka yksinkertaisempaa. Lisäksi voidaan ravinteiden hyväksikäyttöä tuottavuuteen verrattuna parantaa suuresti niin, että saadaan aikaan polypeptidien taloudellisempi ja tehokkaampi tuotanto. Hiivan käytöllä on myös monia etuja sikäli, että vältetään endotoksiinit, joita voi olla läsnä prokaryooteissa, ja voidaan käyttää ennestään tunnettuja menetelmiä, jotka on kehitetty hiivoil 101232 12 le pitkän ajan kuluessa, ja joihin menetelmiin sisältyy hiivan tuotteiden eristäminen.

Keksintöä valaistaan seuraavien esimerkkien avulla. Näillä esimerkeillä ei ole tarkoitus rajoittaa keksinnön kattamaa alaa millään tavoin.

Esimerkit K. lactiksen o<-tekijän tunnistaminen ja eristäminen

Viljelmien emäliuosten biologiset määritykset suoritettiin julkaisussa Julius et ai., Cell (1983) 32:839 kuvatulla tavalla käyttämällä koetuskantana (engl. tester) S. cerevisiae Mat a sst2-3-kantaa RC687. K. lactis-kantaa CBS 141(oc) kasvatettiin ravinnealustassa, jossa oli 0,5 % glukoosia, 0,17 % hiivan typpiravinnealustaa ilman ammo-niumsulfaattia (Difco) ja 0,002 % ammoniumsulfaattia.

Solut sentrifugoitiin pois ja viljelmän emäliuokseen lisättiin etikkahappoa pitoisuuteen 0,1 mol/1 ja sen jälkeen emäliuos laskettiin Bio-Rex 70-pylvään läpi (Biorad).

Pylväs pestiin 0,1 M etikkahapolla ja sen jälkeen <X-tekijä eluoitiin 80 %:sella etanolilla, jossa oli 10 mM HCl.

Eluaatti haihdutettiin kuiviin ja jäännös liuotettiin liuokseen, jossa oli 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA) ja 20 % asetonitriiliä, ja saatu liuos sijoitettiin kään-teisfaasi-HPLC-suojakolonniin. Kolonni pestiin vaiheittain liuoksilla, jotka sisälsivät 0,1 % trifluorietikkahappoa ja 20 %, 40 %, 60 % ja 80 % asetonitriiliä.

60 %:n jae, joka sisälsi o<-tekijäaktiivisuuden, pantiin sen jälkeen analyyttiseen C-18 HPLC-pylvääseen ja . eluoitiin gradientilla, jossa oli 20 % - 80 % asetonit- ' riiliä 0,1 %:sessa trifluorietikkahapossa. Kerättiin jakeet ja niistä analysoitiin o(-tekijäaktiivisuus. ¢(-tekijäaktiivisuutta sisältävät jakeet kuivattiin ja niille suoritettiin aminohapposekvenssin määritys käyttämällä Applied Biosystems’n kaasufaasiproteiinisekvenaattoria malli 470 A kytkettynä mallia 120A olevaan PTH-analysaat-toriin.

101232 13

Plasmidikirjaston seulonta hybridisoinnilla 3 2

Oligonukleotidierät leimattiin käyttämällä f-/ P/- ATP:tä ja T4-polynukleotidikinaasia. Näillä oligonukeoti-dikoettimilla tutkittiin Southern-blotit tai bakteeri-pesäkkeet 42°C:ssa seuraavassa hybridisointiliuoksessa: 4xSSC, 50 mM KH2 PC>4 pH 7, 1 % sarkosyyliä, 10 % dekstraa-nisulfaattia, 200 pg/ml sonikoitua, denaturoitua lohen sperman DNA:ta. Kalvot pestiin 42°C:ssa liuoksessa, jossa oli 2xSSC:tä ja 0,1 % SDSrää.

