ES2313756T3 - Usos de polipeptido secretado wisp-1 inducido por wnt-1. - Google Patents

Usos de polipeptido secretado wisp-1 inducido por wnt-1. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para diagnosticar el crecimiento o proliferación de células neoplásicas en un humano, el cual comprende detectar la amplificación a nivel de la expresión de un gen que codifica un polipéptido WISP-1, que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), (a) en una muestra de ensayo de células del tejido obtenida del humano, y (b) en una muestra de control de células de tejido que se sabe es normal del mismo tipo de células, en donde la amplificación o una nivel de expresión superior en la muestra de ensayo indica la presencia de un tumor en el humano del cual se obtuvieron las células de tejido de ensayo.

Description

Usos de polipéptido secretado WISP-1 inducido por Wnt-1.
Campo de la invención
La presente invención se refiere de forma general a polipéptidos que tienen homología con el factor de crecimiento del tejido conectivo, denominado en la presente invención como Proteínas Secretadas Inducidas por Wnt-1 (WISP).
Antecedentes de la invención
Los tumores malignos (cáncer) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, por detrás de las enfermedades cardíacas. Boring et al., CA Cancer J. Clin., 43:7 (1993).
El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal, las cuales proliferan para formar una masa tumoral, por la invasión de tejidos adyacentes por parte de estas células tumorales, y por la generación de células cancerosas, las cuales, finalmente se propagan a través de la sangre o del sistema linfático hasta nódulos linfáticos regionales y hasta sitios distantes (metástasis). En un estado canceroso, una célula prolifera en condiciones en las que las células normales no crecen. El cáncer se manifiesta de una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad.
La alteración de la expresión génica está íntimamente relacionada con el crecimiento celular descontrolado y la desdiferenciación, las cuales son una característica común de todos los cánceres. Se ha hallado que los genomas de ciertos tumores bien estudiados muestran una expresión disminuida de genes recesivos, normalmente denominados como genes supresores de tumores, los cuales normalmente funcionarían para prevenir el crecimiento de las células malignas, y/o la sobreexpresión de ciertos genes dominantes, tales como los oncogenes, que actúan para promover el crecimiento canceroso. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser responsable de importar algunos de los rasgos que, en conjunto, representan el fenotipo neoplásico completo. Hunter, Cell, 64:1129 (1991); Bisbop, Cell, 64:235-248 (1991).
Un mecanismo bien conocidos de sobreexpresión de genes (por ejemplo, oncogenes) en células cancerosas es la amplificación de genes. Este es un proceso en donde se producen múltiples copias de un gen determinado en el cromosoma de la célula ancestral. El proceso implica una replicación no programada de la región del cromosoma que comprende el gen, seguida por una recombinación de los segmentos replicados de vuelta en el cromosoma. Alitalo et al., Adv, Cancer Res., 47:235-281 (1986). Se cree que la sobreexpresión del gen sucede de forma paralela a la amplificación del gen, es decir, es proporcional al número de copias realizadas.
Se ha identificado que los protooncogenes que codifican factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento desempeñan papeles importantes en la patogénesis de varios tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de mama. Por ejemplo, se ha hallado que el gen del ErbB2 humano (erbB2, también conocido como her2, o c-erbB-2), que codifica un receptor glicoproteico transmembrana de 185 kd (p185HER2; HER2) relacionado con el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), está sobreexpresado en aproximadamente del 25% al 30% de los cánceres de mama humanos. Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989).
Se ha descrito que la amplificación génica de un protooncogén es un suceso típicamente implicado en las formas más malignas de cáncer, y que puede actuar como un vaticinador del resultado clínico. Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer, 1:181-193 (1990); Alitalo et al., ver más arriba. Por tanto, la sobreexpresión del erbB2 es visto normalmente como un vaticinador de una prognosis pobre, especialmente en pacientes con una enfermedad primaria que implica nódulos linfáticos axilares (Slamon et al., (1987) y (1989), ver más arriba; Ravdin y Chamness, Gene, 159:19-27 (1995); y Hynes y Stern, Biochim. Biophys. Acta, 1198:165-184 (1994)), y se ha vinculado a la sensibilidad y/o resistencia a la terapia con hormona y a los regímenes quimioterapéuticos, incluyendo el CMF (ciclofosfamida, metotrexato, y fluoruracilo) y las antraciclinas. Baselga et al., Oncology, 11(3 Suppl 1):43-48 (1997). Sin embargo, a pesar de la asociación de la sobreexpresión del erbB2 con una prognosis pobre, las probabilidades de los pacientes HER2-positivos que respondían clínicamente al tratamiento con taxanos eran superiores a tres veces las de los pacientes HER2-negativos. Baselga et al., supra. Un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (anti-HER2) humanizado recombinante (una versión humanizada del anticuerpo múrido 4D5 anti-ErbB2, denominado rhuMAb HER2 o HERCEPTIN®) ha sido clínicamente activos en paciente con cánceres de mama metastáticos que sobreexpresaban el ErbB2, que habían recibido una amplia terapia anticáncer previa. Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996).
Las citocinas han sido implicadas en la patogénesis de un cierto número de enfermedades cerebrales, en las cuales la disfunción neurológica se ha atribuido a un cambio en el metabolismo de neurotransmisores aminoácidos. En particular, se han implicado miembros de la familia del factor-\beta de crecimiento transformante (TGF-\beta). Los péptidos TGF son polipéptidos pequeños que se identificaron primero por su capacidad para inducir la proliferación y transformación en células no cancerosas en cultivo. Aunque definido inicialmente como un factor de crecimiento, el CTGF-\beta inhibe también la proliferación de células epiteliales, endoteliales, linfoides y hematopoyéticas. Se cree que esta citocina desempeña un papel importante en la regulación de la duración de la respuesta inflamatoria, permitiendo que progrese el proceso de curación. Es también un potente inmunomodulador, el cual tiene muchos efectos pleiotróficos, incluyendo la regulación de muchas otras citocinas.
La superfamilia del TGF-\beta incluye las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7), las activinas A & B, el decapentaplégico(dpp), 60A, OP-2, la dorsalina, los factores de crecimiento y diferenciación (GDF), nodal, MIS, la inhibina-\alpha, el TGF-\beta1, el TGF-\beta2, el TGF-\beta3, el TGF-\beta5, y el factor neurotrófico derivado de glia (GDNF). Atrisano, et al., J. Biochemica et Biophysica Acta, 1222:71-80 (1994). Tienen especial interés los factores de crecimiento y diferenciación, puesto que, como su nombre implica, estos factores están implicados en la diferenciación de las células.
El factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) es un factor de crecimiento inducido en fibroblastos por muchos factores, incluyendo el TGF-\beta, y es esencial para la capacidad del TGF-\beta de inducir el crecimiento independiente del anclaje (AIG), una propiedad de las células transformadas. El CTGF se descubrió en un intento por identificar el tipo dímeros de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) presente en los medios de cultivo de células endoteliales cultivadas, y está relacionado inmunológica y biológicamente con el PDGF. Consultar la Patente Estadounidense nº 5.408.040. El CTGF es también mitogénico y quimiotáctico para las células, y, por tanto, se cree que los factores de crecimiento de esta familia desempeñan un papel en el desarrollo, crecimiento y reparación normales del tejido humano.
Se han aislado, clonado, secuenciado, y caracterizado como pertenecientes a la familia del gen del CTGF, siete proteínas relacionadas con el CTGF, incluyendo la ortóloga del pollo para Cyr61, CEF10, el CTGF humano, de ratón y de Xenopus laevis, y la Nov humana, de pollo y de Xenopus laevis. Oemar y Luescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17:1483-1489 (1997). Se ha hallado que el gen que codifica la Cyr61 promueve la angiogénesis, el crecimiento del tumor, y la vascularización. Babic et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 95:6355-6360 (1998). El gen nov se expresa en el riñón esencialmente en el estado embrionario, y las alteraciones de la expresión de nov, en relación al riñón normal, se han detectado tanto en nefroblastomas de aves como en tumores de Wilms humanos. Martinerie et al., Oncogene, 9:2729-2732 (1994). El Wt1 regula a la baja la expresión del nov humano, regulación a la baja que puede representar un elemento clave en la nefrogénesis normal y tumoral. Martinerie et al., Oncogene, 12:1479-1492 (1996). Recientemente se ha propuesto que los genes de CTGF, nov y cyr61, los cuales codifican proteínas secretadas que contienen secuencias conservadas y motivos IGFBP en sus extremos N-terminales, y que unen los IGF con baja afinidad, representan más miembros de la superfamilia del IGFBP, junto con la mac25/IGFBP-7 de baja afinidad (Yamanaka et al., J. Biol. Chem., 272: 30729-30734 (1997)) y las IGFBP 1-6 de alta afinidad. El CTGF, de acuerdo con esta propuesta, se denominaría IGFBP-8. Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12981-12986 (1997).
Recientemente, se ha hallado una proteína en el ratón, denominada ELM 1, que se expresa en células poco metastáticas. Hashimoto et al., J. Exp. Med., 187:289-296 (1998). El gen elm1, un homólogo de ratón del WISP-1 descrito más arriba, es otro miembro de la familia del CTGF, de Cyr61/Cef10, y del gen de neuroblastoma sobreexpresado, y suprime el crecimiento tumoral in vivo, y la metástasis de célula de melanoma múrida K-1735. Otro artículo reciente sobre rCop-1, el ortólogo de rata del WISP-2 descrito más abajo, describe la pérdida de expresión de este gen después de la transformación de la célula, Zhang et al., Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141 (1998).
Los miembros de la familia del CTGF (con excepción de nov) son genes que responden de forma inmediata al crecimiento temprano, y se cree que regulan la proliferación y diferenciación celular, la embriogénesis, y la curación de heridas. La homología de secuencia entre miembros de la familia del gen del CTGF es alta; sin embargo, la funciones de estas proteínas in vitro abarcan desde la estimulación del crecimiento (a saber, el CTGF humano) hasta la inhibición del crecimiento (a saber, el Nov del pollo y, posiblemente, el hCFGF). Además, se ha indicado que algunas moléculas homólogas del CTGF son útiles en la prevención de la desmoplasia, la formación del estroma excesivo de tejido conectivo, altamente celular, asociado con algunos cánceres, y las lesiones fibróticas asociadas con varios trastornos de la piel tales como la esclerodermia, la queloide, la fascitis eosinofílica, la fascitis nodular, y la contractura de Dupuytren. Más aún, se ha demostrado recientemente la expresión del CTGF en el estroma fibroso de los tumores de mama, lo que sugiere que la formación del estroma del cáncer implica la inducción de factores de crecimiento fibroproliferativos similares como reparadores de la herida. El CTGF humana también se encuentra expresado en niveles muy elevados en las lesiones ateroescleróticas avanzadas, pero no en las arterias normales, lo que sugiere que puede desempeñar un papel en la ateroesclerosis. Oemarand Luescher, supra. Por tanto, las moléculas homólogas del CTGF son importantes.
Las proteínas extracelulares y las unidas a membrana desempeñan papeles importantes en la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, está típicamente gobernadas por la información recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información se transmite a menudo mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas), los cuales, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos o moléculas de señalización secretados normalmente pasan a través de la vía secretora celular para alcanzar su sitio de acción en el entorno extracelular, usualmente en un proteína receptora unida a membrana.
Las proteínas secretadas tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo usos como farmacéuticos, diagnósticos, biosensores, y bioreactores. De hecho, la mayoría de los fármacos proteicos disponibles en la actualidad, tales como los agentes trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las eritropoyetinas, los factores estimuladores de colonias, y otras varias citocinas, son proteínas secretadas. Sus receptores, que son proteínas unidas a membrana, también tiene un potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, las inmunoadhesinas de receptor pueden emplearse como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana pueden emplearse también para examinar potenciales inhibidores peptídicos o de molécula pequeña de la interacción receptor-ligando relevante. Tales proteínas unidas a membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, los receptores de citocina, las quinasas receptoras, las fosfatasas receptoras, los receptores implicados en las interacciones célula-célula, y las moléculas de adhesión celular como las selectinas e integrinas. La transducción de señales que regulan el crecimiento y diferenciación celular está regulada, en parte, por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina quinasas, enzimas que catalizan ese proceso, pueden actuar también como receptores de factor de crecimiento. Los ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento del nervio.
Tanto la industria como el mundo académico se han esforzado en identificar nuevas proteínas, nativas secretadas y receptoras unidas a membrana, particularmente aquellas que tienen homología con el CTGF. Muchos esfuerzos se han concentrado en el examen de bibliotecas de ADN recombinantes de mamífero para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas secretadas y receptoras unidas a membrana. En la literatura se describen ejemplos de procedimientos y técnicas de examen. Consultar, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); ya la Patente Estadounidense nº 5.536.637.
Las Wnt están codificadas por una gran familia de genes cuyos miembros se han hallado en nematodos, insectos, peces cartilaginosos y vertebrados. Holland et al., Dev, Suppl., 125-133 (1994). Se cree que las Wnt funcionan en una variedad de procesos de desarrollo y fisiológicos, puesto que muchas especies diversas tienen múltiples genes de Wnt conservados. McMahon, Trends Genet., 8:236-242 (1992); Nusse y Varmus, Cell, 69:1073-1087 (1992). Los genes Wnt codifican glicoproteínas secretadas que se cree funcionan como señales activas paracrinas o autocrinas en varios tipos de células primitivas. McMahon, supra (1992); Nusse y Varmus, supra (1992). La familia del factor de crecimiento Wnt incluye más de diez genes identificados en el ratón (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -4, -5A, -5B, -6, -7A, -7B, -8A, -8B, -10B, -11, -12, y -13) (consultar, por ejemplo, Gavin et al., Genes Dev., 4:2319-2332 (1990); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2268-2272 (1995); Christiansen et al., Mech. Dev., 51:341-350 (1995)), y al menos nueve genes identificados en humanos (Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B, y -11) mediante clonación de ADNc. Consultar, por ejemplo, Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol., 4:2532-2534 (1984).
El protooncogén de la Wnt-1 (int-1) se identificó originalmente a partir de tumores mamarios inducidos por el virus del tumor mamario del ratón (MMTV) debido a una inserción de una secuencia de ADN vírico. Nusse y Varmus, Cell, 31:99-109 (1982). En los ratones adultos, el nivel de expresión del ARNm del Wnt-1 se detecta sólo en los testículos durante las etapas tardías de desarrollo del esperma. La proteína Wnt1 pesa aproximadamente 42 kDa y contiene una región hidrofóbica amino terminal, la cual puede funcionar como un secuencia señal para la secreción (Nusse y Varmus, supra, 1992). La expresión del Wnt-2/irp se detecta en tejidos de ratón fetal y adulto, y su distribución no se solapa con el patrón de expresión del Wnt-1, el Wnt-3 está asociado con la tumorigénesis mamaria del ratón. La expresión del Wnt-3 en los embriones de ratón se detecta en los tubos neurales y en los brotes de las extremidades. Los transcritos de Wnt5a se detectan en las extremidades anteriores y posteriores en desarrollo entre loes 9,5 y 14,5 días, y los niveles más elevados se concentran en el ectodermo apical del extremo distal de las extremidades. Nusse y Varmus, supra (1992). Recientemente, se ha descrito (WO95/17.146) un factor de crecimiento Wnt, denominado Wnt-x, junto con la detección de la expresión del Wnt-x en tejidos óseos y en células derivadas del hueso. También se ha descrito el papel del Wnt-x en el mantenimiento de los osteoblastos maduros, y el uso del factor de crecimiento Wnt-x como un agente terapéutico, o en el desarrollo de otros agentes terapéuticos, para tratar las enfermedades relacionadas con el hueso.
Las Wnt pueden desempeñar un papel en la señalización celular local. Estudios bioquímicos han mostrado que la mayor parte de la proteína Wnt secretada puede hallarse asociadas con la superficie celular o con la matriz extracelular en vez de difundiéndose libremente en el medio. Papkoff y Schryver, Mol. Cell. Biol., 10:2723-2730 (1990); Bradley y Brown, EMBO J., 9:1569-1575 (1990).
Los estudios de mutaciones en los genes Wnt han indicado un rol para las Wnt en el control del crecimiento y en el diseño de los tejidos. En drosófila, "wingless" (wg) codifica un gen relacionado con el Wnt (Rijsewik et al., Cell, 50:649-657 (1987)), y las mutaciones del wg alteran el patrón del ectodermo embriónico, la neurogénesis, y el desarrollo del disco imaginal. Morata y Lawerence, Dev. Biol., 56:227-240 (1977); Baker, Dev. Biol., 125:96-108 (1988); Klingensmith y Nusse, Dev. Biol., 166:396-414 (1994). En Caenorhabditis elegans, lin-44 codifica un homólogo de la Wnt que es necesario para las divisiones celulares asimétricas. Herman y Horvitz, Development, 120:1035-1047 (1994). Las mutaciones nuligénicas en ratones han mostrado que las Wnt son esenciales para el desarrollo cerebral (McMahon y Bradley, Cell, 62:1073-1085 (1990); Thomas y Cappechi, Nature, 346:847-850 (1990)), y para el desarrollo del primordio embrionario del riñón (Stark et al., Nature, 372:679-683 (1994)), el brote de la cola (Takada et al., Genes Dev., 8:174-189 (1994)), y el brote de las extremidades (Parr y McMahon, Nature, 374:350-353 (1995)). La sobreexpresión de las Wnt en la glándula mamaria puede resultar en hiperplasia mamaria (McMahon, supra (1992); Nusse y Varmus, supra (1992)), y en el desarrollo alveolar precoz. Bradbury et al., Dev. Biol., 170:553-563
(1995).
Wnt-5a y Wnt-5b se expresan en le mesodermo posterior y lateral, y en el mesodermo extraembrionario del embrión múrido de 7-8 días. Gavin et al., supra (1990). Estos dominios embrionarios contribuyen a la región AGM y a los tejidos del saco vitelino, de los cuales se derivan precursores hematopoyéticos multipotentes y los HSC.Dzierzak and Medvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995); Zon et al., en, editores Gluckman y Coulombel, Colloque, INSERM, 235:17-22 (1995), presentado en el "Joint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failure". París, Francia. 3-6 de abril de 1995; Kanatsu y Nishikawa, Development, 122:823-830 (1996). La Wnt-5a, Wnt-10b, y otras Wnts se han detectado en los brotes de las extremidades, indicando posibles roles en el desarrollo y diseño del microentorno óseo temprano, tal y como se mostró para la Wnt-7b. Gavin et al., supra (1990); Christiansen et al., Mech. Devel., 51:341-350 (1995); Parr y McMahon, supra (1995).
La vía de transducción de señal Wnt/Wg desempeña un papel importante en el desarrollo biológico del organismo, y ha sido implicada en varios cánceres humanos. Esta vía incluye también el gen supresor del tumor, APC. Las mutaciones en el gen APC están asociadas con el desarrollo de formas esporádicas y heredadas de cáncer colorrectal humano. La señal Wnt/Wg conduce a la acumulación de beta-catenina/Armadillo en la célula, lo que resulta en la formación de un complejo de transcripción bipartido consistente en beta-catenina y un miembro de la familia del factor de transcripción caja HMG/factor de unión potenciador linfoide/factor de la célula T (LEF/TCF). Este complejo se transloca al núcleo en donde puede activar la expresión de genes cadena abajo respecto la señal Wnt/Wg, tales como los genes "engrailed" y "Ultrabithorax" en drosófila. Sin embargo, actualmente se desconocen los genes diana cadena abajo de la señal Wnt-1 en los vertebrados, los cuales presumiblemente funcionan en la tumorigénesis.
Para una revisión más reciente sobre las Wnt, consultar Cadigan y Nusse, Genes & Dev., 11:3286-3305 (1997).
Existe una necesidad de elucidar los miembros adicionales de las familias anteriores, incluyendo las moléculas de la superficie celular que puede ser antígenos específicos de tumor, o proteínas que tienen una función reguladora en el inicio de la vía del Wnt de la tumorigénesis. Éstas incluirían también los componentes cadena abajo de la vía de señalización del Wnt que son importantes para el fenotipo transformado y el desarrollo del cáncer.
Resumen de la invención
Se han identificado, a nivel de ARNm, varios genes putativos inducidos por Wnt-1 e un experimento de sustracción de ADNc de elevado rendimiento. Así pues, los solicitantes han identificado nuevos clones de ADNc (WISP1, WISP2, y WISP3) que codifican nuevos polipéptidos de la familia WISP, denominados respectivamente como WISP-1, WISP-2, y WISP-3. Esta clase de polipéptidos se denominaba anteriormente como polipéptidos de "Wnt-1-Induced Gene (WIG)", siendo WISP-1 y WISP-2 denominados anteriormente respectivamente como WIG-1 y WIG-2. Uno de los clones de ADNc codifica un nuevo polipéptido, el WISP-2 humano, que tiene homología con el CTGF, en donde el polipéptido se denomina en la presente solicitud como "WISP-2 humano" o "PRO261". Las moléculas WISP-1 y WISP-3 también tienen homología con el CTGF.
En la presente invención se describe un ácido nucleico aislado que comprende un ADN que tiene al menos aproximadamente 600 nucleótidos y al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). Preferiblemente, este ácido nucleico tiene al menos una actividad biológica de WISP. Este ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
Es más preferido el ácido nucleico que comprende el ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), o el ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), o el complemento de cualquiera de los ADN codificantes. Se prefiere aún más este ácido nucleico cuando comprende el ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, excepto por un residuo isoleucina en la posición 184 en vez de un residuo valina, o un residuo serina en la posición 202 en vez de un residuo alanina (SEC Nº ID.: 5-8, respectivamente). También se prefiere aún más este ácido nucleico cuando comprende el ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, excepto por un residuo isoleucina en la posición 184 en vez de un residuo valina, y un residuo serina en la posición 202 en vez de un residuo alanina (SEC Nº ID.: 21-22, respectivamente).
También se describe este ácido nucleico cuando comprende el ADN que codifica un polipéptido WISP-1 de ratón que tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 11), o el ADN que codifica un polipéptido WISP-1 de ratón que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 12), o el complemento de cualquiera de los ADN codificantes.
En la presente invención también se describe un ácido nucleico aislado que comprende un ADN que tiene al menos aproximadamente 600 nucleótidos y al menos aproximadamente un 85% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido WISP-1 de ratón que comprende la secuencia de aminoácidos 23 a 367 de la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 11), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). Preferiblemente, este ácido nucleico tiene al menos una actividad biológica de WISP. Más preferiblemente, este ácido nucleico comprende un ADN que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido WISP-1 de ratón que comprende la secuencia de aminoácidos 23 a 367 de la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 11), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
En la presente invención también se describe un ácido nucleico aislado que comprende un ADN que tiene al menos aproximadamente 600 nucleótidos y al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido de longitud completa codificado por el ADNc del polipéptido WISP-1 humano en el Depósito de la ATCC nº 209.533 (pRK5E.h.WISP-1.568.38), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). Este ácido nucleico aislado preferiblemente comprende un ADN que tiene al menos aproximadamente 600 nucleótidos y al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido de longitud completa codificado por el ADNc del polipéptido WISP-1 humano en el Depósito de la ATCC nº 209.533 (pRK5E.h.WISP-1.568.38), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).
También se describe en la presente invención un proceso para producir un polipéptido WISP-1, el cual comprende cultivar una célula huésped que comprende el ácido nucleico anterior en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido WISP-1, y recuperar el polipéptido WISP-1 del cultivo celular. Adicionalmente, se proporciona un polipéptido WISP-1 aislado codificado por el ácido nucleico anterior, inclusive cuando el polipéptido es WISP-1 humano o WISP-1 de ratón.
También se describe el ácido nucleico aislado que comprende las secuencias SEC. Nº ID.: 23, 24, 25, 26, 27, 28, ó 29, y un polipéptido WISP-1 aislado codificado por tal ácido nucleico.
En la presente invención también se describe un ácido nucleico aislado que tiene al menos aproximadamente 600 nucleótidos, y que se produce mediante la hibridación de una molécula de ADN de ensayo en condiciones rigurosas con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y, si la molécula de ADN de ensayo tiene al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia con (a) o (b), aislar la molécula de ADN de ensayo.
Adicionalmente se describe un polipéptido producido mediante (i) la hibridación de una molécula de ADN de ensayo en condiciones rigurosas con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido WISP-1 humano que comprende la secuencia de aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y, si la molécula de ADN de ensayo tiene al menos aproximadamente un 75% de identidad de secuencia con (a) o (b), (ii) cultivar una célula huésped que comprende la molécula de ADN de ensayo en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido, y (iii) recuperar el polipéptido del cultivo celular.
Preferiblemente, los complementos de las moléculas de ADN en la presente invención permanece unidos establemente a la secuencia primaria, al menos bajo condiciones de rigurosidad moderada, y, opcionalmente, en condiciones de elevada rigurosidad.
También se describen vectores que comprenden los anteriores ácidos nucleicos, células huéspedes que comprenden el vector, en donde la célula es preferiblemente una célula ovárica de hámster chino (CHO), una célula de E. coli, una célula infectada por baculovirus, o una célula de levadura.
Adicionalmente, se describe una molécula quimérica que comprende uno de los polipéptidos anteriores o una variante desactivada del mismo, fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga, en donde la secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser, por ejemplo, una secuencia etiqueta de epítopo, un poliaminoácido tal como la polihistidina, o una región constante de inmunoglobulina (Fc). También se describe un anticuerpo que se une específicamente a uno de los anteriores polipéptidos, en donde el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.
Además se describe una composición que comprende uno de los anteriores polipéptidos y un portador del mismo, y una composición que comprende un antagonista contra uno de los polipéptidos y un portador del mismo. Una composición semejante comprende un polipéptido WISP-1 y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido humano. Preferiblemente, estas composiciones pueden comprender también un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento. En un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de:
\quad
una molécula no codificante, un ribozima, o una molécula de triple hélice, que inhibe la expresión de un polipéptido WISP-1, o un anticuerpo que específicamente se une a dicho polipéptido WISP-1, en la fabricación de un medicamento para tratar un tumor que sobreexpresa WISP-1.
en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4).
Preferiblemente, el trastorno maligno es cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de colon, o melanoma. También, preferiblemente, el mamífero es un humano.
En otra realización, la invención proporciona un proceso para diagnosticar el crecimiento o proliferación de células neoplásicas en un humano, el cual comprende detectar la amplificación a nivel de la expresión de un gen que codifica un polipéptido WISP-1, en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), (a) en una muestra de ensayo de células del tejido obtenida del humano, y (b) en una muestra de control de células de tejido que se sabe es normal del mismo tipo de células, en donde la amplificación o una nivel de expresión superior en la
muestra de ensayo indica la presencia de un tumor en el humano del cual se obtuvieron las células de tejido de ensayo.
También se describe en la presente invención un anticuerpo aislado que une un polipéptido WISP-1. Preferiblemente, el anticuerpo induce la muerte de una célula que sobreexprese un polipéptido WISP-1, más preferiblemente de una célula cancerosa. También se prefiere un anticuerpo que se une a un polipéptido WISP-1 humano, y es un anticuerpo humano o humanizado. Se prefiere más un anticuerpo monoclonal, aún se prefiere más un anticuerpo monoclonal que tiene regiones determinantes de la complementariedad y regiones constantes de inmunoglobulina, y en otras realizaciones se trata de un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo anti-idiopático. Además, el anticuerpo se marcar convenientemente con una marca detectable, o se inmoviliza sobre un soporte sólido.
También se describe una composición que comprende un anticuerpo para un polipéptido WISP-1, mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el anticuerpo es contra un polipéptido WISP-1 humano, y es un anticuerpo humano o humanizado, lo más preferiblemente un anticuerpo monoclonal contra el WISP-1 humano. Además, la composición puede comprender una cantidad inhibidora del crecimiento de dicho anticuerpo.
La composición de anticuerpo de más arriba puede usarse para tratar el cáncer en un mamífero, lo cual comprende administrarle al mamífero una cantidad efectiva de la anterior composición de anticuerpo. En un aspecto preferido de este procedimiento, el cáncer el cáncer de colon, el anticuerpo es contra el WISP-1 humano, y es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado, y el mamífero es humano.
Adicionalmente, puede usarse una composición que comprende un antagonista contra un polipéptido WISP-1 en un portador farmacéuticamente aceptable, para tratar un trastorno relacionado con el WISP-1.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de células tumorales, el cual comprende exponer una célula, que sobreexpresa un gen inducido por el Wnt-1, a una cantidad efectiva de un antagonista que inhibe la expresión o activación de un polipéptido WISP-1, en donde dicho antagonista es una molécula no codificante, ribozima o molécula de triple hélice, la cual inhibe la expresión del polipéptido WISP-1, o un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido WISP-1, y en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4).
El procedimiento puede comprender exponer dichas células a una cantidad efectiva de la composición con la cantidad inhibidora del crecimiento de un anticuerpo anti-WISP-1 mezclada con el portador. En un aspecto preferido de este procedimiento, las células tumorales son células de cáncer de colon, el anticuerpo es contra el WISP-1 humano, y es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado, y el mamífero es humano.
Además, la invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la actividad de un polipéptido WISP-1, que comprende los pasos de:
(a)
poner en contacto células y un compuesto a examinar, en presencia de polipéptido WISP-1, en condiciones apropiadas para la estimulación de la proliferación celular por parte del polipéptido; y
(b)
medir la proliferación de las células para determinar si el compuesto es un antagonista efectivo, en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4).
En otra realización preferida, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar un trastorno relacionado con el WISP en un mamífero, el cual comprende (a) poner en contacto un anticuerpo anti-WISP-1 con una muestra de ensayo de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-WISP-1 y el polipéptido WISP-1 en la muestra de ensayo, en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), y una mayor nivel de WISP-1 en la muestra de ensayo, respecto a las células del tejido normal conocidas del mismo tipo celular, indica la presencia de un tumor en el humano del cual se obtuvieron las células de tejido de ensayo. Preferiblemente, dicha muestra de ensayo se obtiene de un individuo que se sospecha tiene un crecimiento o proliferación de células neoplásicas. También, el anticuerpo se marcar preferiblemente con una marca detectable, y/o se inmoviliza sobre un soporte sólido.
Descripción resumida de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WISP-1 de ratón de secuencia nativa, entre los aminoácidos 1 a 367 (SEC. Nº ID.: 12), y la secuencia nucleotídica (y secuencia complementaria) que codifica la proteína (SEC. Nº ID.: 9 y 10, respectivamente). Hay una región codificante de 1104 pb y una región 3' no traducida de 584 pb. En la Figura, los aminoácidos 1 a 22 forman una secuencia señal putativa, los aminoácidos 23 a 367 son la proteína madura putativa (SEC. Nº ID.: 11), siendo los aminoácidos 86 a 88, 143 a 145, 284 a 286, y 343 a 345 sitios de glicosilación potenciales. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la proteína quinasa C están en los aminoácidos 43-45, 159-161, 235-237, 292-294, 295-297, y 345-347. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la caseína quinasa II están en los aminoácidos 44-47, 131-134, 145-148, y 358-361. Los sitios potenciales de N-miristilación están en los aminoácidos 18-23, 72-77, 127-132, 149-154, 231-236, y 289-294. Hay un sitio potencial de amidación en los aminoácidos 269-272. Hay un sitio potencial de anclaje a lípido de lipoproteína de membrana procariota en los aminoácidos 113-133. Hay un potencial dominio C1 von Willebrand en los aminoácidos 130-146. Hay un potencial dominio trombospondina I en los aminoácidos 223-237. Hay un módulo potencial CT en los aminoácidos 301-312. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 72-80.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WISP-2 de ratón de secuencia nativa, entre los aminoácidos 1 a 251 (SEC. Nº ID.: 20), y la secuencia nucleotídica (y secuencia complementaria) que codifica la proteína (SEC. Nº ID.: 17 y 18, respectivamente) procedentes de un clon 1367,3. Hay 756 pb de nucleótidos codificantes, y 722 pb de región 3' no traducida. En la Figura, los aminoácidos 1 a 23 forman una secuencia señal putativa, los aminoácidos 24 a 251 son la proteína madura putativa (SEC. Nº ID.: 11). Hay un sitio potencial de N-glicosilación en los aminoácidos 197-200. Hay un sitio potencial de anclaje de glicosaminoglicano en los aminoácidos 85-88. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la proteína quinasa C están en los aminoácidos 85-87 y 112-114. Los sitios potenciales de N-miristilación están en los aminoácidos 49-54, 81-86, 126-131, 210-215, y 245-250. Hay un sitio potencial de amidación en los aminoácidos 103-106. Hay un potencial sitio activo de ácido aspártico para la fosfolipasa A2 en los aminoácidos 120-130. Hay un firma consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 49-64. Hay un potencial dominio C1 von Willebrand en los aminoácidos 107-123. Hay un potencial dominio trombospondina I en los aminoácidos 103-216. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 49-57.
Las Figuras 3A y 3B muestran la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WISP-1 human de secuencia nativa, entre los aminoácidos 1 a 367 (SEC. Nº ID.: 4), y la secuencia nucleotídica (y secuencia complementaria) que codifica la proteína (SEC. Nº ID.: 1 y 2, respectivamente). Hay 1104 pb de región codificante en este clon 568.38 humano, y 1638 pb de región 3' no traducida. En la Figura, los aminoácidos 1 a 22 forman una secuencia señal putativa, los aminoácidos 23 a 367 son la proteína madura putativa (SEC. Nº ID.: 3), siendo los aminoácidos 85 a 87, 143 a 145, 284 a 286, y 343 a 345 sitios de glicosilación potenciales. Hay un sitio potencial de fosforilación para la proteína quinasa dependiente de AMPc y GMPc en los aminoácidos 171 a 174; hay sitios potenciales de fosforilación para la proteína quinasa C en los aminoácidos 43-45, 235-237, 292-294, y 345-347; hay sitios potenciales de fosforilación para la caseína quinasa II en los aminoácidos 30-33, 145-148, y 358-361. Los sitios potenciales de N-miristilación están en los aminoácidos 72-77, 127-132, 149-154, 201-206, 331-236, 289-294, y 327-332 Hay un sitio potencial de amidación en los aminoácidos 269-272. Hay un sitio potencial de anclaje a lípido de lipoproteína de membrana procariota en los aminoácidos 113-123. Hay un potencial dominio C1 von Willebrand en los aminoácidos 130-146. Hay un potencial dominio trombospondina I en los aminoácidos 223-237. Hay un potencial módulo CT (C-terminal) en los
aminoácidos 301-312. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 72-80.
La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WISP-2 humana de secuencia nativa, entre los aminoácidos 1 a 250 (SEC. Nº ID.: 16), y la secuencia nucleotídica (y secuencia complementaria) que codifica la proteína (SEC. Nº ID.: 13 y 14, respectivamente). La región codificante tiene 753 pb y la región 3' no traducida tiene 519 pb. La secuencia señal putativa está entre los residuos aminoácidos 1 a 23, y la región madura putativa va desde el 24 hasta el 250 (SEC Nº ID.: 15). El clon denominado en la presente invención como "UNQ228" y/o "DNA33473-seqmin" (SEC. Nº ID.: 38) empieza en el nucleótido 34 de la SEC. Nº ID.: 13. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la proteína quinasa C están en los aminoácidos 4-6, 118-120, y 227-229. Hay un sitio potencial de fosforilación para la caseína quinasa II en los aminoácidos 98-101. Hay un sitio potencial de N-miristoilación en los aminoácidos 3-8, 49-54, 81-86, 85-90,126-131,164-169, 166-171, 167-172, 183-188, y 209-214. Hay un firma consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 49-64. Hay un potencial dominio C1 von Willebrand en los aminoácidos 107-123. Hay un potencial dominio trombospondina I en los aminoácidos 201-215. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 49-57.
La Figura 5 muestra una secuencia nucleotídica consenso de 841 pb denominada "DNA30843" (SEC Nº ID.: 39) derivada de las secuencias nucleotídicas de veinte marcas de secuencia expresadas de Incyte. Cuando se alinea con las otras secuencias, el DNA30843 tiene 3 huecos. Tiene un orf (+1) de 441 pb. La DNA30843 se usó para diseñar sondas para aislar el WISP-2 humano.
Las Figuras 6A y 6B muestran la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WISP-3 human de secuencia nativa, entre los aminoácidos 1 a 372 (SEC. Nº ID.: 33), y la secuencia nucleotídica (y secuencia complementaria) que codifica la proteína (SEC. Nº ID.: 30 y 31, respectivamente). En la Figura, los aminoácidos 1 a 33 forman una secuencia señal putativa, los aminoácidos 34 a 372 son la proteína madura putativa (SEC. Nº ID.: 32), siendo los aminoácidos 196 a 198 y 326 a 328 sitios de glicosilación potenciales. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la proteína quinasa C están en los aminoácidos 209-211, 246-248, 277-279, 308-310, y 342-344. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la caseína quinasa II están en los aminoácidos 47-50, 254-257, y 293-296. Los sitios potenciales de N-miristilación están en los aminoácidos 21-26, 89-94, 139-144, 166-171, 180-185, 185-190, 188-193, 242-247, y 302-307. Hay un sitio potencial de amidación en los aminoácidos 188-191. Los sitios potenciales de anclaje a lípido de lipoproteína de membrana procariota están en los aminoácidos 130-140 y 160-170. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 89-104. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF (menos riguroso que los de Prosite) en los aminoácidos 89-104.
Las Figuras 7A y 7B muestran la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína WISP-3 human de secuencia nativa, entre los aminoácidos 1 a 355 (SEC. Nº ID.: 37), y la secuencia nucleotídica (y secuencia complementaria) que codifica la proteína (SEC. Nº ID.: 34 y 35, respectivamente). Se cree que esta proteína es una variedad de ayuste de la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 6 con un extremo 5' más corto. En la Figura, los aminoácidos 1 a 15 forman una secuencia señal putativa, los aminoácidos 16 a 355 son la proteína madura putativa (SEC. Nº ID.: 36), siendo los aminoácidos 178 a 180 y 308 a 310 sitios de glicosilación potenciales. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la proteína quinasa C están en los aminoácidos 191-193, 228-230, 259-261, 290-292, y 324-326. Los sitios potenciales de fosforilación por parte de la caseína quinasa II están en los aminoácidos 29-32, 236-239, y 275-278. Los sitios potenciales de N-miristilación están en los aminoácidos 3-8, 71-76, 121-126, 148-153, 162-167, 167-172, 170-175, 224-229, y 284-289. Hay un sitio potencial de amidación en los aminoácidos 170-173. Los sitios potenciales de anclaje a lípido de lipoproteína de membrana procariota están en los aminoácidos 112-122 y 142-152. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF en los aminoácidos 71-87. Hay un sitio consenso potencial para la proteína unidora de IGF (menos riguroso que los de Prosite) en los aminoácidos 71-79.
La Figura 8 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del WISP-1 de ratón y humano (respectivamente SEC Nº ID.: 4 y 12).
La Figura 9 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del WISP-2 de ratón y humano (respectivamente SEC Nº ID.: 16 y 20).
La Figura 10 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del WISP-3 de ratón y humano (respectivamente SEC Nº ID.: 33 y 37).
Las Figura 11A-11C muestran un alineamiento de las secuencias nucleotídicas del WISP-1 humano (SEC. Nº ID.: 1) y del WISP-3 humano (SEC. Nº ID.: 30).
La Figura 12 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del WISP-1 humano (SEC. Nº ID.: 1) y del WISP-3 humano (SEC. Nº ID.: 33).
La Figura 13 muestra un mapa del vector pBabe puro (5,1 kb) usado para transformar células con la finalidad de la expresión diferencial. El vector incluye ambos, sitios de restricción únicos y sitios de restricción múltiples. Se muestra en la presente invención en forma modificada para la clonación del Wnt-1, en donde el sitio HindIII detrás del promotor SV40 en el vector puro pBabe original se ha eliminado, y se ha añadido un sitio HindIII al sitio de clonación múltiple del vector puro pBabe original. El Wnt-1 se clonó a partir de EcoRI-HindIII en el sitio de clonación múltiple. Las construcciones derivadas de este vector se seleccionan en ampicilina (100 mg/ml) y las células infectadas en cultivo se seleccionan en 1,0-2,5 mg/ml de puromicina.
La Figura 14 muestra las secuencias del cebador de síntesis de ADNc PRC-Select® (SEC Nº ID.: 40), de los adaptadores 1 y 2 (SEC Nº ID.: 41 y 42, respectivamente) y las secuencias complementarias para los adaptadores (SEC Nº ID.: 43 y 44, respectivamente), cebador 1 para la PCR (SEC Nº ID.: 45), cebador 2 para la PCR (SEC Nº ID.: 46), cebador 1 para la PCR con cebadores internos (SEC Nº ID.: 47), cebador 2 para la PCR con cebadores internos (SEC Nº ID.: 48), cebador G3PDH 5' como cebador control (SEC Nº ID.: 49), y cebador G3PDH 3' como cebador control (SEC Nº ID.: 50), usadas para la hibridación sustractiva de supresión para identificar clones WISP. Cuando los adaptadores se ligaron con ADNc digerido con RsaI, se restableció el sitio RsaI.
La Figura 15 muestra la región del sitio de clonación del plásmido pGEM-T usado para clonar todas las secuencias WISP en la presente invención (respectivamente SEC. Nº ID.: 51 y 52 para las secuencias 5' y 3').
Las Figuras 16A-16D muestran la secuencia (SEC. Nº ID.: 53) de un plásmido que se usa para preparar un plásmido de expresión para la expresión del WISP-1 de ratón en células de mamífero, denominándose éste último pRK5.CMV.puro-dhfR.mWISP1.6His.
Las Figuras 17A-17D muestran la secuencia (SEC. Nº ID.: 54) del plásmido pb.PH.IgG, el cual se usa para preparar un plásmido de expresión para la expresión del ADN de WISP-1 de ratón en células de insecto infectadas con baculovirus.
Las Figuras 18A-18D muestran la secuencia (SEC. Nº ID.: 55) del plásmido pbPH.His.C, el cual se usa para preparar un plásmido de expresión para la expresión del ADN de WISP-1 en células de insecto infectadas con baculovirus, denominándose éste último pbPH.mu.568.8his.baculo.
Las Figuras 19A-19D muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y ADN procedente de sangre, a menudo de donantes humanos (Nor Hu), como control, respectivamente para el TNF humano, el WISP-1 humano, la Lyra, y el ligando de Apo2 humano, usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
Las Figuras 20A-20D muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y Nor Hu como control, respectivamente para el DCRI humano, el huFAS, el WISP-2 humano, y la Apo3, usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
Las Figuras 21A-21D muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y Nor Hu como control, respectivamente para tres realizaciones distintas del WISP-1 humano (denominadas en las figura como hu WISP-1c, -1b y 1a) y el promedio de estas tres realizaciones del WIPS-1 humano, usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
Las Figuras 22A-22D muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y Nor Hu como control, respectivamente para tres realizaciones distintas del WISP-2 humano (denominadas en las figuras como hu WISP-2c, -2b y 2a; respectivamente Figuras 22A, C y D) y el promedio de estas tres realizaciones del WIPS-2 humano, usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
Las Figuras 23A-23C muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y Nor Hu como control, respectivamente para dos realizaciones distintas del DR5 humano (DR5a y DR5b) y el promedio de estas dos realizaciones del DR5, usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
Las Figuras 24A-24D muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y Nor Hu como control, respectivamente para cuatro realizaciones diferentes del c-myc (respectivamente c-mys(a1), c-mys(b1), c-mys(c1), y c-mys(d1)), usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
Las Figuras 25A-25D muestran gráficas de la Delta Ct en nueve líneas celulares de cáncer de colon y Nor Hu como control, respectivamente para dos realizaciones diferentes del WISP-1 humano (denominadas en la figura como hu WISP-1(a) y hu WISP-1(b)) y para dos realizaciones diferentes del WISP-2 humano (denominadas respectivamente en la figura como hu WISP-2(a) y hu WISP-2(b)), usando el procedimiento del Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism 7700^{TM} para ensayar la amplificación genómica.
La Figura 26 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 23) del clon 568.13, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A, el cual es el clon aislado inicial de una biblioteca de pulmón humano en el proceso de obtener el ADN del WISP-1 humano de longitud completa.
La Figura 27 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 24) del clon 568.1A, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano, sólo del extremo 5', obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A.
La Figura 28 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 25) del clon 568.39, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano, sólo del extremo 5', obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A.
La Figura 29 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 26) del clon 568.4A, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A.
La Figura 30 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 27) del clon 568.5A, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano, sólo del extremo 5', obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A.
La Figura 31 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 28) del clon 568.6B, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano, sólo del extremo 5', obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A.
La Figura 32 muestra la secuencia (SEC Nº ID.: 29) del clon 568.7, una variante de ayuste potencial del WISP-1 humano, sólo del extremo 5', obtenida examinando con una sonda derivada del clon 568.15A.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones
El término "polipéptido WISP" se refiere a la familia de proteínas WISP humanas y de ratón, de secuencia nativa, y las variantes descritas en la presente invención, cuyos genes son inducidos al menos por el Wnt-1. Este término incluye el WISP-1, WISP-2, y WISP-3.
Los términos "polipéptido WISP-1", "homólogo de WISP-1", y las variantes gramaticales de los mismos, tal y como se usan en la presente invención, abarcan la proteína WISP-1 de secuencia nativa y sus variantes (las cuales se definen adicionalmente en la presente invención). El polipéptido WISP-1 puede aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos, o mediante cualquier combinación de éstas y similares técnicas.
Los términos "polipéptido WISP-2", "homólogo de WISP-2", "PRO261", y "polipéptido PRO261", y las variantes gramaticales de los mismos, tal y como se usan en la presente invención, abarcan la proteína WISP-2 de secuencia nativa y sus variantes (las cuales se definen adicionalmente en la presente invención). El polipéptido WISP-2 puede aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos, o mediante cualquier combinación de éstas y similares técnicas.
Los términos "polipéptido WISP-3", "homólogo de WISP-1", y las variantes gramaticales de los mismos, tal y como se usan en la presente invención, abarcan la proteína WISP-3 de secuencia nativa y sus variantes (las cuales se definen adicionalmente en la presente invención). El polipéptido WISP-3 puede aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos, o mediante cualquier combinación de éstas y similares técnicas.
Un "polipéptido WISP-1 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una polipéptido WISP-1 derivado de la naturaleza. Tal polipéptido WISP-1 de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza, o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido WISP-1 de secuencia nativa" específicamente abarca las formas truncadas o secretadas que ocurren de forma natural de un polipéptido WISP-1 descrito en la presente invención, las formas variantes que ocurren de forma natural (por ejemplo, formas alternativamente ayustadas o variantes de ayuste), y variantes alélicas de un polipéptido WISP-1 que ocurren de forma natural. En una realización de la invención, el polipéptido WISP-1 de secuencia nativa es un polipéptido WISP-1 de secuencia nativa maduro o de longitud completa, que comprende respectivamente los aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC Nº ID.: 3), o los aminoácidos 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC Nº ID.: 4), con o sin la metionina N-terminal.
En otra realización de la invención, el polipéptido WISP-1 de secuencia nativa es el polipéptido WISP-1 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa, que comprende respectivamente los aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, en donde el residuo valina en la posición 184, o el residuo alanina en la posición 202 se ha/se han cambiado respectivamente por un residuo isoleucina o serina (SEC Nº ID.: 5-8), con o sin la metionina N-terminal. En otra realización de la invención, el polipéptido WISP-1 de secuencia nativa es el polipéptido WISP-1 humano de secuencia nativa maduro o de longitud completa, que comprende respectivamente los aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, en donde el residuo valina en la posición 184 y el residuo alanina en la posición 202 se ha/se han cambiado respectivamente por un residuo isoleucina o serina (SEC Nº ID.: 21 y 22), con o sin la metionina N-terminal. En otra realización de la invención, el polipéptido WISP-1 de secuencia nativa es un polipéptido WISP-1 de ratón, de secuencia nativa, maduro o de longitud completa, que comprende respectivamente los aminoácidos 23 a 367 de la Figura 1 (SEC Nº ID.: 11), o los aminoácidos 1 a 367 de la Figura 1 (SEC Nº ID.: 12), con o sin la metionina N-terminal.
En otra realización de la invención, el polipéptido WISP-1 de secuencia nativa es uno que está codificado por una secuencia nucleotídica que comprende una de las variantes de ayuste del WISP-1 humano, u otras variantes naturales, incluyendo las SEC Nº ID.: 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29, con o sin la metionina N-terminal.
El término "variante del WISP-1" significa un polipéptido WISP-1 activo, según se define más abajo, que tiene al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, de identidad de secuencia de aminoácidos con el WISP-1 maduro humano que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el WISP-1 de longitud completa humano que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), y/o con el WISP-1 maduro de ratón que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 11), y/o con el WISP-2 de longitud completa de ratón que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 12). Tales variantes incluyen, por ejemplo, los polipéptidos WISP-1 en donde uno o más residuos aminoácidos se han añadido a, o suprimido de los extremos N- o C-terminal de las secuencias de longitud completa o maduras de las Figuras 3A-3B y 1 (SEC. Nº ID.: 4, 3, 12 y 11 respectivamente), incluyendo las variantes procedentes de otras especies, pero excluye una secuencia nativa del polipéptido WISP-1.
"Porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos", en relación a las secuencias identificadas en la presente invención, se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en una secuencia del polipéptido WISP, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máxima porcentaje de identidad de la secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Los alineamientos, para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, pueden conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos del campo, por ejemplo, usando programas de ordenador disponibles públicamente, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR^{TM}). Aquellos capacitados en la técnica pueden terminar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se están comparando.
El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de ácido nucleico" con respecto a la región codificante de las secuencia WISP identificadas en la presente invención, incluyendo la secuencia UNQ228 (DNA34387-seq min) y la región codificante en la misma, se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en una región codificante de la secuencia WISP de interés, por ejemplo, en la secuencia UNQ228 (DNA34387-seq min) (SEC. Nº ID.: 38) o región codificante en la misma (SEC. Nº ID.: 16), después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Los alineamientos para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico pueden conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos del campo, por ejemplo, usando programas de ordenador disponibles públicamente, tales como los programas BLAST, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Aquellos capacitados en la técnica pueden terminar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se están comparando.
Son "condiciones rigurosas" aquellas que emplean (1) emplean una baja fuerza iónica y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/0,1% de sulfato dodecilo de sodio a 50ºC; (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridación, tal como la formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con un 0,1% de albúmina de suero bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean 50% de formamida, 5\times SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico 0,1%, 5\times solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2\times SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguido por un lavado de elevada rigurosidad consistente en 0,1\times SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones de rigurosidad moderadas" se describen en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989), e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y porcentaje de SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es una condición tal como la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5\times SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times solución de Denhardt, 10% de dextrano sulfato, y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido por un lavado con los filtros en 1\timesSSC a aproximadamente 37-50ºC. El especialista capacitado reconocerá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar los factores tales como la longitud de la sonda y similares.
"Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente invención, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interfieren con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria, o (2) hasta su homogeneidad según SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos uno de los componentes del entorno natural del polipéptido no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido WISP o un DNA33473 aislado, o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO261, es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico respectivo. Una molécula aislada de DNA33473 o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica WISP está en una forma o entorno distinto de aquel en el cual se halla en la naturaleza. Por tanto, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica WISP o DNA33473 se distinguen respectivamente de la molécula de ácido nucleico que codifica el WISP o DNA33473, tal como éstas existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica WISP o DNA33473 incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente expresan respectivamente ADN que codifica WISP o DNA33473, en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión en un determinado organismo huésped de una secuencia codificante operativamente ligada. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señal de poliadenilación, y potenciadores.
El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de tal forma que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están uniéndose son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en los sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente, el polipéptido anti-WISP simple, tal como el anti-PRO261, anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes), y el polipéptido anti-WISP, tal como el anti-POR261, las composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, y composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades.
"Activo" o "actividad" o "actividad biológica de WISP", para los propósitos de las presente invención, describe forma(s) de un polipéptido WISP, tal como el PRO261, incluyendo sus variantes, o sus antagonistas, que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de un polipéptido WIPS nativo o que ocurre de forma natural (secuencia nativa), tal como el PRO261 o sus antagonistas. Las "actividades" preferidas para un polipéptido WISP o sus antagonistas incluyen la capacidad para inhibir la proliferación de células tumorales, o para estimular la proliferación de células normales, y para tratar la arterioesclerosis, incluyendo la ateroesclerosis, así como para inducir la reparación de herida y la hematopoyesis, prevenir la desmoplasia, prevenir las lesiones fibróticas asociadas con los trastornos dérmicos tales como la escleroderma, la queloide, la fascitis eosinofílica, la fascitis nodular, y la contractura de Dupuytren, para tratar enfermedades relacionadas con los huesos, tales como la osteoporosis, para regular el anabolismo, incluyendo la promoción del crecimiento, para tratar trastornos inmunes, para tratar el tumor de Wilms y los trastornos relacionados con el riñón, para tratar los trastornos relacionados con los testículos, para tratar los trastornos pulmonares, y para tratar los trastornos cardíacos.
Un "antagonista" de un polipéptido WISP es una molécula que inhibe una actividad de un polipéptido WISP. Los antagonistas preferidos son aquellos que interfieren o bloquean una actividad biológica no deseada de un polipéptido WISP, tal como donde actúa un polipéptido WISP para estimular las células cancerosas, y los antagonistas servirán para inhibir el crecimiento de estas células. En algunos casos, tales como con el WISP-1, WISP-2 y WISP-3, el antagonista puede ser útil para inhibir la unión de un polipéptido WISP a un IGF. Tales moléculas incluyen los anticuerpos y las moléculas pequeñas que tienen tal capacidad inhibidora, así como las variantes del polipéptido WISP de, y los receptores para, el polipéptido WISP (si están disponibles), o porciones de los mismos que se unen a WISP. Por ejemplo, los antagonistas pueden derivarse de receptores de WISP-1, WISP-2 y WISP-3 usando la familia predicha de receptores para el WISP-1, -2 y -3 (los receptores CTGF). Por tanto, el receptor puede clonarse para su expresión a partir de la familia: entonces se prepara una forma soluble del receptor para identificar el dominio extracelular, y recortar el dominio transmembrana del mismo. La forma soluble del receptor puede usarse como un antagonista, o puede usarse el receptor para examinar en busca de moléculas pequeñas que antagonizarán la actividad del polipéptido WISP.
Alternativamente, usando las secuencias múridas mostradas en las Figuras 1 y 2 (SEC Nº ID.: 11, 12, 19, y 20, respectivamente), o las secuencias humanas mostradas en las Figuras 3A-3B. 4. (SEC Nº ID.: 3, 4, 15, y 16, respectivamente), 6A-6B, y 7A-7B, se preparan variantes de las WISP-1, WISP-2, o WISP-3 nativas que actúan como antagonistas. Usando el conocimiento de la familia del receptor del CTGF, pueden determinarse los sitios de unión del receptor de los polipéptidos WISP-1, WISP-2, y WISP-3 mediante estudios de unión, y eliminarse uno de ellos mediante técnicas estándar (supresión o sustitución radical) de forma que la molécula actúe como un
antagonista.
La actividad del antagonista puede determinarse mediante varios medios, incluyendo los ensayos estándares para inducción de la muerte celular, tales como los descritos en la presente invención, por ejemplo, ensayos de proliferación con 3H-timidina, u otros ensayos mitogénicos, tales como un ensayo que mide la capacidad del antagonista candidato para inducir un crecimiento independiente del anclaje, potenciado por el EGF, de las líneas celulares diana (Volckaert et al., Gene, 15:215-223 (1981)) y/o la inhibición del crecimiento de células neoplásicas. Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:119-123 (1985). El crecimiento independiente del anclaje se refiere a la capacidad de las células diana no neoplásicas, tratadas con el polipéptido WISP, o tratadas con TGF-\beta, y tratadas con EGF, para formar colonias en agar blando, una característica adscrita a la transformación de las células. En este ensayo, el candidato se incuba junto con una cantidad equimolar de un polipéptido WISP, detectable de otro modo, en el ensayo de crecimiento de la célula diana independiente del anclaje potenciado por el EGF, y se observa si el cultivo no consigue inducir un crecimiento independiente del anclaje. Además, un antagonista puede ser un IGF, tal como el IGF-1 o un péptido que imite el IGF-1, o un receptor del IGF o un receptor de una IGFBP.
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a las medidas preventivas. Aquellos que precisan el tratamiento incluyen aquellos que ya presentan el trastorno o afección, así como aquéllos en los que debe prevenirse el trastorno o afección.
Mamífero, para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológicos, de deportes, o de compañía, tales como los perros, los caballos, los gatos, la ovejas, los cerdos, las vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.
Un "trastorno" o "trastorno relacionado con WISP" es cualquier afección que se beneficiará del tratamiento con los polipéptidos WISP o los antagonistas de WISP en la presente invención. Esto incluye los trastornos crónicos y agudos, así como aquellas condiciones patológicas que predisponen el mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratarse en la presente invención incluyen los tumores benignos y malignos: leucemia y cánceres linfoides; neuronales, gliales, astrocíticos, hipotalámicos y de otros glandulares, de macrófagos, epiteliales, estromales, y los trastornos blastocélicos; los trastornos relacionados con la hematopoyesis; los trastornos de crecimiento de tejidos; los trastornos de la piel: desmoplasia, lesiones fibróticas; los trastornos renales; los trastornos relacionados con los huesos; traumas como quemaduras, incisiones, y otras heridas; estados catabólicos; trastornos relacionados con los testículos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, incluyendo la arterioesclerosis. Una "trastorno relacionado con Wnt" es uno causado al menos por la regulación al alza de la vía del gen Wnt, incluyendo el Wnt-1 y Wnt-4, pero preferiblemente el Wnt-1, y puede incluir el cáncer.
Los términos "cáncer", "canceroso" y "maligno" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular descontrolado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, el carcinoma, incluyendo el adenocarcinoma, el linfoma, el blastoma, el melanoma, el sarcoma y la leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen el cáncer de célula escamosa, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el linfoma de Hodgkin o no Hodgkin, el cáncer de pancreas, el glioblastoma, el cáncer de cuello de útero, el cáncer de ovarios, los canceres de hígado, tales como el carcinoma hepático y hepatoma, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorectal, el carcinoma de endometrio, el carcinoma de la glándula salivar, los cánceres de riñón, tal como el carcinoma de célula renal y los tumores de Wilm, el carcinoma de célula basal, el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el cáncer de testículos, el cáncer de esófago, y varios tipos de cánceres de cabeza y cuello. Los cánceres preferidos para su tratamiento en la presente invención son los de mama, colon, pulmón y melanoma.
El término "agente citotóxico", tal como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Se pretende que el término incluya los isótopos radiactivos (por ejemplo, ^{131}I, ^{125}I, ^{90}Y y ^{186}Re), los agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen la Adriamicina, la Doxorrubicina, el 5-Fluorouracilo, el arabinósido de citosina ("Ara-C"), la ciclofosfamida, la Tiotepa, el Busulfán, la Citoxina, el Taxol, el Toxotere, Metotrexato, el Cisplatino, el Melfalán, la Vinblastina, la Bleomicina, el Etopósido, la Ifosfamida, la Mitomicina C, la Mitoxantrona, la Vincristina, la Vinorelbina, el Carboplatino, el Tenipósido, la Daunomicina, la Carminomicina, la Aminopterina, la Dactinomicina, las Mitomicinas, las Esperamicinas (consultar Patente Estadounidense nº 4.675.187), el Melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen en esta definición los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores, tales como el tamoxifén y la onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en la presente invención, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, tal como una célula cancerosa que sobreexpresa el Wnt, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células cancerosas en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en una etapa distinta de la fase S), tales como los agentes que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen el vincas (vincristina y vinblastina), el taxol, y los inhibidores de la topo II tales como la doxorubicina, la daunorubicina, el etopósido y la bleomicina. Aquellos agentes que detienen en G1 también rebasan hacia la detención en la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN tales como el tamoxifén, la prednisona, la dacarbazina, la mecloretamina, el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y el Ara-C. Puede hallarse información adicional en "The Molecular Basis of Cancer", editores Mendelsohn e Israel, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente en la p. 13. El anticuerpo 4D5 (y los equivalentes funcionales del mismo) pueden emplearse también con este propósito si el cáncer implica células cancerosas que sobreexpresan el ErbB2. Consultar, por ejemplo, WO-92/22.653.
El "análisis Northern" o la "transferencia Northern" es un procedimiento usado para identificar secuencias de ARN que se hibridan con una sonda conocida tal como un oligonucleótido, fragmento de ADN, ADNc o fragmento del mismo, o fragmento de ARN. La sonda se marca con un radioisótopo tal como el ^{32}P, o mediante biotinilación, o con un enzima. El ARN a analizarse usualmente se separa electroforéticamente sobre un gel de agarosa o poliacrilamida, se transfiere a nitrocelulosa, nilón, u otra membrana apropiada, y se hibrida con la sonda, usando técnicas estándares bien conocidas en el estado de la técnica, tales como las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al., supra.