Kloonausvektoriin pJS109 tehty plasmidikirjasto (muita standardikloonausvektoreita, joita voidaan käyttää pJSl09:n tilalla ovat esim. pUC18 ja pBR322), joka sisälsi liitännäiset, jotka oli saatu katkaisemalla K. lactis-kannan SD11 (a trpl lac4) perimä-DNA rajoitetusti Sau3AI:llä ja fraktioimalla koon mukaan >5000 ep:n fragmenttien puhdistamiseksi, seulottiin näillä koettimilla maljaamalla E. coli-kannan HB101 transformantit tiheydessä 500 - 2000 pesäkettä per 80 mm:n malja käyttämällä L-agaria, joka sisälsi ampisilliiniä 100 jiq/ml. DNA siirrettiin pesäkkeistä nitroselluloosakalvoille ja nämä kalvot hybridisoitiin edelläkuvatulla tavalla. Alkuperäisistä maljoista poimittiin alueet, jotka vastasivat kalvojen hybridisoituneita alueita, ja poimitut pesäkkeet maljattiin ja hybridisoitiin uudestaan, jotta saatiin erilleen yksittäiset pesäkkeet, joiden plasmidissa oli hybridisoituvia sekvenssejä. Positiiviset pesäkkeet jatkotestattiin vielä suorittamalla pienistä viljelmistä puhdistetulle DNA:lie Southern-blot-analyysi.

Hybridisoinnissa positiivisiksi osoittautuneiden . pesäkkeiden plasmidit katkaistiin erilaisilla restriktio- * entsyymeillä ja syntyneet fragmentit analysoitiin Southern- blot-analyysillä samoja hybridisointikoettimia käyttäen, jotta saatiin esiin sopivankokoiset restriktiofragmentit DNA-sekvenssianalyysiä varten. Näin tunnistetut fragmentit puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin sopivaan MP18- tai MP19-vektoriin. Sen jälkeen 101232 14 suoritettiin DNA:n sekvenssianalyysi.

Kymosiininmääritykset viljelmien emäliuoksista

Viljelmistä poistettiin solut sentrifugoimalla ja saatujen emäliuosten pH säädettiin arvoon 2 lisäämällä 1 M rikkihappoa ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten liuosten pH nostettiin arvoon 6 lisäämällä 2 M Tris-emäsliuosta. 50 pl tarvittavaa laimennosta lisättiin 200 ^ul:aan suspensiota, jossa oli 12 % rasvatonta maitoa, ja jonka CaC^-pitoisuus oli 10 mmol/1, ja inkuboitiin 37°C:ssa, kunnes muodostui hyytymä. Kymosiiniaktiivisuusyksikkö määritellään sellaiseksi määräksi aktiivista kymosiinia, joka tarvitaan tuottamaan hyytymä 10 minuutissa näissä olosuhteissa.

Tulokset K. lactis-^-tekijän ensimmäiset 10 aminohappoa osoittivat selvää homologiaa S. cerevisiaen vastaavan kanssa siten, että oli 6 identtistä tähdettä. Tämä sekvenssi oli seuraava:

Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln Tämän proteiiniosan perusteella suunniteltiin joukko oligonukleotideja niin, että päätelmien perusteella ne ‘ olivat komplementaarisia vastaavalle rakennegeenille, kuten kuvassa 1 on esitetty. Oligonukleotidivaihtoeh-dot, jotka sisälsivät kaikki mahdolliset o(-tekijäpeptidin osa-alueen kodonit, syntetisoitiin kahtena eränä, joissa oli vastaavasti 96 ja 48 erilaista molekyyliä.

Nämä kaksi erää leimattiin radioaktiivisesti käyttämällä /'-/3^P/-ATP:tä ja T4-polynukleotidikinaasia ja kutakin käytettiin koettimena K. lactis-DNA:n restriktio-katkaisutuotteen Southern-blottauksessa. Erä nro. 2 antoi voimakkaan hybridisaation yhden fragmentin kanssa useissa eri katkaisuissa.Näin ollen erä 2 valittiin K. lactis-perimä-DNA:n kirjaston seulontaan.

Kun näitä koettimia käytettiin plasmidikirjastojen 101232 15 seulontaan, saatiin eristetyksi useita hybridisoituvia klooneja. Kun yhdelle näistä klooneista, W.fkl8g:lie, suoritettiin DNA-sekvenssin analyysi, havaittiin, että se koodittaa o(-tekijälle sukua olevaa peptidiä, joka on suuressa määrin samanlainen kuin S. cerevisiaen o(-teki-jäpeptidin prekursori. Hybridisoituva alue paikannettiin noin 1000 ep:n Pstl-EcoRI-fragmenttiin. Tämän fragmentin sekvenssi on esitetty kuvassa 2.