La técnica de la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", tal como se usa en la presente invención se refiere generalmente a un procedimiento en el que cantidades minúsculas de una pieza específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican según se describe en la patente estadounidense nº 4.683.195 concedida el 28 de julio de 1987. Generalmente, la información de secuencia procedente de los extremos de la región de interés o más allá tiene que estar disponible, de tal forma que pueden diseñarse cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores serán idénticos o similares en su secuencia a las hebras opuestas de la plantilla a amplificarse. Los nucleótidos 5'-terminales de los dos cebadores pueden coincidir con los finales del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas procedentes de ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir del ARN celular total, bacteriófagos, o secuencias de plásmidos, etcétera. Ver, de forma general, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); editor Erlich, "PCR Technology". (Stockton Press, NY, 1989). Tal y como se usa en la presente invención, la PCR se considera que es un ejemplo, pero no el único, de un procedimiento de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una pieza específica de ácido nucleico.
II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Polipéptido WISP de longitud completa
Se han identificado y aislado ADNc que codifican nuevas variantes de ayuste de WISP-1 y WISP-2 múridos y humanos, y WISP-3 humano, como se describe con más detalle en los Ejemplos siguientes.
Usando los programas de ordenador de alineamiento de secuencias BLAST y FasA, se halló que las secuencias codificantes del WISP-1 y WISP-2 de ratón y humanos, así como las dos secuencias codificantes del WISP-3 humano descubiertas en la presente invención, muestran una homología significativa con las secuencias de ADN descritas en la base de datos GenBank, incluyendo las publicadas por Adams et al., Nature, 377:3-174 (1995).
Además, usando los programas de ordenador de alineamiento de secuencias BLAST y FasA, se halló que varias porciones de las secuencias codificantes del WISP-1 y WISP-2 de ratón y humanos muestran una homología significativa con las del CTGF, cef-10, Cyr61, y/o proteína Nov. En este aspecto, el WISP-1 de ratón es un 47% homólogo con el CTGF de ratón y un 46% homólogo con el CTGF humano, el WISP-2 de ratón es homólogo en un 46% con el precursor de la proteína cef-10 del pollo y un 42% homólogo con la proteína Cyr61 humana, el WISP-1 humano es un 47% homólogo con el CTGF humano y un 48% homólogo con el CTGF de ratón, 49% homólogo con el precursor del CTGF humano, 46% homólogo con el precursor homólogo de la proteína Nov de ratón, 49% homólogo con el CTGF humano, y 48% homólogo con el precursor del CTGF de ratón. Además, aparentemente las secuencias de aminoácidos del WISP-1 de ratón y del ELM I de ratón (Hashimoto et al., supra) son idénticas, y las secuencias de aminoácidos del WISP-1 humano y del ELM I de ratón son un 84% idénticas.
Puesto que estos factores se han correlacionado también con los IGFBP, se cree actualmente que los polipéptidos WISP-1 y WISP-2 descritos en la presente solicitud son miembros recién identificado de la familia del CTGF o IGFBP, y poseen actividad relacionada con el desarrollo de células y tejido normal, lesionado y canceroso. Más específicamente, el WISP-1 y WISP-2 pueden estar implicados en el cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma, y cáncer de colon, así como en la reparación de heridas. Además, pueden estar implicados en la ateroesclerosis.
Además, usando los programas de ordenador de alineamiento de secuencias BLAST y FasA, se halló que varias porciones de las secuencias codificantes de las dos variantes de ayuste del WISP-3 humano muestran una homología significativa con las de las proteínas CTGF y ELM I. En este aspecto, ambas variantes de ayuste del WISP-3 son un 45% homólogas con la ELM I de ratón y un 42% homólogas con el CTGF de ratón y humano y sus precursores, siendo la variante más larga de la Figura 6 un 43% homóloga con el CTGF de Xenopus, y siendo la variante más corta de la Figura 7 un 42% homóloga con el CTGF de Xenopus.
B. Variantes del polipéptido WISP
Además de los polipéptidos WISP de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que puedan prepararse variantes de estas secuencias. Las variantes del WISP-1 pueden prepararse mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN que codifica el WISP-1, o mediante la síntesis de los polipéptidos de WISP variantes deseados. Los especialistas en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar el procesamiento del polipéptido WISP, tal como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación o alterando las características de anclaje a la membrana, si el polipéptido WISP nativo está unido a membrana.
Las variaciones en las secuencias de WISP nativas de longitud completa, o en varios dominios de los polipéptidos WISP descritos en la presente invención, pueden hacerse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y pautas para mutaciones conservadoras y no conservadores establecidas, por ejemplo, en la Patente Estadounidense nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, supresión o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido WISP, la cual resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con el polipéptido WISP de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación se realiza mediante la sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en cualquier porción del polipéptido WISP. La guía para determinar qué residuo aminoácido puede insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar de forma adversa la actividad deseada, puede hallarse comparando la secuencia del polipéptido WISP con la de moléculas de la proteína CTGF que se sabe son homólogas, en el caso de WISP-1, WISP-2 y WISP-3, y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina con una serina, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácido. Las inserciones o supresiones pueden estar opcionalmente en el rango de 1 a aproximadamente 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse haciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia, y ensayando las variantes resultantes en función de su actividad en ensayos in vitro de regulación al alza o regulación a la baja, y en animales transgénicos o nuligénicos.
Las variaciones pueden hacerse sobre el ADN clonado para producir el ADN del WISP o ADN de la variante del polipéptido WISP usando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como la mutagénesis (dirigida a un sitio) mediada por oligonucleótidos (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), la mutagénesis por inserción en un casete (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), el barrido con alanina, la mutagenesis mediante PCR, la mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)), u otras técnicas conocidas.
El análisis de aminoácidos por barrido puede emplearse también para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutrales, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen la alanina, la glicina, la serina y la cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido de entre este grupo, porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también se prefiere típicamente porque es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se halla tanto en posiciones enterradas como expuestas. T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties" (W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983); Chothis, J.Mol. Biol., 150:1 (1976). Si la sustitución con alanina no rinde cantidades adecuadas de la variante, entonces puede usarse un aminoácido isostérico.
Otras variantes por supresión del polipéptido WISP de longitud completa incluyen las variantes de las que se ha suprimido el péptido señal N-terminal, si hay alguno (tal como, por ejemplo, los identificados putativamente como aminoácidos 1 a 22 para el WISP-1, 1 a 23 para el WISP-2, 1-33 para el WISP-3 de la Figura 6, y 1-15 para el WISP-3 de la Figura 7), y/o se ha suprimido la metionina iniciadora.
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C. Modificaciones del polipéptido WISP
También se contemplan las modificaciones covalentes de los polipéptidos WISP. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos aminoácidos diana de un polipéptido WISP con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas, o con los residuos N- o C-terminales. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar un polipéptido WISP con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua, para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-WISP, y viceversa. Los agentes entrecruzadores comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, los ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres bifuncionales, incluyendo los ésteres de disuccinimidilo tales como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), la maleimida bifuncionales tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano, y agentes tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo o asparaginilo respectivamente a los correspondientes residuos glutamilo y asparagilo, la hidroxilación de la prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo y treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido WISP comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se pretende que signifique, para los propósitos en la presente, suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en el polipéptido de secuencia nativa (bien suprimiendo el sitio de glicosilación subyacente, bien suprimiendo la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye los cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporción de los diversos residuos azúcares presentes.
La adición de sitios de glicosilación al polipéptido puede conseguirse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede hacerse, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos serina o treonina en la secuencia nativa (para los sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácido puede alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido WISP en bases preseleccionadas de tal forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. La mutación o mutaciones de ADN pueden hacerse usando los procedimientos descritos más arriba.
Otra forma de incrementar el número de grupos carbohidratos sobre el polipéptido WISP es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Tales procedimientos se describen en el ámbito de la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
La supresión de grupos carbohidratos presentes sobre el polipéptido WISP puede conseguirse química o enzimáticamente, o mediante sustitución por mutación de codones que codifican residuos aminoácidos que sirven como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en el campo, y se describen, por ejemplo, en Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y en Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La ruptura enzimática de los grupos carbohidrados sobre los polipéptidos puede conseguir mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas, según describen Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente comprende unir el polipéptido WIPS a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, el polietilenglicol, el polipropilenglicol, o los polioxialquilenos, de la manera establecida en las Patentes Estadounidenses nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
El polipéptido WISP puede modificarse también de manera que forme una molécula quimérica que comprende un polipéptido WISP, o un fragmento del mismo, fusionado a un polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido WISP con un polipéptido etiqueta, el cual proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta del epítopo se coloca generalmente en los extremos amino- o carboxi-terminales de una molécula nativa o variante de WISP. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido etiquetado. También, la presencia de la etiqueta del epítopo permite que el polipéptido WISP sea fácilmente purificado mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta, u otro tipo de matriz de afinidad, que se une a la etiqueta del epítopo. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido WISP, o un fragmento del mismo, con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, tal fusión puede ser con la región Fc de una Ig, tal como una molécula
de IgG.
Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en el campo. Los ejemplos incluyen las etiquetas polihistidina (poly-His) o la poli-histidina-glicina (poly-His-Gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)); la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra la misma (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)). Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag (Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)); el péptido del epítopo de KT3 (Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)); un péptido del epítopo de la \alpha-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)); y la etiqueta de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)).
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D. Preparación del polipéptido WISP
La descripción siguiente se refiere principalmente a la producción de polipéptidos WISP mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene al menos el ADN que codifica las secuencias maduras o de longitud completa del WISP-1 humano o de ratón (SEC Nº ID.: 3, 4, 11, ó 12, respectivamente), o que contiene al menos el ADN que codifica las secuencias maduras o de longitud completa del WISP-2 humano o de ratón (SEC Nº ID.: 15, 16, 19, ó 20, respectivamente), o que contiene al menos el ADN que codifica las secuencias maduras o de longitud completa del WISP-3 humano de la Figura 6 (SEC Nº ID.: 32 ó 33, respectivamente), o que contiene al menos el ADN que codifica las secuencias maduras o de longitud completa del WISP-3 humano de la Figura 7 (SEC Nº ID.: 36 ó 37, respectivamente),
Por supuesto, se contempla la posibilidad que puedan emplearse procedimientos alternativos, bien conocidos en el estado de la técnica, para preparar los polipéptidos WISP. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido WIPS, o porciones de la misma, pueden producirse mediante la síntesis directa del péptido usando técnicas de fase sólida. Consultar, por ejemplo, Stewart et al., "Solid-Phase Peptide Synthesis" (W.H. Freeman Co.; San Francisco, CA, 1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). La síntesis proteica in vitro puede realizarse usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse usando, por ejemplo, un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Varias porciones de los polipéptidos WISP pueden sintetizarse químicamente por separado, y combinarse usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir un polipéptido WISP de longitud completa.
1. Aislamiento del ADN que codifica el polipéptido WISP
El ADN que codifica el polipéptido WISP puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree posee el ARNm que codifica el polipéptido WISP, y que lo expresa en un nivel detectable. En consecuencia, los ADN que codifican el polipéptido WISP humano pueden obtenerse convenientemente a partir de bibliotecas de ADNc preparadas a partir de tejidos humanos, tales como las bibliotecas de hígado fetal humano o cualquiera otra descrita en los Ejemplos. El gen que codifica el polipéptido WISP puede obtenerse también a partir de una biblioteca genómica o mediante la síntesis del oligonucleótido.
Aún otro procedimiento alternativo de clonación del polipéptido WISP es la hibridación por sustracción supresora, la cual es un procedimiento para generar sondas y bibliotecas de ADNc reguladas diferencialmente o específicas de un tejido. Esto se describe, por ejemplo, en Diatchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6025-6030 (1996). El procedimiento se basa principalmente en una técnica denominada PCR de supresión, y combina la normalización y la sustracción en un único procedimiento. El paso de normalización iguala la abundancia de ADNc dentro de la población diana, y el paso de sustracción excluye las secuencias comunes entre las poblaciones diana y conductora.
Las bibliotecas pueden examinarse con sondas (tales como anticuerpos contra un polipéptido WISP, u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El examen de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo usando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al., ver más arriba. Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el polipéptido WISP es usar la metodología de la PCR. Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1995).
Los ejemplos siguientes describen las técnicas para examinar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener la longitud suficiente, y ser lo suficientemente no ambiguas como para que los falsos positivos estén minimizados. El oligonucleótido está preferiblemente marcado, de tal forma que pueda detectarse a partir de su hibridación con el ADN de la biblioteca que se está examinando. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en el campo, e incluyen el uso de marcas radiactivas como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcado con enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo las de rigurosidad moderada y elevada rigurosidad, se proporcionan en Sambrook et al., ver más arriba.
Las secuencias identificadas en tales procedimientos de examen de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como el GenBank, u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula, o a través de la secuencia de longitud completa, puede determinarse a través del alineamiento de la secuencia usando programas de ordenador tales como el ALIGN, el DNAstar, y el INHERIT, los cuales emplean varios algoritmos para medir la homología.
El ácido nucleico que tiene la secuencia que codifica el polipéptido puede obtenerse examinando bibliotecas de ADNc o genómicas usando las secuencias de aminoácidos deducidas descritas en la presente invención por primera vez, y, si es necesario, usando procedimientos convencionales de extensión del cebador según se describen en Sambrook et al., ver más arriba, para detectar precursores y procesar los intermediarios del ARNm que pueden no haberse transcrito a la inversa en el ADNc.
2. Selección y transformación de células huéspedes
Las células huéspedes se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción del polipéptido WISP, y se cultivan en medio nutritivo convencional, modificado según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones del cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, puede seleccionarlas el especialista capacitado sin experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células pueden hallarse en "Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach", editor M. Butler (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1991), y Sambrook et al., ver más arriba.
Los procedimientos de transfección son conocidos por el especialista ordinariamente capacitado, por ejemplo, el CaPO_{4} y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, tal como se describe en Sambrook et al., ver más arriba, o la electroporación, generalmente se usan para los procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene, 23:315 (1983), y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, puede emplearse el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas huéspedes de células de mamífero se han descrito en la Patente Estadounidense nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros procedimientos para introducir el ADN en las células, tales como mediante la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, por ejemplo, el polibreno o la poliornitina, etcétera. Para información sobre varias técnicas para transformar células de mamífero, consultar Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células huéspedes apropiadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente incluyen las células de procariota, de levadura o de eucariota superior. Los procariotas apropiados incluyen, pero no se limitan a las eubacterias, tales como los organimos Gram-negativos o Gram-positvos, por ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. lichenformis 41 P descrito en DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Hay varias cepas de E. coli disponibles públicamente, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa W3110 de E. coli (ATCC 27.325); y K5 772 (ATCC 53.635). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un huésped o progenitor de huésped particularmente preferido, porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, incluyendo los ejemplos de tales huésped la cepa 1A12 de E. coli, la cual tiene el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kartr; la cepa 37D de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-/ac)169 degP ompT rbsT ilvG kanr; la cepa 40B4 de E. coli W3110, la cual es una cepa 37D6 con una mutación de supresión degP que la hace no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplasmática mutante descrita en la Patente Estadounidense nº 4.946.783, concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son apropiados los procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que contienen ácido nucleico que codifica el polipéptido WISP. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente usado. No obstante, existe un cierto número de otros géneros, especies y cepas comúnmente disponibles y útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); EP 139,383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces, tales como Kluyveromyces lactis (Patente estadounidense nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.049), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070: Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurosporacrassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)), y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)). Las levaduras metilotróficas son apropiadas aquí, e incluyen, pero no se limitan a las levaduras capaces de crecer sobre metanol seleccionadas de entre los géneros consistentes en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ilustrativas de esta clase de levaduras puede hallarse en C. Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs", 269 (1982).
Las células huéspedes apropiadas para la expresión de WISP glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células taleas como las S2 de Drosophila y las Sf9 de Spodoptera, así como las células de plantas. Los ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero útiles incluyen las células ováricas de hámster chino (CHO) y las COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 renal de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivos en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]; las células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl Acad Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Las selección de la célula huésped apropiada se considera que se halla dentro del conocimiento del campo.
3. Selección y uso de un vector replicable
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el polipéptido WISP puede insertarse dentro de un vector replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay varios vectores disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en el sitio o sitios apropiados de endonucleasas de restricción usando técnicas conocidas en el estado de la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándares, las cuales son conocidas por el especialista capacitado.
El polipéptido WISP deseado puede producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia de señal, si el polipéptido WISP es propicio a ser secretado, u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro o de longitud completa. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el polipéptido WISP que está insertado en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariota, tal como, por ejemplo, las líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de la levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de los factores-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la patente estadounidense nº 5.010.182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como los líderes secretores víricos.
Ambos vectores, el de expresión y el de clonación, contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de las células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el polipéptido WISP, tales como la DHFR o la quinasa de timidina. Una célula huésped apropiada, cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje, es la línea CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describieron Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de levadura. Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980). El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC nº 44076 ó PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977).
Los vectores de clonación y expresión usualmente contienen un promotor, unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido WISP, para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales son bien conocidos. Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)); de la fosfastasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776); y los promotores híbridos tal como el promotor tac, deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983). Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido WISP.
Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa, (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978), tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa del 3-fosfoglicerato, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen las ventajas adicionales de la transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas de degradación asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en EP 73,657.
La transcripción del WISP a partir de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma de las aves, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus 40 del mono (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido WISP por parte de eucariotas superiores puede incrementarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, de forma habitual aproximadamente de 10 a 300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Se conocen muchas secuencias potenciadores procedentes de genes de mamíferos (de globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, típicamente se usarán un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b. 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de los adenovirus. El potenciador puede ayustarse dentro del vector en una posición 5' o 3' respecto la secuencia codificante de un ºpp WISP, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto el promotor.
Los vectores de expresión usados en las células huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones 5', y ocasionalmente 3', no traducidas de los ADN o ADNc víricos eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos que se transcriben como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el polipéptido WISP.
Aún otros procedimientos, vectores y células huéspedes, apropiados para su adaptación a la síntesis del polipéptido WISP en cultivos de células vertebradas recombinantes, se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; y EP 117.058.
4. Detectando la amplificación/expresión del gen
La amplificación y/o la expresión del gen puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia Southern o transferencia Northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), la transferencia en punto (análisis del ADN), o la hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplexes específicos, incluyendo los dúplexes de ADN, los dúplexes de ARN, y los dúplexes híbridos ADN-ARN o los dúplexes ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos pueden estar marcados, y el ensayo puede llevarse a cabo cuando el dúplex está unido a la superficie, de forma que, a partir de la formación del dúplex sobre la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
La expresión del gen puede medirse alternativamente mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de las células o de las secciones de tejido, y el ensayo del cultivo de células o de los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras fluidas pueden ser tanto monoclonales como policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido WISP de secuencia nativa, o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención, o contra una secuencia exógena fusionada al ADN que codifica el polipéptido WISP y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.
5. Purificación de los polipéptidos
Las formas de PRO364 o PRO175 pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si están unidos a la membrana, pueden liberarse de la membrana usando una solución detergente apropiada (e.g. Triton-X 100) o mediante corte enzimático. Las células empleadas en la expresión del polipéptido WISP pueden romperse mediante varios medios físicos o químicos, tales como un ciclo de congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica, o los agentes de lisado de células.
Puede ser deseable purificar el polipéptido WISP de otras proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los procedimientos siguientes son ilustrativos de los procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; la precipitación con etanol; la HPLC de fase inversa; la cromatografía en columnas de sílice o de una resina de intercambio catiónico tal como la DEAE; el cromatoenfoque; la SDS-PAGE; la precipitación con sulfato amónico; la filtración en gel usando, por ejemplo, SEPAHDEX G-75; las columnas de proteína A-SEPHAROSE para retirar contaminantes tales como la IgG; y columnas quelantes de metales para unir las formas etiquetadas con epítopo del polipéptido WISP. Pueden emplearse varios procedimientos de purificación de proteínas, y tales procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", Springer-Verlag, New York (1982).
En un ejemplo específico de purificación, se añaden una etiqueta poli-His o la porción Fc de la IgG humana a la región codificante C-terminal del ADNc para el WISP-1, WISP-2, o WISP-3 antes de la expresión. El medio condicionado procedente de las células transfectadas se recolecta mediante centrifugación para eliminar las células y se filtra. Para las construcciones etiquetadas con poli-His, la proteína puede purificarse usando una columna Ni-NTA. Después de cargada, la columna puede lavarse con tampón de equilibrado adicional, y se eluye la proteína con tampón de equilibrado que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada puede desalarse a continuación en un tampón de almacenamiento, si se desea.
Las construcciones de inmunoadhesinas (que contienen Fc) de las proteínas WISP-1, WISP-2 y WISP-3 pueden purificarse también a partir del medio condicionado bombeándolo sobre una columna de 5 ml de Proteína A la cual se ha equilibrado en tampón fosfato. Después de cargada, puede lavarse la columna exhaustivamente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico. La proteína eluida puede neutralizarse inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen tampón TRIS. La proteína altamente purificada puede desalarse a continuación en tampón de almacenamiento, tal y como se ha descrito más arriba para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de la proteína puede verificarse mediante geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación N-terminal por la degradación de Edman.
El paso o pasos de purificación seleccionados dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del polipéptido WISP concreto producido.
E. Usos del polipéptido WISP y de su ácido nucleico
Las secuencias nucleotídicas (o sus complementos) que codifican los polipéptidos WISP tienen varias aplicaciones en el campo de la biología molecular, incluyendo su uso como sondas de hibridación, en el mapeado de cromosomas y genes, y en la generación de ARN y ADN no codificante. El ácido nucleico que codifica el polipéptido WISP será útil también para la preparación de polipéptidos WISP mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente invención.
Las secuencias nucleotídicas de longitud completa para el WISP-1 o WISP-2 de ratón o humanos (respectivamente SEC Nº ID.: 9, 1, 17, y 13), o porciones de los mismos, o las secuencias nucleotídicas de longitud completa del WISP-3 humano de la Figura 6 (SEC Nº ID.: 30) o del WISP-3 de la Figura 7 (SEC Nº ID.: 34), pueden usarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar o detectar aún otros genes (por ejemplo, las variantes del polipéptido WISP que ocurren de forma natural, otros miembros de la familia del polipéptido WISP, o polipéptidos WISP de otras especies) los cuales tienen la identidad de secuencia deseada con las secuencias del polipéptido WISP descritas en las Figuras 1, 2, 3A y 3B, 4, 6A y 6B, y 7A y 7B (SEC Nº ID.: 3, 4, 11, 12, 15, 16. 19, 20, 32, 33, 36, ó 37). Por ejemplo, procedimientos tales como la hibridación in situ, Las transferencias Northern y Southern, y el análisis mediante PCR, pueden usarse para determinar si está presente el ADN y/o ARN que codifica un WISP diferente en el tipo o tipos celulares que se están evaluando. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Por ejemplo, las sondas de hibridación pueden derivarse de la secuencia nucleotídica UNQ228 (DNA33473-seq min) (SEC Nº ID.: 38), o de la secuencia nucleotídica del WISP-2 humano de longitud completa (SEC Nº ID.: 13) según se muestra en la Figura 4, o de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores, e intrones de ADN que codifican el polipéptido WISP de secuencia nativa.
A modo de ejemplo, un procedimiento de examen comprenderá aislar la región codificante del gen WISP usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante una variedad de marcas, incluyendo radionúcleos tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcas enzimáticas tales como la fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sonda marcadas que tienen una secuencia complementaria a la de cualquiera de los genes que codifican los polipéptidos WISP de la presente invención pueden usarse para examinar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico, o ARNm para determinar a qué miembros de dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con más detalle en los Ejemplos siguientes.
Las sondas pueden emplearse también en técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la identificación de secuencias WISP estrechamente relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido WISP pueden usarse también para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifica el polipéptido WISP, y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias nucleotídicas proporcionadas en la presente invención pueden mapearse sobre un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de unión respecto marcadores cromosómicos conocidos, y el examen de hibridación con bibliotecas. Si la amplificación de un determinado gen es funcionalmente relevante, entonces ese gen debería amplificarse más que las regiones genómicas vecinas que no son importantes para la supervivencia del tumor. Para ensayar esto, el gen puede mapearse a un cromosoma determinado, por ejemplo, mediante análisis del híbrido de radiación. A continuación, se determina el nivel de amplificación en la ubicación identificada, y en la región genómica vecina. La amplificación selectiva o preferente de la región genómica a la que se ha mapeado el gen es consistente con la posibilidad de que la amplificación del gen observada promueva el crecimiento o supervivencia del tumor. El mapeado del cromosoma incluye ambos, el mapeado del esqueleto y del epicentro. Para más detalles consultar, por ejemplo, Stewart et al., Genome Research 7:422-433 (1997).
El ácido nucleico que codifica un polipéptido WISP puede usarse como un diagnóstico para determinar el alcance y la velocidad de expresión del ADN que codifica el polipéptido WISP en las células de un paciente. Para llevar a cabo tal ensayo, se trata una muestra de células de un paciente, a través de la hibridación in situ o mediante otros medios apropiados, y se analiza para determinar si la muestra contiene moléculas de ARNm capaces de hibridarse con la molécula de ácido nucleico.
Los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido WISP, o cualquiera de sus formas modificadas, puede usarse también para generar animales no humanos transgénicos o animales no humanos nuligénicos, los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, transgén que se introdujo en el animal, o en un ancestro del animal, en una etapa prenatal, por ejemplo, embrionario. Un transgén es un AND que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica el polipéptido WISP puede usarse para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido WISP de acuerdo con técnicas establecidas, y las secuencias genómicas usadas para generar los animales transgénico pueden usarse para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica el polipéptido WISP.
Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como los ratones, han pasado a ser convencionales en la técnica, y se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses nº 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, células concretas serán la diana para la incorporación del transgén del polipéptido WISP, con potenciadores específicos para tejidos. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica el polipéptido WISP, introducido en la línea germinal del animal en un estado embrionario, pueden usarse para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica el polipéptido WISP. Tales animales pueden usarse como animales probadores para reactivos que se cree que confieren protección frente a, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la investigación, se trata un animal con el reactivo, y una incidencia reducida de la condición patológica, en comparación con los animales no tratados portadores del transgén, indicará una potencial intervención terapéutica para la condición patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos no humanos del polipéptido WISP para construir un animal nuligénico del polipéptido WISP, el cual tiene un gen defectuoso o alterado que codifica un polipéptido WISP, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido WISP y el ADN genómico alterado que codifica el polipéptido WISP introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica el polipéptido WISP puede usarse para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido WISP de acuerdo con técnicas establecidas. Un porción del ADN genómico que codifica el polipéptido WISP puede suprimirse o remplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable, el cual puede usarse para monitorizar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector varios kilobases de ADN flanqueador inalterado (tanto en el extremo 5' como en el 3'). Consultar, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores recombinantes homólogos. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias no humanas (por ejemplo, mediante electroporación), y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno. Consultar, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992). Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocito de un animal no humano (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación. Consultar, por ejemplo, Bradley, en "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", editor E.J. Robertson, (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152. Un embrión quimérico no humano puede implantarse a continuación en un animal nodriza hembra pseudopreñado, y el embrión se lleva a término para crear un animal nuligénico. La progenie que alberga en sus células germinales el ADN recombinado homólogamente puede identificarse mediante técnicas estándares, y se usa para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales nuligénicos pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse de ciertas condiciones patológicas, y por desarrollar condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido WISP.
En particular, los ensayos en los que usualmente se usan el CTGF, las IGFBP, y otros miembros de la superfamilia del CTGF preferiblemente se realizan con los polipéptidos WISP-1 y WISP-2. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo para determinar si el TGF-\beta induce el polipéptido WISP, indicando un papel en el cáncer, tal y como es conocido en el estado de la técnica, así como ensayos que implican la inducción de la muerte celular y los ensayos de proliferación con 3H-timidina. También se realizan con el polipéptido WISP los ensayos mitogénicos y de crecimiento de tejido, tal como se detalló más arriba. Los resultados se aplican como corresponde.
Los polipéptidos WISP de la presente invención puede usarse también para inducir la formación de anticuerpo anti-polipéptido WISP, los cuales se identifican mediante examen rutinario, como se detalla más abajo.
Además de los usos anteriores, los polipéptidos WISP-1, WISP-2, y WISP-3 son útiles como base para ensayos de la actividad del IGF. De forma importante, puesto que semejante ensayo mide un suceso de unión fisiológicamente significativo, es decir, el de un IGF a su IGFBP, activando un cambio detectable (tal como la fosforilación, corte, modificación química, etc.), es probable que sea tanto más sensible como más preciso que los inmunoensayos, los cuales detectar la unión fisiológicamente no significativa de un IGF a un anticuerpo anti-polipéptido WISP. Aunque más sensible y preciso que los anticuerpos, las moléculas WISP-1, WISP-2, y WISP-3 pueden usarse para ensayar niveles de IGF (tal como el IGF-I de IGF-II) en una muestra de la misma forma en la que se usan los anticuerpos.
Para propósitos diagnósticos, el polipéptido WISP-1, WISP-2, o WISP-3 puede usarse de acuerdo con la tecnología del inmunoensayo. Wide, en las páginas 199-206 de "Radioimmune Assay Method", editores Kirkham y Huner, E&S, Livingstone, Edimburgo, 1970, proporciona ejemplos de inmunoensayos.
Por tanto, los polipéptidos WISP-1, WISP-2, y WISP-3 pueden marcarse de forma detectable e incubarse con una muestra de ensayo que contiene moléculas de IGF (tales como los fluidos biológicos, por ejemplo, suero, esputo, orina, etcétera), y puede establecerse la cantidad de molécula de WISP-1, WISP2, o WISP-3 unida a la muestra.
En ciertos procedimientos de ensayo se requiere la inmovilización de los reactivos. La inmovilización comporta la separación del polipéptido WISP1, WISP-2, o WISP-3 de cualquier analito que permanezca libre en solución. Convencionalmente, esto se consigue solubilizando el polipéptido WISP-1, WISP-2 o WISP-3 antes del procedimiento de ensayo, como mediante su adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich et al., Patente Estadounidense nº 3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando entrecruzamiento con glutaraldehído), o mediante insolubilización de la molécula a continuación, por ejemplo, mediante inmunoprecipitación.
Los anteriores son meramente ensayos diagnósticos ilustrativos para la IGF. Otros procedimientos desarrollado ahora o partir de ahora para la determinación de estos analitos se incluyen dentro del ámbito de la misma.
Los polipéptidos WISP-1, WISP-2 y WISP-3 son útiles también en radioinmunoensayos para medir IGF tales como el IGF-I o el IGF-II. Semejante radioinmunoensayo se realizaría como se describe en la literatura usando el WISP-1, WISP-2 o WISP-3 purificado naturalmente o recombinante como elemento WISP.
Además, los polipéptidos WISP son útiles para examinar en busca de compuestos que se unen a ellos, tal como se a definido más arriba. Preferiblemente, estos compuestos son moléculas pequeñas tales como moléculas orgánicas o peptídicas que exhiben una o más de las actividades deseadas. Los ensayos de cribado de este tipo son convencionales en el campo, y puede emplearse cualquiera de tales procedimientos de cribado, en donde la molécula de ensayo se pone en contacto con el polipéptido WISP en la presente invención, y se determina el alcance de la unión y la actividad biológica de la molécula unida.
Más específicamente, esta invención abarca procedimientos de cribado de compuestos para identificar aquellos que impiden el efecto del polipéptido WISP (antagonistas). Los ensayos de cribado en busca de candidatos de fármacos se diseñan para identificar compuestos que se unen o complejan con los polipéptidos WISP codificados por los genes identificados en la presente invención, o que interfieren de otro modo con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de cribado incluyen los ensayos capaces de un cribado de elevado rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente apropiados para identificar pequeñas moléculas candidatas a fármaco.
Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de cribado bioquímicos, los inmunoensayos, y los ensayos basados en células, los cuales están bien caracterizados en el campo.
Todos los ensayos para antagonistas tienen en común que buscan poner en contacto el candidato a fármaco con un polipéptido WISP codificado por un ácido nucleico identificado en la presente invención, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen.
En los ensayos de unión, la interacción es la unión, y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido WISP codificado por el gen identificado en la presente invención o el candidato a fármaco se inmovilizan sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una placa de microvaloración, mediante acoplamiento covalente o no covalente. El acoplamiento no covalente generalmente se consigue recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido WISP y secándola. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido WISP a inmovilizarse, puede usarse para anclarlo sobre un superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, el cual puede marcarse mediante una marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, se eliminan los componentes que no han reaccionado, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado es portador de una marca detectable, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que ha ocurrido la formación del complejo. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no es portador de una marca, la formación del complejo puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona con un polipéptido WISP determinado codificado por un gen identificado en la presente invención pero no se une a él, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse mediante procedimientos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen las estrategias tradicionales, tales como, por ejemplo, el entrecruzamiento, la coinmunoprecipitación, y la copurificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden monitorizarse usando un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) tal como descubrieron Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991). Muchos de los activadores de la transcripción, tales como el GAL4 de levadura, consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, actuando uno como dominio unidor de ADN, y funcionando el otro como dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones precedentes (generalmente denominado como el "sistema de dos híbridos") se aprovecha de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está fusionada al dominio unidor de ADN de GAL4, y otra en la que las proteínas activadoras candidatas están unidas al dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo control de un promotor GAL4-activado depende de la reconstitución de la actividad GAL4 a través de la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica de dos híbridos está disponible de Clontech. Este sistema puede extenderse también para mapear dominios proteicos implicados en interacciones proteicas específicas, así como para señalar residuos aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen, que codifica un polipéptido WISP identificado en la presente invención, y otros componentes intra- o extracelulares, puede ensayarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular en condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos productos. Para ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se corre en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción para servir como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla se monitoriza como se ha descrito en la presente más arriba. La formación de un complejo en la reacción o reacciones de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo, indica que el compuesto de ensayo interfiere con la interacción del compuesto de ensayo y su pareja de reacción.
Si el polipéptido WISP tiene la capacidad de estimular la proliferación de las células endoteliales en presencia de comitógeno ConA, entonces un ejemplo de un procedimiento de cribado saca partido de esta capacidad. Específicamente, en el ensayo de proliferación, se obtienen células endoteliales de la vena umbilical humana, y se cultivan en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA), y se suplementan con un mezcla de reacción apropiada para facilitar la proliferación de las células, conteniendo la mezcla Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA). Se añaden Con-A y el compuesto a examinarse, y después de la incubación a 37ºC, los cultivos se pulsan con (3-H)timidina y se recolectan sobre filtros de fibra de vidrio (phD; Cambridge Technology, Watertown, MA). La incorporación promedio de (3-H)timidina (c.p.m.) de tres cultivos triplicados se determina usando un contador de centelleo líquido (Beckman Instruments, Irvine, CA). Una incorporación significativa de (3-H)timidina indica la estimulación de la proliferación de las células endoteliales.
Para ensayar en busca de antagonistas, se realiza el ensayo descrito más arriba; sin embargo, en este ensayo el polipéptido WISP se añade junto con el compuesto a examinar, y la capacidad del compuesto para inhibir la incorporación de (3H)-timidina en presencia del polipéptido WISP indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido WISP. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse combinando el polipéptido WISP y un antagonista potencial, con receptores o receptores recombinantes del polipéptido WISP unidos a membrana, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido WISP puede marcarse, tal como mediante radiactividad, de tal forma que el número de moléculas de polipéptido WISP unidas al receptor puede usarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos procedimientos conocidos por aquéllos capacitados en el estado de la técnica, por ejemplo, el cribado de ligando y la separación FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): capítulo 5 (1991). Preferiblemente, la clonación de expresión se emplea cuando se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula que responde al polipéptido WISP, y una biblioteca de ADNc, creada a partir de este ARN, se divide en lotes y se usa para transfectar células COS u otras células que no responden al polipéptido WISP. Las células transfectadas, que se hacen crecer sobre portaobjetos de vidrio, se exponen a polipéptido WISP marcado. El polipéptido WISP puede marcarse mediante una variedad de medios, incluyen la yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una quinasa de proteína específica de un sitio. A continuación de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico. Se identifican los lotes positivos y se preparan sublotes y transfectan de nuevo usando un proceso interactivo de sub-división y reexamen, rindiendo eventualmente un único clon que codifica el receptor putativo.
Como una estrategia alternativa para la identificación del receptor, el polipéptido WISP marcado puede unirse por fotoafinidad con preparaciones de membrana celular o extractos que expresan la molécula del receptor. El material entrecruzado se resuelve mediante PAGE y se expone a película de rayos-X. El complejo marcado que contiene el receptor puede extraerse, resolverse en fragmentos peptídicos, y someterse a microsecuenciación de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de la microsecuenciación se usará para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degeneradas para examinar un biblioteca de ADNc para identificar los genes que codifican el receptor putativo.
En otro ensayo en busca de antagonistas, las células de mamífero, o una preparación de membrana, que expresan el receptor se incubarán con polipéptido WISP marcado en presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto para potenciar o bloquear estar interacción pueden medirse entonces.
Las composiciones útiles para el tratamiento de los trastornos relacionados con el WISP incluyen, sin limitación, los anticuerpos, las moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, los péptidos, los fosfopéptidos, loas moléculas no codificantes y los ribozimas, las moléculas de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o actividad del producto del gen diana.
Los ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une al polipéptido WISP, a las fusiones de (poli)péptido-inmunoglobulina, y, en particular, los anticuerpos, incluyendo, sin limitación, los anticuerpos poli- y monoclonales y los fragmentos de anticuerpo, los anticuerpos de cadena simple, los anticuerpos antiidiopáticos, las versiones quiméricas y humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, una forma mutada del polipéptido WISP que reconoce el receptor pero no transmite efecto alguno, inhibiendo competitivamente de ese modo la acción del polipéptido WISP.
Otro antagonista potencial del polipéptido WISP es una construcción de ARN o ADN no codificante preparada usando tecnología no codificante, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN no codificante actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm hibridándose con el ARNm diana e impidiendo la traducción de la proteína. La tecnología no codificante puede usarse para controlar la expresión génica a través de la formación de una triple hélice o a través de ADN o ARN no codificante, ambos procedimientos se basan en la unión de un polinucleótido al ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia de polinucleótido, la cual codifica los polipéptido WISP maduros de la presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de desde aproximadamente 10 hasta 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario con una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, consultar Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), impidiéndose de ese modo la transcripción y la producción de polipéptido WISP. El oligonucleótido de ARN no codificante se hibrida con el ARNm in vivo, y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido WISP (no codificante - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression" (CRC Press: Boca Raton, FL. 1988). Los oligonucleótidos descritos más arriba pueden administrarse también a células, de tal forma que el ARN o ADN no codificante puede expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido WISP. Cuando se usa el ADN no codificante, se prefieren los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de cada secuencia de nucleótidos del gen diana.
Los antagonistas potenciales incluyen las moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, al sitio de unión al receptor, o al factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido WISP, bloqueando de ese modo la actividad biológica normal del polipéptido WISP. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, los péptidos pequeños o las moléculas similares a péptidos, los péptidos preferiblemente solubles, y los compuestos inorgánicos u orgánicos no peptídicos sintéticos.
Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el corte específico del ARN. Los ribozimas actúan mediante hibridación específica para la secuencia con el ARN diana complementario, seguida por el corte endonucleolítico. Los sitios específicos de corte por ribozima con una diana potencial de ARN pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para más detalles consultar, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y la publicación del nº WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de hélice triple, usadas para inhibir la transcripción, deberían ser de hebra simple y compuestas por desoxirribonucleótidos. La composición en bases de estos oligonucleótidos está diseñada de tal forma que promueve la formación de la hélice triple a través de las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, lo que generalmente requiere tiradas considerables de purinas o pirimidinas sobre una hebra de un dúplex. Para más detalles consultar, por ejemplo, la publicación del PCT nº WO 97/33551, ver más arriba.
Todas estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante uno cualquiera, o más, de los ensayos de cribado discutidos más arriba en la presente invención, y/o mediante cualesquiera otras técnicas de cribado bien conocidas por expertos en la materia.
Los polipéptidos WISP-1, WISP-2, y WISP-3 son útiles además en la purificación por afinidad de un IGF que se una al WISP-1, WISP-2, o WISP- 3 (tal como, por ejemplo, el IGF-I) y en la purificación de los anticuerpos contra ellos. El polipéptido WISP-1, WISP-2, o WISP-3 típicamente se acopla a una resina inmovilizada tal como el Affi-Gel 10^{TM} (Bio-Rad, Richmond, CA) o a otras resinas semejantes (matrices de soporte) por medios bien conocidos en el estado de la técnica. La resina se equilibra en un tampón (tal como uno que contenga NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, suplementado para contener un 20% de glicerol y un 0,5% de NP-40), y la preparación a purificarse se coloca en contacto con la resina, en donde las moléculas se adsorben selectivamente al WISP-1, WISP-2 o WISP-3 sobre la resina.
A continuación, la resina se lava secuencialmente con tampones apropiados para eliminar el material no adsorbido, incluyendo los contaminantes no deseados, de la mezcla a purificarse, usando, por ejemplo, NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, conteniendo un 0,5% de NP-40; NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, conteniendo NaCl 0,5 M y 0,1% de NP-40; NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, conteniendo un 0,1% de deoxicolato; NaCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4, conteniendo un 0,1% de NP-40; y una solución del 0,1% de NP-40, 20% de glicerol, y glicina 50 mM, pH 3. La resina se trata a continuación para eluir el IGF usando un tampón que romperá el enlace entre el IGF y el WISP-1, WISP-2 o WISP-3 (usando, por ejemplo, glicina 50 mM, pH 3, 0,1% de NP-40, 20% de glicerol, y NaCl 100 mM).
Se contempla que los polipéptidos WISP de la presente invención pueden usarse para tratar varios afecciones, incluyendo aquellas caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de al menos la vía del Wnt. Además, puesto que las moléculas WISP-1 WISP-2, y WISP-3 responden al cáncer de mama expresado por hormonas en ratones y están anormalmente expresados en el cáncer humano, y están sobreamplificados en varias líneas celulares de cáncer de color, son útiles para diagnosticar el cáncer, por ejemplo, como un marcador de una susceptibilidad incrementada al cáncer o a tener cáncer. Las afecciones o trastornos de ejemplo a tratar con los polipéptidos WISP incluyen los tumores benignos y malignos (por ejemplo, los tumores renales, hepáticos, del riñón, de la vejiga, testiculares, de mama, gástricos, de ovarios, colorrectales, de próstata, pancreáticos, de pulmón, esofágicos, de vulva, de tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemia y cánceres linfoides; otros trastornos tales como los trastornos neuronales, gliales, astrocíticos, hipotalámicos y otros glandulares, de macrófagos, epiteliales, estromales, y los blastocélicos; los trastornos cardíacos, los trastornos renales; los trastornos catabólicos; los trastornos relacionados con los huesos tales como la osteoporosis; y los trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, tales como la arterioesclerosis; así como los trastornos del tejido conectivo, incluyendo la cicatrización de heridas.
Los polipéptidos WISP de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente a un humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa en embolada o mediante infusión continuada a lo largo de un período de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o mediante inhalación. La preferida es la administración intravenosa o subcutánea del polipéptido.
Las formulaciones terapéuticas del polipéptido WISP se preparan para su almacenamiento mezclando la molécula activa, que tiene el grado de pureza deseado, con portadores, excipientes o estabilizantes optativos farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, editor Osol, A. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas Los portadores, excipientes o estabilizantes no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico y la metionina; conversantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalcono, el cloruro de bencetonio; el fenol, el alcohol butílico o bencílico; los alquilparabenos tales como el metil o propilparaben; el catecol; el resorcinol; el cclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como el TWEEN^{TM}, el PLURONICS^{TM} o el polietilenglicol (PEG).
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración de los polipéptidos WISP de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a tratar con los polipéptidos descritos en la presente invención puede recibir también terapia de radiación si el trastorno es cáncer. Alternativamente, o además, puede administrarse al paciente con cáncer un agente quimioterapéutico. La preparación y programación de la dosificación para los agentes quimiterapéuticos puede usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o según sea determinado empíricamente por el médico capacitado. La preparación y los programas de dosificación para tal quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service, editor M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir la administración del polipéptido, o puede administrarse simultáneamente al mismo. El polipéptido puede combinarse con un compuesto antiestrógeno como el tamoxifén, o con una antiprogesterona tal como la onapristona (consultar, EP 616.812) en dosis conocidas para tales moléculas.
También puede ser deseable coadministrar el el polipéptido WISP (o el anti-polipéptido WISP) anticuerpos contra otros antígenos asociados a tumor, tales como los anticuerpos que se unen a HER-2, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, o al factor endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o además, pueden coadministrarse al paciente dos o más anticuerpos anti-cáncer, tales como los anticuerpos anti-ErbB2, junto con el polipéptido WISP (o el anticuerpo anti-polipéptido WISP). A veces, puede ser beneficioso administrar también una o más citocinas al paciente.
En una realización preferida, el polipéptido WISP se coadministra al paciente con cáncer junto con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse primero, seguido por el polipéptido WISP. No obstante, también se contempla la administración simultánea o la administración primero del polipéptido WISP. Las dosificaciones apropiadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas actualmente usadas, y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del polipéptido. Los anticuerpos, agentes citotóxicos, citocinas, o agentes inhibidores del crecimiento están convenientemente presentes en combinación, en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos pueden estar atrapados también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, respectivamente microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), es sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, editor Osol, A. Ed. (1980). supra.
Las formulaciones a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estéril.
Pueden prepararse preparaciones de liberación continua. Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación continua incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continuada incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato), o el poli(alcohol vinílico)), los polilácticos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, el etilenvinilacetato no degradable, los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etilenvinilacetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo período, pueden desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios de su inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específica.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad o trastorno, la dosificación apropiada de polipéptido WISP de la presente invención dependerá del tipo de trastorno a tratar, según se definió más arriba, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el polipéptido se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente, y de la respuesta al polipéptido, de la ruta de administración, de la condición del paciente, y del criterio del médico responsable. El polipéptido se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial, para la administración al paciente, es aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de polipéptido WISP, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continuada. Una dosificación diaria típica puede oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas del trastorno. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se sigue fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. En otra realización de la invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos más arriba. El artículo manufacturado comprende un contenedor y una marca. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, las botellas, los viales, las jeringas y los tubos de ensayo. Los contenedores pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para tratar la condición, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es polipéptido WISP. Las marca sobre, o asociada al contenedor indica que la composición se usa para tratar la afección o trastorno escogidos. El artículo manufacturado puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, una solución de Ringer, y una solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del paquete con instrucciones para su uso.
F. Anticuerpos anti-polipéptido WISP
La presente invención describe también anticuerpos anti-polipéptido WISP. Los anticuerpos de ejemplo incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y heteroconjugados.
1. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos anti-polipéptido WISP usados en la presente invención pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos por el especialista capacitado. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante, y, si se desea, de un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido WISP o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a la hemocianina de lapa californiana, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, y el inhibidor de la tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). Alguien formado en el campo puede seleccionar el protocolo de inmunización sin experimentación excesiva.
2. Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos anti-polipéptido WISP pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando los procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón, un hámster, u otro animal apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para elicitar linfocitos que producen, o son capaces de producir, anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante típicamente incluirá el polipéptido WISP o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, o se usan linfocitos de la sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de nódulo linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión apropiado, tal como el PEG, para formar una célula de hibridoma. Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (Nueva York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovinas o de origen humano. Usualmente se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo apropiado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células progenitoras carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluye hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan la expresión estable a nivel elevado del anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma del ratón, las cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito también las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano. Kozbor, J. lmmunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications" (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63.
El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibrido puede ensayarse entonces en busca de la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido WISP. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determinará mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en el campo. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de haberse identificado las células de hibridoma, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares. Goding, ver más arriba. Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridomas pueden hacerse crecer in vivo como ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del fluido de ascites mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, la Proteína A-Sepharose, la cromatografía con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente Estadounidense nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de ratón). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan a continuación a células huéspedes tales como las células COS de mono, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante con dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias homólogas múridas (Patente Estadounidense nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Un polipéptido tal que no es de inmunoglobulina puede sustituirse en lugar de los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse en lugar de los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto de la región Fc con objeto de impedir el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo aminoácidos o se suprimen para prevenir el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro son también apropiados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede conseguirse usando técnicas rutinarias conocidas en el campo.
3. Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos anti-WISP usados en la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como los Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2}, u otras subsecuencias unidoras de antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se sustituyen residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor con residuos de una CDR de una especie que no es humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos estructurales del Fv de la inmunoglobulina humana se remplazan con los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni el las secuencias de la CDR o estructurales importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad o al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina que no es humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquéllas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado preferiblemente comprenderá también al menos una porción de una Fc, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el estado de la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en él procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos se denominan a menudo como residuos "importados", los cuales se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR o secuencias de CDR en lugar de las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente Estadounidense nº 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente procedente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR, y posiblemente algunos residuos de FR, se sustituyen con residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden producirse también usando varias técnicas conocidas en el campo, incluyendo las bibliotecas de exhibición en fago. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos. Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991).
4. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es para un polipéptido WISP, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína de la superficie celular o un receptor o subunidad de receptor.
Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos en el estado de la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes. Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura bioespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se consigue usualmente mediante pasos de cromatografía de afinidad. Se describieron procedimientos similares en WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo al menos parte de las regiones gozne, CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión distintos, y se cotransfectan en un organismo huésped apropiado. Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos consultar, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
5. Anticuerpos heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas (Patente Estadounidense nº 4.676.980), y para el tratamiento de la infección con VIH. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos apropiados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato, y aquéllos descubiertos en la Patente Estadounidense nº 4.676.980.
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G. Usos para los anticuerpos anti-polipéptido WISP
Los anticuerpos pueden usarse como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan sobre una fase sólida tal como una resina SEPHADEX^{TM} o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. El ácido nucleico inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el polipéptido WISP (o un fragmento del mismo) a purificarse, y a continuación se lava el soporte con un solvente apropiado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína WISP, la cual está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente apropiados, tal como un tampón glicina, pH 5,0, que liberará el polipéptido WISP del anticuerpo.
Los anticuerpo anti-polipéptido WISP pueden ser útiles también en ensayos diagnósticos del polipéptido WISP, por ejemplo, la detección de su expresión en células específicas, en tejidos, en el suero. Por tanto, los anticuerpos pueden usarse en la diagnosis de cánceres humanos (consultar, por ejemplo, la Patente Estadounidense nº 5.183.884).
Para las aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente se marcará con un fragmento detectable. Hay numerosas marcas disponibles, las cuales pueden agruparse preferiblemente en las siguientes categorías:
(a)
Radioisótopos, tales como ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H, y ^{131}I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en "Current Protocols in Immunology", Volúmenes 1 y 2, editores Coligen et al. (Wiley-Interscience, Nueva York, 1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse usando el recuento de centelleo.
(b)
Están disponibles las marcas fluorescentes, tales como los quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansilo, la lisamina, la ficoeritrina y el Rojo de Texas. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse al anticuerpo usando, por ejemplo, las técnicas descritas en "Current Protocols in Immunology", ver más arriba, editor Colingen. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.
(c)
Hay varias marcas enzima-sustrato disponible y la Patente Estadounidense nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunas de estas. El enzima preferiblemente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico, la cual puede medirse usando varias técnicas. Por ejemplo, el enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, el cual puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, el enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen más arriba. El sustrato quimioluminiscente para a estar excitado electrónicamente por una reacción química, y puede a continuación emitir luz, la cual puede medirse (usando, por ejemplo, un quimioluminómetro) o donar energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen las lucieferasas (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana; Patente Estadounidense nº 4.737.456), la luciferina, las 2,3-dihidroftalazinedionas, la malato deshidrogenasa, la ureasa, la peroxidasa tal como la peroxidasa de rábano silvestre (HRPO), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima, las sacárido oxidasas (por ejemplo, la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa, y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), las oxidasas heterocíclicas (tales como la uricasa y la xantina oxidasa), la lactoperoxidasa, la microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzym., volúmen 73, editores Langone y Van Vunakis (Nueva York: Academic Press, 1981), pp. 147-166.
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Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen:
(i)
la peroxidasa de rábano silvestre (HRPO) con la hidrógeno peroxidasa como sustrato, en donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor del colorante (por ejemplo, la ortofenilendiamina (OPD), o el 3,3',5,5'-tetrametil bencidina hidrocloruro (TMB));
(ii)
la fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromogénico; y
(iii)
la \beta-D-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa) o un sustrato fluorogénico como la 4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosidasa.
Hay numerosas combinaciones enzima-sustrato disponibles para los especialistas en el campo. Para una revisión general de éstos, consultar, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses nº 4.275.149 y 4.318.980.
A veces, la marca está conjugada indirectamente con el anticuerpo. El especialista capacitado será consciente de varias técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina, y cualquiera de las tres categorías amplias de marcas mencionadas más arriba puede conjugarse a la avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina, y así la marca puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, la digoxina), y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados más arriba se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). Por tanto, puede conseguirse la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo.
En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-polipéptido WISP no necesita estar marcado, y la presencia del mismo puede detectarse usando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo anti-polipéptido WISP.
Los anticuerpos pueden emplearse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos en sándwich directos e indirectos, y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques" (CRC Press, Inc., 1987), pp. 147-158.
Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra de ensayo por la unión a un cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína WISP en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que pasa a estar unido a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que pasa a estar unido, los anticuerpos preferiblemente se insolubilizan antes o después de la competición, de forma que el estándar y el analito que están unidos a los anticuerpos puedan separarse convenientemente del estándar y analito que permanecen sin unir.
Los ensayos en sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica, o epítopo, diferente de la proteína a detectarse. En un ensayo en sándwich, el analito de la muestra de ensayo está unido a un primer anticuerpo, el cual está inmovilizado sobre un soporte sólido, y a continuación un segundo anticuerpo se une al analito, formando de ese modo un complejo insoluble a tres bandas. Consultar, por ejemplo, la Patente Estadounidense nº 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar él mismo marcado con un grupo detectable (ensayos en sándwich directos), o puede medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un grupo detectable (ensayo en sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo en sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el grupo detectable es un enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser fresca o congelada, o puede estar montada en parafina y fijada con un conservante tal como, por ejemplo, la formalina.
Adicionalmente, los anticuerpos anti-polipéptido WISP pueden ser útiles como antagonistas de las funciones del polipéptido WISP, en donde el polipéptido WISP está regulado al alza en las células cancerosas, o estimula su proliferación, o está regulado al alza en el tejido arterioesclerótico. Por consiguiente, por ejemplo, los anticuerpos anti-polipéptido WISP pueden por si mismos, o con un agente quimioterapéutico u otro tratamiento del cáncer, o fármaco tal como los anticuerpos anti-HER-2, puede ser efectivo en el tratamiento de ciertas formas de cáncer, tales como el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer de pulmón, y el melanoma. Otros usos para los anticuerpos incluyen inhibir la unión de un polipéptido WISP a su receptor, si es aplicable, o a un IGF, si es aplicable. Para un uso terapéutico, los anticuerpos pueden usarse en las formulaciones, calendarios, rutas, y dosis indicados más arriba en los usos para los polipéptidos WISP. Además, el anticuerpo anti-polipéptido WISP puede administrarse en la linfa así como en el torrente sanguíneo.
Por una cuestión de comodidad, el anticuerpo anti-WISP de la presente invención puede proporcionarse como un articulo manufacturado, tal como un equipo. Un artículo manufacturado que contiene un polipéptido WISP o un antagonista del mismo útil para el diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos más arriba comprende al menos un contenedor y una etiqueta. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, las botellas, los viales, las jeringas y los tubos de ensayo. Los contenedores pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para diagnosticar o tratar la afección, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica).
El agente activo en la composición es el polipéptido WISP, o un agonista o antagonista del mismo. La etiqueta sobre, o asociada con el contenedor indica que la composición se usa para diagnosticar o tratar la condición escogida. El artículo manufacturado puede comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, una solución de Ringer, y una solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del paquete con instrucciones para su uso. El artículo manufacturado puede comprender además un segundo o tercer contenedor con otro agente activo, tales como se describió más arriba. Un formato de equipo es generalmente una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas, con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico o tratamiento.
Si el agente activo es un anticuerpo que está marcado con un enzima, el equipo incluirá los sustratos y cofactores requeridos por el enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo detectable o fluoróforo). Además, pueden incluirse otros aditivos, tales como los estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis), y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que maximicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que al disolverse proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
Los ejemplos siguientes se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos y sólo para proporcionar información preparatoria, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno.
Ejemplos
Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los Ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los ejemplos siguientes y a lo largo de la memoria, mediante números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc que codifican el WISP-1 de ratón
Se han identificado varios genes de WISP putativos a nivel de ARNm en un experimento de sustracción de ADNc, seleccionado mediante PCR de elevado rendimiento, usando una línea celular mamaria de ratón (C57MG), la cual se había transformado mediante un vector retroviral Wnt1, y se compararon con la línea celular progenitora. La familia del WISP descrita en la presente invención, incluyendo el gen WISP-1 de ratón, se indujo sólo en la línea celular transformada C57MG Wnt-1.
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1. Hibridación sustractiva de supresión
El WISP-1 de ratón se aisló independientemente mediante cribado diferencial de Wnt-1 usando la hibridación sustractiva de supresión (SSH), según se describe en Diatchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6025-6030 (1996). La SSH se llevó a cabo usando el "PCR-SELECT® cDNA Subtraction Kit" (Clontech Laboratories, Inc.) según el protocolo del fabricante. El ADNc conductor de doble hebra (ds) se sintetizó a partir de 2 microgramos de poli-A+ARN aislado de una línea celular mamaria de ratón (C57MG), que puede conseguirse de una línea celular mioepitelial de cáncer de mama de ratón. Esta línea celular se describe en Brown et al., Cell, 46:1001-1009 (1986); Olson and Papkoff, Cell Growth and Differentiation, 5:197-206 (1994); Wong et al., Mol. Cell. Biol., 14:6278-6286 (1994); y Jue et al., Mol. Cell. Biol., 12:321-328 (1992), y responde al Wnt-1 pero no al Wnt-4. El ds-ADNc probador se sintetizó a partir de 2 microgramos de poli-A+ARN aislado de una versión transformada de la C57MG, denominada C57MG/wnt-1.
La línea celular derivada mamaria de ratón C37MG/wnt-1 se preparó transformando primero la línea progenitora con un vector retroviral Wnt-1, pBabe Puro (5,1 kb). Este vector tiene una LTR 5', elementos de empaquetado, un sitio de clonación múltiple, el gen de la resistencia a la puromician dirigido del promotor de SV40, una LTR 3', y los elementos bacterianos para la replicación y la selección con ampicilina. El vector se modificó ligeramente para la clonación de Wnt-1 eliminando el sitio HindIII después del promotor de SV40, y añadiendo un sitio HindIII al sitio de clonación múltiple. El Wnt-1 se clonó del EcoRI-HindIII en el sitio de clonación múltiple. La Figura 13 muestra un mapa del vector.
Las células derivadas transformadas se cultivaron de forma convencional, y la población celular final se seleccionó en DMEM + 10% de FCS, con 2,5 mg/ml de puromicina para estabilizar el vector de expresión.
La PCR se realizó usando el equipo Clontech, incluyendo el cebador de síntesis de ADNc (SEC Nº ID.: 40), los adaptadores 1 y 2 (SEC Nº ID.: 41 y 42, respectivamente) y las secuencias complementarias para los adaptadores (SEC Nº ID.: 43 y 44, respectivamente), el cebador 1 para la PCR (SEC Nº ID.: 45), el cebador 2 para la PCR (SEC Nº ID.: 46), el cebador 1 para la PCR con cebadores internos (SEC Nº ID.: 47), el cebador 2 para la PCR con cebadores internos (SEC Nº ID.: 48), el cebador G3PDH 5' como cebador control (SEC Nº ID.: 49), y el cebador G3PDH 3' como cebador control (SEC Nº ID.: 50), mostrados en la Figura 14.