Tästä fragmentista pääteltyjen °C-tekijän prekurso-rien vertailut on esitetty kuvissa 3 ja 4. Kuten voidaan havaita, ovat niiden johtosekvenssit samanpituiset (aminohapot 1-83 kuvassa 3) ja välillä on huomattavasti homolo-giaa. K. laetis-prekursori sisältää kuitenkin vain kaksi kohtaa, joissa typpeen voi liittyä hiilihydraattiketju (kuva 4). Lisäksi K. lactiksessa toistuvien alueiden välialueet ovat pitempiä kuin jS. cerevisiaen toistuvien alueiden välialueet ja lisäksi niissä sekvenssi vaihtelee enemmän kaavion X-Ala/Pro mukaan, kun taas S. cerevisiaen sekvenssi on paremminkin Glu/Ala-Pro. DNA-sekvenssien välinen vertailu osoitti suurta homologia-astetta koko koodittavalla alueella (kuva 5).

Rakennettiin sarja plasmideja (esitetty kuvassa 6), jotta saatiin aikaan K. lactiksen ©(-tekijän johto-sekvenssin ja prokymosiinin fuusio ilmentymään voimakkaan promoottorin säätelyn alaisena. Ensin ^Cfkl8g:n 673 ep:n SspI-EcoRI-fragmentti muunnettiin täyttämällä yli ulottuva EcoRI-säie Klenow-entsyymin avulla ja lisäämällä tasaisiin päihin Bglll-kytkijä. Sitten tämä fragmentti sijoitettiin Bglll-kohtaan, joka liitti yhteen S. cerevisiaen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasigeenin (GAP) promottorialueen ja terminaattorialueen. Tämä kasetti kloonattiin plasmidin pUC18 BamHI-fragmenttiin, jolloin saatiin plasmidi pAB307.

Sitten suoritettiin ö(-johtosekvenssin ja naudan prokymosiinin sekvenssin yhteenliittäminen. Ensin pAB307 katkaistiin Ncol;llä ja kohesiiviset päät tehtiin tasai 101232 16 siksi käsittelemällä mung-pavun nukleaasilla. Sitten näin saatu tuote katkaistiin Sali:llä. Sitten tähän fragmenttiin liitettiin 2000 ep:n EcoRV-Sall-fraqmentti (sekvenssit esitetty kuvissa 7 ja 8), joka sisälsi proky-mosiinia koodittavan sekvenssin ja S. cerevisiaen GAP-transkriptionlopetusalueen. Tämä fragmentti saatiin plas-midista pJSlll, jossa Xbal-BamHI-adapteri oli liitettynä sellaisen fragmentin 5'-päähän, joka sisälsi prokymosiinin cDNA:n liittyneenä S. cerevisiaen GAP:n transkriptionlope-tusalueeseen. Saadulla yhteenliittämisseoksella transformoitiin kanta E. coli HB101 ja eristettiin transformant-ti, jossa oli plasmidi pAB309. Tämän yhdistelmän liitoskohdan ympärillä olevat sekvenssit on esitetty kuvassa 7 ja plasmidin pAB309 sisältämän koko BamHI-Sali-liitän-näisen sekvenssi on esitetty kuvassa 8.

Jotta saataisiin aikaan K. lactis-kantojen transformoituminen, sijoitettiin plasmidiin pAB309 3560 ep:n HindiII-fragmentti, joka sisälsi E. colin kanamysiinire-sistenssigeenin S. cerevisiaen ADH1-promoottorin transkrip-tionaalisessa säätelyssä sijoitettuna K. lactis LAC4-geenin 3'-alueen sisään, ja tällöin saatiin plasmidi pAB312. Liitännäisen läsnäolo seulottiin restriktiokatkaisuanalyy-sillä ja oikea suunta varmistettiin.