Los productos generados de la reacción de PCR secundaria se insertaron en la región del sitio de clonación del vector pGEM-T (Promega), mostrado en la Figura 15 (respectivamente SEC. Nº ID.: 51 y 52 para las secuencias 5' y 3'). Los ADN plasmídicos se prepararon usando el equipo WIZARD MINIPREP^{TM} (Promega). La secuenciación del ADN de los fragmentos de PCR subclonados se realizó manualmente mediante la reacción de terminación de la cadena (equipo SEQUENASE2.0^{TM}, Pharmacia). Las búsquedas de homología de ácido nucleico se realizaron usando el programa BLAST mencionado más arriba.
Se secuenciaron un total de 1384 clones de los más de 5000 hallados. Se prepararon un total de 1996 plantillas de ADN. Se usó un programa para recortar el vector, y se usó un programa diferente para agrupar los clones en dos o más clones idénticos, o con un solapamiento de 50 bases el mismo. A continuación se realizó un BLAST de un clon representativo del grupo. Los cebadores se diseñaron para RT-PCR para ver si los clones se expresaban diferencialmente.
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2. RT-PCR semicuantitativa
Uno de los clones era el clon 568 que tiene 71 bp, el cual se identificó que codifica el WISP-1 de ratón. Había seis clones en este grupo. La secuencia de nucleótidos y la secuencia putativa de aminoácidos del WISP-1 de ratón de longitud completa se muestran en la Figura 1 (SEC Nº ID.: 9 y 12, respectivamente). Los cebadores de la RT-PCR se diseñaron para confirmar la expresión diferencial, para cribar en busca del clon de ratón de longitud completa, y para cribar en busca del clon humano. Estos cebadores eran el 568.PCR.top 1 (nucleótidos 909-932 de la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica el WISP-1 de ratón (SEC. Nº ID.: 9) de la Figura 1) y el 568.PCR.botI (nucleótidos 955-978 de la secuencia de nucleótidos complementaria de longitud completa que codifica el WISP-1 de ratón (SEC. Nº ID.: 101 de la Figura 1), los cuales son como sigue:
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568.PCR.top1: 5'-CCAGCCAGAGGAGGCCACGAAC (SEC. Nº ID.: 100)
568.PCR.bot1: 3'-TGTGCGTGGATGGCTGGGTTCATG (SEC. Nº ID.: 101)
Para el procedimiento de la RT-PCR, las líneas celulares se hicieron crecer hasta la subconfluencia antes de extraer el ARN. El ARN total se extrajo usando Stat-60^{TM} (TEL-TEST^{TM} B) según las instrucciones del fabricante. El ADNc de la primera hebra se preparó a partir de 0,1 mg-3 mg de ARN total con el equipo de RT SUPERSCRIPT^{TM} (Gibco, BRL). La amplificación mediante PCR de 5 ml de ADNc de la primera hebra se realizó en una reacción de PCR de 50 ml. Los cebadores anteriores su usaron para amplificar el ADNc de la primera hebra. Como controles, se usaron los cebadores que correspondían a las posiciones de nucleótidos 707-729 (codificante; 5'-GTGGCCCATGCTCTGGCA
GAGGG (SEC. Nº ID.: 102)) ó 836-859 (codificante; 5'-GACTGGAGCAAGGTCGTCCTCGCC (SEC. Nº ID.: 103)) y 1048-1071 (no codificante: 5'-GCACCACCCACAAGGAAGCCATCC (SEC. Nº ID.: 104)) de la triosafosfato isomerasa humana (huTPI) (Maquat et al., J. Biol. Chem., 260:3748-3753 (1985); Brown et al., Mol. Cell. Biol., 5:1694-1706 (1985)) para amplificar el ADNc de la primera hebra. Para la triosafosfato isomerasa de ratón, se usaron los cebadores correspondientes a las posiciones de nucleótidos 433-456 (codificante: 5'-GACGAAAGGGAAGCCGG
CATCACC (SEC. Nº ID.: 105)) ó 457-480 bp (codificante:5'-GAGAAGGTCGTGTTCGAGCAAACC (SEC. Nº ID.: 106)) y 577-600 bp (no codificante: 5'-CTTCTCGTGTACTTCCTGTGCCTG (SEC. Nº ID.: 107)) ó 694-717 bp (no codificante: 5'-CACGTCAGCTGGCGTTGCCAGCTC (SEC. Nº ID.: 108)) para la amplificación.
En resumen, se añadieron 4 mCi de (^{32}P-)CTP (3000 Ci/mmol) a cada reacción con 2,5 U de TAKARA EX TAQ^{TM} (Panvera, Madison, WI) y 0,2 mM de cada dNTP. Las reacciones se amplificaron en un 480 PCR THERMOCYCLER^{TM} (Perkin Elmer) usando las condiciones siguientes: 94ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, durante 18-25 ciclos. 5 ml de los productos de la PCR se electroforesaron sobre un gel de poliacrilamida al 6%. El gel se expuso a película. La mediciones de densitometría se obtuvieron usando el programa ALPHA EASE VERSION 3.3a^{TM} (Alpha Innotech Corporation) para cuantificar los productos de genes específicos del WISP o TPI.
3. Análisis de transferencia Northern
Se hibridaron las transferencias Northern de múltiples tejidos de adulto (Clontech) y la transferencia Northern de los poliA+ARN de la C57MG progenitora y de la C57MG/Wnt1 derivada (2 mg/carril) con una sonda de WISP-1 de ratón de 70-bp (aminoácidos 278 a 300 de la Figura 1; QPEEATNFTLAGCVSTRTYRPKY: SEC. Nº ID.: 109) generada usando los cebadores 568.PCR.top1 y 568.pcr.bot1 mencionados más arriba. Las membranas se lavaron en 0,1\times SSC a 55-65ºC y se expusieron para autoradiografía. Las transferencias se hibridaron de nuevo con una sonda sintética de 75-bp procedente del gen humano de la actina. Consultar Godowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8083-8087 (1989) para un procedimiento para preparar uan sonda con oligonucleótidos que se solapan, que es como se preparó la sonda de actina.
4. Cribado de la biblioteca de ADNc
Los clones que codificaban el WISP-1 de ratón de longitud completa se aislaron cribando una biblioteca embrionaria de ratón, cebada con \lambdagt10 oligodT (Clontech), con los cebadores 568.PCR.top1 y 568.PCR.bot1 mencionados más arriba. Los insertos de 13 de estos clones se subclonaron en pBLUESCRIPT^{TM} IISK+ y sus secuencias de ADN se determinaron mediante la secuenciación de ADN didesoxi de ambas hebras.
5. Resultados
La técnica recientemente descrita de la SSH combina una elevada eficiente de sustracción con una representación ecualizada de secuencias expresadas diferencialmente. Este procedimiento se basa en reacciones PCR específicas que permiten la amplificación exponencial de los ADNc que difieren en su abundancia, mientras que se suprime la amplificación de las secuencias de idéntica abundancia en dos poblaciones. La técnica de la SSH se usó en la presente invención para aislar genes expresados en una célula mioepitelial mamaria de ratón transformada con Wnt-1, cuya expresión está reducida o ausente en la célula mioepitelial progenitora. El poliA+RNA extraído de ambos tipos de células se usó para sintetizar los ADNc probador y conductor. El grado de eficiencia de sustracción se monitorizó mediante análisis de transferencia Southern de los productos de la PCR sin sustraer y sustraída, usando una sonda de \beta-actina.
No se observó ARNm de \beta-actina en los productos de la PCR sustraída, confirmando la eficiencia de la sustracción.
La biblioteca de ADNc sustraído se subclonó en un vector pGEM-T para su ulterior análisis. Se secuenció una muestra aleatoria de 1996 clones procedentes de las colonias transformadas obtenidas. Para determinar si los clones obtenidos se expresaban diferencialmente, se diseñaron cebadores de PCR para clones seleccionados, y se realizaron RT-PCR semicuantitativas y análisis Northern usando ARNm procedente de la línea celular mamaria de ratón y sus derivados. Se halló que la expresión del Wnt-1 en células C57MG conduce a una morfología celular alargada y a la pérdida de inhibición por contacto.
Se halló que un clon (m568.19A) de los que cumplía los criterios para la expresión diferencial codificaba el WISP-1 de ratón de longitud completa. Mediante ambos, análisis con RT-PCR y análisis Northern, se halló que este clon proporcionaba una inducción de aproximadamente tres veces en la línea celular Wnt-1 respecto la línea celular progenitora.
La secuencia de ADNc de este clon y la secuencia de aminoácidos deducida del WISP-1 de ratón de longitud completa se muestran en la Figura 1 (SEC Nº ID.: 9 y 12, respectivamente). El alineamiento de la secuencia del WISP-1 humano y de ratón (SEC. Nº ID.: 4 y 12, respectivamente) se muestra en la Figura 8. El análisis in situ del clon se presenta más abajo, junto con los resultados del ensayo de incorporación de la timidina y del ensayo
angiostático.
Este clon se colocó en pRK5E, un vector de clonación derivado de E. coli que tiene un promotor del gen temprano intermedio del citomegalovirus humano, un origen de SV40, y un sitio poliA, un sitio de inicio de la transcripción sp6, un aceptor de ayuste de inmunoglobulina, y sitios de clonación de ADNc XhoI/NotI. Es una progenie de pRKSD que tiene un sitio SceI añadido. Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991). Después de su transformación en células JM 109, el plásmido convirtió las células en resistentes a la ampicilina. Después de su digestión con XbaI y BamHI, se obtuvo un fragmento de 1140-pb, y el tamaño del inserto de ratón era de 1122 pares de bases, desde el ATG hasta el codón de paro, incluyendo una etiqueta 3' de seis histidinas.
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Ejemplo 2 Aislamiento de un clon de ADNc que codifica el WISP-2 de ratón
El WISP-2 de ratón se aisló independientemente mediante cribado diferencial de Wnt-1 usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El clon inicial aislado tenía 318 pb de longitud y se denominó clon 1367. Había cuatro clones en este grupo. El clon se secuenció tal y como se ha descrito más arriba y los cebadores de la RT-PCR se diseñaron como sigue:
1367.pcr.top1: nucleótidos 1604-1627 de la Figura 2:
3'-GGTGTGAAGACCGTCCGGTCCCGG
(SEC. Nº ID.: 110)
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y
1367.pcr.bot1: nucleótidos 1438-1461 de la Figura 2:
5'-GTGTGCCTTTCCTGATCTGAGAAC
(SEC. Nº ID.: 111).
A continuación, se realizaron los procedimientos de RT-PCR y transferencia Northern como se describen en el Ejemplo 1 para confirmar la expresión diferencial, se observó una inducción de cinco veces en la línea celular de
Wnt-1.
A partir de la biblioteca 211 de ARN se aislaron los clones que codificaban el WISP-2 de ratón de longitud completa: C57MG/Wnt-1. El ARNm para la construcción de esta biblioteca se aisló a partir de la línea celular C57MG/Wnt-I descrita en el Ejemplo 1. El ARN se usó para generar una biblioteca de ADNc cebada con oligo-dT, en el vector de clonación pRK5E, usando reactivos y protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, MD (SUPERSCRIPT PLASMID SYSTEM^{TM}).
En este procedimiento, el ADNc de doble hebra se cebó con oligo-dT que contenía un sitio NotI, se unió a adaptadores de extremo romo-SalI hemiquinasados, se cortó con NotI, se separó apropiadamente por tamaño mayor de 1000-pb mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector pRK5E cortado con XhoI/NotI. La biblioteca se cribó mediante hibridación de colonias con una sonda 1367.50mer.1 de las bases 1463-1512 de la Figura 2: 3'-GGGACGGGC-CGACCCTTCTTAAAAGACCCTTGTACTTCTCTACCTTAGTG (SEC. Nº ID.: 112). Se obtuvo el clon del WISP-2 de ratón de longitud completa, denominado clon 1367.3.
El ADNc del WISP-2 de ratón, al igual que la molécula de WISP-1, codifica una nueva proteína secretada que pertenece a la familia del CTGF y es la homóloga en ratón de la SST DNA33473 del Ejemplo 4. (El alineamiento del WISP-2 humano y de ratón (SEC. Nº ID.: 16 y 20, respectivamente) se muestra en la Figura 9. El gen WISP-2 de ratón era un 38% idéntico en su secuencia al WISP-1 de ratón descrito en el Ejemplo 1, pero carece de los 95 aminoácidos C-terminales que se cree están implicados en la dimerización y unión al receptor. El WISP-2 de ratón se expresaba elevadamente en el pulmón. El análisis in situ del clon se menciona más abajo. La secuencia de nucleótidos y la secuencia putativa de aminoácidos del WISP-2 de ratón de longitud completa se muestran en la Figura 2 (SEC Nº ID.: 17 y 20, respectivamente). La secuencia señal putativa está entre los residuos aminoácidos 1 a 23 de la SEC Nº ID.: 20.
El clon se insertó en el pRK5E descrito más arriba. Después de la transformación de las células JM 109, el plásmido convirtió las células en resistentes a la ampicilina. Después de su digestión con BamHI y NotI, se obtuvo un fragmento de 1770-pb, que tenía un inserto de ratón de 756-pb, desde el ATG hasta el codón de paro. Ejemplo 3: Aislamiento de un clon de ADNc que codifica el WISP-1 humano.
\newpage
Para aislar el clon de longitud completa correspondiente al m568.19A (WISP-1 de ratón), se cribó una biblioteca de ADNc de pulmón humano (Clontech), tratada con el equipo SUPERSCRIPT^{TM} usando el vector pRK5E según se describió más arriba, con una sonda de 70-pb a baja rigurosidad (lavado con 20% de formamida, 1\times SSC, 55ºC). La sonda tenía la secuencia de los nucleótidos 909-978 de la secuencia nucleotídica del WISP-1 de ratón de longitud completa de la Figura 1, es decir, la secuencia:
5'-CCAGCCAGAGGAGGCCACGAACTTCACTCTCGCAGGCTGT
\hskip0,35cm GTCAGCACACGCACCTACC GACCCAAGTAC (SEC. Nº ID.: 113)
Sólo se identificó un clon, el hL.568.15A. El inserto de este clon se subclonó en pBLUESCRIPT^{TM} IISK+, y se determinó su secuencia de ADN mediante la secuenciación de ADN didesoxi de ambas hebras. Se halló que este clon carecía de aproximadamente 280 aminoácidos. Por tanto, se diseñó una nueva sonda (hu.568.50mer.1) a partir del clon 15A que tenía los nucleótidos 750-799 de la secuencia nucleotídica del WISP-1 humano de longitud completa mostrada en las Figuras 3 y 3B, es decir,
5'-GCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCC
\hskip0,35cm TGGGGGTCTCCACTCGG (SEC Nº ID.: 114).
Esta sonda se usó para cribar una biblioteca de ADNc reñal fetal humana (Clontech), tratada con el equipo SUPERSCRIPT^{TM} usando el vector pRK5E según se describió más arriba, mediante hibridación de colonia. se obtuvo un cierto número de clones mediante el cribado de esta biblioteca de ADNc renal fetal humana (clones sin la denominación A o B), o mediante el cribado de una biblioteca \lambdagt10 renal fetal humana (clones con la denominación A o B), usando las mismas sondas descritas más arriba. Los insertos de estos clones se subclonaron en pBLUESCRIPT^{TM} IISK+, y sus secuencias de ADN se determinaron mediante la secuenciación de ADN didesoxi de ambas hebras.
Dos de estos clones, denominados 568.1A y 568.4A, tienen sus respectivas secuencias (SEC Nº ID.: 24 y 26) mostradas en las Figuras 27 y 29. Estos clones carecían del dominio C1 de von Willebrand, del dominio variable, y del dominio I de trombospondina, y tenían un desplazamiento del marco de lectura. Se obtuvieron otros clones, denominados como 568.13, 568.39, 568.5A, 568.6B, y 568.7 (SEC Nº ID.: 23, 25, 27, 28, y 29, respectivamente; Figuras 26, 28 y 30-32, respectivamente), que carecían de uno o más dominios y/o de tramos cortos de aminoácidos (por ejemplo, una supresión de 8 aminoácidos), o que contenían tramos cortos adicionales de aminoácidos, y podían contener intrones o variantes de ayuste alternativas.
Se identificaron dos clones compartían una cantidad significativa de secuencia con el clon 568.38 de longitud completa: 568.23 y 568.35. El clon humano 568.38 codificaba el WISP-1 humano de longitud completa. La secuencia de nucleótidos y la secuencia putativa de aminoácidos del clon 568.38 se muestran en las Figuras 3A y 3B (SEC Nº ID.: 1 y 4, respectivamente). Las secuencias alineadas de los clones 568.38 y 568.35 difieren de las correspondientes secuencias alineadas de los clones 568.15A y 568.23 en que las respectivas secuencias de estos últimos dos clones tienen un residuo isoleucina en la posición del aminoácido 184 de las Figuras 3A y 3B, mientras que las respectivas secuencias correspondientes de los clones 568.38 y 568.35 tienen un residuo valina en esta posición. Además, las secuencias alineadas de los clones 568.35 y 568.38 difieren entre ellas en que la secuencia del clon 568.35 tiene un residuo serina en la posición del aminoácido 202 de las Figuras 3A y 3B, mientras que la secuencia correspondiente del clon 568.38 tiene un residuo alanina en esta posición.
Se halló, mediante búsqueda de homología, que el polipéptido WISP-1 humano es también un miembro de la familia del CTGF. El clon se colocó en un plásmido pRK5E según se describió más arriba, y se depositó en la ATCC. Después de su transformación en células JM109, el plásmido convirtió las células en resistentes a la ampicilina. La digestión con CluI y EcoRV rindió un fragmento de 1435-pb con un tamaño de inserto de 1104 pares de bases desde el ATG hasta el codón de paro.
Se llevó a cabo la hibridación in situ del WISP-1 humano, con los resultados proporcionados más abajo. El análisis Northern del WISP-1 humano mostró una elevada expresión en el tejido cardíaco y tejido ovárico adultos, y en el tejido renal fetal. También se presenta más abajo el ensayo de incorporación de la timidina, el ensayo de amplificación del gen, y el ensayo angiostático.
La ubicación cromosómica de los genes del WISP humano se determinó mediante mapeado del hibrido de radiación usando los paneles Stanford G3^{TM} y MIT Genebridge 4 Radiation Hybrid^{TM}. El WISP-1 reside a aproximadamente 3,48 cR del marcador meiótico AFM259xc5 (puntuación LOD 16,31) en el mapa Genebridge. Esto coloca al WISP-1 en la banda 8q24.1 a 8q24.3, aproximadamente a cuatro megabases de distancial del c-myc ubicado en la banda cromosómica 8q24.12-8q24.13. Takahashi et al., Cytogenet. Cell Genet., 57:109-111 (1991), el c-myc es una región que es un sitio recurrente de amplificación en el carcinoma pulmonar de células no pequeñas.
Ejemplo 4 Aislamiento de un clon de ADNc que codifica el PRO261 humano (denominado en la presente invención como WISP-2 humano)
Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluyendo la señal de secreción, si había alguna), procedentes de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos pública de proteínas SWISS-PROT^{TM} se usaron para buscar bases de datos de etiquetas de secuencia expresadas (EST). Las bases de datos de EST incluían bases de datos de EST públicas databases (por ejemplo, GenBank) y una base de datos privada de ADN de EST (LIFESEQ^{TM} Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó, usando el programa de ordenador BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)), como una comparación de las secuencias de proteína ECD respecto la traducción de las seis pautas de lectura de la secuencia EST. Aquellas comparaciones que resultaban en una puntuación de BLAST de 70 (en algunos casos 90) ó más, y que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en secuencias ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington); http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).
Se ensambló una secuencia de ADN consenso relacionada con otras secuencias EST usando phrap. Las secuencias EST usadas (de Incyte) eran las nº 2633736, 2118874, 360014, 2316216, 1985573, 2599326, 1544634, 2659601, 1319684, 783649, 627240, 1962606, 2369125, 939761, 1666205, 692911, 984510, 1985843, 2104709, y 2120142. Esta secuencia consenso se designa en la presente invención como DNA30843 (consultar la Figura 5). Basándose en la secuencia consenso DNA30843, se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar mediante la PCR una biblioteca de ADNc que contuviera la secuencia de interés, y 2) para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa del PRO261 (WISP-2 humano). Se sintetizaron un par de cebadores de la PCR, hacia adelante y hacia atrás, que tenían las respectivas secuencias:
5'-AAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCC (SEC Nº ID.: 115) y
3'-TCCAGTCGGCAGAAGCGGTTCTGG (SEC Nº ID.: 116).
Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridación de oligonucleótidos sintética a partir de la secuencia consenso DNA30843, sonda que tenían la siguiente secuencia:
5'-CCTGGTGCTGGATGGCTGTGGCTGCTGCCGGGTATGTGC
\hskip0,35cm ACGGCGGCTGGG (SEC Nº ID.: 117).
Para cribar varias bibliotecas en busca de una fuente de un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación con la PCR, tal como en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989), con el par de cebadores de la PCR identificados más arriba. A continuación se cribó una biblioteca positiva mediante hibridación de colonias para aislar clones que codificaran el PRO261 (WISP-2 humano) usando la sonda de oligonucleótidos y uno de los cebadores de la
PCR.
El ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc se aisló a partir de tejido pulmonar fetal humano. Las bibliotecas de ADNc usadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándares usando reactivos disponibles comercialmente, tales como los procedentes de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo-dT que contenía un sitio NotI, se unió a adaptadores de extremo romo-SalI hemiquinasados, se cortó con NotI, se calibró su tamaño convenientemente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación apropiado (tal como el pRK5B o pRK5D; el pRK5B es un precursor del pRK5D que no contiene el sitio SfiI; consultar, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991), en los únicos sitios XhoI
y NotI.
La secuenciación del ADN de los clones aislados tal como se describió más arriba proporcionó la secuencia de ADN para la PRO261 [denominada en la presente invención como UNQ228 (DNA33473-seqmin)] (SEC. Nº ID.: 1), y la secuencia de proteína derivada para el PRO261 (SEC. Nº ID.: 16).
La secuencia nucleotídica entera que codifica el WISP-2 humano se muestra en la Figura 4 (SEC. Nº ID.: 13). Esta secuencia contiene un único marco de lectura abierto con un sitio aparente de inicio de la traducción en las posiciones de nucleótidos 22-24 de la SEC. Nº ID.: 13, y finaliza en el codón de paro después del nucleótido 770 de la SEC. Nº ID.: 13 (Figura 4). El precursor polipeptídico predicho tiene 250 aminoácidos de longitud (Figura 4). La secuencia señal putativa abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 23 de la SEC Nº ID.: 16. El clon UNQ228 (DNA33473-seq min) se ha depositado en la ATCC, y tiene asignado el nº de depósito en la ATCC: 209391.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO261 de longitud completa sugiere que ciertas partes de él poseen homología significativa con el CTGF, indicando por tanto que el PRO261 es un nuevo factor de crecimiento.
La hibridación in situ del WISP-2 humano se indica más abajo. La ubicación cromosómica del gen WISP-2 humano se determinó como se ha descrito más arriba para el WISP-1. Específicamente, el WISP-2 está vinculado al marcador SHGC-33922, con una puntuación LOD de 1000. Esto coloca el WISP-2 en la banda 20q12-20q13.1. El 20q12 del cromosoma humano es un sitio frecuente de amplificación del ADN en el cáncer de mama humano. En un ensayo en Xenopus, la inyección de ARN de WISP-2 humano indujo parcialmente la duplicación del eje (ver Ejemplo 11). También se presenta más abajo el ensayo de incorporación de timidina, el ensayo de amplificación del gen, y el ensayo angiostático para el WISP-2 humano.
Ejemplo 5 Aislamiento de clones de ADNc que codifican el WISP-3 humano
En este ejemplo, el gen que codifica el WISP-3 se clonó dos veces, esencialmente en paralelo. Primero, se determinó si las bases de datos descritas más arriba contenían cualesquier nuevos miembros de la familia WISP. Se hallaron dos homologías de EST con los WISP, y ambas se clonaron. Se aislaron clones de longitud completa que correspondían a cada una de estas homologías. Los esfuerzos resultaron en dos clones de longitud completa del mismo gen (las homologías EST originales procedían de dos regiones distintas del mismo gen). El primer clon obtenido se denominó DNA56350 y el segundo DNA58800.
Basándose en la secuencia de INCYTE 3208053, se obtuvo un ADN 48917 virtual, y se sintetizaron oligonucleótidos para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa del PRO956 (WISP-3 humano). Se sintetizaron un par de cebadores de la PCR, hacia adelante y hacia atrás, que tenían las secuencias:
5'-GTCTTGTGCAAGCAACAAAATGGACTCC (SEC Nº ID.: 118)
3'-GACACAATGTAAGTCGGAACGCTGTCG (SEC Nº ID.: 119)
Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridación de oligonucleótidos sintética a partir de la secuencia
INCYTE, sonda que tenía la siguiente secuencia:
5'-GCTCCAGAACATGTGGGATGGGAATATCTAACAGGG
\hskip0,35cm TGACCAATGAAAAC (SEC Nº ID.: 120)
Se cribó una biblioteca renal fetal humana cebada con oligo-dT, que contenía un corte de sitio XhoI-NotI mayor de 3700-kb, en busca de una fuente de un clon de longitud completa para amplificación mediante PCR con el par de cebadores de la PCR identificado más arriba. La biblioteca positiva se usó a continuación para aislar clones que codificaban el gen del PRO956 (WISP-3 humano) usando la sonda de oligonucleótidos y uno de los cebadores de la PCR.
La secuenciación del ADN del clone aislado tal como se describió más arriba proporcionó la secuencia de ADN para el PRO956 [denominada en la presente invención como UNQ462 (SEQ ID NO: 30) y la secuencia de aminoácidos derivada para el PRO956 (SEQ ID NO: 33).
La secuencia nucleotídica entera que codifica el WISP-3 humano procedente de este clon se muestra en la Figura 6 (SEC. Nº ID.: 30). Esta secuencia contiene un único marco de lectura abierto con un sitio aparente de inicio de la traducción en las posiciones de nucleótidos 46-48 de la SEC. Nº ID.: 30, y finaliza en el codón de paro después del nucleótido 1161 de la SEC. Nº ID.: 30 (Figura 6). El precursor polipeptídico predicho tiene 372 aminoácidos de longitud (Figura 6). La secuencia señal putativa abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 33 de la SEC Nº ID.: 33. El clon UNQ462 (DNA56350-1176-2) se ha depositado en la ATCC, y tiene asignado el nº de depósito en la ATCC: 209706.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO956 de longitud completa sugiere que ciertas partes de él poseen homología significativa con el CTGF, indicando por tanto que el PRO956 es un nuevo factor de crecimiento. Este clon tiene una metionina adicional justo 5' de la primera metionina en este clon. La secuencia de aminoácidos de este clone es un 42% homóloga con la del WISP-1 humano, y un 32% homóloga con la del WISP-2 humano.
La hibridación in situ del WISP-3 humano se indica más abajo. Usando las técnicas de mapeado destalladas más arriba, se halló que el WISP-3 humano está localizado en el cromosoma 6q22-6q23 y que está unido al marcador AFM211ze5 con una puntuación LOD de 1000. El WISP-3 está aproximadamente 18 megabases proximal al CTGF, y 23 megabases proximal al oncogén celular humano MYB, los cuales están ubicados también en 6q22-6q23. Martinerie et al., Oncogene, 7:2529-2534 (1992); Meese et al., Genes Chromosomes Cancer, 1:88-94 (1989).
El clon se insertó en el pRK5E descrito más arriba. Después de la transformación de las células JM 109, el plásmido convirtió las células en resistentes a la ampicilina. Después de su digestión con BamHI y NotI, se obtuvo un fragmento que tenía un inserto de humano desde el ATG hasta el codón de paro, tal y como se indica en la Figura 6.
Basándose en la secuencia de HS 142L7, se obtuvo un ADN 56506 virtual, y se sintetizaron oligonucleótidos para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa del PR0790 (WISP-3 humano). Con esta finalidad, se sintetizaron un par de cebadores de la PCR, hacia adelante y hacia atrás, que tenían las secuencias:
5'-CCTGGAGTGAGCCTGGTGAGAGA (SEC. Nº ID.: 121)
3'-ACACTGGGTGTGTTTCCCGACATAACA (SEC. Nº ID.: 122).
Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridación de oligonucleótidos sintética a partir de la secuencia HS142L7, sonda que tenía la siguiente secuencia:
5'-TGGTTGCTTGGCACAGATTTTACAGCATCCACAGCCATCTCTCA (SEC. Nº ID.: 123)
Se cribó una biblioteca de médula ósea humana cebada con oligo-dT, que contenía un corte de sitio XhoI-NotI de 1-3 kb, en busca de una fuente de un clon de longitud completa mediante PCR con el par de cebadores de la PCR identificado más arriba. La biblioteca positiva se usó a continuación para aislar clones que codificaban el gen del PRO790 (WISP-3 humano) usando la sonda de oligonucleótidos y uno de los cebadores de la PCR.
La secuenciación del ADN del clone aislado tal como se describió más arriba proporcionó la secuencia de ADN para el PRO790 (SEC. Nº ID.: 34) y la secuencia de aminoácidos derivada para el PRO790 (SEC. Nº ID.: 37).
La secuencia nucleotídica entera que codifica el WISP-3 humano procedente de este clon se muestra en la Figura 7 (SEC. Nº ID.: 34). Esta secuencia contiene un único marco de lectura abierto con un sitio aparente de inicio de la traducción en las posiciones de nucleótidos 16-18 de la SEC. Nº ID.: 34, y finaliza en el codón de paro después del nucleótido 1077 de la SEC. Nº ID.: 34 (Figura 7). El precursor polipeptídico predicho tiene 355 aminoácidos de longitud (Figura 7). La secuencia señal putativa abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 15 de la SEC Nº ID.: 37. El clon DNA58800-1176-2 se ha depositado en la ATCC, y tiene asignado el nº de depósito en la ATCC: 209707.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO790 de longitud completa sugiere que ciertas partes de él poseen homología significativa con el CTGF, indicando por tanto que, al igual que el PRO956, el cual es una variante de ayuste suya, el PRO790 es un nuevo factor de crecimiento.
La hibridación in situ del WISP-3 humano se indica más abajo.
El clon se insertó en el pRK5E descrito más arriba. Después de la transformación de las células JM 109, el plásmido convirtió las células en resistentes a la ampicilina. Después de su digestión con BamHI y NotI, se obtuvo un fragmento que tenía un inserto de humano desde el ATG hasta el codón de paro, tal y como se indica en la Figura 7.
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Ejemplo 6 Uso del ADN que codifica el WISP como una sonda de hibridación
El procedimiento siguiente describe el uso como sonda de hibridación de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido WISP.