3560 ep:n HindiII-fragmentti saatiin plasmidista PGB901, jonka kaavio on esitetty kuvassa 9. Plasmidi pGB901 rakennettiin liittämällä yhteen (1) plasmidista pUCla56 eristetty 3,6 kernXbal-Haell-fragmentti, joka sisälsi laktaasin promoottorin noin asemaan -90 laktaa-sin aloituskodonista laskettuna (plasmidi pUCla56 on kuvattu jäljempänä), (2) Haell-SalLI-fragmentin, jonka nukleo-tidisekvenssi oli seuraava: « 5· TTAAC ACTTGAAATT TAGGAAAGAG CAGAATTTGG CAAAAAAAAT AAAAAAAAAA TAAACACG 3' 3* CGCGAATTG TGAACTTTAA ATCCTTTCTC GTCTTAAACC GTTTTTTTTA TTTTTTTTTT ATTTGTGCAG CT 5' (3) plasmidin pGB900 (kuvattu jäljempänä) 5,1 ke:n Sall-Xbal-fragmentin, joka sisälsi prokymosiinin ja antibioo- 101232 17 tille G418 resistenssin antavan geenin ja (4) Xbal;llä katkaistun plasmidin pUC19.

Plasmidin rakentamisen aikana Haell-kohdan CG-sek-venssi poistui tahattomasti ja tilalle syntyi HindiII-kohta.

Plasmidi pUCla56 rakennettiin seuraavasti. K. lac-tis-kannasta CBS 2360 eristettiin kromosomaalinen DNA ja se katkaistiin XhoI;llä ja erotettiin koon mukaan sakkaroosigradientissa. Laktaasigeenin sisältävät jakeet havaittiin LAC4-koettimella, kun DNA oli ensin täplitetty nitroselluloosakalvolle. LAC4-geenin sisältävä DNA kloonattiin plasmidin pPAl53-215 (P.M. Andreoli, Mol. Gen.

Genet. (1985) 199:372-380) XhoI-kohtaan ja saatiin plasmidi pPA31. Plasmidin pPA31 Xbal-fragmentti, joka sisälsi laktaasigeenin, alakloonattiin plasmidin pUC19 Xbal-kohtaan (Yanisch-Perron et ai., Gene (1985) 215103-119) ja saatiin plasmidi pUCla56.

Plasmidi pGB900 rakennettiin liittämällä (1) plasmidin pGBTeG418 (esitetty kuvassa 10 ja kuvattu jäljempänä) 3,6 ke:n HindiII-Xbal-fragmentti, joka sisälsi G418-resistenssigeenin, ja (2) plasmidin pGBl23 Sall-HindlII-fragmentti, joka sisälsi prokymosiinin geenin, plasmidiin pUC19, joka oli katkaistu Sali:llä ja Xbal: llä. Plasmidi pGB123 on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa EPÄ 0 096 430.

• Plasmidi pGBTeG418 (kuva 10) sisältää julkaisussa

Andreoli, Mol. Gen. Genet (1985) 199:372-380 kuvatun plasmidin pPA215 ja 5,6 ke:n fragmentin, jossa on 3,7 ke:n BamHI-laktaasiterminaattorifragmentti, joka on saatu K. lactiksesta (Breunig et ai., Nucleic Acids Res. (1984) 12:2327-2341), ja Tn5-geeni (Reiss et ai., EMBO J. (1984) 2:3317-3322), joka antaa G418-resistenssin hiivan alkoholi-dehydrogenaasi I:n (ADHI) promoottorin ohjauksessa, joka on samanlainen kuin julkaisussa Bennetzen and Hall, J.

Biol. Chem. (1982) 257:3018-3025 on selostettu. Plasmidi pGBTeG418 talletettiin CBS-kokoelmiin 26. helmikuuta, 1987 kokoelmanumerolla CBS 184.87.

i 101232 18

Plasmidi pAB312 katkaistiin EcoRV:llä (jotta integroituminen saatiin kohdistumaan K. laetis-perimän LAC4-alueelle) ja katkaisutuloksella transformoitiin K. lactis-kanta 2UV21 (a ura3 trpl lac4 /kil°/) G418-resistentiksi käyttämällä LiCl-tekniikkaa, joka on selostettu julkaisussa Das et ai J. Bacteriol. (1984) 158:1165-1167).