El ADN que comprende la secuencia codificante del WISP-1 humano, maduro, de longitud completa (tal como se muestra respectivamente en las Figuras 3A y 3B, SEC Nº ID.: 4 ó 3), o el WISP-1 de ratón, maduro, de longitud completa (tal como se muestra en la Figura 1, respectivamente SEC Nº ID.: 12 ó 11), o el WISP-2 humano, maduro, putativo o de longitud completa (tal como se muestra en la Figura 4, respectivamente SEC Nº ID.: 16 ó 15), o el WISP-2 de ratón, maduro, putativo o de longitud completa (tal como se muestra en la Figura 2, respectivamente SEC Nº ID.: 20 ó 19), se emplea como una sonda para cribar en busca de ADN homólogos (tales como los que codifican variantes que ocurren de forma natural de estas proteínas WISP concretas en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas humanas.
La hibridación y el lavado de los filtros que contienen cualquiera de las bibliotecas de ADN se realizó en las siguientes condiciones de rigurosidad. La hibridación de la sonda derivada de polipéptido WISP radiomarcada (tal como las sondas derivadas del UNQ228 (DNA33473-seqmin)) a los filtros se realizó en una solución de formamida al 50%, 5\times SSC, 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato sódico, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2\times solución de Denhardt, y 10% de sulfato dextrano, a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realizó en una solución acuosa de 0,1\times SSC y 0,1% de SDS a 42ºC.
Los ADN que tienen la identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica un polipéptido WISP de secuencia nativa y longitud completa pueden identificarse usando técnicas estándares conocidas en el estado de la técnica.
Ejemplo 7 Expresión del polipéptido WISP en E. coli
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada del polipéptido WISP mediante expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido WISP se amplifica inicialmente usando cebadores de la PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Pueden emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector apropiado es el pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) el cual contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con el enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas mediante la PCR se ligan a continuación en el vector. El vector preferiblemente contendrá secuencias que codifican un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, la secuencia polihis, y el sitio de corte per enteroquinasa), la región codificante de WISP, el terminador de la transcripción lambda, y un gen argU.
La mezcla de ligación se usa a continuación para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los procedimientos descritos en Sambrook et al., ver más arriba. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas LB y a continuación se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN plasmídico puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación del ADN.
Los clones seleccionados pueden dejarse crecer en medio de cultivo líquido, tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo nocturno puede usarse subsiguientemente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se hacen crecer hasta una densidad óptica deseada, durante el crecimiento el promotor de la expresión está activado.
Después de cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. El precipitado de células obtenido mediante la centrifugación puede solubilizarse usando varios agentes conocidos en la técnica, y el polipéptido WISP puede purificarse entonces usando una columna quelante de metales en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
Ejemplo 8 Expresión del polipéptido WISP en células de mamífero
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada del polipéptido WISP mediante la expresión recombinante en células de mamífero.
Como vector de expresión se empleó el vector pRK5E. El ADN apropiado que codificaba el polipéptido WISP se ligó en el pRK5E con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN del polipéptido WISP usando procedimientos de ligación como los descritos en Sambrook et al., ver más arriba. Los vectores resultantes fueron el pRK5E.h.WIG-1.568.38, el pRK5E.m.WIG-1.568.6his, el pRK5E.m.WIG-2.1367.3, plásmido que codificaba el WISP-2 humano, el DNA56350-1176-2, y el DNA58800-1176-2, todos depositados en el ATCC. Estos vectors se denominan convenientemente de forma colectiva como pRK5E.WISP en la descripción general siguiente.
En una realización, las células huéspedes seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta su confluencia en placas de cultivo de tejidos, en medios tales como el DMEM suplementado con suero fetal bovino y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos. Aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5E WISP se mezclan con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen VA RNA (Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)) y se disolvieron en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM y CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se le añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 segundos. A continuación, se lavan las células 293 con medio sin suero, se añade medio reciente, y se incuban las células durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 después de las transfecciones, el medio de cultivo se retira y se remplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio condicionado se recolecta, se concentra en un spin-filtro, y se carga sobre un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido WISP. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se ensaya en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido WISP puede introducirse en transitoriamente en células 293 usando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se hacen crecer células 293 hasta la densidad máxima en un frasco con agitador, y se añaden 700 \mug de ADN pRK5E.WISP. Las células se concentran primero a partir del frasco con agitador mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre el precipitado de células durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos, y se reintrodujeron en el frasco rotatorio que contenía medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y filtra para eliminar las células y los restos. La muestra que contiene el polipéptido WISP expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tales como la diálisis y/o la cromatografía en columna.
En otra realización, el polipéptido WISP puede expresarse en células CHO. El pRK5.WISP puede transfectarse al interior de células CHO usando reactivos conocidos tales como el CaPO_{4} o el DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito más arriba, los cultivos de células pueden incubarse, y el medio remplazarse con medio de cultivo (solo) o medio que contiene una marca radiactiva tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido WISP, el medio de cultivo puede remplazarse con medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y a continuación se recolecta el medio condicionado. El medio que contiene el polipéptido WISP expresado puede concentrarse entonces y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido WISP etiquetada con un epítopo puede expresarse también en células CHO huéspedes. El polipéptido WISP puede subclonarse fuera del vector pRK5. Suva et al., Science, 247:893-896 (1987); EP 307.247 publicada el 15 de marzo de 1989. El inserto del subclón puede experimentar la PCR para fusionarse en pauta con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una etiqueta poli-His en un vector de expresión en Baculovirus. A continuación, el polipéptido WISP marcado con poli-His puede subclonarse en un vector dirigido por el SV40, que contiene un marcador de la selección tal como la DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito más arriba) con el vector dirigido por el SV40. El marcado puede realizarse, tal como se ha descrito más arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene la insulina o la variante de la insulina etiquetada con poli-His expresada puede concentrarse a continuación y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la cromatografía de afinidad con Ni^{2+}-quelato.
En particular, el ADNc de WISP-1 de ratón para inserción en vectores de expresión de mamíferos se creó mediante la PCR usando ADN de fago puro del clon m568.19A (ver más arriba) como plantilla, y usando como cebadores m.568.pcr.top4 (5'-TGACTTCCAGGCATGAGGTGGCTCCTG: SEC Nº ID.: 124) y m.568.pcr.bot3 (5'-ATTGG
CAAT-CTCTTCGAAGTCAGGGTAAGATTCC: SEC Nº ID.: 125) para la versión 6-his, o m.S68.pcr.top4 (SEC Nº ID.: 124) y 568.pcr.bot5. que tiene un sitio XbaI 3'-terminal (5'-GGTACGTCTAGACTAATTGGCAATCTCTTC
GAAGTCAGGG: SEC Nº ID.: 126) para la versión no-his. La integridad del inserto se confirmo mediante secuenciación y se analizó. La PCR se realizó usando la polimerasa Pfu y las condiciones fueron:
1
Para la expresión transitoria en células 293 analizadas mediante transferencia Western, los insertos anteriores se ligaron en el vector pRK5 mencionado más arriba, en el sitio BamHI/XbaI usando el equipo de ligación rápido BOEHRINGER MANNHEIM^{TM}. Los plásmidos resultantes se denominaron pRK5.mu.WISP-1.6his y pRK5.mu.WISP-1.nohis respectivamente para los insertos etiquetados con His y no etiquetados con His. A continuación, se sembraron las células 293 y se dejaron alcanzar aproximadamente un 85% de confluencia durante la noche (37ºC/5% CO_{2}). Las células sembradas se transfectaron con ADN plasmídico pRK5.mu.WISP-1.6his ó pRK5.mu.WISP-1.nohis mediante el uso de lipofectamina (Gibco BRL) en una proporción ácido:ADN de 4,5:1.
La eficiencia de la transfección (usualmente >70%) se monitorizó usando un plásmido de expresión GFP (pGREEN LANTERN^{TM} de Gibco BRL). Aproximadamente 5 horas después de la transfección, se cambió el medio por medio SF reciente (50:50, con IX L-Glu y IX P/S) para la producción de proteína. El medio condicionado se dejó que se acumulara durante cantidades de tiempo especificadas (dependiendo del experimento) antes de recolectarlo.
Se recolectó el medio y se concentró en presencia de PMSF 1 mM usando el concentrador CENTRICON-10^{TM}. El medio condicionado, concentrado (usualmente 1,5 ml) se unió entonces a cuentas de Ni^{2+}NTA agarosa (Qiagen) durante 2 horas (sólo para la versión etiquetada con His). La proteína se eluyó de las cuentas hirviéndolas durante 10 minutos en 2\times SDS tampón de carga (Novex), con o sin beta-mercaptoetanol respectivamente para proteína reducida o no reducida.
La proteína se visualizó mediante SDS-PAGE usando geles con un gradiente 4-20% de TRIS-glicina, 10 pocillos, y 1 mm de grosor (Novex). Los geles se corrieron a 125 voltios (constantes) durante 95 minutos. La transferencia Western se consiguió usando un aparato de transferencia NOVEX^{TM}, a membranas de PVDF (Novex), a 200 mA (constantes) durante 45 minutos. Las transferencias se bloquearon durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo (PBS + TWEEN-20^{TM} (0,5%), 5% de leche en polvo, y 3% de suero de cabra). Las transferencias se incubaron en anticuerpo primari (para la proteína marcada con His: anticuerpo anti-his(C-terminal)-HRP-conjugado de INVITROGEN^{TM}, o para la versión no-His: anticuerpo policlonal anti-WISP-1 múrido, preparado como se detalla más abajo) a una dilución de 1:2000 en tampón de bloqueo reciente, durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencia de proteína no marcada con His se incubaron en un anticuerpo secundario (IgG(H+L) de cabra anti-conejo conjugado con HRP de PIERCE^{TM}) diluído 1:2000 en tampón de bloqueo reciente. Las transferencias se incubaron en sustrato quimioluminiscente (ECL^{TM} de Amersham, o SUPERSIGNAL^{TM} de Pierce) durante 1 minuto antes de exponerlas a la película.
Para la expresión transitoria analizada mediante tinción de anticuerpos, se cultivaron células 293, se sembraron, y se transfectaron como se describió más arriba. Las células se adhirieron a placas de cultivo durante 2 minutos en una solución 1:1 metanol:acetona. Las células fijadas se incubaron en anticuerpo primario (para la proteína marcada con His: anticuerpo anti-his(C-terminal)-HRP-conjugado de INVITROGEN^{TM}, o para la versión no-His: anticuerpo policlonal anti-WISP-1 múrido, preparado como se detalla más abajo) diluído 1:1000 en PBS con un 10% de suero fetal bovino, durante 2 horas. Las transferencia de proteína no marcada con His se incubaron en un anticuerpo secundario (IgG(H+L) de cabra anti-conejo conjugado con HRP, de PIERCE^{TM}) diluido 1:150 en PBS con un 10% de suero fetal bovino, durante 1 hora. La incubación fue en sustrato reactivo de color para la HRP, durante hasta 1 hora (1,0% de O-dianisidina-EtOH saturado, 0,01% de peróxido de hidrógeno, en PBS).
Para la expresión estable del WISP-1 de ratón en células de mamífero, el vector de partida empleado fue el pRK5.CMV puro-dhfR, la secuencia del cual se muestra en las Figuras 16A-16D. Este vector tiene dos secuencias SAR clonadas en sitios KpnI, SapI del vector donante de ayuste SVID5, y tiene el esqueleto del pSVI con el conector de clonación del pRK5 (pSVI5), y el intrón preparado a partir del pSVI.WTSD.D mediante la adición de un conector de linealización (LL) dentro del sitio HpaI. La secuencia se edita para incluir cambios en el vector puc118, esqueleto derivado de la secuencia del pRK5, e incluye una inserción de cuatro bases después del MCS característicos del vector SVI.
Los insertos anteriores se ligaron en el pRK5.CMV.puro-dhfR en el sitio BamHIlXbaI usando el equipo de ligación rápido de BOEHRINGER MANNHEIM^{TM}, produciendo el pRK5.CMV.puro-dhfR.mu.WISP-1.6his o el pRK5.CMV.puro-dhfR.mu.WISP1.nohis. Esta construcción permite la selección estable de células que expresan usando tanto puromicina (2 mg/ml en células 293 ó 10 mg/ml en células CHO-DP12), o la supresión CHFR en la línea CHO-DP12, lo que permite la amplificación subsiguiente en metotrexato. Se seleccionaron las colonias aisladas representativas de las células transfectadas establemente, se cultivaron bajo presión selectiva, y se analizaron mediante tinción con anticuerpo o transferencia Western como se describió más arriba.
Ejemplo 9 Expresión del polipéptido WISP en levadura
El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de un polipéptido WISP en levadura.
En primer lugar, se construyen vectores de expresión para la producción intracelular o la secreción del polipéptido WISP a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el polipéptido WISP y el promotor se insertan en los sitios de enzimas de restricción apropiados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular. Para la secreción, el ADN que codifica un polipéptido WISP puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal WISP nativo, u otro péptido señal de mamífero, o un factor-alfa de levadura, o una secuencia señal/líder secretora, y secuencias de conector (si se necesitan) para la expresión.
Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden transformarse a continuación con los plásmidos de expresión descritos más arriba y cultivarse en el medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de las levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación con SDS-PAGE, seguida por la tinción de los geles con colorante Coomassie Blue.
El polipéptido WISP recombinante puede aislarse y purificarse a continuación retirando las células de levadura del medio de centrifugación y concentrando a continuación el medio usando los filtros en cartucho seleccionados. El concentrado que contiene el polipéptido WISP puede purificarse adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
Ejemplo 10 Expresión del polipéptido WISP en células de insecto infectadas con baculovirus, y purificación del mismo
El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de un polipéptido WISP en células de insecto infectadas con baculovirus, y la purificación del mismo.
General
La secuencia que codifica el polipéptido WISP se fusiona cadena arriba de una etiqueta de epítopo contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas de epítopo incluyen las etiquetas poli-His y las etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el pVL1393 (Novagen). De forma resumida, la secuencia que codifica el polipéptido WISP o la porción deseada de la secuencia codificante (tal como la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular) se amplifica mediante la PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador en 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados) flanqueantes. El producto se digiere entonces con esos enzimas de restricción y se subclona en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera cotransfectando el plásmido anterior y el ADN de virus BACULOGOLD^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectan y usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se realiza tal como describieron O'Reilley et al., "Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual" (Oxford: Oxford University Press, 1994).
El polipéptido WISP marcado con poli-His expresado puede purificarse entonces, por ejemplo, mediante la cromatografía de afinidad con Ni^{2+}-quelato como sigue. Los extractos se prepararon a partir de células Sf0 infectadas con virus recombinantes tal como describieron Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). De forma resumida, las células Sf9 se lavaron, resuspendieron en tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y se sonicaron dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se clarificaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluyó 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se preparó una columna de
Ni^{2+}-NTA agarosa (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lavó con 25 ml de agua, y se equilibró con 25 ml de tampón de carga. El extracto de células filtrado se cargó sobre la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lavó con tampón de carga hasta obtener una línea base a A_{280}, momento en el que se inició la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lavó con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 6,0), el cual eluye no específicamente la proteína unida. Después de alcanzar de nuevo la línea base a A_{280}, se reveló la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recolectaron fracciones de un ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con plata, o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA-conjugado con la fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el polipéptido WISP etiquetado con His_{10} se juntaron y dializaron de nuevo frente a tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del polipéptido WISP etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo la cromatografía con columna de Proteína A o de Proteína G.
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Específico 1. Expresión
En particular, el polipéptido WISP-1 de ratón se expresó en un sistema de expresión en baculovirus similar al descrito más arriba usando el vector de transferencia de baculovirus pb.PH.mu.568.9.IgG.baculo o el pbPH.mu.568.8his.
baculo. Las Figuras 17A-17D muestran la secuencia (SEC. Nº ID.: 54) del plásmido pb.PH.IgG, el cual se usó para preparar pb.PH.mu.568.9.IgG.baculo. Las Figuras 17A-17D muestran la secuencia (SEC. Nº ID.: 54) del plásmido pbPH.His.c, el cual se usó para preparar el pbPH.mu.568.8hisbaculo.
Ambos de estos vectores de transferencia de baculovirus se basan en el pVL 1393 (Pharmingen), el cual no tiene ni la marca His ni la marca Fc. El vector pb.PH.IgG (Figura 17) permite la expresión de proteínas foráneas bajo control del promotor de polihedrina AcNPV, el cual es activo en la fase muy tardía de la infección por el virus. La proteína foránea puede expresarse como una proteína de fusión C-terminal con IgG humana. La etiqueta His(8) on se traducirá como resultado del codón de paro justo 5' de la etiqueta His(8). La secuencia que codifica la proteína foránea debe insertarse como un fragmento con el extremo 3' romo en el único sitio StuI que precede la etiqueta His. En ese caso, se añadirá un residuo prolina adicional. El sitio 5' puede ser cualquiera de BamHI, EcoRI, NotI. NcoI, y NheI.
El vector de IgG se construyó mediante la digestión con NdeI del plásmido pVL1393.IgG, seguida por tratamiento Klenow para rellenar el extremo final pegajoso. Esto fue seguido por una digestión con NcoI y la inserción en el vector pbPH.His.c digerido con NcoI/SmaI.
La secuencia de pbPH.His.c mostrada en las Figuras 18A-18D contiene la secuencia esqueleto del vector pVL1392, el cual contiene aproximadamente el fragmento EcoRI/XmaIII del AcMNPV C-6, desde la posición 0,0 hasta 5.7 mu. Possee et al., Virology, 185:229-241 (1991). Esto permite la expresión de proteínas foráneas bajo control del promotor del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), el cual es activo en la fase muy tardía de la infección por el virus.
La proteína foránea peude expresarse como una proteína marcada C-terminalmente con His o con una IgG (sólo la región Fc). La secuencia que codifica la proteína foránea debe insertarse como un fragmento con el extremo 3' romo en el único sitio StuI que precede la etiqueta His. En ese caso, se añadirá un residuo glicina adicional para las etiquetas His, y se añadirá una prolina para las etiquetas IgG. El sitio 5' puede ser cualquier de BamHI, NotI, EcoRI, o NcoI. Bam HI se usó para ambos.
Los vectores se construyeron insertando un inserto de la PCR en BamHI/SmaI para el vector His, y BamHI/StuI para el vector IgG. El inserto de la PCR se construyó usando cebadores 5'-fosforilados como sigue: m.568.pcr.top6 (5'-TTTCCCTTTGGATCCTAAACCAACATGAGGTGGCTCCTGCCC: SEC. Nº ID.: 127) y m.568.pcr.bot3 (SEC. Nº ID.: 125), 5'-fosforilado. Se realizó una reacción de la PCR de veinte ciclos, con el enzima polimerasa Pfu, usando las siguientes condiciones: 1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 60ºC, 3,5 minutos a 72ºC. El producto de la PCR se purificó con QIAQUICK^{TM} y se digirió con BamHI a 37ºC durante 1 hora. El inserto de la PCR digerido se ligó en el vector digerido usando una proporción de 1:3 de inserto respecto a vector, con 1 ml de ADN-ligasa T4 (Bio Labs). Se añadieron 100 \mul de células competentes ULTRA MAX^{TM} DH5a FT (Gibco BRL Cat #10643-013) al producto de ligación, y la mezcla se incubó sobre hielo durante 30 minutos, seguidos por un choque térmico a 42ºC durante 45 segundos. Se seleccionaron colonias individuales y se preparó ADN miniscreen usando QIA PREP^{TM} (Qiagen). La secuenciación de la construcción se realizó usando la secuenciación cíclica del terminador dRHODAMINE DYE^{TM} para ABI Prism.
El plásmido pb.PH.IgG tiene un policonector BamHI-NotI-EcoRI-NcoI-SrfI-StuI-(IgG, sólo región Fc)-Stop-XbaISpeI-PstI-BglII. La ubicación de regiones determinadas en este plásmido es como sigue: inserción del policonector/gen foráneo: 4129-4912 (BamHI-BglII), codificante polh: 4913-5479, ORF 1629: 7134-4820, ORF 588 (PK1): 7133-7723, origen de replicación ColE1: 7973-8858, y codificante de la ampicilina: 9779-8230. El plásmido pbPH.His.c tiene un policonector BamHI-NotIEcoRI-NcoI-SrfI-Smai-(His8)-Stop-XbaI-SpeI-PstI-BglII. El sitio NcoI de pbPH.His.c reside dentro de una secuencia Kozak. La ubicación de regiones determinadas en este plásmido es como sigue: ORF 504 (PTP): 76-582, ORF 984 (ORF2): 1600-614, ORF 453 (ORF3): 2323-1868, conotoxina: 1818-1657, ORF 327 (ORF4): 2352-2681, ORF 630 (lef-2): 2662-3294, ORF 603: 3937-3332, ORF polh:4093 (codón mutado ATG/ATT), inserción del policonector/gen foráneo: 4129-4218 (BamHIBglII), codificante de polh coding: 4224-4790, ORF 1629: 6445-4820, ORF 588 (PK1): 6444-7034, origen de replicación ColEI: 7284-8169, y codificante de ampicilina:9090-8230.
El ADNc del WISP-1 de ratón descrito en la presente invención se insertó en los vectores pbPH.His.c y pb.PH.IgG para producir los plásmidos de expresión respectivos mediante la creación de un fragmento con el extremo 3' romo para su clonación en el único sitio SmaI que precede la etiqueta-His o la etiqueta-IgG. Se añadió un residuo de glicina adicional a la proteína His producida. Se añadió una prolina adicional a la proteína IgG. El sitio 5' del inserto de ADNc era BamHI.
2. Purificación
Para los propósitos de purificación, antes de la expresión, a la región codificante C-terminal del ADNc se le añade una etiqueta poli-His o la porción Fc de una IgG humana. El medio condicionado procedente de las células transfectadas (de 0,5 a 2 l) se recolectó mediante centrifugación para eliminar las células, y se filtró a través de filtros de 0,22 micras. Para las construcciones etiquetadas con poli-His, la proteína se purificó usando una columna Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imizadol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó sobre una columna de 6 ml de Ni^{2+}-NTA equilibrada en tampón HEPES 20 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM, a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de cargarla, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional, y la proteína se eluyó con tampón de equilibrado que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento que contenía HEPES 10 mM, NaCl 0,14 M y 4% de manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia), y se almacenó a -80ºC.
Las construcciones inmunoadhesinas (que contienen Fc) de la proteína WISP-1 se purificaron del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombeó sobre una columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia), la cual se había equilibrado en un tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Después de cargada, se lavó la columna extensivamente con tampón de equilibrado antes de la elución, con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón TRIS 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en tampón de almacenamiento, tal y como se describió más arriba para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de la proteína se verificó mediante geles de SDS-poliacrilamida, y mediante secuenciación N-terminal por la degradación de Edman.
Ejemplo 11 Ensayo de duplicación del Axis
Se inyectaron embriones de Xenopus con ARNm de WISP-2 humano, bien en un presunto blastómero vegetal ventral o presunto dorsal, en una etapa de 8 a 16 células, para sobreexpresar localmente la proteína codificada y ensayar sus efectos sobre el desarrollo. Los procedimientos se describen en Sokol et al., Cell, 67:741-752 (1991).
Más específicamente, para la síntesis de ARN "capped", los ADNc de WISP-2 humano y Wnt-1 de ratón se clonaron en el vector pGEMHE (obsequio del Dr. Todd Evans, AECOM) para preparar respectivamente pGEMHE.hu.WISP-2.8H y pGEMHE.mu.Wnt-1.41. Las construcciones se linealizaron en el extremo 3' usando el enzima de restricción SphI. Los ARN "capped" se sintetizaron usando el equipo de síntesis de ARN T7 MESSAGE MACHINE^{TM} de AMBION.
Para obtener oocitos maduros, se inyectó una hembra adulta de Xenopus laevis con 200 I.U. de suero de yegua preñada 3 días antes de su uso. La noche anterior al experimento, la rana hembra se inyectó con 800 I.U. de gonadotropina coriónica humana. Los oocitos frescos se extrajeron de las ranas hembras a la mañana siguiente. La fertilización in vitro de los oocitos se realizó mezclando oocitos con testículos troceados procedentes de ranas macho sacrificadas. Los huevos fertilizados se desgelificaron con cisteína al 2% (pH 7,8) durante 10 minutos. Los huevos desgelificados se lavaron una vez con agua destilada y se transfirieron a una 0,1\times Solución de Barth Modificada (MBS) (Methods in Cell Biology, volumen 36, "Xenopus laevis: Practical uses in Cell and Molecular Biology", editores Kay y Peng, (Nueva York: Academic Press. 1991)) con un 5% de Ficoll. Los huevos se alinearon en bandejas de inyección que contenían 0,1\times MBS con 5% de Ficoll para su inyección. Después de la inyección, los embriones se mantuvieron en 0,1\times MBS en un incubador a 18ºC. Los embriones se organizaron de acuerdo con Nieuwkoop y Faber, "Normal Table of Xenopus laevis", (Daudin) (Amsterdam: North-Holland. 1967).
Para ensayos de cap en animales, los embriones se inyectaron en la etapa de dos células con 1 ng de ARN-capped, y los cap de los animales se aislaron en la etapa 8, y se cultivaron en 1\times MMR durante otras 24 horas para el ensayo de RT-PCR. El ARN total se aisló de animales "cosechados" usando un equipo RNEASY^{TM} (Qiagen). Las muestras de ARN (aproximadamente 1 mg) usando un hexámero aleatorio y la transcriptasa inversa SUPERSCRIPTII^{TM} de GIBCO BRL. La temperatura de templado para las reacciones de la PCR fue de 55ºC a menos que se indique lo contrario.
Para los ensayos de duplicación del axis, se inyectaron embriones en la etapa de 8 células con 1 ng de ARN-capped en el blastómero vegetal dorsal o ventral, y se incubaron en 1\times MBS durante 72 horas.
Las secuencias de los cebadores de la PCR usados en este experimento fueron:
EF-1a.U: 5'-CAGATTGGTGCTGGATATGC (SEC. Nº ID.: 128)
EF-1a.D: 5'-ACTGCCTTGATTACTCCTAC (SEC. Nº ID.: 129)
noggin.U: 5'-AGTTGCAGATGTGGCTCT (SEC. Nº ID.: 130)
noggin.D: 5'-AGTCCAAGAGTCTCAGCA (SEC. Nº ID.: 131)
goosecoid.U: 5'-ACAACTGGAAGCACTGGA (SEC. Nº ID.: 132)
goosecoid.D: 5'-TCTTATTCCAGAGGAACC (SEC. Nº ID.: 133)
actina-cardíaca.U: 5'-TCCCTGTACGCTTCTGGTCGTA (SEC. Nº ID.: 134)
actina-cardíaca.D: 5'-TCTCAAAGTCCAAAGCCACATA (SEC. Nº ID.: 135)
NCAM.U: 5'-CACAGTTCCAGCAAATAC (SEC. Nº ID.: 136)
NCAM.D: 5'-GGAATCAGGCGGTACAGT (SEC. Nº ID.: 137).
En este ensayo se halló que el WISP-2 humano puede inducir parcialmente la duplicación del axis.
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Ejemplo 12 Ensayo de incorporación de la timidina
En un ensayo de incorporación de (3H)-timidina, se sembraron 19 lineas celulares diferentes, incluyendo las células RAG (adenocarcinoma renal, de ratón) y la NRK-49F (fibroblastos de riñón normal, de rata), identificadas en la Tabla 1 siguiente, en placas de 96 pocillos a 3\times10^{4} en HGDMEM con un 10% de suero. Veinticuatro horas después de sembradas, se cambió el medio a HGDMEM con un 0,2% de suero, antes de añadir las proteínas de ensayo. Las proteínas WISP se añadieron a una concentración final de aproximadamente 3,6 ng/ml. Se prepararon disoluciones en serie en un volumen total de 70 \mul/pocillo de medio reciente. Transcurridas 18 hr de incubación a 37ºC, se añadieron 5 \muCi/ml (^{3}H)timidina durante 5 horas. Se aspiró el medio, y las células se eliminaron con 1\times tripsina sobre un filtro GF/C usando FILTERMATE 196^{TM} de 96-pocillos de Packard's^{TM}. Se secaron los filtros y se añadieron 40 \mul de fluido de centelleo para recuento en un contador de centelleo de microplacas de recuento superior (Packard).
Los resultados se muestran en la Tabla 1:
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TABLA 1
2
TABLA 1 (continuación)
3
TABLA 1 (continuación)
4
Se observa que WISP-1 y WISP-2 presentan efectos estimuladores e inhibidores sobre la proliferación de células normales y tumorales, dependiendo de la línea celular empleada.
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Ejemplo 13 Preparación de Anticuerpos que unen el polipéptido WISP 1. Anticuerpos policlonales
Los antisueros policlonales se generaron en conejos New Zealand White contra el WISP-1 de ratón y el WISP-2 humano. Los antígenos usados fueron las proteínas fusionadas con histidina para el WISP-1 múrido, y las proteínas fusionadas con la porción Fc de la IgG para el WISP-2 humano. Se usó el mismo protocolo para ambas proteínas. Cada proteína se homogeneizó con el adyuvante completo de Freund para al primera inyección y con el adyuvante incompleto de Freund para todos las impulsos posteriores Para la inmunización primaria y para el primer impulso, se inyectaron 3,3 \mug por kg de peso corporal directamente en los nódulos linfáticos popliteales, según se describe en Bennett et al., J. Biol. Chem., 266:33060-23067 (1991), y en "Production of Antibodies by inoculation into Lymph Nodes", por Morton Sigel et al, en Methods in Enzymology, volumen 93 (Nueva York: Academic Press. 1983). Para todos los impulsos subsiguientes, se inyectaron 3,3 \mug por kg de peso corporal en sitios subcutáneos e intramusculares. Las inyecciones se realizaron cada 3 semanas, con sangrados extraídos en las dos semanas siguientes.
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2. Anticuerpos monoclonales
Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales que pueden unir específicamente el polipéptido WISP son conocidas en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, ver más arriba. Los inmunogenes que pueden emplearse incluyen el polipéptido WISP purificado, las proteínas de fusión que contienen el polipéptido WISP, y las células que expresan el polipéptido WISP recombinante sobre la superficie de la célula. La selección del inmunogén puede realizarla el especialista capacitado sin experimentación indebida.