Lukuisia saaduista transformanteista sekä transfor-moimatonta kontrollikantaa kasvatettiin 36 tuntia 1 ml:ssa ravinnealustaa, jossa oli 1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 2 % glukoosia, 0,17 % hiivan typpiperusalustaa, 50 ^ig/ml tryptofaania ja 50 ug/ml urasiilia. Sitten viljelmien emäliuoksista analysoitiin kymosiiniaktiivisuus, kun oli ensin suoritettu aktivointi hapolla. Kaikkien trans-formanttien havaittiin erittävän 100 - 120 yksikköä aktivoitavissa olevaa kymosiinia per ml.

Välikekodonien poisto in vitro-mutatoinnilla

Plasmidista pAB309 eristettiin 1900 ep:n Sacl-Hjndlll-fragmentti ja se kloonattiin MP19:ään (Yanisch-Perron et ai., Gene (1985) Valmistettiin yksi- säikeinen fagi-DNA, jota käytettiin templaattina in vitro-mutatoinnissa kuvassa 11 esitettyjen oligonukleotidialuk-keiden kanssa. Valmistettiin M13-fagit MP19/«kll.5 ja . MP19/<\kl2.2 käyttämällä vastaavasti alukkeita nro. 1 ja 2.

Kustakin näistä fage ista valmistettiin kaksisäikei-nen RF DNA ja kummastakin eristettiin 1100 ep:n Sacl-Stul-fragmentti. Nämä fragmentit liitettiin plasmidista pAB312 saatuun 7100 ep:n Sacl-Stul-fragmenttiin. Saadut plasmidit pAB313 ja pAB314 eristettiin ja niiden sekvens- » sien erot on esitetty kuvassa 12.

Plasmideilla pAB313 ja pAB314 transformoitiin kanta 2UV21 resistentiksi G418:lle. Transformantteja 2UV21:: PAB312, 2UV21::pAB313 ja 2UV21::pAB314 kasvatettiin ja viljelmien emäliuoksista määritettiin kymosiiniaktiivisuus edellä kuvatulla tavalla. Näiden määritysten tu- 101232 19 lokset on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Kymosiiniaktiivisuus

Kanta Isäntä Plasmidi (yksikköä/ml viljelmää) 2UV21 2UV21 - <2 KRN303-1 2UV21 pAB312 256 KRN304-4 2UV21 pAB313 175 KRN305-2 2UV21 pAB314 206

Jokaisen transformantin havaittiin erittävän yhtä prokymosiinille sukua olevaa lajia, kun arviointi suoritettiin tekemällä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi trikloorietikkahapolla saostetuille viljelmien emäliuoksil-le. pAB312-transformanttien erittämä prokymosiinille sukua oleva proteiini näytti olevan molekyylimassaltaan hieman suurempi kuin pAB313- ja pAB314-transformantin erittämät elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella määritettynä.

Edellä mainittujen kantojen solupelleteistä analysoitiin kymosiiniaktiivisuus ja sen havaittiin olevan alle 2 % emäliuoksesta löytyneestä aktiivisuudesta. Näin ollen Kluyveromyces-^-tekijä on noin 98 %:sen tehokas Kluyveromyces lactiksessa tapahtuvan prokymosiinierityksen * ohjaamisessa.

KRN303-l:n ja KRN304-4:n erittämät päälajit puhdistettiin preparatiivisella SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesillla ja sen jälkeen niille suoritettiin aminohappo-järjestyksen määritys kaasufaasissa. Näiden lajien N-pään sekvenssit olivat seuraavat: KRN303-1 1 5 10 15

Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pro KRN304-4 101232 20 1 5

Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile Nämä tulokset osoittavat, ettei KRN303-l:n erittämässä prokymosiinille sukua olevassa lajissa ole tapahtunut aminopään välikesekvenssissä prosessoitumista, mutta sen sijaan KRN304-4:n erittämässä lajissa on aito kypsän prokymosiinin aminopää.

Seuraavat organismit talletettiin American Type Culture Collection-kokoelmiin 30. kesäkuuta, 1987: HB101 PAB307, ATCC No. 67454; HB101 pAB312, ATCC No.

67455.