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Los ratones, tales como los Balb/c, se inmunizan con el inmunogén de WISP en adyuvante completo de Freund, y se inyectan subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad de 1 a 100 microgramos. Alternativamente, el inmunogén se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las plantas de los pies de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se refuerzan de 10 a 12 días más tarde con inmunogén adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante varias semanas, los ratones pueden reforzarse también con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital para ensayar en ensayos de ELISA para detectar los anticuerpos anti-polipéptido WISP.
Una vez se ha detectado un título de anticuerpo apropiado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección final intravenosa de un polipéptido WISP. Tres o cuatro días más tarde, se sacrifican los ratones y se recuperan las células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces (usando PEG al 35%) a una línea celular de mieloma múrido seleccionada, tal como P3x63AgU.1, disponible de ATCC, nº CRL 1597, o la x63.Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunology, 123:1548 (1979)). Las fusiones generan células de hibridoma que pueden sembrarse en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de las células del bazo.
Las células de hibridoma se examinan en un ELISA por su reactividad contra un polipéptido WISP. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra un polipéptido WISP se halla dentro de los conocimientos del campo.
Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones singéneicos Balb/c para producir ascites que contienen los anticuerpos monoclonales anti-polipéptido WISP. Alternativamente, las células de hibridoma pueden hacerse crecer en frascos de cultivo de tejidos o en botellas rodantes. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites puede conseguirse usando la precipitación con sulfato, seguida por la cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede emplearse la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la Proteína A o a la Proteína G.
Específicamente, para cada uno de los anticuerpos de WISP-1 humano, se presangraron cinco ratones Balb-c hembras, y se inyectaron a continuación a a través de la planta del pie de las patas traseras con WISP-1 humano purificado, marcado con la porción Fc de IgG, y emulsionado antes de su inyección con adyuvante MPL-TMD (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) en una proporción 1:1 de antígeno WISP respecto adyuvante. El calendario de dosificación para el inmunogén WISP-1 fue como sigue:
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5
Para el WISP-1, los ratones se sangraron en el día 10 del mes 4. Una vez sangrados los ratones, los anticuerpos monoclonales se prepararon recolectando sus bazos y mediante fusión, según se indicó más arriba, usando la línea celular de mieloma múrido X63.Ag8.653.
Los cinco anticuerpos monoclonales generados con el WISP-1 humano son:
10F2.2A7
gamma 2b/kappa
10A9.2B1
gamma 2a/kappa
8F7.1B1
gamma 1/kappa
1H1.1D5
gamma 1/kappa
2G7.2H4
gamma 1/kappa
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Para los anticuerpos monoclonales contra el WISP-2 se empleó el mismo régimen, excepto que se usó el WISP-2 humano purificado como inmunogén en el protocolo anterior en vez del WISP-1 humano purificado, y el calendario de dosificación para el inmunogén WISP-2 fue como sigue:
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6
7 
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Ejemplo 14 Usos de los anticuerpos que unen el polipéptido WISP 1. Líneas celulares
Las células de tumor mamario humano establecidas BT474 y MDA-MB-231 (las cuales están disponibles de la ATCC) se cultivaron en medio esencial mínimo (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) desactivado con calor (HyClone, Logan, UT), piruvato sódico, L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales, y una solución 2\times de vitaminas, y se mantuvo a 37ºC en 5% de CO_{2}. Zhang et al., Inyas. & Melas., 11:204-215 (1991); Price et al., Cancer Res., 50:717-721 (1990).
2. Anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales anti-WISP-1 o anti-WISP-2, que pueden prepararse tal como se describió más arriba, se recolectaron con PBS que contenía EDTA 25 mM, y se usaron para inmunizar ratones BALB/c. A los ratones se les suministraron inyecciones i.p. de 10^{7} células en 0,5 ml de PBS, en las semanas 0, 2, 5 y 7. A los ratones con antisueros que inmunoprecipitaban el Wnt-1 marcado con ^{32}P se les administraron inyecciones i.p. de un extracto de membrana Wnt purificado en aglutinina de germen de trigo-SEPHAROSE^{TM} (WGA), en las semanas 9 y 13. Esto fue seguido por una inyección i.v. de 0,1 ml de la preparación de Wnt-1, y los esplenocitos se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes de los hibridomas se examinaron en busca de unión del Wnt-1 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación. MOPC-21 (IgG1) (Cappell, Durham, NC) se usó como un control del mismo isotipo.
Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales múridos de IgG1\kappa anti-ErbB2 4D5 (ATCC CRL 10463, depositado el 24 de mayo de 1990) y 7C2, específicos para el dominio extracelular del ErbB2, pueden usarse con los anticuerpos anteriores. Se producen como se describe en Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990) y en WO89/06692.
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3. Análisis del estado del ciclo celular y de la viabilidad
La viabilidad y el estado del ciclo de las células se examinaron simultáneamente mediante citometría de flujo en un FACSTAR PLUS^{TM} (Becton Dickinson Immunocytometry Systems USA, San Jose, CA). La células de tumor mamario se recolectaron lavando la monocapa con PBS, incubando las células en 0,05% de tripsina y EDTA 0,53 mM (Gibco), y resuspendiéndolas en medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía un 1% de FBS, y el precipitado se incubó durante 30 minutos sobre hielo con 50 ml de 400 mM 7-aminoactinomicina D (7AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR), o con un colorante vital que tiñe todas las células permeables. Las células se fijaron a continuación con 1,0 ml de paraformaldehideína al 0,5% en PBS, y simultáneamente se permeabilizaron y tiñeron durante 16 horas a 4ºC con 220 ml de 10 mg/ml del colorante HOECHST 33342^{TM} (también un colorante de unión de ADN) que contenía un 5% de TWEEN 20^{TM}.
Los datos procedentes de 1 \times 10^{4} células se recogieron y almacenaron usando el programa LYSYS II^{TM}, y se analizaron usando el programa PAINT-AGATE^{TM} (Becton Dickinson), Darzynkiewica et al., Cytometry, 13:795-808 (1992); Picker et al., J. Immunol., 150:1105-1121 (1993). La viabilidad y el porcentaje de células en cada etapa del ciclo celular se determinaron sobre células únicas clasificadas usando respectivamente 7AAD y tinción de Hoechst. (Los dobletes de células se excluyen mediante análisis de pulso del ancho respecto el área de la señal del Hoechst.) El recuento de células se determinó usando un hemocitómetro.
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4. Síntesis de ADN (Ensayo de la incorporación de (^{3}H)-timidina)
El ensayo se realizó exactamente como se describe en el Ejemplo 12, excepto que los polipéptidos WISP usados como proteínas de ensayo se sustituyeron con los anticuerpos policlonales, generados en conejos New Zealand White contra el WISP-1 múrido y el WISP-2 humano, descritos en el Ejemplo 13, y que no se ensayaron todas las líneas celulares del Ejemplo 12. Los resultados se muestran en la Tabla II:
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TABLA II 
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TABLA II (continuación)
9 
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Se observa que los anticuerpos policlonales contra el WISP-1 de ratón y el WISP-2 humano presentan tanto efectos estimuladores como inhibidores sobre la proliferación de células normales y tumorales, dependiendo de la línea celular empleada.
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5. Afinidad de unión al receptor putativo
Se prepararon anticuerpos radioyodados anti-WISP-1 y anti-WISP-2 mediante el procedimiento del IODOGEN^{TM}. Fracker et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 80:849-857 (1978). Los ensayos de unión se realizaron usando células que expresaban el receptor apropiado (tales como, para los anticuerpos anti-WISP, la MLG, una línea celular de pulmón de ratón procedente de la ATCC), cultivadas en placas de cultivo de 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, N.J.). Las células se tripsinizaron y sembraron en pocillos de placas de 96 pocillos a una densidad de 10^{4} células/pocillo, y se dejaron adherir durante la noche. Las monocapas se lavaron con medio de cultivo suplementado con azida sódica al 0,1%, y a continuación se incubaron por triplicado con 100 ml de diluciones en serie de los anticuerpos ^{125}I-anti-WISP-1 o WISP-2 en medio de cultivo frío que contenía un 0,1% de azida sódica, durante 4 horas, sobre hielo. La unió no específica se estimó mediante la preincubación de cada muestra con un exceso molar de 100 veces de anticuerpos no radioactivos en un volumen total de 100 \mul. La radiactividad no unida se eliminó mediante dos lavados con medio frío que contenía un 0,1% de azida sódica. La radiactividad asociada a las células se detectó en un contador gamma después de la solubilización de las células con 150 \mul de NaOH 0,1 M/pocillo. Las constantes de unión (K_{d}) a WISP-1 y WISP-2 y las afinidades del anticuerpo anti-WISP se determinaron mediante análisis de Scatchard.
Se espera que los anticuerpos contra el WISP-1 y WISP-2 afectarán el crecimiento de estas células.
Ejemplo 15 Usos adicionales de los anticuerpos que unen el polipéptido WISP 1. WISP-1 y WISP-2
Este ejemplo muestra que los genes de WISP-1 y WISP-2 están amplificados en el genoma de ciertas líneas celulares y/o tumores malignos de pulmón, colon y/o mama. La amplificación está asociada con la sobreexpresión del producto del gen, indicando que las proteínas WISP-1 y WISP-2 son dianas útiles para la intervención terapéutica en ciertos cánceres, tales como el de colon, pulmón, mama, y otros cánceres. Un agente terapéutico puede adoptar la forma de antagonistas de las moléculas WISP, por ejemplo, anticuerpos múridos-humanos, quiméricos, humanizados o humanos contra el WISP-1 y WISP-2, tales como los anticuerpos preparados como se describe más arriba.
El material de partida para el cribado fue ADN genómico aislado de una variedad de cánceres. En ADN se cuantifica con precisión, por ejemplo, fluorométricamente. Como un control negativo, se aisló ADN de las células de diez individuos sanos normales, se juntó, y se usó como un control del ensayo para la copia del gen en individuos sanos.
El ensayo de la 5' nucleasa (por ejemplo, la TAQMAN^{TM}) y la cuantificación en tiempo real mediante la PCR (por ejemplo, ABI PRIZM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM} (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)), se usaron para hallar genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los resultados se usaron para determinar si los ADN que codificaban el WISP-1 y WISP-2 estaban sobrerrepresentados en cualquiera de los cánceres o líneas celulares de cánceres de pulmón o colon primarios, o en las lineas celulares de cáncer de mama que se examinaron. Los cánceres de pulmón primarios se obtuvieron de individuos con los tumores de los tipos y fases indicados en la Tabla III. A continuación se da una explicación de las abreviaturas usadas para la identificación de los tumores primarios listados en la Tabla III, y de los tumores primarios y líneas celulares mencionados a lo largo de este ejemplo:
\quad
Las líneas celulares de carcinoma pulmonar humano incluyen la A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774) y SW900 (SRCC775), todas disponibles de la ATCC. Las células tumorales de pulmón humano usualmente derivan de adenocarcinomas, de carcinomas de células escamosas, de carcinomas de células grandes, de carcinomas de células no pequeñas, de carcinomas de células pequeñas, y de carcinomas bronquioalveolares, e incluyen, por ejemplo, SRCC724 carcinomas de células escamosas abreviado como "SqCCa"), SRCC725 (carcinoma de células no pequeñas, abreviado como "NSCCa"), SRCC726 (adenocarcinoma, abreviado como "AdenoCa"), SRCC727 (adenocarcinoma), SRCC728 (carcinomas de células escamosas), SRCC729 (adenocarcinoma), SRCC730 (carcinomas de células escamosas/adenocarcinoma), SRCC731 (adenocarcinoma), SRCC732 (carcinomas de células escamosas), SRCC733 (adenocarcinoma), SRCC734 (adenocarcinoma), SRCC735 (carcinoma bronquioalveolar, abreviado como "BAC"), SRCC736 (carcinomas de células escamosas), SRCC738 (carcinomas de células escamosas), SRCC739 (carcinomas de células escamosas), SRCC740 (carcinomas de células escamosas), y SRCC740 (carcinoma de células pulmonares, abreviado como "LCCa").
\quad
Las líneas celulares de cáncer de colon incluyen, por ejemplo, las líneas celulares de la ATCC, SW480 (adenocarcinoma, SRCC776), SW620 (metástasis de nódulo linfático de adenocarcinoma de colon, SRCC777), COLO320 (adenocarcinoma, SRCC778), HT29 (adenocarcinoma, SRCC779), HM7 (carcinoma, SRCC780), CaWiDr (adenocarcinoma, srcc781), HCT116 (carcinoma, SRCC782), SKCOI (adenocarcinoma, SRCC783), SW403 (adenocarcinoma, SRCC784), LS174T (carcinoma, SRCC785), y HM7 (una variante de la ATCC, productora de niveles elevados de mucina, de la línea celular de adenocarcinoma de colon LS 174T, obtenida del Dr. Robert Warren, UCSF). Los tumores de colon primario incluyen los adenocarcinomas denominados CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744),CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747), CT15 (SRCC748), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRCC758), y DcR3, BACrev, BACfwd, T160, y T159. Las líneas celulares de carcinoma de mama humano incluyen, por ejemplo, HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC760), T47D (SRCC761), MB468(SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC766), y SKBR3 (SRCC767).
Los resultados se dan en unidades de Delta (\Delta) Ct. Una unidad corresponde a un ciclo de la PCR o aproximadamente una amplificación de 2 veces relativa a la normal, dos unidades corresponden a 4-veces, 3 unidades a una amplificación de 8 veces, etcétera. La cuantificación se obtuvo usando cebadores derivados de las regiones 3' no traducidas de los ADNc de WISP-1 y WISP-2, un una sonda fluorescente TAQMAN^{TM} correspondiente a las respectivas secuencias implicadas. Usando la región 3' se tiene a evitar cruzar límites intrón-exón en el ADN genómico, un requisito esencial para una evaluación precisa de la amplificación del gen usando este procedimiento. Las secuencias de los cebadores y sondas (hacia adelante, hacia atrás, y sonda) usados para la amplificación del gen de codifica el WISP-1 y WISP-2 fueron como sigue:
Sonda y cebadores para WISP-1:
hu.WISP1.TMP (sonda) 5'-AGCCTTTCCAAGTCACTAGAAG
\hskip0,35cm TCCTGCTGG (SEC. Nº ID.: 138)
hu.WISP1.TMF (cebador hacia adelante) 5'-CTGGACTACACCCAAGCCTGA (SEC. Nº ID.: 139)
hu.WISP1.TMR (cebador hacia atrás) 5'-CATTTCTTGGGATTTAGGCAAGA (SEC. Nº ID.: 140)
Sonda y cebadores para WISP-2:SEC. Nº ID.:
DNA33473.3utr-5 (cebador hacia adelante) 5'-TCTAGCCCACTCCCTGCCT (SEC. Nº ID.: 141)
DNA33473.3utr-3 (cebador hacia atrás) 5'-GAAGTCGGAGAGAAAGCTCGC (SEC. Nº ID.: 142)
DNA33473.3utr (sonda) 5'-CACACACAGCCTATATCAAACA
\hskip0,35cm TGCACACG (SEC. Nº ID.: 143)
La reacción del ensayo de la nucleasa 5' es una técnica fluorescente basada en la PCR que utiliza la actividad 5'-exonucleasa del enzima Taq ADN polimerasa para monitorizar la amplificación en tiempo real. Se usan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típido de una reacción en cadena de la PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de la PCR. La sonda no es extensible por el enzima Taq ADN polimerasa, y está marcada con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente extintor. Cualquier emisión inducida por láser procedente del colorante informador es apagada por el colorante extintor cuando los dos colorantes están ubicados cerca, tal y como lo están sobre la sonda. Durante la reacción de amplificación, el enzima Taq ADN polimerasa corta el surco de forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal procedente del colorante informador liberado está libre del efecto extintor del segundo fluoróforo. Por cada nueva molécula sintetizada, se libera una molécula del colorante informador, y la detección del colorante informador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.
El procedimiento de la 5'-nucleasa se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativo en tiempo real, tal como el PRIZM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM} de ABI. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos sobre un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge en tiempo real a través de cables de fibra óptica para la totalidad de los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye un programa para controlar el instrumento y para interpretar los datos.
Los datos del ensayo de la 5'-nucleasa se expresaron inicialmente como Ct, o ciclo umbral. Este se define como el ciclo en el que la señal del informador se acumula por encima del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores de \DeltaCt se usan como una medición cuantitativa del número relativo de copias iniciales de cada secuencia diana concreta en una muestra de ácido nucleico cuando se comparan los resultados de ADN canceroso con los resultados de ADN humano normal.
Los resultados del primer análisis realizado se muestran en las Figuras 19A-D y 20A-D respectivamente para WISP-1 y WISP-2, y para los controles. Hay que destacar el patrón mostrado en la Figura 19B (huWISP-1 marcado). La desviación estándar de las dos muestras de ADN humano normal se muestra en la columna marcada "Nor Hu". Esta se usó como una herramienta de control de calidad. Si la desviación estándar era inaceptablemente grande, se repetía el análisis completo. Las nueve columnas adicionales corresponden a las líneas celulares de cáncer de colon humano mencionadas más arriba. Los Delta Ct para HT29 y WIDr eran >3, correspondientes a una sobrerrepresentación de aproximadamente 8 veces del gen WISP-1 en estas muestras en comparación con las muestras normales. De forma similar, la Figura 19B sugiere una amplificación de aproximadamente 4 veces del WISP-1 en las líneas celulares HCT116, SKCo-1 y SW403.
Como una comparación, ver la Figura 20B (huFASr marcado). Los valores de Delta Ct generalmente pequeños indican que este gen no estaba significativamente ampliado en ninguna de las líneas celulares (el valor de 1 para SW620 correspondiente a una amplificación de 2 veces, se halla dentro del nivel de ruido del ensayo.
El resultado de WISP-1 se confirmó en tres reacciones replicadas. Consultar las Figuras 31A-D, 22A-D, y 33A-C. El patrón y los valores de Delta Ct obtenidos fueron muy similares en las Figuras 21A-C (huWISP-1c marcado, huWISP-1b, y hu WISP-1a, respectivamente). El resultado era esencialmente idéntico al obtenido en el primer análisis. HT29 y WIDr mostraron los niveles más elevados de amplificación del WISP-1, mientras que las líneas celulares HCT116, SKCo-1, y SW403 mostraban valores algo menores de la amplificación del gen WISP-1. Dos reacciones adicionales procedentes de un tercer análisis lo confirmaron. Ver las Figuras 25A y 25B.
El gen de WISP-1 está ubicado en el cromosoma 9, en la cercanía general del gen myc, el cual se sabe que está amplificado en algunas líneas celulares de cáncer de colon. El patrón obtenido usando cebadores y una sonda para el gen myc, a saber,
hu.c-myc.tm.p 5'CTTGAGACTGAAAGATTTAGCCATAATGTAAACTGCCT (SEC. Nº ID.: 144)
hu.c-myc.tm.f 5'-CAAATGCAACCTCACAACCTTG (SEC. Nº ID.: 145), y
hu.c-myc.tm.r 5'-TTCTTTTATGCCCAAAGTCCAATT (SEC. Nº ID.: 146),
es consistente con un informe publicado (Cancer Research, 57:1769-1775 (1997)), que tiende validar el resultado del procedimiento de ensayo de la 5'-nucleasa, pero es claramente diferente del obtenido para WISP-1. Estos datos prueban que el gen myc no es la diana de la amplificación detectada usando los cebadores y sondas para WISP-1.
Los datos usando cebadores y sondas basados en la secuencia de ADN del WISP-2 sugieren que este gen puede ser la diana de una amplificación génica de bajo nivel en la mayoría de las líneas celulares examinadas. Consultar las Figuras 20C, 22A-D y 25C y D. Por tanto, los anticuerpos contra ambos WISP-1 y WISP-2, particularmente los anticuerpos humanizados, se espera que sean beneficiosos para combatir ciertos tipos de cáncer, tales como el cáncer de colon, de forma similar al anticuerpo humanizado anti-HER-2 en su uso clínico.
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2. WISP-2 Descripción de tumores y líneas celulares
Se realizó la amplificación para el WISP-2 humano (PRO261) usando varios tipos de tumores diferentes, como se describe más abajo. La Tabla III describe la fase, la fase T, y la fase N de varios tumores primarios que se usaron para cribar el compuesto WISP-2 de la invención.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA III
10
TABLA III (continuación)
11
TABLA III (continuación)
12
Preparación del ADN
El ADN se preparó a partir de líneas celulares cultivadas, tumores primarios, y sangre humana normal (controles y esqueletos y mapeado del epicentro). El aislamiento se realizó usando el equipo de purificación #13362 (el cual incluye 10 puntas de purificación con una capacidad de 400 \mug de ADN genómico cada uno), conjunto tampón #1960, y proteasas #19155 y #19101, todo procedente de Quiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la descripción siguiente.
Lisis del cultivo celular
Las células se lavaron y tripsinizaron a una concentración de 7,5 \times 10^{8} por punta, y se precipitaron mediante centrifugación a 1.000 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC, seguidos por un lavado de nuevo con 1/2 volumen de PBS y centrifugación de nuevo. Los precipitados se lavaron una tercera vez, y las células suspendidas se recolectaron y lavaron con 2\times PBS. Las células se suspendieron a continuación en 10 ml dePBS. El tampón CI se equilibró 4ºC. La Proteasa #19155 (Quiagen) se diluyó en 6,25 ml de ddH20 fría hasta una concentración final de 20 mg/ml, y se equilibró a 4ºC. Se prepararon 10 ml de tampón G2 diluyendo ARNAsa A de reserva (Quiagen) (100 mg/ml) hasta una concentración final de 200 \mug/ml.
El tampón CI (10 ml, 4ºC) y el ddH2O (40 ml, 4ºC) se añadieron entonces a los 10 ml de suspensión de células, se mezclaron mediante inversión, y se incubaron sobre hielo durante 10 minutos. Los núcleos de las células se precipitaron mediante centrifugación en un rotor de cabezal oscilante a 2.500 r.p.m., a 4ºC durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante y los núcleos se suspendieron con un agitador vórtex en 2 ml de tampón CI (a 4ºC) y 6 ml de ddH2O, seguida por una segunda centrifugación a 4ºC, 2.500 r.p.m. durante 15 minutos. Los núcleos se resuspendieron a continuación en el tampón residual usando 200 ml por punta. Se añadió tampón G2 (10 ml) a los núcleos en suspensión mientras que se aplicaba una suave agitación con vórtice. Una vez se hubo completado la adición de tampón, se aplicó agitación enérgica con vórtice durante 30 segundos. Se añadió la proteasa Quiagen (200 \mul, preparada como se indicó más arriba) y se incubó a 50ºC durante 60 minutos. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisados fueron claros (por ejemplo, incubando 30-60 minutos adicionales, precipitando a 3.000 \timesg durante 10 minutos, 4ºC).
Preparación y lisis de la muestra de tumor humano sólido
Las muestras de tumor se pesaron y colocaron en tubos cónicos de 50 ml y se mantuvieron en hielo. El procesamiento estaba limitado a no más de 250 mg de tejido por preparación (1 punta/preparación). La solución de proteasa se preparó al instante diluyéndola en 6,25 ml de ddH2O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml, y se almacenó a 4ºC. El tampón G2 (20 ml) se preparó diluyendo ARNasa A hasta una concentración final de 200 \mug/ml (desde 100 mg/ml de reserva). El tejido tumoral se homogeneizó en 19 ml de tampón G2 durante 60 segundos usando la punta larga del politrón en una campana TC de flujo laminar con objeto de evitar la inhalación de aerosoles, y se mantuvo a temperatura ambiente. El politrón se limpió entre muestra haciendo girar durante 30 segundos cada vez en 2 l de ddH20, seguidos por tampón G2 (50 ml). Si aún había tejido presente en la punta del generador, se desmontaba el aparato y se limpiaba.
Se añadió la proteasa (Quiagen), preparada como se indicó más arriba, 1 ml, seguida por agitación con vórtice e incubación a 50ºC durante 3 horas. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisados fueron claros (por ejemplo, incubando 30-60 minutos adicionales, precipitando a 3.000 \timesg durante 10 minutos, 4ºC).
Preparación y lisis de sangre humana
Se extrajo la sange de voluntarios sanos usando protocolos estándares para agentes infecciosos, y se citrató en muestras de 10 ml por punta. La solución de proteasas (Quiagen) se preparó al instante mediante dilución en 6,25 ml de ddH2O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml, y se almacenó a 4ºC. El tampón G2 (20 ml) se preparó diluyendo ARNasa A hasta una concentración final de 200 \mug/ml (desde 100 mg/ml de reserva). La sangre (10 ml) se colocó en un tubo cónico de 50 ml, y se añadieron 10 ml de tampón CI y 30 ml de ddH2O (ambos previamente equilibrados a 4ºC), y los componentes se mezclaron mediante inversión y se mantuvieron sobre el hielo durante 10 minutos. Los núcleos se precipitaron con un rotor de cabezal basculante BECKMAN^{TM} a 2.500 r.p.m., a 4ºC durante 15 minutos, y se descartó el sobrenadante. Con un agitador vórtex, los núcleos se suspendieron en 2 ml de tampón CI (4ºC) y 6 ml de ddH2O (4ºC). Se repitió la agitación con vórtice hasta que el precipitado fue blanco. Los núcleos se resuspendieron a continuación en el tampón residual usando una punta de 200 \mul punta. Se añadió tampón G2 (10 ml) a los núcleos en suspensión mientras que se agitaba suavemente con vórtice, seguida por agitación enérgica con vórtice durante 30 segundos. Se añadió la proteasa Quiagen (200 \mul) y se incubó a 50ºC durante 60 minutos. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisados fueron claros (por ejemplo, incubando 30-60 minutos adicionales, precipitando a 3.000 \timesg durante 10 minutos, 4ºC).
Purificación de los lisados aclarados Aislamiento del ADN genómico
Se equilibró el ADN genómico (1 muestra por preparación con Maxi Tip) con 10 ml de tampón QBT. El tampón de elución QF se equilibró a 50ºC. Las muestras se agitaron con vórtice durante 30 segundos, a continuación se cargaron sobre puntas equilibradas y se escurrieron por gravedad. Las puntas se lavaron con 2 \times 15 ml de tampón QC. Se eluyó el ADN en tubos COREX^{TM} de 30 ml, autoclavados y silanizados, con 15 ml de tampón QF (50ºC). Se añadió isopropanol (10,5 ml) a cada muestra, y los tubos se recubrieron con parafina, y se mezclaron mediante inversión repetida hasta que el ADN precipitó. Las muestras se precipitaron mediante centrifugación en el rotor SS-34 a 15.000 r.p.m., durante 10 minutos a 4ºC. Se marcó la ubicación del precipitado, se descartó el sobrenadante, y se añadieron 10 ml de etanol al 70% (4ºC). Las muestras se precipitaron de nuevo mediante centrifugación con rotor SS-34 a 10.000 r.p.m., durante 10 minutos a 4ºC. Se marcó la ubicación del precipitado y se descartó el sobrenadante. Los tubos se colocaron a continuación sobre su lado en una bandeja de secado y se secaron 10 minutos a 37ºC, teniendo cuidado de no secar excesivamente las muestras.
Una vez secados, los precipitados se disolvieron en 1,0 ml de TE (pH 8,5) y se colocaron a 50ºC durante 1-2 horas. Las muestras se mantuvieron durante la noche a 4ºC como disolución continuada. La solución de ADN se transfirió entonces a tubos de 1,5 ml con una aguja de 26 galgas en una jeringuilla de tuberculina. La transferencia se repitió 5\times con objeto de romper el ADN. Las muestras se colocaron entonces a 50ºC durante 1-2 horas.
Cuantificación del ADN genómico y preparación para el ensayo de amplificación del gen
Los niveles de ADN en cada tubo se cuantificaron mediante espectrofotometría estándar a A260, A280 en una dilución 1:20 (5 ml de ADN + 95 ml de ddH2O) usando cubetas de cuarzo de 0,1 ml en el espectrofotómetro BECKMAN DU640^{TM}. Las proporciones A260/A280 estaban en el rango de 1,8-1,9. Cada muestra de ADN se diluyó entonces aún más hasta aproximadamente 200 ng/ml en TE (pH 8,5). Si el material original estaba altamente concentrado (aproximadamente 700 ng/ml), el material se colocaba a 50ºC durante varias horas hasta que se resuspendía.
La cuantificación fluorométrica del ADN se realizó entonces sobre el material diluido (20-600 ng/ml) usando las instrucciones del fabricante según tal y como se modificaron más abajo. Esta se realizó permitiendo que un fluorímetro HOEFFER DYNA QUANT 200^{TM} se calentara durante aproximadamente 15 minutos. La solución de trabajo del colorante HOECHST^{TM} (#H33258, 10 ml, preparada en las 12 horas anteriores a su uso) se diluyó en 100 ml de tampón 1\times TNE. Se llenó una cubeta de 2 ml con la solución del fluorímetro, se colocó en el instrumento, y se ajustó el instrumento a cero, se añadió pGEM 3Zf(+) (2 ml, lote #360851026) a 2 ml de solución del fluorímetro y se calibró a 200 unidades. Una segunda muestra de 2 ml de ADN pGEM 3Zf(+) se ensayó y la lectura se confirmó a 400 \pm 10 unidades. Cada muestra se leyó entonces por triplicado. Cuando se hallaron 3 muestras que estaban dento del 10% entre ellas, se tomó su promedio y se usó este valor como el valor de cuantificación.
La concentración determinada fluorométricamente se usó entonces para diluir cada muestra hasta 10 ng/ml en ddH2=. Esto se hizo simultáneamente con todas las muestras de plantilal para un único ensayo en placa TAQMAN^{TM}, y con material suficiente para 500-1000 ensayos. Las muestra se ensallaron por triplicado tanto con B-actina como GAPDH sobre una única placa con ADN humano normal y sin controles de plantilla. Se usaron las muestras diluidas a condición de que el valor de Ct del ADN humano normal restado del ADN de ensayo fuera \pm 1 Ct. El ADN genómico diluido, de lotes cualificados, se almacenó en alícuotas de 1,0 ml a -80ºC. Las alícuotas que iban a usarse subsiguientemente en el ensayo de amplificación de genes se almacenaron a 4ºC. Cada una de las alícuotas de 1 ml es suficiente para 8-9 placas o 64 ensayos.
Mapeado del esqueleto y mapeado del epicentro
Se reexaminó el WISP-1 humano con mapeado de ambos, el esqueleto y el epicentro. Se reexaminaron tumores seleccionados del cribado inicial de más arriba con mapeado de ambos, el esqueleto y el epicentro. La Tabla IV indica el mapeado cromosómico de los marcadores estructurales que se usaron en el presente ejemplo. Los marcadores estructurales están ubicados aproximadamente cada 20 megabases a lo largo del cromosoma 8, y se usaron para controlar la aneuploidía.
TABLA IV
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La Tabla V describe los marcadores de epicentro que se emplearon en asociación con el WISP-1. Estos marcadores están ubicados en estrecha proximidad al gen del WISP-1 y se usan para verificar el estado de amplificación de la región del cromosoma 8 en la que está ubicado el gen del WISP-1. La distancia entre los marcadores individuales se mide en centiRays (cR), la cual es una unidad de rotura por radiación aproximadamente igual a una probabilidad del 1% de una rotura entre dos marcadores. Un cR es muy aproximadamente equivalente a 20 kilobases. El marcador SHGC-32958 es el marcador más próximo a la ubicación sobre el cromosoma 8 con la cual más próximamente se mapea el gen que codifica el WISP-1.
TABLA V
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Los marcadores estructurales del WISP-2 humano están ubicados aproximadamente cada 20 megabases a lo largo del cromosoma 20, y se usaron para controlar la aneuploidía. Los marcadores se muestran en la Tabla VI
TABLA VI
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El marcador SHGC-33922 es el marcador al cual el ADN del WISP-2 se mapea más cercano. Este marcador está entre los marcadores estructurales. El análisis estructural mostró que todos los marcadores estaban u7p en los tumores: por tanto, el cromosoma 20 era aneuploide en muchos tumores. Puesto que los marcadores estaban incrementados debido a la aneuploidía, no se realizó el análisis del epicentro para el gen del WISP-2 humano.
En las Tablas VII y VIII se indican, para tumores seleccionados, los valores de \DeltaCt de los marcadores estructurales a lo largo del cromosoma 8, descritos más arriba, respecto al WISP-1.
TABLA VII
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TABLA VII (continuación)
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TABLA VII (continuación)
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TABLA VIII
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Resultados del ensayo de amplificación génica
El compuesto WISP-2 humano (PRO261) de la invención se examinó en los siguientes tumores primarios, y los valores de \DeltaCt resultantes se recogen en la Tabla IX.
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TABLA IX
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TABLA IX (continuación)
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TABLA IX (continuación)
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Los valores de \DeltaCt para el DNA33473 (PRO261; WISP-2 humano) en una variedad de tumores primarios de pulmón y colon, así como en líneas celulares de tumor pulmonar, se recogen en la Tabla IX. Un valor de \DeltaCt > 1 se usó típicamente como valor umbral para la puntuación de la amplificación, puesto que representa una duplicación de la copia del gen. La Tabla IX indica que ocurrió una amplificación significativa del DNA33474 en: (1) los tumores de pulmón primarios LT1a, LT10, LT12, LT15, LT17 y LT19; (2) los tumores de colon primarios CT2, CT3, CT14, y CT5; (3) las líneas celulares de tumor de colon SW480, SW620, HT29, WiDr, HCT116, SKCO1, SW403, y LS174T; y (4) las líneas celulares de tumor de mama HBL100, MB435s, BT20 y SKBR3.
Los valores de \DeltaCt y \DeltaCt promedio para los tumores de pulmón primarios fueron los siguientes: 1,08, 1,16, 1,17, 1,64, 1,50 y 1,47, respectivamente; los de los tumores de colon primarios fueron: 1,16, 2,14, 1,03 y 1,07, respectivamente; los de las líneas celulares de tumor de colon fueron 1,67, 1,54, 1,73, 1,24, 1,32, 1,35, 1,65, y 1,48, respectivamente; y los de las líneas celulares de tumor de mama fueron 1,40, 1,43, 1,66, y 1,73, respectivamente.
Para los tumores de pulmón, esto representa aproximadamente un incremento de 2,1, 2,2, 2,2, 3,1, 2,8 y 2,8 veces, respectivamente, en copias de genes en relación la tejido normal. Para los tumores de colon, esto representa un incremento de 2,2, 4,4, 2,0 y 2,1 veces, respectivamente, en copias de genes en relación la tejido normal. Para las líneas celulares de tumor de colon, esto representa un incremento de 3,2, 2,9, 3,3, 2,4, 2,5, 2,5, 3,1 y 2,8 veces, respectivamente, en copias de genes en relación al tejido normal. Para las líneas celulares de tumor de mama, esto representa un incremento de 2,6, 2,7, 3,2 y 3,3 veces, respectivamente, en copias de genes en relación la tejido normal. Puesto que la amplificación de DNA33473 (PRO261) ocurre en varios tumores, probablemente está asociada con la formación o crecimiento del tumor. Como resultado, se espera que los antagonistas (por ejemplo, los anticuerpos) dirigidos contra la proteína codificada por el DNA33473 (PRO261) sean útiles en la terapia del cáncer.
Ejemplo 16 Hibridación in situ
La hibridación in situ es una técnica potente y versátil para la detección y ubicación de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de células o tejidos. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión de genes, analizar la distribución de la transcripción en un tejido, identificar la ubicación de una infección vírica, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico, y ayudar en el mapeado cromosómico.
La hibridación in situ se realizó siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), usando ribosonda marcadas con ^{33}P y generadas mediante la PCR. De forma resumida, los tejidos fijados en formol, y montados en parafina, se seccionaron, se desparafinaron, se desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron adicionalmente para la hibridación in situ según se describieron Lu y Gillett, ver más arriba. Se generó una ribosonda no codificante marcada con (33-P)UTP a partir del producto de la PCR y se hibridó a 55ºC durante la noche. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión de traza nuclear KODAK NTB2^{TM} y se expusieron durante 4 semanas.
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Síntesis de la ^{33}P-Ribosonda
6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol) se secaron con centrifugado al vacío. A cada tubo que contenía 33P-UTP seca, se le añadieron los siguientes ingredientes:
2,0 \mul 5\times tampón de transcripción
1,0 \mul DTT (100 mM)
2,0 \mul mezcla de NTP (2,5 mM; 10 \mul de cada de 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 \mul H2O)
1,0 \mul UTP (50 \muM)
1,0 \mul RNAsina
1,0 \mul de plantilla de ADN (1 \mug)
1,0 \mul H2O
1,0 \mul de polimerasa de ARN (para los productos de la PCR, T3 = AS, T7 = S, usualmente).
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadió un total de 1,0 \mul de RQI ADNasa, seguidos por incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron un total de 90 \mul de TE (10 mM Tris, pH 7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0), y la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La solución restante se cargó sobre una unidad de ultrafiltración MICROCON-50^{TM}, y se centrifugó usando el programa 10 (6 minutos). Se invirtió la unidad de filtración sobre un segundo turbo, y se centrifugó usando el programa 2 (3 minutos). Después de la centrifugación de recuperación final, se añadieron un total de 100 \mul de TE. A continuación, se pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81, y se contó en 6 ml de BIOFLUOR H^{TM}.
La sonda se analizó sobre un gel de TBE/urea. Se añadieron un total de 1-3 \mul de la sonda, ó 5 \mul del ARN Mrk III, a 3 \mul de tampón de carga. Después de calentarlo sobre un bloque de calor a 95ºC durante tres minutos, el gel se colocó inmediatamente sobre hielo. Se lavaron los pocillos del gel, y se cargó la muestra y se corrió a 180-250 voltios durante 45 minutos. Se envolvió el gen en película de plástico (marca SARAN^{TM}) y se expuso a película XAR con una pantalla intensificadora en un congelador a -70ºC, desde una hora hasta toda la noche.
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Hibridación con ^{33}P A. Pretratamiento de las secciones congeladas
Los portaobjetos se sacaron del congelador, se colocaron sobre bandejas de aluminio, y se descongelaron a temperatura ambiente durante unos minutos. Las placas se colocaron en un incubador a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en 4% de paraformaldehído sobre hielo en una campana extractora, y se lavaron con 0,5\times SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml 20\times SSC + 975 ml s.c. H2O). Después de la desproteinación en 0,5 mg/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 ml de 10 mg/ml de reserva en 250 ml de tampón de RNAasa sin RNAasa, precalentado), se lavaron las secciones en 0,5 \times SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, y 100%, 2 minutos en cada una.
B. Pretratamiento de las secciones impregnadas en parafina
Los portaobjetos se desparafinaron colocándolos en s.c. H2O, y se aclararon dos veces en 2\times SSC a temperatura ambiente, 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón RNAasa sin RNAasa; 37ºC, 15 minutos) para el tejido embrionario humano, u 8\times proteinase K (100 ml en 250 ml de tampón RNAasa, 37ºC, 30 minutos) para los tejidos con formol. El aclarado subsiguiente en 0,5\times SSC y la deshidratación se realizaron como se ha descrito más arriba.
C. Prehibridación
Los portaobjetos se depositaron en una caja de plástico recubierta con tampón Box (4\times SSC, 50% de formamida). Se saturó el papel de filtro. Se cubrió el tejido con 50 ml de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato dextrano + 6 ml s.c. H2O), se agitaron con vórtice, y se calentaron en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Después de enfriarlos en agua, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20\times SSC, y 9 ml de s.c. H2O, y el tejido se agitó con vórtice a conciencia y se incubo a 42ºC durnate 1-4 horas.
D. Hibridación
Se calentaron 1,0 \times 10^{6} cpm de sonda y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml stock) por portaobjetos, a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjetos. Después de agitarlos con vórtice, se añadieron 50 \mul de la mezcla ^{33}P a 50 \mul de prehibridación sobre el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron a 55ºC durante la noche.
E. Lavados
El lavado se realizó durante 2 \times 10 minutos con 2\times SSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml 20\times SSC - 16 ml EDTA 0,25 M, V_{f}=4L), seguido por tratamiento con ARNasa a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 \mul de tampón ARNasa = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron 2 \times 10 minutos con 2\times SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones del lavado de rigurosidad fueron como sigue: 2 horas a 55ºC, 0,1\times SSC, EDTA (20 ml 20\times SSC + 16 ml EDTA. V_{f}=4L).
F. Oligonucleótidos
El análisis in situ se realizó sobre las secuencias de ADN descritas en la presente invención. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis son como sigue:
(1) WISP-1 de ratón (Clon 568)
Notrim-p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GTC CCT
\hskip0,35cm GGC CAG TGC TGT GAG-3' (SEC. Nº ID.: 147)
Notrim-p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG CCA
\hskip0,35cm GGC TTT GCT TCC ATT-3' (SEC. Nº ID.: 148) 
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(2) WISP-1 humano
hm WISP-1 p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG
\hskip0,35cm AGG CAT GGC ACA GGA AC-3' (SEC. Nº ID.: 149)
hm WISP-1 p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCC
\hskip0,35cm GGA TCA GGC TTG GGT GTA-3' (SEC. Nº ID.: 150) 
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(3) WISP-2 de ratón (Clon 1367.3)
1367.p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AGC TTG
\hskip0,35cm GGA TGG AGG TCT TTC-3' (SEC. Nº ID.: 151)
1367.p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG CAC
\hskip0,35cm TGG GGT GGT GT-3' (SEC. Nº ID.: 152) 
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(4) WISP-2 humano (DNA33473)
DNA33473-p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCG
\hskip0,35cm AGG ACG GCG GCT TCA-3' (SEC. Nº ID.: 153)
DNA33473-p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA AGA GTC
\hskip0,35cm GCG GCC GCC CTT TTT-3' (SEC. Nº ID.: 154) 
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(5) WISP-3 humano
WISP3-p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGG GCT
\hskip0,35cm CCT CTT CTC CAC TCT-3' (SEC. Nº ID.: 155)
WISP3-p2: 5'-CTA TGA AATTAA CCC TCA CTA AAG GGA GCT GTC
\hskip0,35cm GCA AGG CTG AATGTA-3' (SEC. Nº ID.: 156) 
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G. Resultados
El análisis in situ se realizó sobre las secuencias de ADN anteriores descritas en la presente invención. Los resultados de estos análisis son como sigue:
(1) WISP-1 de ratón Expresión en tejidos de ratón
Tejidos fetales de ratón: la hibridación in situ del WISP-1 de ratón mostró una intensa expresión en los tejidos mesenquimales embrionarios. En E10.5 se observó la expresión en tejidos que se desarrollarán en elementos esqueléticos en el adulto: este patrón se mantuvo en fases posteriores del desarrollo embrionario. En fases posteriores (E12.5 y E15.5), la expresión fue máxima en los osteoblastos en los sitios de formación de huesos. También se observó la expresión en el corazón embrionario, en donde la señal fue particularmente intensa en las aurículas en E12.5 (las aurículas no se incluyeron en las secciones a E15.5).
Tejidos adultos del ratón: No se observó expresión en ninguno de los tejidos adultos examinados, incluyendo el corazón, pulmones, riñones, glándulas suprarrenales, hígado, páncreas, cerebro y cerebelo. Estos resultados no se correlacionan con los datos de Northern.
Fueron sitios adicionales de expresión en el feto las paredes de los vasos sanguíneos en desarrollo, y las células similares a los fibroblastos dentro del mesenquima del tracto portal hepático.
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Expresión en tumores normales y transgénicos de Wnt-1
Se observó la expresión con la sonda no codificante sobre células similares a fibroblastos adyacentes al músculo esquelético subcutáneo en P10 (crías de día 10 postnatal) y en hembras preñadas. No se observó la expresión sobre células epiteliales mamarias en ninguno de los instantes examinados en el estudio.
La expresión del WISP-1 de ratón fue elevada en los tres tumores transgénicos de Wnt-1 ensayados, y parece estar confinada a las células de apoyo parecidas a fibroblastos dentro del delicado estroma del tejido conectivo. Se observó algo de expresión sobre las propias células tumorales; sin embargo, esto representa probablemente un excedente procedente de los fibroblastos del tumor, en vez de una expresión verdadera por parte de las células tumorales.
En resumen, el WISP-1 de ratón se expresó en la mesénquima esquelética embrionaria y en los sitios de formación de hueso. Se expresó adicionalmente en fibroblastos del subcutis de crías en crecimiento y hembras preñadas. Es probable que desempeñe un papel en la osteogénesis, y puede estar implicado en la reparación posterior a una lesión. También se observó la expresión en el corazón embrionario.
(2) WISP-1 humano Expresión en tejidos humanos
Tejido fetal humano. Los tejidos fetales examinados (semanas E12-E16) incluyen: la placenta, el cordón umbilical, el hígado, el riñón, las glándulas suprarrenales, la glándula tiroides, los pulmones, el corazón, los grandes vasos, el esófago, el estómago, el intestino delgado, el bazo, el timo, el páncreas, el cerebro, el ojo, la médula espinal, la pared corporal, la pelvis, y las extremidades inferiores.
El WISP-1 humano exhibió expresión en sitios de interfaz del tejido conectivo en el feto, por ejemplo, en los tractos portales en desarrollo, en los planos fasciales del músculo, en el tejido conectivo que rodea los elementos esqueléticos y tendones en desarrollo. También se observó la expresión en el epitelio del córtex renal en desarrollo, y en las células parecidas a fibroblastos con forma ahusada de las glándulas suprarrenales fetales. El WISP-2 humano era expresado intensamente por los osteoblastos en los sitios de formación de huesos en las extremidades del feto.
Tejido adulto humano. Los tejidos adultos examinados fueron: hígado, riñón, glándulas suprarrenales, miocardio, aorta, bazo, pulmón, piel, condrosacroma, ojo, estómago, carcinoma gástrico, colon, carcinoma de colon, carcinoma de célula renal, próstata, mucosa de la vejiga urinaria y de la vesícula biliar, así como el tejido con lesión hepática inducida por acetominofén y por cirrosis hepática.
En este estudio, no se observó expresión en tejidos adultos normales o enfermos.
En resumen, el patrón global de expresión del WISP-1 humano es en términos generales similar al observado para el gen del ratón, como se ha mencionado más arriba. La sonda WISP-1 humana no reaccionó de forma cruzada con la sección del embrión de ratón.
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Expresión en carcinoma mamario humano y en tejido mamario normal
El WISP-1 humano fue negativo en las células epiteliales benignas o malignas, pero mostró un hibridación específica en células mesenquimales, particularmente en áreas de reparación del tejido, incluyendo la osificación distrófica. La mayoría de las células positivas tenían la morfología de fibroblastos, las células de músculo liso parecían ser negativas.
En resumen, este estudio muestra la expresión del ARN del WISP-1 humano en células mesenquimales implicadas en la reparación del tejidos y/o en el depósito del colágeno. La señal fue particularmente intensa en las células benignas parecidas a fibroblastos adyacentes, bien a las células de carcinoma mamario que se infiltraban, o a la destrucción del tejido debida a condiciones inflamatoria benignas (rotura de ducto). Debe destacarse el hecho de que el depósito de osteoide benigno parecía correlacionarse con la expresión intensa del ARN.
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(3) WISP-2 de ratón Expresión en tejidos normales de ratón
Tejidos fetales de ratón: la expresión del WISP-2 de ratón se observó en osteoblastos en un embrión de ratón E15.5, dentro de la mandíbula en desarrollo.
Tejidos adultos de ratón: Se observó la expresión del WISP-2 en células estromales alrededor del origen, y dentro de las cúspides de las válvulas mitral y tricúspide del corazón adulto. También se observó la expresión en las células adventicias de la arteria renal: se presumió que la expresión estaba presente en este sitio en todas las arterias.
Todos los otros tejidos fueron negativos.
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Expresión en tumores Wnt-1
Los resultados demostraron la expresión específica del WISP-2 de ratón en el estroma de todos los tumores Wnt-1 examinados. Había una señal sobre las células mononucleares dentro del núcleo vesicular abierto, posiblemente, macrófagos. No se observó expresión ni en el epitelio benigno ni en el maligno.
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(4) WISP-2 humano Expresión en tejidos humanos
Se observó una expresión intensa del gen que codifica el WISP-2 en fibroblastos dérmicos en la piel adulta normal. Adicionalmente, se observó una expresión intensa en dos hígados cirróticos, en sitios de fibrosis hepática activa. Se halló una expresión moderada sobre células fasciculadas de la corteza suprarrenal. Esta ubicación respalda un papel para el WISP-2 humano en la formación o recambio de la matriz extracelular.
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Expresión en carcinoma mamario humano y en tejido mamario normal, y en carcinoma pulmonar
El WISP-2 humano mostró un patrón de hibridación similar al del WISP-1 humano (descrito más arriba) en los dos tumores mamarios examinados. Fue negativo en las células epiteliales benignas o malignas, pero mostró un hibridación específica en células mesenquimales, particularmente en áreas de reparación del tejido, incluyendo la osificación distrófica. La señal parecía ubicarse en la misma población de células para ambas sondas, WISP-1 y WISP-2; sin embargo, en algunas áreas (tumor mamario 02), la señal para el WISP-2 era significativamente más intensa que para el WISP-1 humano. La mayoría de las células positivas tenían la morfología de fibroblastos; las células de músculo liso parecían ser negativas. La señal para el WISP-2 humano era menos intensa en el tejido tumoral pulmonar; sin embargo, esta sección también mostraba menos reparación de tejido en comparación con los portaobjetos de tumor mamario. El tejido pulmonar y renal normal eran esencialmente negativos para el WISP-2 humano, así como para el WISP-1 humano.
En resumen, este estudio muestra la expresión del ARN del WISP-2 humano en células mesenquimales implicadas en la reparación del tejidos y/o en el depósito del colágeno. La señal fue particularmente intensa en las células benignas parecidas a fibroblastos adyacentes, bien a las células de carcinoma mamario que se infiltraban, o a la destrucción del tejido debida a condiciones inflamatoria benignas (rotura de ducto). Debe destacarse el hecho de que el depósito de osteoide benigno parecía correlacionarse con la expresión intensa del ARN.
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(5) WISP-3 humano Expresión en tejidos adultos y fetales normales, y en tejido normal y de carcinoma mamario humano, y en carcinoma de colon
El análisis muestra la expresión intensa del WISP-3 humano en fibroblastos dérmicos en la piel adulta normal, y en hígados cirróticos en sitios de fibrosis hepática activa. Este patrón de ubicación respalda un papel para este factor de crecimiento en la formación y recambio de la matriz extracelular.
La sonda para el WISP-3 humano fue negativa en la mayoría de los tejidos examinados. Mostró una positividad débil y difusa sobre sección de un osteosarcoma; algunas de las células positivas no representan células malignas. El WISP-3 fue negativo en todos los tejidos normales y fetales examinados.
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Ejemplo 17 Capacidad de los polipéptidos WISP para inhibir la proliferación estimulada por VEGF del crecimiento celular endotelial
Se ensayó la capacidad de los polipéptidos WISP-1 humano y de ratón y WISP-2 humano para inhibir la proliferación estimulada por VEGF de células endoteliales. Específicamente, se sembraon células endoteliales capilares (ACE) de la corteza suprarrenal bovina (procedentes de cultivos primarios, con un máximo de 12-14 pasajes) en placas de microvaloración de 96 pocillos (Amersham Life Science) a una densidad de 500 células/pocillo por 100 \mul en DMEM con glucosa baja, 10% de suero bovino, glutamina 2 mM, 1\times penicilina/estreptomicina, y fungizona, suplementado con 3 ng/ml de VEGF. Los controles se sembraron de la misma forma, pero algunos no incluían el VEGF. Se añadió una muestra de ensayo del WISP-1 de ratón o del WISP-1 humano, conjugados a IgG, o del WISP-2 (PRO261) conjugado a poli-His, en un volumen de 100 \mul para un volumen final de 200 \mul. Las células se incubaron durante 5-7 días a 31ºC. Los medios se aspiraron y se lavaron las células con 1\times PBS. Se añadió una mezcla de reacción de fosfatasa ácida (100 \mul, acetato sódico 0,1 M, pH 5,5, 0,1% de TRITON-100^{TM}, 10 mM p-nitrofenilfosfato). Después de una incubación de 2 horas a 37ºC, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 \mul de NaOH 1 N. Se midió la OD sobre un lector de placa de microvaloración a 405 nm. Los controles fueron: sin células, células solas, células +FGF (5 ng/ml), células -VEGF (3 ng/ml), células -VEGF (3 ng/ml) -TGF-\beta (1 ng/ml), and células +VEGF (3 ng/ml) +LIF (5 ng/ml). (Se sabe que el TGF-\beta a una concentración de 1 ng/ml bloquea el 70-90% de la proliferación celular estimulada por el VEGF).
Los resultados se evaluaron calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación celular estimulada con VEGF (3 ng/ml), determinada midiendo la actividad fosfatasa ácida a OD405 nm, (1) respecto a células sin estimulación, y (2) respecto a la inhibición de TGF-\beta de referencia de la actividad estimulada por el VEGF. Los resultados, tal y como se muestran en la Tabla X siguiente, son indicativos de la utilidad de los polipéptidos WISP en la terapia del cáncer y específicamente en la inhibición de la angiogénesis tumoral. Los valores numéricos (inhibición relativa) mostrados en la Tabla X se determinaron calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada por el VEGF, por parte de los polipéptidos WISP-1 de ratón, WISP-1 humano-IgG, y WISP-2-humano-poli-His, respecto a células sin estimulación, y dividiendo a continuación ese porcentaje por el porcentaje de inhibición obtenido mediante el TGF-\beta a 1 ng/ml, el cual se sabe que bloquea el 70-90% de la proliferación celular estimulada por el VEGF. El WISP-1 humano y el WISP-2 humano parecen ser particularmente útiles como agentes angiostáticos.
TABLA X
23 
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Depósito de material
Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA, USA (ATCC):
24 
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Estos depósitos se hicieron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes, y las Regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables de los depósitos durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los depósitos se harán asequible por parte de la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que asegura una disponibilidad permanente y no restringida de la progenie de los cultivos de los depósitos al público a partir de la concesión de la pertinente patente estadounidense o a partir de la exposición al publico de cualquier solicitud de patente estadounidense o de pais extranjero, cualquiera que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la progenie para alguien determinado por el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks como con derecho a la misma de acuerdo con los artículos 35 y 112 de la USC y las normas del Commissioner en relación a lo mismo (incluyendo el 37 CFR 1.14, con particular referencia a 886 OG 638).
El cesionario de la presente aplicación ha aceptado que, si un cultivo de los materiales en depósito muriese o se perdiera o fuera destruido cuando se cultiva en condiciones apropiadas, los materiales serán remplazados con prontitud, a partir de la notificación, con otros del mismo tipo. La disponibilidad de los materiales depositados no debe considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
La memoria escrita precedente se considera que es suficiente para permitir que un especialista en el campo practique la invención. La presente invención no debe limitarse en su ámbito por las construcciones depositadas, puesto que la realización depositada se pretende que sea una sencilla ilustración de ciertos aspectos de la invención. Los depósitos de materiales en la presente invención no constituye una aceptación de que la descripción escrita en la presente invención es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe considerarse como limitante del ámbito de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que éste representa.
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante sólo es para provecho del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha tenido sumo cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones, y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto. 
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Documentos de patentes citados en la descripción
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\bullet US 4675187 A [0076]
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\bullet EP 139383 A [0109]
\bullet US 4943529 A [0109]
\bullet EP 402226 A [0109]
\bullet EP 183070 A [0109]
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\bullet WO 9100357 A [0109]
\bullet US 5010182 A [0112]
\bullet EP 362179 A [0112]
\bullet WO 9013646 A [0112]
\bullet EP 36776 A [0116]
\bullet EP 73657 A [0118]
\bullet GB 2211504 A [0119]
\bullet EP 117060 A [0122]
\bullet EP 117058 A [0122]
\bullet US 4736866 A [0137]
\bullet US 4870009 A [0137]
\bullet WO 9738086 A [0137]
\bullet US 3720760 A, Bennich [0144]
\bullet WO 9733551 A [0162] [0163]
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<400> 136
\hskip1cm189 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\hskip1cm190 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\hskip1cm191 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\hskip1cm192 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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<400> 140
\hskip1cm193 
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<210> 141
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\hskip1cm194 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\hskip1cm195 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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<400> 143
\hskip1cm196 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 144
\hskip1cm197 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\hskip1cm198 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\hskip1cm199 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\hskip1cm200 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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<400> 148
\hskip1cm201 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 149
\hskip1cm202 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\hskip1cm203 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
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<400> 151
\hskip1cm204 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\hskip1cm205 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\hskip1cm206 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\hskip1cm207 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\hskip1cm208 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintetizada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\hskip1cm209

Claims (17)

1. Procedimiento para diagnosticar el crecimiento o proliferación de células neoplásicas en un humano, el cual comprende detectar la amplificación a nivel de la expresión de un gen que codifica un polipéptido WISP-1, que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), (a) en una muestra de ensayo de células del tejido obtenida del humano, y (b) en una muestra de control de células de tejido que se sabe es normal del mismo tipo de células, en donde la amplificación o una nivel de expresión superior en la muestra de ensayo indica la presencia de un tumor en el humano del cual se obtuvieron las células de tejido de ensayo.
2. Procedimiento para diagnosticar el crecimiento o proliferación de células neoplásicas en un humano, el cual comprende (a) poner en contacto un anticuerpo anti-WISP-1, el cual se une específicamente a un polipéptido WISP-1, con una muestra de ensayo, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-WISP-1 y el polipéptido WISP-1 en la muestra de ensayo, en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4), y una mayor nivel de WISP-1 en la muestra de ensayo, respecto a las células del tejido normal conocidas del mismo tipo celular, indica la presencia de un tumor en el humano del cual se obtuvieron las células de tejido de ensayo.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el cual el procedimiento es un procedimiento para diagnosticar un tumor.
4. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el cual el procedimiento es un procedimiento para diagnosticar el cáncer de colon.
5. Uso de:
\quad
una molécula no codificante, un ribozima, o una molécula de triple hélice, que inhibe la expresión de un polipéptido WISP-1, o un anticuerpo que específicamente se une a dicho polipéptido WISP-1, en la fabricación de un medicamento para tratar un tumor que sobreexpresa WISP-1;
en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.:
4).
6. Uso de un anticuerpo que específicamente se une al polipéptido WISP-1 para la diagnosis in vitro del crecimiento o proliferación de células neoplásicas en una muestra procedente de un humano;
en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.:
4).
7. El uso de la reivindicación 5 en el cual el mamífero es humano.
8. El uso de la reivindicación 5 ó 7 en el cual las células tumorales son células de cáncer de colon.
9. Procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de células tumorales, el cual comprende exponer una célula, que sobreexpresa un polipéptido WISP un gen inducido por el Wnt-1, a una cantidad efectiva de una molécula no codificante, ribozima o molécula de triple hélice, la cual inhibe la expresión del polipéptido WISP-1, o de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido WISP-1, y en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4).
10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el cual las células tumorales son células de cáncer de colon.
\newpage
11. Procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la actividad de un polipéptido WISP-1, que comprende los pasos de:
(a)
poner en contacto células y un compuesto a examinar, en presencia de polipéptido WISP-1, en condiciones apropiadas para la estimulación de la proliferación celular por parte de dicho polipéptido WISP-1; y
(b)
medir la proliferación de las células para determinar si el compuesto es un antagonista efectivo,
en donde dicho polipéptido WISP-1 tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido WISP-1 maduro humano, el cual tiene los residuos aminoácidos 23 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 3), y/o con el polipéptido WISP-1 de longitud completa humano que tiene los residuos aminoácidos 1 a 367 de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 3A y 3B (SEC. Nº ID.: 4).
12. El uso o procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el cual el polipéptido WISP-1 comprende los residuos aminoácidos 23 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC Nº ID.: 3), o los residuos aminoácidos 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B (SEC Nº ID.: 4), con o sin la metionina N-terminal.
13. El uso o procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el cual el polipéptido WISP-1 comprende los residuos aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, excepto por un residuo isoleucina en la posición 184 en vez de un residuo valina (SEC Nº ID.: 7), con o sin la metionina N-terminal.
14. El uso o procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el cual el polipéptido WISP-1 comprende los residuos aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, excepto por un residuo serina en la posición 202 en vez de un residuo alanina (SEC Nº ID.: 5, 6 y 8), con o sin la metionina N-terminal.
15. El uso o procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el cual el polipéptido WISP-1 comprende los residuos aminoácidos 23 a 367 ó 1 a 367 de las Figuras 3A y 3B, excepto por un residuo isoleucina en la posición 184 en vez de un residuo valina, y excepto por un residuo serina en la posición 202 en vez de un residuo alanina (SEC Nº ID.: 22), con o sin la metionina N-terminal.
16. El uso o procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
17. El uso o procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, o un anticuerpo anti-idiotípico.
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