Vaikka tätä keksintöä onkin esimerkkien ja kuvien avulla valaistu selventävässä tarkoituksessa, on selvää, että tiettyjä muuutoksia ja muunnoksia voidaan tehdä liitteenä olevien patenttivaatimusten kattamissa rajoissa.

Claims (19)

101232

1. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se koodit-taa proteiinia, jonka aminohappojärjestys kattaa erittymistä ohjaavan Kluyveromyces-g-tekHän johtosekvenssin liittyneenä heterologisen polypeptidin sekvenssiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että Kluyveromyces-a-tekijän johtosekvens-si on liittynyt heterologisen polypeptidin sekvenssiin hiivan prosessointisignaalin välityksellä, jonka avulla mainittu proteiini prosessoituu mainituksi heterologiseksi poly-peptidiksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että sen 5'-päässä on lisäksi hiivan promoottori .

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että johtosekvenssi on villityyppisen Kluyveromyces-a-tekij än täyspitkä johtosekvenssi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että johtosekvenssi on kuvassa 2 esitetty j ohtosekvenssi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että johtosekvenssi on villityyppisen Kluyveromyces-a-tekij än täyspitkän johtosekvenssin toiminnallinen fragmentti.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että täyspitkä johtosekvenssi on kuvassa 2 esitetty johtosekvenssi.

8. Patenttivaatimuksen l mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että Kluyveromyces-a-tekij än johtosekvenssi on Kluyveromyces lactiksen α-tekijän johtosekvenssi.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että hiivan prosessointisignaali sisältää emäksisen dipeptidikatkaisukohdan ja välikkeen.

10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että hiivan prosessointisignaali 101232 sisältää emäksisen dipeptidikatkaisukohdan liittyneenä suoraan heterologisen polypeptidin N-päähän ja välike puuttuu.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että emäksinen dipeptidikatkaisukoh-ta on lysiini-arginiini tai arginiini-arginiini.

12. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että hiivan promoottori on α-tekijän promoottori tai GAP-promoottori, Kluyveromyces-a-tekijän johto-sekvenssi on Kluyveromyces lactiksen α-tekijän johtosekvenssi ja Kluyveromyces lactiksen α-tekijän johtosekvenssi on liittynyt heterologisen polypeptidin sekvenssiin hiivan proses-sointisignaalin välityksellä, joka koostuu lysiini-arginii-ni-katkaisukohdasta ja välikkeestä.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että heterologinen polypeptidi on prokymo-siini.

14. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että hiivan promoottori on α-tekijän promoottori tai GAP-promoottori, Kluyveromyces-a-tekljän johto-sekvenssi on Kluyveromyces lactiksen α-tekijän johtosekvenssi ja Kluyveromyces lactiksen α-tekijän johtosekvenssi on liittyneenä heterologisen polypeptidin sekvenssiin hiivan prosessointisignaalin välityksellä, joka sisältää lysiini-arginiini-katkaisukohdan ilman välikettä suoraan liittyneenä heterologiseen polypeptidiin.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että heterologinen polypeptidi on prokymo-siini.

16. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää replikoituvan tai integroituvan systeemin stabiilia hiivassaylläpysymistä varten ja minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-15 mukaisen DNA-rakenteen.

17. Menetelmä heterologisen polypeptidin tuottamiseksi hiivassa, tunnettu siitä, että hiivaa, joka sisältää patenttivaatimuksen 16 mukaisen ilmentämisvektorin, kasvatetaan ravinnealustassa olosuhteissa, joissa mainittu hetero- 101232 loginen polypeptidi ilmentyy ja erittyy mainitun hiivan toimesta propolypeptidinä, ja propolypeptidi prosessoituu mainituksi heterologiseksi polypeptidiksi ainakin osittain.

18. Menetelmä heterologisen polypeptidin tuottamiseksi hiivassa niin, että heterologinen polypeptidi erittyy hiivan α-tekijän johtosekvenssin ohjaamana, tunnettu siitä, että hiivan α-tekijän johtosekvenssi on Kluyveromyces-a-tekijän johtosekvenssi.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Kluyveromyces-g-tekijän johtosekvenssi on Kluyveromyces lactiksen α-tekijän johtosekvenssi. * 4 101232